BR102017021294A2

BR102017021294A2 - Processo de obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados, carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR102017021294A2
Application number: BR102017021294-7A
Authority: BR
Inventors: Nadia Araci Bou Chacra; Paulo Cesar Cotrim; Lis Marie Monteiro; Nikoletta Fotaki; Raimar Löbenberg
Original assignee: Universidade De São Paulo - Usp
Priority date: 2017-10-04
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2019-04-24
Also published as: WO2019068161A1

Abstract

processo de obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados, carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos e uso dos mesmos a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados compreendendo buparvaquona revestidos com polímeros catiônicos e aniônicos associados a um polipeptídeo através da tecnologia de homogeneização a alta pressão promovendo a interação eletrostática entre os seus componentes em meio aquoso. adicionalmente, a presente invenção refere-se aos referidos carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos, os quais compreendem de 0,5 a 50% p/v de fase oleosa; de 1 a 10% p/v de tensoativo; de 50 a 500000 ui/ml de um polipeptídeo; de 0,01 a 2% p/v de um polímero catiônico; de 0,04 a 5% p/v de um polímero aniônico; e água purificada q.s.p. permitindo, portanto, à liberação sítio-específica em macrófagos, possibilitando o desenvolvimento de medicamentos inovadores para o avanço do tratamento da leishmaniose.

Description

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PROCESSO DE OBTENÇÃO DE CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS, CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS

OBTIDOS E USO DOS MESMOS carreadores buparvaquona

Campo da invenção:

[001] A presente invenção se insere no campo de aplicação da ciência médica, mais especificamente, na área de preparações para finalidades médicas ou veterinárias, uma vez que se refere a um processo de obtenção de nanoestruturados compreendendo com polímeros catiônicos e aniônicos associados a um polipeptídeo, assim como os nanocarreadores obtidos visando à melhoria do tratamento da leishmaniose.

Estado da técnica:

lipídicos revestidos [002] As leishmanioses estão entre as principais doenças tropicais negligenciadas. Essas doenças são responsáveis pelo segundo maior número de mortes devido à infecção parasitária no mundo e são extremamente associadas à pobreza. Elas são predominantes em 98 países, em três dos cinco continentes. Cerca de 1,3 milhões de novos casos ocorrem anualmente e o número estimado de mortes por leishmaniose visceral varia entre 20.000 a 50.000 por ano.

[003] O tratamento clássico das leishmanioses requer a administração de medicamentos pouco tolerados e altamente tóxicos, uma vez que a localização intracelular dos parasitos da leishmaniose dificulta o acesso dos quimioterápicos ao local de ação, o que exige a administração de altas e repetidas doses de medicamentos, fator responsável pela sua elevada toxicidade. Os antimoniais pentavalentes, antimoniato de meglumina

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2/34 (Glucantime®) e estibogluconato de sódio (Pentostam®), são os compostos de primeira linha utilizados para tratar as leishmanioses.

[004] Outros compostos que podem ser utilizados incluem a pentamidina e anfotericina B. Contudo, a resistência do parasita reduz grandemente a eficácia desses medicamentos convencionais. A miltefosina é o único medicamento via oral para o tratamento da leishmaniose, entretanto, esse fármaco apresenta graves efeitos adversos tais como efeito teratogênico e distúrbios gastrointestinais. Nos últimos 15 anos, a prescrição inadequada desses medicamentos, assim como, a baixa adesão do paciente ao tratamento, tem causado o desenvolvimento de resistência generalizada a esses agentes. Tendo em vista esse cenário, a busca de novos fármacos e de novas formas de administração desses agentes quimioterápicos é urgente.

[005] Ao encontro das necessidades da terapia da

leishmaniose, otimização e	a presente avaliação	invenção propõe o de formulações	desenvolvimento,
inovadoras	de
carreadores	lipídicos	nanoestruturados	revestidos	com
polimixina B,	quitosana	e dextrana para	encapsulação	de
buparvaquona	visando	à melhoria do	tratamento	da
leishmaniose.

[006] Alguns documentos do estado da técnica descrevem formulações nanoestruturadas compreendendo buparvaquona, por exemplo, o documento IN02166MU2012A descreve um processo de preparação de nanopartículas sólidas (SLN) contendo buparvaquona por método de ultrassom. Diferentemente, a presente invenção propõe um processo de preparação de carreadores lipídicos

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3/34 nanoestruturados (CLN) compreendendo buparvaquona por homogeneização à alta pressão; e a funcionalização destas nanopartículas para a liberação sítio-específica do fármaco.

[007] Os CLN são considerados a segunda geração de nanopartículas lipídicas e são constituídos por partículas coloidais que apresentam matriz composta por mistura binária de lipídio sólido com lipídio líquido. Tal estrutura especial traz vantagens se comparado com as SLN, como maior eficiência de encapsulação, aumento da estabilidade física e redução do risco de liberação do fármaco durante a armazenagem. Além disso, a quantidade de fármaco pode ser aumentada pelo uso de lipídio líquido, o qual a buparvaquona se mostrou mais solúvel. Ainda, além de utilizar tecnologia mais avançada, a presente invenção descreve o revestimento das nanopartículas, incorporando um segundo fármaco (polimixina B) e moléculas que possibilitam a internalização e liberação do fármaco de modo seletivo em células fagocitárias. Adicionalmente, a mesma apresenta a performance dos CLN em parasitos de Leishmania infantum e sua segurança empregando testes de citotoxicidade.

[008] O documento US2003059470A1 descreve a preparação de emulsões convencionais, não nanoestruturadas, compreendendo buparvaquona. Tal como descrito anteriormente, os CLN são formados por uma mistura de lipídio sólido e lipídio líquido. Essa mistura proporciona propriedades inovadoras, tais como melhor estabilidade da formulação e maior eficiência de encapsulação. O documento US2003059470A1 ensina apenas emulsões convencionais preparadas somente com lipídio líquido que requerem grande

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4/34 quantidade de tensoativos. Nesse sentido, o documento americano difere da presente invenção por apresentar uma formulação na forma de emulsão que não apresenta qualquer nanoestrutura, a qual não possui ação sítio-específica que promove o efeito melhorado inesperado e a ação da buparvaquona intracelular, tal como proposta pelos CLNs da presente invenção.

[009] Já o documento BR102014023050A2 refere-se à obtenção de nanoestrutura lipídica empregando homogeneização à alta pressão e revestimento dessa nanoestrutura empregando polimixina B. Todavia, não há menção nesse documento do uso de polímeros catiônicos (quitosana) e aniônicos (dextran) associados à nanoestrutura revestida com o polipeptídeo (polimixina B). A associação do sulfato de dextrano à nanoestrutura, conforme proposto pela presente invenção, foi de fundamental importância para a internalização dessa, no macrófago.

[010] Portanto, a presente invenção proporciona o uso da buparvaquona por meio de nanocarreadores visando reduzir a toxicidade sistêmica apresentada por medicamentos presentes no mercado, o que facilitaria a aceitação deste medicamento pelos pacientes a serem tratados e pelo corpo clínico.

[011] Assim, a ação sítio específico dos CLN com buparvaquona propostos é atribuída ao revestimento por uma combinação de compostos quitosana, dextrana e sulfato de dextrano, os quais permitem o reconhecimento pelos receptores celulares dos referidos CLN que permite a ação sítio-específica que promove o efeito melhorado inesperado

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5/34 e a ação da buparvaquona intracelular.

[012] Portanto, entende-se que o efeito sinérgico entre a ação da poliximina B, sulfato de dextrano, quitosana e buparvaquona é o responsável por possibilitar o alcance do resultado inesperado da presente invenção.

Breve descrição da invenção:

[013] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados compreendendo buparvaquona revestidos com polímeros catiônicos e aniônicos associados a um polipeptídeo através da tecnologia de homogeneização à alta pressão promovendo a interação eletrostática entre os seus componentes em meio aquoso.

[014] Adicionalmente, a presente invenção referese aos referidos carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos, os quais compreendem de 0,5 a 50% p/v de fase oleosa; de 1 a 10% p/v de tensoativo; de 50 a 500000 UI/ml de um polipeptídeo; de 0,01 a 2% p/v de um polímero catiônico; de 0,04 a 5% p/v de um polímero aniônico; e água purificada q.s.p.

[015] Portanto, os carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos permitem à liberação sítioespecífica em macrófagos, possibilitando, desta maneira, o desenvolvimento de medicamentos inovadores para o avanço do tratamento da leishmaniose.

Breve descrição das figuras:

[016] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[017] A Figura 1 apresenta o diagrama das etapas

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6/34 (“g, “h, “i) do revestimento de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo buparvaquona (A) por polimixina B (B), quitosana (C) e sulfato de dextrana (D).

[018] A Figura 2 apresenta o fluxograma do processo de obtenção dos carreadores lipídicos nanoestruturados da presente invenção.

[019] A Figura 3 representa uma fotografia da formulação de carreador lipídico nanoestruturado para a encapsulação de buparvaquona, em que (A) refere-se à formulação antes e (B) refere-se a formulação após a homogeneização a alta pressão.

[020] A Figura 4 representa graficamente a validação do modelo matemático do diâmetro hidrodinâmico médio de partícula (DHM) de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona da formulação 1 (V1).

[021] A Figura 5 representa graficamente a validação do modelo matemático do diâmetro hidrodinâmico médio de partícula (DHM) de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona da formulação 2 (V2).

[022] A Figura 6 representa os gráficos de contorno no ensaio para avaliação do diâmetro hidrodinâmico médio de partícula (DHM) de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona.

[023] A Figura 7 representa graficamente a validação do modelo matemático do potencial zeta de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona revestidas de polimixina, quitosana e dextrana da formulação 1 (V1).

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7/34 [024] A Figura 8 representa graficamente a validação do modelo matemático do potencial zeta de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona revestidas de polimixina, quitosana e dextrana da formulação 2 (V2).

[025] A Figura 9 representa graficamente a dissolução média (DP) (n = 6) de buparvaquona livre (BPQ) (círculo negros) e carreadores lipídicos nanoestruturados com pancrelipase (triângulo cinza) e sem pancrelipase (círculo negro), contendo 4 mg de BPQ, utilizando tampão fosfato pH 7,4 0,05M, tween 80 0,07%, em que (A) representa a Formulação V1, e (B) representa a formulação V2.

[026] A Figura 10 representa graficamente a dissolução média (SD) (n = 6) da buparvaquona livre (BPQ) (círculos negros) contendo 4 mg de BPQ, utilizando meio tampão fosfato pH 7,4 0,05 M, dodecil sulfato 1% de sódio (p/v), em que (A) refere-se à formulação V1 (triângulo invertido cinza); e (B) refere-se à formulação V2 - média Z: 230,7 nm (diamante negro).

[027] A Figura 11 representa graficamente a atividade leishmanicida em amastigotas de L.infantum (n=3) da buparvaquona livre (BPQ) (círculo cinza claro, V1 (quadrado negro), V1 revestido com polimixina B, quitosana e dextrana aniônica (asterisco negro) relacionando a % viabilidade medida de morte celular das amastigotas de L.infantum, com a concentração da buparvaquona.

Descrição detalhada da invenção:

[028] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados compreendendo buparvaquona revestidos com polímeros

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8/34 catiônicos e aniônicos associados a um polipeptídeo.

[029] Desse modo, o referido processo compreende

as etapas	de:
a)	Preparar de 0,5 a 50% (p/v) de fase oleosa;
b)	Adicionar de 0,01 a 5% (p/v) de buparvaquona;
c)	Preparar a fase aquosa;
d)	Aquecer e misturar as fases oleosa e aquosa sob
agitação;
e)	Agitar a mistura das fases oleosa e aquosa
obtida;
f)	Homogeneizar à alta pressão;
g)	Resfriar em temperatura ambiente o carreador
obtido;
h)	Diluir o carreador obtido na etapa “g” com até

1:3 partes de água purificada;

i) Adicionar de 50	a 500.000	UI/mL	de um
polipeptídeo sob agitação;
j) Adicionar de 0,01	a 2,0% p/v	de um	polímero
catiônico sob agitação;
k) Adicionar de 0,04	a 5,0% p/v	de um	polímero

aniônico sob agitação; e

l) Realizar o envasamento.

[030] Na etapa “a”, para o preparo da fase oleosa misturam-se os lipídios líquidos e sólidos até a homogeneização dos mesmos. Assim, a referida fase oleosa compreende de 0,5 a 50% (p/v), preferencialmente de 5 a 15% (p/v), de uma proporção de 0,1 (10:1) a 10,0 (1:10) de lipídios líquidos e sólidos (LL/LS), respectivamente, preferencialmente de 0,5 (2:1) a 3 (1:3).

[031] Os lipídios líquidos são selecionados do

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9/34 grupo que consiste em triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico, monocaprilato de glicerila, óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de oliva, óleo de gergelim, óleo de algodão, óleo de soja, ácido oleico, preferencialmente triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico.

[032] Já os lipídios sólidos são selecionados do grupo que consiste em óleo de palma hidrogenado, mono, di e triglicerídeos de coco hidrogenados (Witepsol® E85), estearoil-macrogol-32-gliceridos (Gelucire® 50/13), distearato de glicerila (Precirol^® ATO 5), óleo de soja hidrogenado (Sterotex^® HM), triglicerídeos dos ácidos palmítico e esteárico (Dynasan® P60), behenato de glicerilo (Compritol^® 888), preferencialmente óleo de palma hidrogenado.

[033] Na etapa “b”, a buparvaquona é adicionada na fase oleosa obtida na etapa anterior, na concentração de 0,01 a 5%, preferencialmente 0,3% (p/v).

[034] A seguir, na etapa “c”, é preparada a fase aquosa, a qual compreende a mistura de água purificada q.s.p, e de 1 a 10% (p/v) de tensoativo, submetida à agitação magnética até completa homogeneização, preferencialmente de 2 a 4% (p/v).

[035] Os tensoativos são selecionados do grupo queconsiste em copolímeros de óxido de etileno e óxido

propileno	(poloxamer) 188, 407, 101, 105,	108,	122,	123,
124, 181,	182,	183, 184, 185, 212, 215, 217,	231,	234,	235,
237, 238,	282,	284, 288, 331, 333, 334, 335,	338,	401,	402,
403; estearato	de sorbitano, monooleato	de	sorbitano,
trioleato	de	sorbitano, triestearato	de	sorbitano,

polisorbato 80, polisorbato 60, preferencialmente poloxamer

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188.

[036] Na etapa “d”, a mistura das fases oleosa e aquosa é realizada à temperatura que varia de 45 a 85°C, preferencialmente 70°C, sob agitação que varia de 150 a 800 rpm, preferencialmente 500 rpm, durante 2 a 45 minutos, preferencialmente 10 minutos.

[037] A seguir na etapa “e”, é realizada a formação da pré-emulsão empregando um equipamento adequado, tal como um dispersor de alta performance, à rotação que varia de 500 a 14000 rpm, preferencialmente 8000 rpm, à temperatura que varia de 40 a 80 °C, preferencialmente 70°C, durante 2 a 45 minutos, preferencialmente 10 minutos.

[038] Na etapa “f”, a homogeneização a alta pressão é realizada por um a dez ciclos a 10⁶ a 10⁷ Pa, à temperatura que varia de 45 a 85°C, preferencialmente 70°C.

[039] Posteriormente, na etapa “g” é realizado o resfriamento em temperatura ambiente (20-25°C).

[040] A seguir, na etapa “h”, é realizada a diluição do carreador em até 1:3 partes de água purificada.

[041] A seguir, é realizada na etapa “i” a adição de 50 a 500000 UI/ml de um polipeptídeo, preferencialmente 1000 a 9000 UI/ml, ao carreador à temperatura que varia de 20 a 25°C, à homogeneização por agitação magnética que varia de 50 a 250 rpm, preferencialmente 100 rpm, a pH que varia de 3,5 a 9,0, preferencialmente entre 5,0 e 7,0, durante 50 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos.

[042] O referido polipeptídeo é preferencialmente a polimixina B, podendo ser substituída pela polimixina E (colistina).

[043] Posteriormente, é adicionado na etapa “j” de

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0,01 a 2% p/v de um polímero catiônico, preferencialmente entre 0,05 e 0,2%, à homogeneização por agitação magnética que varia de 50 a 1000 rpm, preferencialmente 100 rpm, a pH que varia de 3,5 a 9,0, à temperatura que varia de 20 a 25°C, durante 50 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos.

[044] O referido polímero catiônico é preferencialmente a quitosana, podendo esta variar entre baixo e médio peso molecular (50 a 200 kDa), com grau de desacetilação de no mínimo 75%.

[045] A seguir, é adicionado na etapa k de 0,04 a 5% p/v, preferencialmente de 0,4 a 0,55% p/v, de um polímero aniônico, à homogeneização por agitação magnética que varia de 50 a 150 rpm, preferencialmente 100 rpm, a pH que varia de 3,5 a 9,0, à temperatura que varia de 20 a 25°C, durante 50 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos.

[046] O referido polímero aniônico é preferencialmente o sulfato de dextrana, podendo ser substituído por D-manose-6-fosfato.

[047] A Figura 1 apresenta o diagrama das etapas (g, h, i) do revestimento de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo buparvaquona (A) por polimixina B (B), quitosana (C) e sulfato de dextrana (D).

[048] Por fim, na etapa l é realizado o envasamento da formulação obtida para posterior aplicação em veículos farmacêuticos.

[049] Vale ressaltar que, com o intuito de exemplificar a invenção, todos os processos foram realizados em recipientes adequados, tais como béqueres,

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12/34 balões volumétricos, erlenmeyers, tubos falcon e provetas. Todavia, é oportuno ressaltar que a presente invenção não é limitada pelos referidos exemplos, podendo ser utilizados outros equipamentos, utensílios e recipientes para reprodução em escala industrial.

[050]

Para melhor visualização,

Figura 2 apresenta o fluxograma do processo da presente invenção.

[051] Portanto, ao final do processo aqui descrito, obtêm-se carreadores lipídicos nanoestruturados compreendendo buparvaquona revestidos com polímeros catiônicos e aniônicos associados a um polipeptídeo, possibilitando o reconhecimento pelos seus receptores celulares que permitem a ação sítio-específica que promove o efeito melhorado inesperado e a ação da buparvaquona intracelular no tratamento da leishmaniose visceral e prevenção da reincidência da leishmaniose cutânea.

[052] Nesse sentido, adicionalmente, a presente invenção refere-se aos referidos carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos, os quais compreendem:

- de 0,5 a 50% p/v de fase oleosa;

- de 1 a 10% p/v de tensoativo;

- de 50 a 500000 UI/ml de um polipeptídeo;

- de 0,01 a 2% p/v de um polímero catiônico;

- de 0,04 a 5% p/v de um polímero aniônico; e

- água purificada q.s.p.

[053] A referida fase oleosa compreende de 0,5 a

50% (p/v) de uma proporção de 0,1 (1:10) a 10,0 (1:10) de lipídios líquidos e sólidos (LL/LS), respectivamente, preferencialmente de 0,5 (2:1) a 3 (1:3), e buparvaquona de 0,1 a 5,0%, preferencialmente 0,3% (p/v).

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13/34 [054] Os lipídios líquidos são selecionados do grupo que consiste em triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico, monocaprilato de glicerila, óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de oliva, óleo de gergelim, óleo de algodão, óleo de soja, ácido oleico, preferencialmente triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico.

[055] Já os lipídios sólidos são selecionados do grupo que consiste em óleo de palma hidrogenado, mono, di e triglicerídeos de coco hidrogenados (Witepsol® E85), estearoil-macrogol-32-gliceridos (Gelucire® 50/13), distearato de glicerila (Precirol^® ATO 5), óleo de soja hidrogenado (Sterotex^® HM), triglicerídeos dos ácidos palmítico e esteárico (Dynasan® P60), behenato de glicerilo (Compritol^® 888), preferencialmente óleo de palma hidrogenado.

[056] está em uma selecionado

Preferencialmente, concentração de 2 a do grupo que consiste referido tensoativo (p/v), e o mesmo é em copolímeros de óxido

de	etileno e	óxido	propileno	(poloxamer) 188,	407,	101,
105	, 108, 122,	123,	124,	181,	182, 183, 184, 185,	212,	215,
217	, 231, 234,	235,	237,	238,	282, 284, 288, 331,	333,	334,
335	, 338, 401,	402,	403;	estearato de sorbitan,	monooleato
de	sorbitan,	trioleato	de	sorbitan, triestearato	de

sorbitan, polisorbato 80, polisorbato 60, preferencialmente poloxamer 188.

[057] Preferencilamente, o referido polipeptídeo está em uma concentração de 1000 a 9000 UI/ml, o qual é preferencialmente a polimixina B, podendo ser substituída pela polimixina E (colistina).

[058] Preferencialmente, o referido polímero

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14/34 catiônico está em uma concentração entre 0,05 e 0,2%, o qual é preferencialmente a quitosana, podendo esta variar entre baixo e médio peso molecular (50 a 200 kDa), com grau de desacetilação de no mínimo 75%.

[059] Preferencialmente, o polímero aniônico está em uma concentração de 0,4 a 0,55% p/v, o qual é preferencialmente o sulfato de dextrana, podendo este ser substituído por D-manose-6-fosfato.

[060] Além disso, os referidos carreadores lipídicos nanoestruturados apresentam diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) que varia de 100 a 350 nm; potencial zeta (mV) menor que -10, preferencialmente menor que -20; e índice de polidispersividade menor que 0,3.

[061] Portanto, os referidos carreadores lipídicos nanoestruturados possuem características inovadoras que permitem a internalização das nanopartículas na membrana celular do macrófago através da ação direta da polimixina B, combinada com a interação dos polissacarídeos com receptores SIGN-R1. Assim, a administração dos referidos carreadores direcionada ao sistema linfático pode ser uma abordagem inovadora para o tratamento das leishmanioses.

[062] Nesse sentido, adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso dos carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos para o preparo de um medicamento para tratar a leishmaniose.

[063] Para avaliar o potencial dos carreadores lipídicos nanoestruturados da presente invenção, a seguir são apresentados os resultados dos testes realizados.

Testes Realizados:

- Exemplo da invenção:

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15/34 [064] O óleo de palma hidrogenado (Softisan® 154) foi escolhido para o preparo da nanopartículas, uma vez que a buparvaquona (BPQ) apresentou maior solubilidade nesse lipídio e porque seu ponto de fusão varia de 53-58°C, característica que possibilita a adição de maior quantidade de lipídio líquido ao lipídio sólido mantendo a característica sólida da mistura.

[065] Na avaliação da solubilidade da BPQ em lipídios líquidos, os triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico (Miglyol® 182) se mostraram como lipídio que melhor solubiliza a BPQ, esse lipídio é amplamente utilizado para formulações orais e tópicas, é resistente à oxidação e é sintetizado industrialmente e, portanto, foi escolhido como lipídio líquido para compor a formulações dos CLNs.

[066] A preparação dos carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona por homogeneização à alta pressão se revelou simples, rápida e sem intercorrências. Foi possível verificar que o fármaco foi encapsulado logo após o preparo; a Figura 3A, antes da homogeneização, mostra a coloração amarelada do fármaco. Essa cor característica não foi observada após o processo (Figura 3B). Assim, conclui-se que o fármaco permaneceu dentro da estrutura localizado encapsulado [067] lipídica, portanto,

A primeira etapa da preparação dos CLNs consistiu no aquecimento e agitação das fases oleosa e aquosa a 70 ± 5°C, a 500 ± 50 rpm por 10 minutos. A segunda etapa consistiu na formação da pré-emulsão empregando dispersor ultra-turrax a 8.000 rpm, por 10 minutos. A

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16/34 terceira e última etapa consiste na homogeneização a alta pressão, por cinco ciclos a 600 bar e 70 ± 5°C.

- Estudo fatorial para avaliação das variáveis significativas na preparação do carreador lipídico nanoestruturado para a encapsulação de buparvaquona:

[068] O estudo fatorial 2 foi aplicado no método de preparo dos carreadores lipídicos nanoestruturados para selecionar as concentrações de excipientes. As variáveis avaliadas foram: a proporção entre lipídio líquido e sólido (LL/LS) na faixa entre 0,5 (2:1) a 3,0 (1:3); a porcentagem de fase oleosa entre 5 a 15% (p/v) e a concentração de poloxamer entre 1 a 4% (p/v). A resposta aferida foi diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) e os resultados estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1 - Matriz de experimentos e valores de diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) na avaliação estatística da preparação de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona (BPQ).

Ordem Ensaio	LS/LL	LS (g)	LL (g)	Poloxamer (%)	% Fase oleosa	DHM (nm)
1	1,75	2,6	1,5	2,5	10	231,8
2	1,75	2,6	1,5	2,5	10	235,5
3	3,00	4,5	1,5	4,0	15	229,3
4	0,50	0,7	1,3	1,0	5	239,9
5	0,50	2,0	4,0	1,0	15	366,9
6	3,00	1,5	0,5	4,0	5	198,1
7	0,50	2,0	4,0	4,0	15	208,3
8	3,00	4,5	1,5	1,0	15	390,6
9	1,75	2,6	1,5	2,5	10	232,6
10	3,00	1,5	0,5	1,0	5	267,7
11	0,50	0,7	1,3	4,0	5	180,6

LS: lipídio sólido. LL: lipídio líquido. LS/LL: proporção de lipídio sólido e líquido [069] Pelos resultados da análise de variância (Tabela 2 e 3), o modelo matemático se mostrou adequado pela ausência de falta de ajuste (valor-p>0,05) e pelos

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2 2 valores de R , R ajustado e R de previsão do modelo ajustado, serem maiores que 80% e não variar bruscamente entre si, o que nos indica que os dados de DHM são bem descritos pelo modelo matemático e esse poderá ser utilizado para prever valores de DHM quando os fatores estudados são modificados, na ocasião da otimização/validação do modelo.

Tabela 2 - Análise de variância para testar a significância da regressão para os dados obtidos no ensaio para avaliação do diâmetro hidrodinâmico médio de partícula de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona.

Fonte	GL	CT (%)	SQ (aj)	MQ (aj)	Teste F	Valor-p
Modelo	4	96,37	42681,4	10670,4	39,80	0,000
Linear	3	86,08	38122,9	12707,6	47,40	0,000
LS/LL	1	2,28	1011,8	1011,8	3,77	0,100
Poloxamer	1	56,87	25188,9	25188,9	93,95	0,000
% Fase oleosa	1	26,92	11922,3	11922,3	44,47	0,001
Interação com 2 fatores	1	10,29	4558,5	4558,5	17,00	0,006
Poloxamer*%Fase oleosa	1	10,29	4558,5	4558,5	17,00	0,006
Erro	6	3,63	1608,6	268,1
Falta de ajuste	3	0,06	28,0	9,3	2,48	0,301
Erro puro	2	0,02	7,5	3,8
Total	10	100,00

GL: graus de liberdade; CT: contribuição; SQ seq: soma dos quadrados; SQ aj: soma dos quadrados ajustados; Teste F: estatística F; MQ (aj) : média quadrática ajustada. Valor-p: nível de significância.

[070] A Equação 1 que descreve a influência dos fatores no processo está apresentada abaixo. Com essa equação é possível calcular os valores de DHM a partir da variação das concentrações de poloxamer, fase oleosa e LS/LL.

Equação 1

DHM =173,8 +9,00 LS/LL-5,58 POL +15,68 FO -3,183

POL*FO em que:

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LS/LL: proporção de lipídio sólido e líquido;

POL: concentração de poloxamer (p/v); e

FO: concentração de fase oleosa (p/v).

- Otimização e validação do modelo matemático do preparo de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona:

[071] Para validação do modelo matemático, é necessário desafiá-lo com a preparação de pelo menos duas formulações calculadas a partir das variações nos fatores principais. Na presente invenção foram propostos dois exemplos de concretização: as formulações V1 e V2 que apresentam os parâmetros apresentados nas Figuras 6 e 7. Essas formulações apresentam as concentrações de excipientes otimizadas para a obtenção de DHM<300 nm.

[072] Na V1, a LS/LL foi otimizada para 0,5 (2:1); a concentração de poloxamer foi de 4% (p/p) e a concentração de fase oleosa foi de 5% (p/p). Com esses parâmetros, o modelo matemático forneceu o valor de DHM teórico de 170,7 nm com intervalo de confiança de 95% de 139,9 a 201,5 nm (Tabela 3). A Figura 4 apresenta o gráfico da formulação 1 (V1) de validação do modelo matemático do diâmetro hidrodinâmico médio de partícula (DHM) de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona.

[073] Para V2, o parâmetro modificado foi a concentração de poloxamer de 2% (p/p). O modelo forneceu o valor de DHM teórico de 213,7 nm com intervalo de confiança de 189,4 a 238,0 nm (Tabela 3). A Figura 5 apresenta o gráfico da formulação 2 (V2) de validação do modelo matemático do diâmetro hidrodinâmico médio de partícula

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19/34 (DHM) de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona.

[074] Os valores de DHM práticos estão apresentados na Tabela 4, é possível verificar que ambas as formulações estão dentro do intervalo de confiança e, portanto, o modelo matemático de DHM para esse processo/produto está validado.

Tabela 3 - Validação do modelo matemático do diâmetro hidrodinâmico médio de partícula do processo de produção de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona.

	DHM Prático (nm)	DHM Teórico (nm)	IC 95% para DHM (nm)	Modelo validado
V1	186,0	175,7	139,9 a 201,5	Sim
V2	205,5	213,7	189,4 a 238,0	Sim

[075] Portanto, para a obtenção dos CLNs, as concentrações dos materiais deverão estar entre as faixas estudadas. Para a proporção entre lipídio líquido e sólido (LL/LS) a faixa deverá ser de 0,5 (2:1) a 3 (1:3) . Para a porcentagem de fase oleosa, a faixa deverá ser entre 5 a 15% (p/v). Para a concentração de poloxamer, essa deverá permanecer entre 1 e 4% (p/v), conforme anteriormente descrito.

[076] carreadores buparvaquona dextrana é componentes.

A base teórica do revestimento dos lipídicos nanoestruturados contendo por polimixina B, quitosana e sulfato de a interação eletrostática entre esses [077] Os carreadores apresentam cargas negativas (potencial zeta de aproximadamente -15 mV) que interagem eletrostaticamente com as cargas positivas da polimixina B

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20/34 (PM: 1301,6 g/mol). Portanto, a primeira etapa do revestimento é a adição de solução de polimixina B ao carreador, a fim de depositar o fármaco na superfície, mas evitar a neutralização total das cargas negativas do carreador. A quitosana (PM: 50000-150000 g/mol, 75-90% de desacetilação), por sua vez, apresenta cargas positivas, que interagem com as cargas negativas líquidas da primeira etapa, invertendo o potencial zeta para positivo.

[078] A terceira etapa é semelhante à descrita na literatura, refere-se à preparação de partículas formadas com núcleo de quitosana e revestidas por dextrana. Devido à carga líquida positiva dos carreadores, o sulfato de dextrana (PM~40,000 g/mol), de carga negativa, pode ser depositado na superfície do carreador lipídico nanoestruturado.

[079] O processo de revestimento foi iniciado com a preparação de soluções estoque de polimixina B: 100.000 UI/ml, quitosana: 2% (m/v) e dextrana sulfato 2% (m/v) e a diluição de uma parte do carreador nanoestruturado para três partes de água purificada.

[080] A primeira etapa consiste da adição da solução de polimixina B ao carreador diluído, a homogeneização foi realizada por agitação magnética a 100 rpm por 1 hora. Na segunda etapa, é acrescentada a quitosana e mantida a agitação por mais uma hora. Na terceira e última etapa, a dextrana sulfato é acrescentado e, o sistema é mantido por mais uma hora a 100 rpm. Após cada etapa, uma pequena alíquota é retirada para a verificação do potencial zeta como controle do processo. O processo de revestimento foi realizado nas seguintes

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21/34 condições: pH 5,0 - 7,0, temperatura 25°C.

- Estudo fatorial para avaliação das variáveis significativas no revestimento do carreador lípidíco nanoestruturado para a encapsulação de buparvaquona:

[081] O estudo fatorial de Plackett-Burman foi aplicado no método de revestimento dos carreadores lipídicos nanoestruturados, as variáveis avaliadas foram: as concentrações de polimixina, quitosana e dextrana. A resposta aferida foi o potencial zeta. Na Tabela 4 está apresentada a matriz de experimentos e os resultados de potencial zeta. Foi possível observar que em concentrações de 0,35% (p/v) de quitosana e 9.000 UI/ml de polimixina, o sistema apresentou agregação, o que indica que concentrações menores de quitosana devem ser utilizadas para comportar maior quantidade de polimixina.

Tabela 4 - Matriz de experimentos e valores de potencial zeta (PZ) do estudo fatorial da preparação de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona, revestidos de polimixina (POL), quitosana

QUI) e dextrana (DEX).

Ensaio	POL (UI/mL)	QUI (%) p/v	DEX (%) p/v	PZ (mV)	Obs.
1	1000	0,05	0,55	-18,3
2	9000	0,35	0,05	30,2	Agregação
3	1000	0,05	0,05	-13,6
4	9000	0,05	0,05	0,63
5	1000	0,35	0,55	-21,1
6	5000	0,2	0,3	-15,5
7	9000	0,35	0,05	10,7
8	1000	0,05	0,05	-8,15
9	9000	0,05	0,55	-27,0
10	9000	0,35	0,55	-19,0	Agregação
11	9000	0,05	0,55	-26,9
12	1000	0,35	0,55	-23,5
13	5000	0,2	0,3	-16,2
14	5000	0,2	0,3	-16,9
15	1000	0,35	0,05	32,5

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22/34 [082] De acordo com a Tabela 5, os fatores principais são a concentração de quitosana e dextrana, o valor-p para ambos os fatores é <0,05 e, portanto, são significantes para o potencial zeta, assim como, a interação entre eles. Nessa mesma tabela, pode-se verificar a não-significância da falta de ajuste (p>0,5). Assim, o modelo matemático é adequado, pois esse representa bem os dados coletados. A adequação do modelo pode ser corroborada pelos valores de r apresentados na Tabela 6. Os valores de

2 2 r², r² ajustado e r² de previsão estão acima de 80% e não há grande discrepância entre estes coeficientes.

Tabela 5 - Análise de variância para testar a significância da regressão para os dados obtidos no ensaio para a avaliação do potencial zeta de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona revestidos de polimixina, quitosana e dextrana.

Fonte	GL	SQ (aj)	MQ (aj)	Teste F	Valor-p
Modelo	4	2958,32	739,58	62,09	0,000
Linear	3	2711,79	903,93	75,89	0,000
Polimixina	1	8,07	8,07	0,68	0,430
Quitosana	1	645,19	645,19	54,16	0,000
Dextrana	1	2058,53	2058,53	172,82	0,000
Interação com 2 fatores	1	191,99	191,99	16,12	0,002
Quitosana*Dextrana	1	191,99	191,99	16,12	0,002
Erro	10	119,12	11,91
Falta de ajuste	3	8,20	2,73	0,38	0,774
Erro puro	6	43,57	7,26
Total	14	3077,43

GL: graus de liberdade; SQ seq: soma dos quadrados; SQ aj: soma dos quadrados ajustados; Teste F: estatística F; MQ (aj): média quadrática ajustada. Valor-p: nível de significância.

Tabela 6 - Teste para significância dos coeficientes codificados de regressão e índices de ajuste do modelo selecionado no ensaio de potencial zeta de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona revestidos de polimixina, quitosana e dextrana.

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Termos	Coeficientes	Estatística T	Valor-p
Constante	-11,962	-13,42	0,000
Polimixina	0,87	0,82	0,430
Quitosana	7,332	7,36	0,000
Dextrana	-13,097	-13,15	0,000
Quitosana*Dextrana	-4,24	-4,01	0,002
DP: 3,45133	R²: 96,13%	R² (aj): 94,58%	R² (prev): 92,04%

Índices de ajuste do modelo: R²: coeficiente de determinação; R² (aj): coeficiente de determinação ajustado; R² (prev): coeficiente de determinação de previsão do modelo ajustado; DP = desvio-padrão; Valor-p: nível de significância C- DP: coeficientes de desvio padrão.

[083] Outra contribuição importante apresentada na

Tabela 6 efere-se à interação entre a quitosana e a dextrana. Essa interação contribui para a redução do potencial zeta (coeficiente negativo -4,24). Tal resultado revela como a aplicação de estudo fatorial é ferramenta necessária para descrever, e entender um processo ou produto e, até mesmo dar embasamento teórico tendo em vista a melhoramento contínuo desses.

[084] A Equação 2 apresenta o modelo matemático que descreve o processo de revestimento do carreador lipídico nanoestruturado para encapsulação de buparvaquona. Essa equação foi utilizada para a otimização desse processo de maneira a reduzir o potencial zeta até aproximadamente 30 mV. Essas formulações com potencial zeta reduzido possuem cargas necessárias para que haja repulsão entre partículas, fato que contribui para a estabilidade a longo prazo dos carreadores revestidos.

Equação 2:

PZ (mv)=-7,02+0,000826 POL +40,10 QUI-56,86 DEX - 113,1

QUI*DEX em que:

PZ: potencial zeta em mV (milivolts);

POL: concentração de polimixina B em UI/mL;

QUI: concentração de quitosana em % (p/v); e

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DEX: concentração de dextrana em % (p/v).

[085] A Figura 6 apresenta o comportamento do potencial zeta para cada par de fatores. Os gráficos mostram que a concentração de quitosana deverá ser inferior a 0,2% p/v e a de dextrana deverá ser acima de 0,4% p/v para que formulações de potencial zeta menores que -20 mV possam ser alcançadas. Portanto, no preparo de CLNs revestidos, as concentrações deverão ser as seguintes, conforme anteriormente descrito: polimixina B entre 1.000 e 9.000 UI/ml, quitosana entre 0,05 e 0,2% (p/v) e dextran entre 0,4 a 0,55% (p/v).

Tabela 7 - Validação do modelo matemático do potencial zeta (PZ) do processo de produção de carreadores lipídicos nanoestruturados para a encapsulação de buparvaquona revestidos com polimixina, quitosana e dextrana.

Formulação	PZ (mV)	IC 95%
V1	-32,8	-29,02 (-34,37 a -23,67)
V2	-21,0	-24,46 (-28,33 a -20,58)

- Otimização e validação do modelo matemático do revestimento do carreador lipídico nanoestruturado para a encapsulação de buparvaquona:

[086] As Figuras 7 e 8 apresentam, respectivamente, as formulações V1 e V2 para a validação do modelo matemático no processo de revestimento de carreadores lipídicos nanoestruturados com polimixina B, quitosana e dextrana. As referidas concentrações referem-se às formulações otimizadas. A concentração reduzida de quitosana na V2 reflete potencial zeta calculado menor que a V1. As concentrações de dextrana foram mantidas no limite superior do modelo para a obtenção de carreadores com menor potencial zeta possível. A Tabela 7 mostra os resultados

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25/34 práticos e teóricos das formulações da validação. Em ambas as formulações, o valor obtido esteve dentro do previsto (intervalo de confiança de 95%). Portanto, o modelo matemático está validado e poderá ser utilizado para prever valores de potencial zeta de acordo com as modificações nos fatores principais desejadas.

- Determinação da eficiência de encapsulação da buparvaquona em carreadores lipídicos nanoestruturados:

[087] A eficiência de encapsulação foi calculada subtraindo a quantidade de fármaco no sobrenadante da concentração total do fármaco na amostra. Foram testadas duas amostras sem revestimento e os resultados estão sumarizados na Tabela 8 e mostram que a eficiência de encapsulação foi satisfatória porque apresenta valores próximos de 100%.

Tabela 8 - Teste de eficiência de encapsulação de buparvaquona em carreador lipídico nanoestruturado por cromatografia líquida de alta eficiência.

	Concentração total (pg/mL)	Concentração sobrenadante (pg/mL)	Eficiência de encapsulação
Am 1	565,01	0,77	99,86%
Am 2	500,7	de detecção	100%
Média	532,855	0,39	99,93%

- Avaliação da citotoxicidade do carreador lipídico nanoestruturado contendo buparvaquona revestidos de polimixina B, quitosana e dextrana:

[088] A avaliação da citotoxicidade foi realizada em dois tipos celulares, THP-1 e macrófagos de peritônio de camundongo. O primeiro tipo celular foi cultivado em meio RPMI 1640 e tratado com PMA (acetato de forbol miristato) 10nM por 24 horas, para diferenciação de monócitos para macrófagos humanos. Em ambos os testes, 2x 10 células

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26/34 foram incubadas por 24h a 37°C com a formulação final V1. As concentrações utilizadas foram de 0,88; 1,75; 3,5; 7,0; e 14,00 μΜ de buparvaquona.

[089] Os resultados de sobrevivência celular estão apresentados nas Tabelas 9 e 10, o que evidencia a baixa toxicidade ín vitro desses carreadores por não apresentar média ou amostra com sobrevivência abaixo de 70%. Logo, esses carreadores revestidos poderão ser utilizados de forma segura em testes de atividade leishmanicida ín vitro e ín vivo futuros.

Tabela 9 - Teste de citotoxicidade de carreador lipídico nanoestruturado contendo buparvaquona (BPQ) e revestidos de polimixina, quitosana e dextrana em células THP-1, ativadas por PMA (24 h, 37°C).

Concentração BPQ	0,88 μΜ	1,75 μΜ	3,50 μΜ	7,00 μΜ	14,00 μΜ
Am1	102,10	100,23	100,87	99,76	92,17
Am2	99,20	103,59	92,45	103,59	104,84
Am3	99,80	101,50	87,98	102,10	98,75
Am4	84,49	101,83	79,10	89,20	80,10
Am5	93,40	96,18	86,12	80,10	78,25
Am6	70,63	99,18	66,60	81,30	77,73
Média	91,60	100,42	85,52	92,67	88,64
DPR	1,32	0,25	1,37	1,14	1,31

Tabela 10 - Teste de citotoxicidade de carreador lipídico nanoestruturado contendo buparvaquona (BPQ) e revestidos de polimixina, quitosana e dextrana em macrófagos peritoneais de camundongo (24 h, 37°C).

Concentração BPQ	0,88 μΜ	1,75 μΜ	3,50 μΜ	7,00 μΜ	14,00 μΜ
Am1	75,74	98,02	82,89	98,02	94,46
Am2	85,06	96,26	94,98	96,26	84,27
Am3	98,95	88,95	91,50	88,95	103,67
Am4	95,30	81,30	90,20	88,43	99,90
Am5	81,70	101,10	99,20	99,21	101,20
Am6	99,00	98,20	89,90	91,20	99,80
Média	89,29	93,97	91,45	93,68	97,22

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27/34

DPR

1,10

0,79

0,60

0,51

0,72

- Avaliação da solubilidade dos carreadores lipídicos nanoestruturados contendo buparvaquona (BPQ):

[090] A Tabela 11A mostra a solubilidade das CLNs sem revestimento. As nanopartículas revestidas deverão ser empregadas em formulações injetáveis. Todas as formulações apresentaram maior solubilidade em água quando comparado ao fármaco livre. Em geral, quanto menor o DHM, maior a solubilidade. A formulação V1, que tem o menor DHM (170,4 nm), mostrou solubilidade de 611 vezes maior quando comparado ao fármaco livre, no fluido corporal simulado. Mesmo na presença de elevada concentração de dodecil sulfato de sódio (1% p/v) pH 7,4, a solubilidade foi 3,2 vezes superior.

[091] O tampão fosfato pH 7,4 com 1% (p/v) de dodecilsulfato de sódio foi testado para simular o estado alimentado e o tampão fosfato pH 7,4 com Tween 80 0,07% p/v para simular a liberação da BPQ em jejum. Uma vez que o fármaco BPQ mostrou solubilidade semelhante nesses meios (Tabela 11).

Tabela 11A - Média da solubilidade (SD) (n=3) da buparvaquona livre e dos carreadores lipídicos nanoestruturados contendo buparvaquona.

Solubilidade (pg/ml)	BPQ	V1	V2
Fluido gástrico simulados pH 1,2	0,05 (0,01)	3,57 (1,72)	3,64 (2,20)
Tampão fosfato 0,05 M pH 4,5	0,06 (0,04)	3,30 (0,98)	2,78 (0,90)
Tampão fosfato 0,05 M pH 6,8	0,08 (0,02)	2,82 (1,41)	2,77 (3,05)
Tampão fosfato 0,05 M pH 7,4	0,19 (0,10)	12,62 (1,52)	2,16 (0,65)
Fluido intestinal simulado	12,53	24,98	25,56
alimentado pH 5,0	(1,85)	(2,04)	(1,12)
Fluido intestinal simulado jejum pH 4,0	3,39 (0,24)	26, 30 (2,66)	2,28 (0,85)

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28/34

Fluido corporal simulado	0,02 (0,01)	12,22 (6,53)	15,32 (22,36)
Tampão fosfato 0,05 M	11,68	37,74	17,08
dodecilsulfato de sódio1% (p/v)	(0,78)	(10,66)	(4,5)
Tampão fosfato 0,05 M pH 7,4	3,39	15,31	9,19
Tween 80 0,07%	(0,30)	(7,05)	(2,02)

[092] Adicionalmente, foram avaliadas a estabilidade das formulações V1 e V2 sem revestimento ao processo de esterilização por via úmida, 121°C por 30 minutos. Os valores descritos nas Tabelas 11B e 11C mostram que o DHM e a polidispersividade em ambas formulações não variaram consideravelmente, indicando a adequabilidade do processo para a esterilização das formulações.

Tabela 11B - Teste esterilização por via úmida de V1.

V1	Inicial	Após esterilização
Diâmetro	172,6	173,9
hidrodinâmico	(176,1, 170,3, 171,4)	(175,4, 173,4, 173,0)
médio (nm)
Polidispersividade	0,142	0,161
	(0,140, 0,139, 0,148)	(0,144 - 0,172 - 0,168)

Tabela 11C - Teste esterilização por via úmida de V2.

V2	Inicial	Após esterilização
Diâmetro	226, 6	233,2
hidrodinâmico	(229,7 - 226,4 - 223,7)	(238,3 - 232,3 - 229,1)
médio (nm)
Polidispersividade	0,172	0,128
	(0,166 - 0,150 - 0,201)	(0,061 - 0,146 - 0,176)

- Perfis de dissolução dos carreadores lipídicos nanoestruturados contendo buparvaquona (BPQ):

[093] A Tabela 12 mostra os valores de dissolução de BPQ livre em tampão fosfato pH 7,4 0, 05M com Tween 80

0,07% p/v. Mesmo após quatro horas, apenas 2,89% de 4 mg de fármaco livre foi dissolvido. Tal resultado revelou que o fármaco não atingiu o valor de solubilidade (3,39 pg/ml) nesse meio. Durante o desenvolvimento do método de dissolução, a pancrelipase foi testada para simular a degradação das nanopartículas a partir de lipases intestinais.

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29/34 [094] A Figura 9 apresenta os perfis de dissolução em tampão fosfato pH 7,4 0, 05 M com tween 80 0, 07% das formulações V1 e V2. A Tabela 13 e a Tabela 14 mostram os valores médios de dissolução. V1, no ensaio sem pancrelipase, liberou 65, 43% da dose de 4 mg após 90 minutos. Com a utilização da enzima, a dissolução atingiu 77,34%. A formulação V2 teve comportamento similar, mas o aumento da dissolução foi mais proeminente com pancrelipase. Nesse meio, após 60 minutos, dissolveu-se 81,25% da dose de 4 mg.

Tabela 12 - Perfil de dissolução de buparvaquona livre (BPQ) usando aparelho de pás USP, 900 mL de tampão fosfato pH 7,4 com Tween 80 0,07%, 50 rpm, 37 °C.

Tempo (min)	Amostra 1 (%)	Amostra 2 (%)	Amostra 3 (%)	Amostra 4 (%)	Amostra 5 (%)	Amostra 6 (%)	Média (%)
15	0,00	0,50	0,00	0,00	0,00	0,10	0,10
30	0,34	0,40	0,00	0,00	0,36	0,00	0,18
45	0,00	0,60	0,08	0,00	0,30	0,10	0,18
60	0,00	0,66	0,65	0,00	0,67	0,57	0,43
90	0,62	1,38	0,70	0,80	0,60	1,10	0,87
120	1,43	1,64	1,84	1,55	1,67	1,78	1,65
180	1,53	2,1	2,33	2,45	1,6	1,9	1,99
240	2,24	3,09	3,48	2,56	2,98	3,01	2,89

Tabela 13 - Dissolução média (DP) (n= 6) da formulação V1 com e sem pancrelipase, contendo 4 mg de BPQ, em meio tampão fosfato 0,05M pH 7,4, tween 80 0,07 %.

Tempo (min)	Dissolução (%)	(DP)	Dissolução (%) com pancrelipase	(DP)
5	66, 34	2,04	48,98	10,09
15	56, 09	10,02	58,56	3,32
30	67,93	4,41	83,29	6, 42
60	58,66	6,21	75,15	9,82
90	65,43	4,31	77,34	7,61

Tabela 14 - Dissolução média (SD) (n= 6) da formulação V2 com e sem pancrelipase, contendo 4 mg de BPQ, em meio tampão fosfato pH 7,4 0,05M, tween 80 0,07 %.

Tempo (min)

Dissolução (%)

(DP)

Dissolução (%) com pancrelipase

(DP)

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5	39,78	15,11	70,37	26, 99
8	35,04	19,20	72,23	19,30
12	38,31	3,03	78,14	14,12
15	49,72	18,33	78,11	8,62
30	50,21	16, 10	82,30	2,41
60	39,07	10,00	81,25	6, 55

[095] A Tabela 15 mostra a dissolução de 4 mg de BPQ livre em tampão fosfato a pH 7,4 0, 05M com dodecilsulfato de sódio 1% (p/v). Embora a concentração do tensoativo tenha aumentado quando comparada ao método anterior (tween 80 0,07%), o fármaco livre não se dissolveu nesse meio. Isso pode ser explicado pela precipitação de BPQ devido à interação com o sal de sódio, que pode ocorrer in vivo. Portanto os sais biliares, como o taurocolato de sódio, podem precipitar o fármaco no sistema gastrointestinal.

Tabela 15 - Dissolução de buparvaquona livre (BPQ) (4 mg) em meio tampão fosfato pH 7,4 com dodecilsulfato de sódio 1% (p/v).

Tempo (min)	Amostra 1 (%)	Amostra 2 (%)	Amostra 3 (%)	Amostra 4 (%)	Amostra 5 (%)	Amostra 6 (%)
2	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
10	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
20	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
30	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
45	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
60	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0

[096] A Figura 10 e a Tabela 16 mostram os perfis

de	dissolução das	formulações V1	e V2 em tampão fosfato a
pH	7,4	0,05 M com	dodecilsulfato	de	sódio 1% (p/v). Para
V1,	a	dissolução	atingiu 83,71%	aos	5 minutos do teste,
embora	se tenha	observado alguma	precipitação aos 20

minutos, a dissolução foi de 75,12%. A extensão da precipitação e a variação entre as amostras (DP) foram minimizadas quando comparadas aos perfis do meio Tween 80.

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Para V2, a dissolução atingiu 79, 84% da dose de 4 mg após 60 minutos. Tal como se verificou em V1, a precipitação e o desvio padrão foram reduzidos.

Tabela 16 - Dissolução média (SD) (n = 6) de buparvaquona livre (4 mg) (círculo negro) e carreadores lipídicos nanoestruturados em meio tampão fosfato pH 7,4 0,05 M e dodecilsulfato de sódio 1% (p/v), (A) Formulação V1; (B) Formulação V2.

Tempo (min)	V1 dissolução (%)	(DP)	V2 dissolução (%)	(DP)
2	79,90	6,28	109,97	7,54
5	83,71	5,54	86,26	8,13
10	79,52	3,31	88,77	6, 17
20	75,12	1,61	83,41	2,38
30	78,99	3,91	81,42	5,63
45	76, 64	3,85	79,84	7,82
60	77,91	3,21	79,47	2,27

[097] A avaliação dos perfis de dissolução evidencia a importância do tensoativo para a liberação, dissolução e, portanto, absorção da BPQ. No caso de administração das CLNs por via oral, o fármaco não seria liberado até que as nanopartículas atingissem o duodeno, onde os sais biliares e a pancrelipase são secretados. Consequentemente, o fármaco poderia ser absorvido nos intestinos.

[098] Além disso, as formulações desenvolvidas podem constituir um sistema de liberação de fármacos dirigido ao sistema linfático. O fármaco pode atingir os vasos linfáticos devido ao tamanho pequeno das nanopartículas ou mesmo pelo fármaco dissolvido nos lipídios, os quais podem ser hidrolisados pela pancrelipase.

[099] A administração de fármacos direcionada ao sistema linfático pode ser uma abordagem inovadora para o

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32/34 tratamento das leishmanioses. Após a picada, os parasitas são disseminados através dos sistemas vascular e linfático, e infectam monócitos e macrófagos do sistema mononuclear. O baço, o fígado e os linfonodos são os órgãos mais afetados pela leishmaniose visceral. Desse modo, a absorção e a distribuição da BPQ através do sistema linfático, poderá aumentar a disponibilidade do fármaco no local de ação.

[100] Como resultado da absorção intestinal e distribuição dos CLNs pelo sistema linfático e circulação sistêmica, a BPQ poderá atingir o baço, o fígado e os gânglios linfáticos após administração oral. Tal característica não é possível empregando a formulação convencional veterinária ou o lipossoma. Consequentemente, os CLNs desenvolvidos têm aplicação potencial para o tratamento da leishmaniose visceral e prevenção da reincidência da leishmaniose cutânea.

- Avaliação da atividade leishmanicida de BPQ livre e BPQ-CLNs em macrófagos infectados por amastigotas de L.

Infantum [101] A Figura 11 mostra a atividade da formulação V1 com e sem revestimento contra amastigotas de L.infantum. A Tabela 17 mostra os valores de EC₅₀ para cada condição. Todos apresentaram atividade leishmanicida melhorada quando comparado ao BPQ livre. V1 mostrou EC₅₀ de 229, 0 nM, que representa aumento de 2,0 vezes. A formulação revestida apresentou aumento na EC50 (150,5 nM) 3,0 vezes comparadas com a BPQ livre (456,5 nM). Essa diferença pode ser explicada pela ação direta da polimixina B, combinada com a interação dos polissacarídeos com receptores SIGN-R1 da membrana celular do macrófago, o que favoreceria a

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33/34 internalização das nanopartículas.

Tabela 17 - Atividade leishmanicida em amastigotas de

L.infantum (n = 3) da buparvaquona livre (BPQ), formulação V1 e V1 revestido com polimixina B, quitosana e dextrana aniônica.

	Buparvaquona	Formulação V1	Revestimento
EC50 (nM)	456, 5	229,0	150,5
EC₅₀ (nM) (95% IC)	332,4 a 627,0	190,5 a 275,2	139,5 a 162,4

[102] O aumento da atividade leishmanicida dos testes in vitro dos CNLs mostram perspectiva sólida para sua aplicação parenteral in vivo. Na literatura é descrito que as proteínas séricas presentes nas interações de nanopartículas e macrófagos formam uma corona (opsonização) em torno da nanopartícula, tornando-as mais visíveis para o reconhecimento e internalização de macrófagos (endocitose).

[103] A endocitose é um processo de células eucarióticas, que consiste na internalização de substâncias extracelulares tipicamente pela invaginação das vesículas formadoras de membrana, conhecidas como fagosomas. Após a internalização, o lisossoma se funde com o fagosoma e liberta suas hidrolases para degradar o conteúdo em aminoácidos, ácidos graxos e glicose. Essa estrutura resultante é conhecida como fagolisossomo.

[104] Portanto, é possível desenvolver sistemas específicos de administração de fármacos para o tratamento de leishmanioses usando o mecanismo de endocitose. Os parasitas podem sobreviver e se multiplicar dentro dos fagolisossomos. No entanto, as nanopartículas também terminam em fagolisossomos. Assim, o fármaco encapsulado

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34/34 pode ser liberado pela degradação da nanopartícula e atingir o parasita.

[105] Uma vez que o método in vitro não apresenta a totalidade dos compartimentos de um organismo, a internalização das nanopartículas pode ser reforçada pela opsonização e, portanto, os CNLs desenvolvidos poderão apresentar atividade leishmanicida ainda mais pronunciada.

[106] Devido aos resultados da presente invenção, os CLNs desenvolvidos têm potencial aplicação para melhorar a eficácia do fármaco, reduzir a toxicidade do tratamento e melhorar a adesão do paciente. Essas formulações podem ser utilizadas como medicamentos orais e parenterais para preencher as lacunas do tratamento convencional de leishmanioses. Como consequência, o custo pode ser minimizado pela redução da hospitalização para administração de medicamentos e monitoramento de efeitos colaterais.

[107] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

1/7

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

a) Preparar de 0,5 a 50% (p/v) de fase oleosa; b) Adicionar de 0,01 a 5% (p/v) de buparvaquona; c) Preparar a fase aquosa; d) Aquecer e misturar as fases oleosa e aquosa sob agitação; e) Agitar a mistura das fases oleosa e aquosa obtida; f) Homogeneizar a alta pressão; g) Resfriar em temperatura ambiente o carreador obtido; h) Diluir o carreador obtido na etapa g em até 1:3 partes de água purificada;

aniônico sob agitação; e

l) Realizar o envasamento.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa a, a fase oleosa compreender de 0,5 a 50% (p/v), preferencialmente de 5 a

15% (p/v), de uma proporção de 0,1 (10:1) a 10,0 (1:10) de lipídios líquidos e sólidos (LL/LS), respectivamente, preferencialmente de 0,5 (2:1) a 3 (1:3).

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2,

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2/7 caracterizado pelo fato de os lipídios líquidos serem selecionados do grupo que consiste em triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico, monocaprilato de glicerila, óleo de cartámo, óleo de milho, óleo de oliva, óleo de gergelim, óleo de algodão, óleo de soja, ácido oleico, preferencialmente triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de os lipídios sólidos serem selecionados do grupo que consiste em óleo de palma hidrogenado, mono, di e triglicerídeos de coco hidrogenados, estearoil-macrogol-32-gliceridos, distearato de glicerila, óleo de soja hidrogenado, triglicerídeos dos ácidos palmítico e esteárico, behenato de glicerilo, preferencialmente óleo de palma hidrogenado.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa b, a buparvaquona ser adicionada na fase oleosa obtida na etapa anterior, na concentração de 0,01 a 5%, preferencialmente 0,3% (p/v).

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa c, ser preparada a fase aquosa, a qual compreende a mistura de água purificada q.s.p, e de 1 a 10% (p/v) de tensoativo, submetida à agitação magnética até completa homogeneização, preferencialmente de 2 a 4% (p/v).

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de os tensoativos serem selecionados do grupo que consiste em copolímeros de óxido de etileno e óxido propileno 188, 407, 101, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 212, 215, 217, 231, 234,

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235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401,

402, 403; estearato de sorbitan, monooleato de sorbitan, trioleato de sorbitan, triestearato de sorbitan, polisorbato 80, polisorbato 60, preferencialmente poloxamer 188.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa d, a mistura das fases oleosa e aquosa ser realizada à temperatura que varia de 45 a 85°C, preferencialmente 70°C, sob agitação que varia de 150 a 800 rpm, preferencialmente 500 rpm, durante 2 a 45 minutos, preferencialmente 10 minutos.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa e, ser realizada a formação da pré-emulsão empregando um equipamento adequado, tal como um dispersor de alta performance, à rotação que varia de 500 a 14000 rpm, preferencialmente 8000 rpm, a temperatura que varia de 40 a 80 °C, preferencialmente 70°C, durante 2 a 45 minutos, preferencialmente 10 minutos.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa f, a homogeneização a alta pressão ser realizada por um a dez ciclos de 10⁶ a 10⁷ Pa, à temperatura que varia de 45 a 85°C, preferencialmente 70°C.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa g, ser realizado o resfriamento em temperatura ambiente que varia de 20-25°C.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa h, ser realizada a diluição do carreador em até 1:3 partes de água purificada.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1,

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4/7 caracterizado pelo fato de, na etapa i, ser realizada a adição de 50 a 500000 UI/ml de um polipeptídeo, preferencialmente 1000 a 9000 UI/ml, ao carreador à temperatura que varia de 20 a 25°C, à homogeneização por agitação magnética que varia de 50 a 250 rpm, preferencialmente 100 rpm, a pH que varia de 3,5 a 9,0, preferencialmente entre 5,0 e 7,0, durante 50 a 120 minutos, preferencialmente 60 minutos.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de o referido polipeptídeo ser preferencialmente a polimixina B, em que alternativamente é substituída pela polimixina E (colistina).

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa j, ser adicionado de 0,01 a 2% p/v de um polímero catiônico, preferencialmente entre 0,05 e 0,2%, à homogeneização por agitação magnética que varia de 50 a 1000 rpm, preferencialmente 100 rpm, a pH que varia de 3,5 a 9,0, à temperatura que varia de 20 a 25°C, durante 50 a 120 minutos preferencialmente 60 minutos.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o referido polímero catiônico ser preferencialmente a quitosana, em que esta varia entre 50 a 200 kDa, com grau de desacetilação de no mínimo 75%.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa k, ser adicionado de 0,04 a 5% p/v, preferencialmente de 0,4 a 0,55% p/v, de um polímero aniônico, à homogeneização por agitação magnética que varia de 50 a 150 rpm, preferencialmente 100 rpm, a pH que varia de 3,5 a 9,0, à temperatura que varia de 20 a

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5/7

25°C, durante 50 a 120 minutos preferencialmente 60 minutos.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de o referido polímero aniônico ser preferencialmente o sulfato de dextrana, em que alternativamente este é substituído por D-manose-6-fosfato.

19. Carreadores lipídicos nanoestruturados obtidos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de compreender:

- de 0,5 a 50% p/v de fase oleosa;

- de 1 a 10% p/v de tensoativo;

- de 50 a 500000 UI/ml de um polipeptídeo;

- de 0,01 a 2% p/v de um polímero catiônico;

- de 0,04 a 5% p/v de um polímero aniônico; e

- água purificada q.s.p.

20. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo fato de a referida fase oleosa compreender de 0,5 a 50% (p/v) de uma proporção de 0,1 (1:10) a 10,0 (1:10) de lipídios líquidos e sólidos (LL/LS), respectivamente, preferencialmente de 0,5 (2:1) a 3 (1:3), e buparvaquona de 0,1 a 5,0%, preferencialmente 0,3% (p/v).

21. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 20, caracterizados pelo fato de os lipídios líquidos serem selecionados do grupo que consiste em triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico, monocaprilato de glicerila, óleo de cartámo, óleo de milho, óleo de oliva, óleo de gergelim, óleo de algodão, óleo de soja, ácido oleico, preferencialmente triglicérides dos ácidos cáprico e caprílico.

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6/7

22. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 20, caracterizados pelo fato de os lipídios sólidos serem selecionados do grupo que consiste em óleo de palma hidrogenado, mono, di e triglicerídeos de coco hidrogenados, estearoil-macrogol-32-gliceridos, distearato de glicerila, óleo de soja hidrogenado, triglicerídeos dos ácidos palmítico e esteárico, behenato de glicerilo, preferencialmente óleo de palma hidrogenado.

23. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo fato de, preferencialmente, o referido tensoativo estar em uma concentração de 2 a 4% (p/v), e ser selecionado do grupo que consiste em copolímeros de óxido de etileno e óxido

propileno 188, 407, 101, 105, 108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 212, 215, 217, 231, 234, 235, 237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403 estearato

de sorbitan, monooleato de sorbitan, trioleato de sorbitan, triestearato de sorbitan, polisorbato 80, polisorbato 60, preferencialmente poloxamer 188.

24. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo fato de preferencilamente, o referido polipeptídeo estar em uma concentração de 1000 a 9000 UI/ml, e ser preferencialmente a polimixina B, em que alternativamente é substituída pela polimixina E (colistina).

25. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo fato de, preferencialmente, o referido polímero catiônico estar em uma concentração entre 0,05 e 0,2%; e ser preferencialmente a quitosana, a qual varia entre 50 a 200 kDa de peso

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7/7 molecular, com grau de desacetilação de no mínimo 75%.

26. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo fato de, preferencialmente, o polímero aniônico estar em uma concentração de 0,4 a 0,55% p/v; e ser preferencialmente o sulfato de dextrana, em que alternativamente é substituído por D-manose-6-fosfato.

27. Carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo fato de apresentarem diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) que varia de 100 a 350 nm; potencial zeta (mV) menor que -10, preferencialmente menor que -20; e índice de polidispersividade menor que 0,3.

28. Uso dos carreadores lipídicos nanoestruturados conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 27, caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para tratar a leishmaniose.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de ser direcionado ao sistema linfático.