BR102017026311A2 - Processo de produção biotecnológica do aroma de 2- feniletanol através do cultivo microbiano submerso de kluyveromyces marxianus cca 510 em suco de caju. - Google Patents

Abstract

a presente invenção, que consiste de nove métodos de cultivo microbiano de kluyveromyces marxianus cca 510 para a produção biotecnológica do 2-feniletanol com uso de duas formulações de substratos líquidos preparados a partir do suco extraído do caju (anacardium occidentale l.) destaca-se pelas suas vantagens em relação aos métodos extrativos e aos métodos químicos de preparo no que diz respeito às condições amenas de temperatura e pressão (25-45 o c e 1 atm) empregadas no cultivo de kluyveromyces marxianus cca 510, ao emprego de um meio reacional livre de reagentes perigosos ou reagentes gasosos sob pressão e à utilização de um importante e abundante resíduo agroindustrial brasileiro, disponível a baixos custos, que é o pedúnculo do caju (anacardium occidentale l.) na produção de um aroma de amplo espectro de aplicações industriais e de alto valor agregado, o 2-feniletanol. a presente invenção evidencia também a economicidade do processo e os seus baixos impactos ambientais.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DO AROMA DE 2-FENILETANOL ATRAVÉS DO CULTIVO MICROBIANO SUBMERSO DE Kluyveromyces marxianus CCA 510 EM SUCO DE CAJU.

[001] A presente invenção refere-se ao processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol, substância caracterizada por ser o aroma característico de Rosas, através do cultivo de microrganismos da espécie Kluyveromyces marxianus CCA 510 em substrato líquido preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.).

[002] O 2-Feniletanol, cuja fórmula molecular é C6H8O, também chamado de álcool 2-feniletílico, álcool β-feniletílico, álcool fenil, benzil carbinol e β-hidroxi etil benzeno, tem peso molecular de 122 g.mol-1, é cadastrado sobre o registro CAS 60-12-8, não apresenta tóxicidade e está incluído no catálogo FEMA-GRAS sob o número 2858.

[003] O 2-Feniletanol é um dos aromas mais utilizados na indústria de alimentos e de cosméticos. Atualmente, muitas formulações comerciais de bebidas não alcoólicas (tais como chás e cafés), de bebidas alcoólicas (tais como vinhos e cidras), massas alimentícias (tais como pães e biscoitos), doces (tais como gomas, sorvetes, pudins e gelatinas) e molhos especiais contêm significativas concentrações desta substância. Na indústria de cosméticos, este aroma está associado à fragrância de rosas e tem sua ampla aplicação em formulações comerciais de perfumes, loções e cremes na composição do aroma final do produto.

[004] O 2-Feniletanol pode ser obtido por meio de rotas de extração direta de pétalas de rosas ou através síntese química.

[005] A rota de extração do 2-Feniletanol convencionalmente envolve a recuperação de óleos essenciais oriundos de biomassa vegetal e o posterior isolamento e purificação desta substância a partir destes extratos oleosos obtidos de muitas flores e plantas, como jacintos, jasmim, narcisos e lírios. Na maioria dos casos, as concentrações de 2-Feniletanol obtidas são muito baixas, com exceção do extrato oleoso obtido de rosas, que pode conter até 60% deste aroma, conforme reportam ETSCHMANN et al. (2002) [Appl. Biochem. Biotechnol., v. 59, n. 1, p. 1-8, 2002].

[006] Diversos são os reportes técnicos sobre rotas de síntese química de 2-Feniletanol encontrados na literatura.

[007] No início do século XX, a redução de ésteres de ácido fenilacético com sódio e álcool, foi reportada por L. BOUVEAULT e C. BLANC [Compt. Rend., v.137, p.60-62, 1903]. Esta rota de produção de 2-Feniletanol ficou conhecida como processo BOUVEAULT-BLANC.

[008] Processo semelhante ao BOUVEAULT-BLANC auxiliados com a presença de catalisadores a base de crômio e óxido de crómio é reportado na Patente Americana U.S. N ° 2.091. 800.

[009] Rotas químicas de condensação de benzeno com óxido de etileno sob a ação de cloreto de alumínio [Patentes Americanas U.S. No. 1.944.959 e U.S. No 2.013.710], de condensação álcali-fenila [Patente Alemã No 596.523] ou por condensação de brometo de fenilmagnésio com óxido de etileno ou etilenocloridrina [Patente Americana U.S. No 1.996.746 e Patentes Alemãs No 660.075 e No 697.420] foram reportadas para a síntese de 2-Feniletanol.

[010] O método de síntese de 2-Feniletanol através da cloração de etilbenzeno seguido de processo de hidrólise seletiva foi reportado na invenção registrada como a Patente Americana U.S. No 2.185.141.

[011] De acordo com a Patente Americana U.S. No 2.822.403, a hidrogenação catalítica de óxido de estireno foi realizada na presença de água para a síntese de 2-Feniletanol. Nesta invenção a reação deve ser carreada na presença de agentes promotores de emulsão e dispersão além da combinação de catalisadores de níquel de Raney e outro catalisador para reações de hidrogenação (tal como cobalto, platina ou paládio).

[012] Atualmente, quase que a totalidade do volume de 2-Feniletanol encontrado no mercado é obtido por meio de rotas químicas de síntese, uma vez que sua rota de extração direta de pétalas de rosas empenha um alto custo, geralmente associado aos baixos rendimentos extrativos obtidos (próximos à 0,013 mg.kg-1 de Rosa damascena) e ao alto dispêndio energético impelido nestes processos, que impacta diretamente no preço comercial desta substância quando obtida da extração direta, que chega a ser cerca 250 vezes mais caro que o 2-Feniletanol obtido da síntese química, conforme mencionam MEI et al. (2009) [Process Biochem., v. 44, n. 8, p. 886-890, 2009] e ETSCHMANN etal. (2003) [Biotechnol. Lett., v. 25, n. 7, p. 531-536, 2003].

[013] Dentre as diversas rotas de preparo químico do 2-Feniletanol, destacam-se dois métodos. O primeiro deles é via síntese de Grignard, em que o clorobenzeno é convertido em cloreto de fenilmagnésio que reage com o óxido de etileno a 100°C para formar cloreto de feniletoxiamónio que é, então, decomposto com ácido sulfúrico na formação 2-Feniletanol, segundo mencionou Ernst T. Theimer (1982) [in Fragrance Chemistry, p. 271, Academic Press, New York, 1982]. O segundo, conforme relatos de Richard Wilson [in Kirk Other's Encyclopaedia of Chemical Technology, v. 4, p.116, John Wiley & Sons, New York, 1991], envolve a alquilação de Friedel Crafts a baixa temperatura utilizando benzeno e óxido de etileno, na presença de cloreto de alumínio anidro. A maior peculiaridade deste processo é que as baixas temperaturas e baixas razões molares dos reagentes são extremamente críticas para o processo e limitam o preparo do 2-feniletanol ao passo que a manutenção destes parâmetros de reação é dificultada.

[014] Embora mais vantajosos que os processos de extração direta, estes métodos de preparação por síntese química, no entanto, têm algumas desvantagens. Algumas destas desvantagens começam a partir da complexidade das matérias-primas ou da exigencia de emprego de substâncias auxiliares de alto custo e periculosidade ou condições de reação que envolvem elevado dispêndio energético. Como é o caso do método de Grignard, que envolve a utilização de solventes perigosos como o éter dietílico. No entanto, o principal problema deste processo é a qualidade final do produto (2-feniletanol), que é obtido juntamente com grandes quantidades de produtos secundários, que não são fácilmente separados.

[015] Uma alternativa aos processos convencionais de síntese ou extração de 2-Feniletanol é a via biotecnológica, na qual leveduras, capazes de metabolizar L- fenilalanina pela via metabólica de EHRLICH [Ber. Dtsch. Chem. Ges., v. 40, p. 10271047, 1907], são empregadas em cultivo submerso sob condições amenas de processo e com emprego de meios reacionais formulados com substâncias de baixa toxicidade.

[0016] Diversas são as cepas de leveduras, tais como Pichia ferments, Kluyveromyces marxianus ou Saccharomyces cerevisiae, que apresentaram elevado potencial para a produção industrial de diversos aromas, dentre eles o 2-feniletanol, como derivado direto da L-fenilalanina por bioconversão.

[017] FABRE et al. (1997), por exemplo, investigaram a produção de 2-Feniletanol por 21 cepas de leveduras, delineando como conclusão de seu trabalho que, dentre as diferentes cepas 2-feniletanol-produtoras, o microrganismo Kluyveromyces marxianus teve melhores resultados. [Biotechnol. v. 11, p 523-525, 1997].

[018] MASUO et al. (2015) estudaram a produção de 2-feniletanol por Aspergillus oryzae RIB40. Os estudos de MASUO et al. (2015), que produziram 2-feniletanol utilizando como substrato a L-fenilalanina, com rendimento de 0,1g/L. [Fungal Genet. Biol., v. 77, p. 22-30, 2015].

[019] FABRE e seus colaboradores [Biotechnol. Progr., v. 14, p. 270-274, 1998] reportaram os efeitos da inibição provocada pelo 2-Feniletanol em Kluyveromyces marxianus. Neste trabalho, a inibição do crescimento de Kluyveromyces marxianus foi identificada quando a concentração de 2-feniletanol atingiu um valor crítico próximo de 1,4 g/L.

[020] ESHKOL et al. (2009) [J. Appl. Microbiol., v. 106, n. 2, p. 534-542, 2009] também reportou o efeito inibitório do crescimento de leveduras por 2-Feniletanol. No seu estudo, algumas cepas de Saccharomyces cerevisiae foram isoladas de fontes naturais e testadas quanto a sua capacidade de termotolerância e resistencia ao stress promovido pelo 2-Feniletanol. Estes efeitos inibitórios causados por 2-Feniletanol em Saccharomyces cerevisiae já haviam sido tecnicamente constatados por STARK et al. em 2003 [Enzyme Microb. Technol., v. 32, n. 2, p. 212-223, 2003].

[021] De fato, a biotransformação de L-fenilalanina em 2-feniletanol é limitada pela citotoxicidade deste produto, como evidenciado por FABRE et al. (1998), STARK et al. (2003) e ESHKOL et al. (2009). Alguns reportes técnicos apontam métodos de remoção in situ de 2-Feniletanol dos meios de cultivo microbiano, impedindo que a biotransformação seja afetada, como estratégia para melhorar a produção final deste aroma.

[022] ETSCHMANN et al. (2005) investigaram e apresentaram um bioprocesso integrado para a produção de 2-feniletanol e 2-feniletilacetato, a partir de L-fenilalanina por leveduras. Neste trabalho, um processo de pervaporação organofílica, equipada com uma membrana de polioctilmetilsiloxano, foi acoplada através de um bypass a um biorreator e provou ser uma técnica adequada para a remoção in situ destes produtos. Com culturas de levedura termotolerantes Kluyveromyces marxianus CBS 600, o uso da pervaporação resultou em uma dupla concentrações finais de 2-Feniletanol entre 1,35,85 g/L [Biotechnol. Bioeng., v. 92, n. 5, p. 624-634, 2005].

[023] MEI et al. (2009), também na tentativa de melhorar a produção de 2-Feniletanol utilizaram resinas adsorventes macroporosas para a remoção do 2-Feniletanol gerado no cultivo microbiano [Process Biochem. , v. 44, n. 8, p. 886-890, 2009].

[024] Além destes métodos, processos de extração com membranas e microfiltração foram propostos em dois trabalhos de MIHAL e colaboradores. O primeiro deles de 2012 [Sep. Purif. Technol., v. 95, p. 126-135, 2012] e o Segundo de 2013 [Chem. Eng. Process.: Process Intensification, v. 72, p. 144-152, 2013].

[025] ETSCHMANN et al. (2004) reportou a importância da composição dos meios de cultivo na produção de 2-Feniletanol. Utilizando um algoritmo genético, 13 constituintes e a temperatura foram ensaiados no intuito de se melhorar a bioconversão da L-Fenilalanina em 2-feniletanol por Kluyveromyces marxianus CBS 600. Assim, em 98 experimentos, obteve-se concentrações finais próximas a 5,6 g/l, equivalente a um aumento de 87% em comparação à meios mais pobres. [ J. Mol. Catal. B: Enzym., v. 29, n. 1-6, p. 187-193, 2004].

[026] Uma peculiaridade destes cultivos microbianos empregados na via biotecnológica de produção de 2-Feniletanol é que o emprego de substratos formulados com meios sintéticos pobres em nutrientes leva à baixas produtividades, assim como menciona ETSCHMANN et al. (2004), e acarreta na necessidade de suplementação com formulações comerciais de aminoácidos e vitaminas ou de formulações mais complexas como extrato de leveduras, hidrolisados proteicos ou peptonas. A suplementação com tais substâncias traz como consequência os elevados custos impelidos no preparo dos substratos por conta dos insumos e matérias-primas empregadas. Visando alternativas economicamente viáveis para a produção de 2-Feniletanol, alguns resíduos agroindustriais têm sido empregados na formulação destes substratos. Três reportes em específico apresentam cultivos microbianos em substratos formulados a partir de resíduos agroindustriais. O primeiro deles, de DAMASCENO et al. (2001), reporta a produção de compostos de aroma, incluindo o 2-Feniletanol, em cultivos de Geotrichum fragans utilizando em manipueira recuperada de fecularias [In Manejo, uso e tratamento de subprodutos da industrialização da mandioca. São Paulo, Cargill, 4, p. 96-107, 2001]. O segundo, de ETSCHMANN et al. (2003), reporta a produção de 2-Feniletanol e meios formulados a partir de melaço [Biotechnol. Lett., v. 25, n. 7, p. 531-536, 2003] e o terceiro, de GARAVAGLIA et al. (2007), reporta o cultivo de Kluyveromyces marxianus em mosto de uva [World J. Microbiol. Biotechnol., v. 23, n. 9, p. 1273-1279, 2007] para a produção de 2-Feniletanol.

[027] Estes três estudos têm em comum o fato de levarem em consideração o fator econômico associado à formulação dos substratos de cultivo microbiano. DAMASCENO et al. (2001), ETSCHMANN et al. (2003) e GARAVAGLIA et al. (2007) viabilizaram a utilização de resíduos agroindustriais para a produção de 2-Feniletanol, ao passo que evidenciaram a formação consideráveis concentrações deste aroma durante o cultivo.

[028] De fato, a grande oportunidade do emprego da rota biotecnológica, além das vantagens ambientais e de processo, que se opõem às dos processos tradicionais, é a possibilidade de obtenção de 2-Feniletanol utilizando resíduos agroindustriais de diversas naturezas, reduzindo assim os custos com matérias-primas. Entretanto, embora relatados como promissores na literatura, a obtenção de 2-Feniletanol através de cultivos microbianos utilizando alguns resíduos agroindustriais apresentam certas limitações e algumas desvantagens. No caso da utilização do melaço e do mosto de uva, a produção de 2-feniletanol compete diretamente com duas das cadeias produtivas mais significativas no Brasil. No caso do Melaço a competição é direta com a produção de álcool etílico, açúcar e derivados. No caso do mosto de uva a competição é direta com a cadeia de produção de sucos, vinhos e derivados de uva, cujo promissor mercado tem apresentado grande progresso nas últimas décadas. Quanto à utilização de águas residuárias de fecularias, a pobre composição em açúcares diretamente fermentescíveis, aminoácidos e outros nutrientes necessários aos cultivos de microrganismo, sobretudo L-Fenilalanina, diretamente vinculado à síntese bioquímica de 2-Feniletanol, leva à necessidade de suplementação e enriquecimento da sua composição, que por sua vez acarreta em maiores custos no processo.

[029] O principal objetivo da presente invenção é proporcionar um processo biotecnológico para a preparação do 2-feniletanol através do cultivo de microrganismos da espécie Kluyveromyces marxianus CCA 510 em substrato líquido preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.). Outro objetivo da presente invenção é o de proporcionar métodos diversos para o cultivo de microrganismos da espécie Kluyveromyces marxianus CCA 510 em substrato líquido preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.) e que podem ser utilizados no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol.

[030] Diferente do Melaço e do mosto derivado de uva, esta invenção, que proporciona o uso inovador do caju (Anacardium occidentale L.) no cultivo de microrganismos da espécie Kluyveromyces marxianus CCA 510 para a produção de 2-Feniletanol, não compete diretamente com nenhuma via de produção de derivados alimentícios e similares, uma vez que a agroindústria produtiva do caju produz cerca de 2 milhões de toneladas de pseudofruto por ano e tem cerca de 90% desta produção descartada como resíduo desta cadeia e, diferente da utilização de águas residuárias de fecularias, o caju apresenta um rico conteúdo nutricional, açúcares (glicose e frutose), vitaminas, minerais e aminoácidos, disponível em baixos custos de processamento e com mínima necessidade de suplementação na obtenção de substratos líquidos a serem utilizados na produção biotecnológica de 2-Feniletanol.

[031] A utilização de substratos líquidos preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.) na produção biotecnológica de 2-Feniletanol, objeto desta invenção, apresenta diversas vantagens em relação aos métodos extrativos e aos métodos químicos de preparo. A primeira delas diz respeito às condições amenas de temperatura e pressão (25-45oC e 1 atm) empregadas no cultivo de Kluyveromyces marxianus CCA 510. A segunda delas diz respeito ao meio reacional, que não emprega produtos químicos perigosos ou reagentes gasosos sob pressão, não necessitando, portanto, de equipamentos específicos para a condução de reações perigosas ou vasos de pressão capazes de suportar pressões acima da pressão atmosférica. A terceira vantagem evidenciada nesta invenção diz respeito à utilização de um importante e abundante resíduo agroindustrial brasileiro, disponível a baixos custos, que é o pedúnculo do caju (Anacardium occidentale L. ) na produção de um aroma de amplo espectro de aplicações industriais e de alto valor agregado, o 2-Feniletanol, evidenciando a economicidade do processo e os seus baixos impactos ambientais.

[032] Quando comparados aos resultados obtidos para a produção biotecnológica do 2-Feniletanol em cultivos de diversos microrganismos em melaço, mosto de uva ou águas residuárias de fecularias, os métodos de cultivo microbiano de Kluyveromyces marxianus CCA 510 com uso de duas formulações de substratos líquidos a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.) apresentam produção final de 2-Feniletanol similares ou até mesmo superiores. Estes resultados podem ser evidenciados nas figuras 1, 2 e 3.

[033] A presente invenção consiste de nove (9) métodos de cultivo microbiano de Kluyveromyces marxianus CCA 510 para a produção biotecnológica do 2-Feniletanol com uso de duas formulações de substratos líquidos preparados a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L. ). As formulações/métodos 1, 2 e 3 consistem da utilização direta do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.) em cultivo submerso, em tanque agitado a 250 rpm, mantidos a 30 oC com aerações de 0,5 l/min, 2,0 l/min e 3,0 l/min, respectivamente. As formulações/métodos 4, 5 e 6 consistem da utilização direta do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.), adicionado de 3,0 g/l de L-Fenilalanina, em cultivo submerso, em tanque agitado a 250 rpm, mantidos a temperatura de 30 oC com aerações de 0,5 l/min, 2,0 l/min e 3,0 l/min, respectivamente As formulações/métodos 7, 8 e 9 consistem da utilização direta do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.), adicionado de 3,0 g/L de L-fenilalanina, em cultivo submerso, em tanque agitado a 250 rpm, mantidos sob aeração de 2,0 l/min e temperaturas de 25, 30 e 45 oC, respectivamente.

[034] A Figura 1 apresenta a concentração final da biomassa microbiana após 72 horas do cultivo de Kluyveromyces marxianus CCA 510 em substrato líquido preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.) nas nove (9) formulações diferentes ou nove (9) condições de cultivo, objeto desta invenção.

[035] A Figura 2 apresenta a produtividade volumétrica de 2-Feniletanol após 72 horas de cultivo microbiano de Kluyveromyces marxianus CCA 510 em substrato líquido preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.) nas nove (9) formulações diferentes ou nove (9) condições de cultivo, objeto desta invenção.

[036] A Figura 3 apresenta a concentração final de 2-Feniletanol obtida após 72 horas de cultivo microbiano de Kluyveromyces marxianus CCA 510 em substrato líquido preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L nas nove (9) formulações diferentes ou nove (9) condições de cultivo, objeto desta invenção.

[037] Exemplo 1: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 1, de acordo com a reivindicação 5. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 135,8 mg/L, em uma produtividade 1,89 mg/L.h de 2-Feniletanol quando a o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 16,0 g/L em 72 horas de cultivo.

[038] Exemplo 2: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 2, de acordo com a reivindicação 6. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 211,3 mg/L, em uma produtividade 2,94 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 30,0 g/L em 72 horas de cultivo.

[039] Exemplo 3: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 3, de acordo com a reivindicação 7. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 196,7 mg/L, em uma produtividade 3,97 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 46,0 g/L em 72 horas de cultivo.

[040] Os Exemplos 1,2 e 3, anteriormente descritos, demonstram o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, e são caracterizados pela similaridade da utilização do o substrato líquido 1, de acordo com a reivindicação 2, com pH ajustado para 7,0, em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brasil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, com temperatura mantida a 30°C e com agitação mantida a 250 rpm. Os três exemplos apresentam diferenças nas condições de suprimentos de ar. No Exemplo 1 utilizou-se suprimento de ar de 0,5 L/min, no Exemplo 2 utilizou-se suprimento de ar de 2,0 L/min, no Exemplo 3 utilizou-se suprimento de ar de 3,0 L/min. A tabela 1 sumariza os resultados obtidos para estes exemplos. TABELA 1: Produção de 2-feniletanol utilizando suco de caju in natura como substrato líquido, preparado conforme reivindicação 2, através dos diversos métodos de cultivo de Kluyveromyces marxianus CCA 510 a 30 °C, 250 rpm e 72 horas.

[041] Exemplo 4: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 4, de acordo com a reivindicação 8. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 231,8 mg/L, em uma produtividade 3,21 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 18,87 g/L em 72 horas de cultivo.

[042] Exemplo 5: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 5, de acordo com a reivindicação 9. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 414,0 mg/L, em uma produtividade 7,66 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 7,58 g/L em 72 horas de cultivo.

[043] Exemplo 6: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 6, de acordo com a reivindicação 10. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 303,2 mg/L, em uma produtividade 6,31 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 7,48 g/L em 72 horas de cultivo.

[044] Os Exemplos 4,5 e 6, anteriormente descritos, demonstram o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, e são caracterizados pela similaridade da utilização do o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brasil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, com temperatura mantida a 30 °C e com agitação mantida a 250 rpm. Os três exemplos apresentam diferenças nas condições de suprimentos de ar. No Exemplo 4 utilizou-se suprimento de ar de 0,5 L/min, no Exemplo 5 utilizou-se suprimento de ar de 2,0 L/min, no Exemplo 6 utilizou-se suprimento de ar de 3,0 L/min. A tabela 2 sumariza os resultados obtidos para estes exemplos. TABELA 2: Produção de 2-feniletanol utilizando suco de caju in natura como substrato líquido, preparado conforme reivindicação 3, através dos diversos métodos de cultivo de Kluyveromyces marxianus CCA 510 a 30 °C, 250 rpm e 72 horas.

[045] Exemplo 7: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 7, de acordo com a reivindicação 11. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 394,3 mg/L, em uma produtividade 8,21 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 4,8 g/L em 72 horas de cultivo.

[046] Exemplo 8: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 8, de acordo com a reivindicação 12. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 1041,1 mg/L, em uma produtividade 43,4 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 5,8 g/L em 72 horas de cultivo.

[047] Exemplo 9: Este exemplo demonstra o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso do método de cultivo microbiano 9, de acordo com a reivindicação 13. A adoção deste método proporcionou a concentração final de 636,8 mg/L, em uma produtividade 26,5 mg/L.h de 2-Feniletanol quando o crescimento celular de Kluyveromyces marxianus CCA 510 atingiu a concentração de 1,3 g/L em 72 horas de cultivo.

[048] Os Exemplos 7,8 e 9, anteriormente descritos, demonstram o Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol de acordo com a reivindicação 1, e são caracterizados pela similaridade da utilização do o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brasil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, com suprimento de ar de 2,0 L/min e com agitação mantida a 250 rpm. Os três exemplos apresentam diferenças nas condições temperatura do cultivo. No Exemplo 7 utilizou-se a temperatura de 25 °C, no Exemplo 8 utilizou-se a temperatura de 35 °C e no Exemplo 9 utilizou-se a temperatura de 45°C. A tabela 3 sumariza os resultados obtidos para estes exemplos. TABELA 3: Produção de 2-feniletanol utilizando suco de caju in natura como substrato líquido, preparado conforme reivindicação 3, através dos diversos métodos de cultivo de Kluyveromyces marxianus CCA 510 com suprimento de ar de 2,0 L/ min, agitação de 250 rpm e em 72 horas.

Claims (13)

1. 01. Processo de produção biotecnológica do álcool superior aromático 2-Feniletanol, substância caracterizada por ser o aroma característico de Rosas, através do cultivo de microrganismos da espécie Kluyveromyces marxianus CCA 510 em substrato líquido preparado a partir do suco extraído do caju (Anacardium occidentale L.).
2. 02. Preparo do substrato líquido 1 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser constituído de suco extraído do pedúnculo in natura de caju (Anacardium occidentale L.), cuja característica composicional típica é de 45-48 gramas de Glicose para cada litro de suco, 40-44 gramas de Frutose para cada litro de suco, acidez média entre 0,30-0,35 gramas de Ácido Cítrico para cada 100 gramas de suco com pH entre 3,8-4,5.
3. 03. Preparo do substrato líquido 2 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser constituído de suco extraído do pedúnculo in natura de caju (Anacardium occidentale L.), cuja característica composicional típica é de 45-48 gramas de Glicose para cada litro de suco, 40-44 gramas de Frutose para cada litro de suco, acidez média entre 0,30-0,35 gramas de Ácido Cítrico para cada 100 gramas de suco com pH entre 3,8-4,5, suplementado com 3,0 gramas de L-Fenilalanina para cada litro de suco extraído.
4. 04. Método de preparo do inóculo microbiano utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter células de Kluyveromyces marxianus CCA 510, originalmente mantidas em placas Petri contendo meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose), constituído de 2 g/L de glicose, 0,5 g/L de extrato de levedura, 0,5 g/L de peptona, 0,1 g/L, e estocadas a o -4 °C, dispersas em meio líquido sintético composto de 0,5 g/L de peptona, 30 g/L de glicose, 15 g/L de extrato de levedura, 12 g/L de ácido cítrico, 0,6 g/L de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O), 24 g/L de fosfato de sódio monohidratado (Na2HPO4.H2O), preparado com a transferência de três alçadas de colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510 contidas nas placas de Petri, previamente submetidas à ativação por 54 horas a 30 °C em estufa microbiológica, para um volume de 100 mL do meio sintético descrito, acondicionado em frascos de Erlenmeyer que posteriormente foram levados à agitação de mínimo cisalhamento (agitador recíproco) por 24 h a 30 °C e agitação de 180 rpm.
5. 05. Método de cultivo microbiano 1 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 1, de acordo com a reivindicação 2, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brasil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 0,5 L/min e de controle de temperatura (mantida a 30 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
6. 06. Método de cultivo microbiano 2 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 1, de acordo com a reivindicação 2, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brasil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 2,0 L/min e de controle de temperatura (mantida a 30 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
7. 07. Método de cultivo microbiano 3 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 1, de acordo com a reivindicação 2, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brazil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 3,0 L/min e de controle de temperatura (mantida a 30 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
8. 08. Método de cultivo microbiano 4 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brazil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 0,5 L/min e de controle de temperatura (mantida a 30 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
9. 09. Método de cultivo microbiano 5 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brazil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 2,0 L/min e de controle de temperatura (mantida a 30 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
10. 10. Método de cultivo microbiano 6 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brazil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 3,0 L/min e de controle de temperatura (mantida a 30 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
11. 11. Método de cultivo microbiano 7 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brazil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 2,0 L/min e de controle de temperatura (mantida a 25 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
12. 12. Método de cultivo microbiano 8 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brazil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 2,0 L/min e de controle de temperatura (mantida a 35 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).
13. 13. Método de cultivo microbiano 9 utilizado no processo de produção biotecnológica de 2-Feniletanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter o substrato líquido 2, de acordo com a reivindicação 3, com pH ajustado para 7,0, 100 mL de inóculo contendo colônias de Kluyveromyces marxianus CCA 510, preparado de acordo com a reivindicação 4, e ser conduzido em biorreator de bancada comercial de modelo Tec-Bio/Model 1.5-1L (Tecnal, SP, Brazil) com um volume de líquido equivalente à 750 ml, provido de alimentação de ar na vazão de 2,0 L/min e de controle de temperatura (mantida a 45 °C), assim como de agitação (mantida a 250 rpm).