BR102017000578B1

BR102017000578B1 - Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por pseudomonas ou enterobacter utilizando o resíduo de semente de andiroba ou murumuru

Info

Publication number: BR102017000578B1
Application number: BR102017000578-0A
Authority: BR
Inventors: Noemi Jacques Vieira; Cintia Rosa Ferrari; Gabriela Da Silva Bicalho; Patricia Léo; Alfredo Eduardo Maiorano; Eliza Mami Ota; Maria Filomena De A. Rodrigues; Rosa Mitiko Saito Matsubara
Original assignee: Natura Cosméticos S.A.; Instituto De Pesquisas Tecnológicas Do Estado De São Paulo S.A. - Ipt
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2017-01-11
Publication date: 2019-04-02
Also published as: CL2019001899A1; WO2018129603A1; MX2019008154A; US20200115729A1; EP3569714A4; AR110736A1; US10801053B2; EP3569714A1

Abstract

processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por pseudomonas ou enterobacter utilizando o resíduo de semente de andiroba ou murumuru. processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por pseudomonas ou enterobacter utilizando o resíduo de semente de andiroba ou murumuru pertencente ao setor de compostos contendo radicais monossacarídeos, consiste na obtenção de raminolipídeos por processo biotecnológico utilizando o resíduo de semente de andiroba ou murumuru, após extração do seu óleo, como substrato para a linhagem de pseudomonas aeruginosa ou enterobacter hormaechei ou enterobacter buriae cultivada em biorreator com sistema de aeração não dispersiva para redução de espuma, obtendo-se teor de raminolipídeo de 10,5 g/l para as bactérias pseudomonas aeruginosa, em biorreatores conduzidos em tanque agitado com aeração não dispersiva utilizando-se membranas microporosas, particularmente de tubos de silicone, que permitem o fornecimento de oxigênio por difusão. este tipo de aeração permite diferentes configurações, sendo que no exemplo de concretização da invenção, a membrana/tubo poroso foi localizada internamente no líquido do biorreator na forma de serpentina, nas condições de processo: oxigênio puro com pressão e vazão adequada para manter a pressão de o2 no biorreator em 20% nas primeiras 24 horas de ensaio e agitação variando de 300 a 700 rpm, utilizando 2 impelidores radiais e ajuste manual conforme a diminuição da concentração de oxigênio dissolvido. o produto obtido possui características aplicáveis principalmente na indústria de cosméticos devido a sua capacidade de emulsificação, estabilidade e não toxicidade.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE RAMNOLIPÍDEO PRODUZIDO POR PSEUDOMONAS OU ENTEROBACTER UTILIZANDO O RESÍDUO DE SEMENTE DE ANDIROBA OU MURUMURU.

Campo da Invenção [0001] A presente invenção, pertencente ao setor compostos lipídicos contendo unidades de monossacarídeos, refere-se a biossurfactantes/ramnolipídeo de origem microbiana, obtido a partir das linhagens microbianas Pseudomonas aeruginosa ou Enterobacter hormaechei ou Enterobacter buriae e resíduo agroindustrial de semente de andiroba ou murumuru como substrato de seu crescimento e produção, e ao seu processo de obtenção, com características aplicáveis principalmente na indústria de cosméticos devido a sua capacidade de emulsificação, estabilidade e não toxicidade.

Antecedentes da Invenção [0002] Os biossurfactantes são agentes de atividade superficial com características anfipáticas (hidrofílica/hidrofóbica) naturalmente produzidos e excretados por uma ampla variedade de microrganismos sob condições específicas de crescimento. Estas moléculas são classificadas em glicolipídeos, fosfolipídeos, lipolipídeos ou lipoproteínas.

[0003] Os glicolipídeos são biossurfactantes de baixo peso molecular, incluindo os ramnolipídeos (RLs), os quais apresentam a propriedade de diminuir as tensões superficiais e interfaciais e também apresentam propriedades de emulsificação, espumação, detergência, umectação e dispersão ou solubilização.

[0004] Estes biossurfactantes apresentam crescente interesse por parte da comunidade científica devido às suas propriedades físicoquímicas e tensoativas, que lhes conferem um amplo espectro de aplicação. Os biossurfactantes podem substituir os surfactantes sintéticos, produzidos quimicamente, por apresentarem menor toxicidade, serem biodegradáveis e ecologicamente mais aceitos. Os biossurfactantes

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2/23 apresentam potencial de aplicação em diferentes mercados tais como biorremediação, recuperação de petróleo, agricultura (pesticidas), farmacêutico, indústria de alimentos, dermatológica e cosmética. Assim, os ramnolipídeos podem ser utilizados em processos de biorremediação, no controle biológico e nas indústrias de alimentos, cosméticos por apresentarem boa compatibilidade com a pele e farmacêutica. Ramnolipídeos também têm sido utilizados para a obtenção de ramnose, um importante precursor na produção de aromas.

[0005] Pseudomonas aeruginosa produz até seis tipos de ramnolipídeos que possuem estrutura química e atividade superficial similares, podendo reduzir a tensão superficial da água de 72 dina/cm para 30 dina/cm com concentração micelar crítica de 27 a 54 mg/L. P. aeruginosa é uma linhagem bem estudada e produtora, principalmente, de monorramnolipídeos do tipo Rha-C10-C10 e dirramnolipídeos do tipo Rha2-C10-C10.

[0006] Os biotensoativos da classe dos ramnolipídeos, produzidos por bactérias do gênero Pseudomonas, tiveram sua estrutura descrita em meados dos anos 40 e desde então diversos autores têm apresentado métodos para sua produção.

[0007] O documento US 4.628.030 (KAEPELLI, O. AND GUERRASANTOS, L. 1986) descreve o primeiro processo contínuo de produção de ramnolipídeo sem biorreator pela linhagem P. aeruginosa DSM 2659, utilizando meio de cultura composto por sais minerais e glicose como fonte de carbono, apresentando limitação na disponibilidade de fontes nitrogênio, ferro e magnésio visando aumentar a concentração de ramnolipídeos produzidos. Nesse documento não é feita qualquer menção à utilização de resíduos como matéria-prima/fonte de carbono na produção dos ramnolipídeos produzidos.

[0008] Posteriormente, o documento US 4.814.272 (Wagner et al, 1989) descreve processo de produção de ramnolipídeos utilizando di

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3/23 ferentes fontes de carbono e demonstrando que ramnosil-p-hidroxidecanoato e ramnosil-ramnosil-p-hidroxidecanoato, além de ramnosilp-hidroxidecanoil-p-hidroxidecanoato e do ramnosil-ramnosil-p-hidroxidecanoil-p-hidroxidecanoato também são sintetizados pela linhagem Pseudomonas aeruginosa DSM 2874. Os inventores demonstraram que ramnolipídeos contendo essas estruturas químicas eram produzidos utilizando glicerina ou parafina como fonte de carbono e que a temperatura de cultivo das células de Pseudomonas também interferia na sua presença. Culturas de Pseudomonas com glicerina ou parafina à temperatura de 30°C produziram ramnolipídeos contendo 16,2 e 17% das novas estruturas, respectivamente. Quando Pseudomonas aeruginosa DSM 2874 foi cultivada a 37°C, a quantidade das novas estruturas químicas obtida foi de 2%. Assim, demonstram ser possível modificar a composição de ramnolipídeos em uma situação bastante particular, que envolve o cultivo utilizando glicerina ou parafina como fonte de carbono.

[0009] Daniels e colaboradores (EP 0282942, 1988), revelam método de produção de ramnose através do processo de produção dos ramnolipídeos utilizando óleos vegetais. No processo descrito, são atingidas concentrações da ordem de 30 a 50 g/l de ramnolipídeos. O processo tem como interesse principal a produção da ramnose, obtida da hidrólise do ramnolipídeo posteriormente à sua biossíntese.

[0010] No documento WO 1992005182 (1992), Mixich et al. descrevem processo para obtenção de ramnose a partir da hidrólise de ramnolipídeos. Nesse documento, o foco é o processo de hidrólise e separação da ramnose dos ramnolipídeos.

[0011] O documento US 5.501.966, (Giani et al., 1996) descreve o processo de produção de ramnose a partir da hidrólise de ramnolipídeos, resultante de um processo utilizando óleos vegetais e bactérias do gênero Pseudomonas isoladas de amostra de água ou seus mutan

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4/23 tes submetidos a n-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). Neste processo, a concentração de ramnolipídeos atinge entre 70 e 120 g/L. [0012] Chayabutra e colaboradores (CHAYABUTRA, C.; WU, J.; JU, L.K. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa under denitrification: effects of limiting nutrients and carbon substrates. Biotechnol Bioeng, v. 72(1), p. 25-33, 2001) avaliaram a produção de ramnolipídeos sob condições de desnitrificação, ou seja, na ausência de oxigênio e na presença de nitrato como aceptor final de elétrons. Nesse trabalho, foram fornecidos como fonte de carbono ácidos graxos, óleos vegetais, glicerol ou glicose, e condições de limitação de crescimento celular por diferentes nutrientes. A limitação com fósforo foi a mais efetiva para a produção de ramnolipídeos, resultando em produtividades quatro a cinco vezes maiores que com a limitação convencional de nitrogênio.

[0013] Santos e colaboradores (SANTOS, A.S; SAMPAIO, A.P.; VASQUEZ, G.S., SANTA ANNA, L.M.; PEREIRA, N. JR; FREIRE, D.M. Evaluation of different carbon and nitrogen sources in production of rhamnolipids by a strain of Pseudomonas aeruginosa. Appl Biochem Biotechnol, v. 98-100, p. 1025-1035) avaliaram a biossíntese de ramnolipídeos utilizando diferentes fontes de carbono (C - glicerol, óleo de soja, azeite de oliva e etanol) e de nitrogênio (N - NH4⁺ e NO3^-), bem como diferentes proporções C/N. Os autores concluíram que a proporção relativa entre ramnosil-p-hidroxidecanoil-e-hidroxidecanoato (monorramnolipídeo) e o ramnosil-ramnosil-p-hidroxidecanoil-e-hidroxidecanoato (dirramnolipídeo) variam em função da fonte de carbono fornecida. [0014] A utilização de fontes de carbono hidrofílicas (glicerol e glicose) e hidrofóbicas (borra de soja, óleo de fritura e gordura de frango) para a produção de ramnolipídeos foi estudada por Nitschke e colaboradores (NITSCHKE, M.; COSTA, S.G.; HADDAD, R.; GONÇALVES, L.A.; EBERLEIN, M.N.; CONTIERO, J. Oil wastes as unconventional

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5/23 substrates for rhamnolipid biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa LBI. Biotechnol. Prog., 21: 1562-1566, 2005) que verificaram que os substratos oleosos apresentaram uma produção de ramnolipídeos 64% maior do que os substratos não oleosos. O estudo valorizou as fontes hidrofóbicas como fonte de carbono mostrando resultados iguais ou superiores aos relatados na literatura.

[0015] O documento PI 0705327-4 A2 (2007) descreve método utilizando linhagens bacterianas selecionadas para a produção de ramnolipídeos, a partir de óleos vegetais como óleos de mamona, soja, milho, girassol, canola, algodão, pinhão manso e carboidratos como glicose, frutose, dissacarídeos ou polissacarídeos para produção dos ramnolipídeos. Neste método de produção são obtidos de forma controlada ramnolipídeos de composição variada, tanto na relação ramnose/3-hidroxialcanoatos como nos 3-hidroxialcanoatos presentes, por meio de mutante de Pseudomonas aeruginosa afetada no metabolismo de biossíntese de polihiroxialcanoatos, aumentando o espectro de aplicações para os produtos, nos campos de biorremediação, alimentos, aromas, cosméticos e farmacêuticos.

[0016] Outros aspectos da biossíntese de ramnolipídeos também são considerados na literatura.

[0017] Diferentes genes associados à biossíntese de ramnolipídeos foram descritos: rhlA, rhlB, rhlC, rhlG, rhlR, rhlI, rmlABCD (OCHSNER, U.A.; KOCH, A.K.; FIECHTER, A.;REISER, J. Isolation and characterization of a regulatory gene affecting rhamnolipid biosurfactant synthesis in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol., v. 176(7): 2044-2054, 1994); (RAHIM, R.; OCHSNER, U.A.; OLVERA, C.; GRANINGER, M.; MESSNER, P.; LAM, J.S., SOBERÓN-CHÁVEZ, G. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Mol Microbiol 40:708-718, 2001); e Olvera et al., (OLPetição 870170002015, de 11/01/2017, pág. 29/51

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VERA, C.; GOLDBERG, J.B.; SÁNCHEZ, R.; SOBERÓN-CHÁVEZ, G. The Pseudomonas aeruginosa algC gene product participates in rhamnolipid biosynthesis. FEMS Microbiol Lett v. 179, p.85-90 1999). As sequências de nucleotídeos desses genes estão disponíveis no banco de dados dos genomas de Pseudomonas aeruginosa PAO1 e PA14 (www.pseudomonas.com).

[0018] Segundo Ochsner e Raiser (OCHSNER, U.A.; KOCH, A.K.; FIECHTER, A.; REISER, J. Isolation and characterization of a regulatory gene affecting rhamnolipid biosurfactant synthesis in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol., v. 176(7):2044-2054, 1994), os principais ramnolipídeos produzidos por Pseudomonas aeruginosa são o ramnosil-p-hidroxidecanoil-e-hidroxidecanoato (monorramnolipídeo) e o ramnosil-ramnosil-p-hidroxidecanoil-e-hidroxidecanoato (dirramnolipídeo), entretanto, outras estruturas químicas pertencentes à família dos ramnolipídeos foram descritas.

[0019] Exemplos interessantes de biossurfactantes com relevância em aplicações cosméticas são os RLs, glicolipídeos produzidos principalmente por Pseudomonas aeruginosa facilmente isolados do meio de cultura e podem ser produzidos utilizando substratos hidrofóbicos ou hidrofílicos, tais como hidrocarbonetos, óleos vegetais, açúcares, glicerol ou resíduos da indústria de alimento. Costa e colaboradores (COSTA, S. G. V. A. O.; NITSCHKE, M, HADDAD; R, EBERLIN M.N.; CONTIERO, J. Production of Pseudomonas aeruginosa LBI rhamnolipids following growth on Brazilian native oils. Process Biochemistry, v. 41, p. 483-488, 2006) descreveram a biossíntese de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa quando cultivada na presença de 2%, em volume, de diferentes óleos de vegetais nativos brasileiros. A concentração de ramnolipídeos variou entre 2,9 e 9,9 g/L após 120 horas de cultivo e o monorramnolipídeo foi o principal ramnolipídeo detectado. Cosméticos contendo ramnolipídeos já foram patenteados para

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7/23 serem usados como produtos antirrugas e antienvelhecimento (WO1999043334, PILJAC & PILJAC, 1999).

[0020] Em geral, biossurfactantes ainda são incapazes de competir com os surfactantes sintéticos para fins comerciais devido ao seu alto custo de produção e recuperação. Como relatado por Mukherjeee colaboradores (MUKHERJEE, S.; DAS, P.; SEN, R. Towards commercial production of microbial surfactants. Trends Biotechnol., Amsterdam, 24: 509-515, 2006), três principais fatores que dificultam a comercialização de biossurfactantes são: i) o elevado custo das matérias-primas; ii) o alto custo de recuperação e purificação; e iii) os baixos rendimentos nos processos de produção. Assim, a fim de reduzir o custo de produção de biossurfactantes e para aumentar a eficiência da produção do biotensoativo, várias técnicas e abordagens foram adotadas mundialmente. Alternativa de uso de substratos baratos, condições de cultura otimizadas em processos em biorreatores, processos de recuperação econômicos e melhorias de cepas têm sido investigados para melhorar os rendimentos de biossurfactante.

[0021] Assim, o estado da técnica demonstra que bactérias do gênero Pseudomonas são capazes de produzir diferentes biotensoativos da família dos ramnolipídeos, a partir de diferentes substratos, entretanto, não há informação disponível sobre a produção de ramnolipídeos a partir de resíduos vegetais. Considerando que o substrato utilizado para a produção do ramnolipídeo pode interferir na composição final do produto e nas propriedades tensoativas e, consequentemente, em suas potenciais aplicações, além é claro do custo final de produção, a utilização de resíduos agroindustriais pode representar vantagens em relação ao custo da matéria-prima. Porém produzir as moléculas de biossurfactantes com propriedades aplicáveis em produtos cosméticos semelhantes ou superiores aos dos tensoativos de origem química é um grande desafio.

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8/23 [0022] Estas fontes alternativas de nutrientes, tais como subproduto agrícola ou de processamento industrial, podem reduzir o problema econômico da produção de biossurfactantes, pois estima-se que a matéria-prima seja responsável por cerca de 10 a 30% dos custos totais de produção em muitos processos biotecnológicos. Além disto, o aproveitamento de resíduos pode contribuir para a redução da poluição ambiental, bem como permitir a valorização econômica dos resíduos que seriam descartados.

[0023] Grandes quantidades de resíduos são geradas pela indústria de óleos e gorduras, que são provenientes tanto da extração como da utilização de óleos vegetais. Estudos demonstraram que resíduos de óleos vegetais podem ser utilizados como substratos para a produção de ramnolipídeos por alguns isolados de Pseudomonas aeruginosa (BENINCASA, M.; CONTIERO, J.; MANRESA, M.A.; MORAES, I.O. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source. J. Food Eng., 54: 283-288, 2002); NITSCHKE e colaboradores (NITSCHKE, M.; COSTA, S.G.; HADDAD, R.; GONÇALVES, L.A.; EBERLEIN, M.N.; CONTIERO, J. Oil wastes as unconventional substrates for rhamnolipid biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa LBI. Biotechnol. Prog., v. 21, p.. 1562-1566, 2005); COSTA (COSTA, G. A. N. Produção biotecnológica de surfactante de Bacillus subtilis em resíduo agroindústria, caracterização e aplicações. 85p. Dissertação de Mestrado em Ciência de Alimentos; Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2005); RAZA e colaboradores (RAZA, Z. A.; REHMAN, A.; KHAN, M. S.; KHALID, Z. M. Improved production of biosurfactant by a Pseudomonas aeruginosa mutant using vegetable oil refinery wastes. Biodegradation, Dordrecht, v. 18, p. 115-121, 2007). Alguns autores relatam ainda a utilização de melaço de cana, resíduos da produção de queijo, batata e mandioca como fontes para

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9/23 a produção de biotensoativos (MUKHERJEE, S.; DAS, P.; SEN, R. Towards commercial production of microbial surfactants. Trends Biotechnol., Amsterdam, 24: 509-515, 2006). A água de maceração de milho é um subproduto do processamento dos grãos de milho, sendo um material ácido, rico em aminoácidos e polipeptídios, minerais e vitaminas pode ser utilizado como suplemento de nutrientes em meio de cultivo para bioprocessos industriais (LIGGETT R. W.; KOFFLER, H. Corn steep liquor in microbiology. Bacteriol. Rev., 12: 297-311, 1948). Outra fonte alternativa é o glicerol, um dos principais subprodutos obtidos durante a produção de biodiesel.

[0024] A biossíntese de ramnolipídeos por P. aeruginosa é diretamente influenciada pela disponibilidade de nutrientes, visto que após o crescimento celular, a disponibilidade de fonte de carbono e limitação de nitrogênio promove o aumento da produção destes glicolipídeos.

[0025] A utilização de fontes de carbono hidrofílicas (glicerol e glicose) e hidrofóbicas (borra de soja, óleo de fritura e gordura de frango) para a produção de ramnolipídeos foi estudada por Nitschke e colaboradores (NITSCHKE, M.; COSTA, S.G.; HADDAD, R.; GONÇALVES, L.A.; EBERLEIN, M.N.; CONTIERO, J. Oil wastes as unconventional substrates for rhamnolipid biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa LBI. Biotechnol. Prog., v. 21, p.. 1562-1566, 2005) e verificaram que os substratos oleosos apresentaram uma produção de ramnolipídeos 64% maior do que os substratos não oleosos. Este estudo valorizou as fontes hidrofóbicas como fonte de carbono e mostrou resultados iguais ou superiores aos relatados na literatura. Nitschke e colaboradores (NITSCHKE, M.; COSTA, S.G.; HADDAD, R.; GONÇALVES, L.A.; EBERLEIN, M.N.; CONTIERO, J. Oil wastes as unconventional substrates for rhamnolipid biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa LBI. Biotechnol. Prog., v. 21, p.. 1562-1566, 2005) destacam que os resíduos oleosos estudados são produzidos

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10/23 em grande quantidade pelas indústrias de processamento de óleos vegetais e alimentícias, sendo que a utilização destes resíduos poderá contribuir não somente com a redução dos custos de tratamento, mas também para a sua valorização econômica. Considerando que o custo de produção é o maior problema para a expansão do mercado de biossurfactantes, a procura por substratos alternativos e o isolamento de novos microrganismos constituem uma estratégia para implementar a obtenção e o uso destas moléculas. O trabalho destes autores mostrou o potencial de uso de resíduos de indústrias alimentícias como fonte de carbono na produção de biotensoativos, bem como o isolamento de dois novos microrganismos.

[0026] Estudos apontam diferentes tipos de resíduos que podem ser usados como substratos alternativos na produção de biossurfactantes. Ter o conhecimento da composição adequada de nutrientes que permita o crescimento celular e o acúmulo do produto de interesse é um dos maiores problemas encontrados durante a escolha do resíduo a ser utilizado. O estabelecimento de um processo biotecnológico a partir desses substratos alternativos também apresenta outra dificuldade, que é a padronização devido às variações naturais de composição, bem como os custos de transporte, armazenamento e tratamento prévio (NITSCHKE, M.; PASTORE, G. M. Biossurfactantes a partir de resíduos agroindustriais: Avaliação de resíduos agroindustriais como substratos para a produção de biossurfactantes por Bacillus. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. Edição n° 31, pag. 63-67, junho/dezembro 2003), sendo que os resíduos agroindustriais possuem elevados teores de carboidratos e lipídeos, mostrando-se como substratos interessantes para a produção de biossurfactantes (MAKKAR, R.S., CAMEOTRA, S.S. Production of biosurfactant at mesophilic and thermofilic conditions by a strain of Bacillus subtilis. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 20: 48-52, 1998).

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11/23 [0027] Alguns autores já revelaram a produção de ramnolipídeo por Pseudomonas aeruginosa utilizando substratos não convencionais, como o efluente da extração do óleo de oliva (MERCADE, M.E.; MANRESA, M.A.; ROBERT, M.; ESPUNY, M.U.; de ANDRES, C.; GUINEA, J.. Olive oil mil efluente (OOME). New substrate for biosurfactant production. Bioresour. Technol., 43:1-6, 1993), resíduos do refino do óleo de soja (ABALOS, A.; PINAZO, A.; INFANTE, M.R.; CASALS, M., GARCIA, F.; MANRESA, A. Physicochemical and antimicrobial properties of new rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 from soybean oil refinery wastes. Langmuir, 17: 13671371, 2001), soro de leite (KOCH, A. K.; RAISER, J.; KAPPELI, O.; FIECHTER, A. Genetic construction of lactose utilizing strains of Pseudomona aeruginosa and their application in biosurfactant production. Nat. Biotechnol., 6, 1335-1339. doi: 10.1038/nbt 1188-1335, 1988), óleo de fritura usado (HABA E.; ESPUNY M.J.; BUSQUETS M.; MANRESA A. Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils. J. Appl. Microbiol.; 88: 379- 387, 2000).

[0028] Thaniyavarn e colaboradores (THANIYAVARN, J.; CHONGCHIN, A.; WANITSUKSOMBUT, N.; THANIYAVARN, S.; PINPHANICHAKARN, P.; LEEPIPATPIBOON, N.; MORIKAWA, M.; KANAYA, S. Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa A41 using palm oil as carbon source. The Journal of General and Applied Microbiology, 52: 215-222, 2006) obtiveram diferenças significativas de rendimento para a produção de ramnolipídeos pela linhagem Pseudomonas aeruginosa A41 a partir de diferentes fontes de carbono (2% v/v): azeite de oliva, óleo de palmeira, óleo de coco, ácido láurico, ácido miriástico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico e ácido linoleico. A maior concentração do bioproduto, 6,58 g/L, foi obtida pelo cultivo em azeite de oliva, no entanto para o óleo de coco e o de palPetição 870170002015, de 11/01/2017, pág. 35/51

12/23 meira foram produzidos apenas 2,9 g/L de ramnolipídeos.

[0029] Manresa e colaboradores. (MANRESA, M. A.; BASTIDA, M.E.; MERCADÉ, M R.; DE ANDRÉS, C.; ESPUNY, M.J.; GUINEA, J. Kinetic studies on surfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44T1. Journal of Industrial Microbiology, 8: 133-136, 1991) consideram a produção de ramnolipídeos utilizando óleo de oliva como um fenômeno complexo, e sugerem que a Pseudomonas aeruginosa 44T1 provavelmente produza lipases extracelulares que quebrem as triglicérides e catabolizem os ácidos graxos liberados. Ressaltam ainda que, apesar das dificuldades técnicas no bioprocesso e no downstream do produto, a produção de ramnolipídeos de óleos vegetais apresenta vantagens.

[0030] Mulligan (MULLIGAN, C. N. Recent advances in the environmental applications of biosurfactants. Curr. Op. Coll. Interf. Sci.,14: 372 - 378, 2009) estudou o potencial de P. aeruginosa para produzir ramnolipídeos a partir de uma grande variedade de substratos, incluindo alcanos C11 e C12, succinato, piruvato, citrato, frutose, glicerol, óleo de oliva, glicose e manitol, sendo que a composição e os rendimentos do biossurfactante ramnolipídeo dependem também do tipo de biorreator, pH, composição de nutrientes, substrato e temperatura.

[0031] Diversos autores empregaram estratégias visando otimizar o meio de cultura para a produção de biossurfactantes, porém um fator pouco avaliado, que pode contribuir para um aumento na produção de biossurfactantes, é a influência dos micronutrientes presentes no meio de cultura.

[0032] A produção de biossurfatantes se depara com várias dificuldades de processo. Entre os parâmetros que influenciam o tipo e a quantidade de produto formado estão: a natureza da fonte de carbono, possíveis limitações nutricionais e parâmetros físicos e químicos, como aeração, agitação, geração de espuma, temperatura e pH. Eleva

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13/23 das proporções C/N (GUERRA-SANTOS, L.H.; KÃPPELI, O.; FIECHTER, A. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source. Appl Environ Microbiol., v. 48, p.301-305, 1984); e C/P (MULLIGAN C.N.; MAHMOURIDES G., GIBBS B.F. The influence of phosphate metabolism on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 12:199210, 1989) estimula a síntese de ramnolipídeos, enquanto altas concentrações de cátions bivalentes, especialmente ferro, são inibitórias (GUERRA-SANTOS, L.; KAPPELI, O.; FIECHTER, A. Dependence of Pseudomonas aeruginosa continuous culture biosurfactant production on nutritional and environmental factors. Applied Microbiology and Biotechnology, 24: 443-448, 1986); (BENINCASA, M.; ACCORSINI F.R. Pseudomonas aeruginosa LBI production as an integrated process using the wastes from sunflower-oil refining as a substrate. Bioresour. Technol., 99: 3843-3849, 2008) avaliaram a produção de ramnolipídeos por P. aeruginosa LBI sob diferentes proporções C/N e alcançaram a mais alta concentração, 7,3 g/L, com a proporção C/N de 8/1. A utilização de NH₄, glutamina, asparagina e arginina, como fonte de nitrogênio, inibem a produção de ramnolipídeos, enquanto NO^-3, glutamato e aspartato promovem a síntese (MULLIGAN, C. N.; GIBBS, B. F. Correlation of nitrogen metabolism with biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa. Appl. Environ. Microbiol., 55: 3016-3019, 1989). De acordo com alguns autores, o nitrato é a melhor fonte de nitrogênio a ser utilizada, pois estimula uma alta expressão de rhlAB, sequência gênica responsável pela síntese de monorramnolipídeos (VENKATA-RAMANA, K.; KARANTH, N. G. Factors affecting biosurfactant production using Pseudomonas aeruginosa CFTR-6 under submerged conditions. J.Chem. Technol. Biotechnol., Oxford, v. 45, p. 249-257, 1989). De acordo com Manresa e colaboradores (MANRESA, M. A.; BASTIDA, M.E.; MERCADÉ, M R.; DE ANDRÉS, C.;

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ESPUNY, M.J.; GUINEA, J. Kinetic studies on surfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44T1. Journal of Industrial Microbiology, 8: 133-136, 1991), a preferência por esta fonte de nitrogênio pode ser devido ao fato de P. aeruginosa ser apta a fazer denitrificação e, portanto, pode utilizar nitrato como aceptor de elétrons, mesmo na presença de oxigênio.

[0033] Fatores ambientais e condições de crescimento como pH, temperatura, agitação e disponibilidade de oxigênio afetam a produção de biossurfactantes, interferindo no crescimento e na atividade celular. A produção de ramnolipídeos por Pseudomonas sp. foi máxima quando o pH foi mantido entre 6 e 6,5; já acima de 7, a produção caiu bruscamente (GUERRA-SANTOS, L.; KAPPELI, O.; FIECHTER, A. 1984. Pseudomonas aeruginosa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source. Applied and Environmental Microbiology, 48: 301-305, 1984). A temperatura ótima de produção de ramnolipídeos por P. aeruginosa 44T1 foi 37°C, de acordo com Robert e colaboradores, (ROBERT, M.; MERCADÉ, E.; BOSH, M. P.; PARRA, J. L.; ESPUNY; M. J.;MANRESA, M. A.; GUINEA, J. Effect of the carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 44T1. Biotechnol. Lett., Dordrecht, v.1, n.2, p.871-874, 1989). A temperatura pode afetar também a composição do biossurfactante produzido por linhagens de Pseudomonas sp. DSM-2874 (SYLDATK, C.; LANG, S.; WAGNER, F. Chemical and physical characterization of 4interfacial-active rhamnolipids from Pseudomonas spec dsm 2874 grown on normal alkanes. Zeitschrift fur Naturforschung c-a Journal of Biosciences, Tubingen, 40, 51-60, 1985). Durante a produção por leveduras, a produção de biossurfactantes aumentou quando as taxas de agitação e aeração foram elevadas (YEH, M.S.; WEI, Y.H.; CHANG, J.S. Bioreactor design foe enhanced carrier- assisted surfactin production with Bacillus subtilis. Proc. Biochem., v. 41, p. 1799

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1805, 2006). Para Sheppard e Cooper (SHEPPARD, J. D.; COPPER, D. G. The effect of biosurfactant on oxygen transfer in acyclone column reactor. J. Chem. Technol. Biotechnol., Oxford, v. 48, p. 325-336, 1990) a transferência de oxigênio é um dos parâmetros chaves para a otimização e produção em grande escala de surfactina por B. subtilis. [0034] A maior parte dos relatos na literatura da utilização de produtos ou subprodutos agroindustriais está relacionada a produtos puros como carboidratos e óleos vegetais. Pouco tem sido publicado sobre a utilização de resíduos sólidos provenientes de plantas oleaginosas (BENINCASA, M.; CONTIERO, J.; MANRESA, M. A.; MORAES, I. O. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source. J. Food Eng., v. 54, p. 283288, 2002) e sobre as possíveis soluções para o problema da formação de espuma. MÜLLER e colaboradores utilizaram um sistema de separador de espuma instalado na cabeça do biorreator para o controle da espuma (MÜLLER, M.M., HORMANN, B., KUGEL, M., SYLDATK, C., HAUSMANN, R. Evaluation of rhamnolipid production capacity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 in comparison to the rhamnolipid over-producer strains DSM 7108 and DSM 2874. Appl Microbiol Biotechnol. v. 89, p. 585-592, 2011.

[0035] A novidade e atividade inventiva de OBTENÇÃO DE RAMNOLIPÍDEO PRODUZIDO POR PSEUDOMONAS AERUGINOSA UTILIZANDO O RESÍDUO DE SEMENTE DE ANDIROBA consiste na obtenção de raminolipídeos por processo biotecnológico utilizando o resíduo de semente de andiroba após extração do seu óleo, como substrato para a linhagem de Pseudomonas aeruginosa, cultivada em biorreator com sistema de aeração não dispersiva para redução de espuma, obtendo-se teor de raminolipídeo de 10,5 g/L em biorreatores conduzidos em tanque agitado com aeração não dispersiva, utilizandose membranas microporosas, particularmente de tubos de silicone,

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16/23 que permitem o fornecimento de oxigênio por difusão. Estas membranas permitem a aeração isenta de bolhas, evitando a formação de espuma. Este tipo de aeração permite diferentes configurações, sendo que no exemplo de concretização da invenção, a membrana/tubo poroso foi localizado internamente no líquido do biorreator na forma de serpentina, nas condições de processo: oxigênio puro com pressão e vazão adequada para manter a pressão de O₂ no biorreator em 20% nas primeiras 24 horas de ensaio e agitação variando de 300 a 700 rpm, utilizando 2 impelidores radiais e ajuste manual conforme a diminuição da concentração de oxigênio dissolvido.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO [0036] PROCESSO DE obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou enterobacter utilizando o resíduo de semente de ANDIROBA ou murumuru refere-se a um processo de obtenção de biossurfactante ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando resíduo de semente de andiroba ou murumuru como substrato alternativo e renovável para a produção do biossurfactante ramnolipídeo com propriedades de emulsificação, estabilidade e não toxicidade aplicáveis a formulações cosméticas, de acordo com as etapas: a) reativação celular; b) preparo de inóculo e c) bioprocesso em batelada em biorreator.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0037] Figura 1: Gráfico da medida da tensão superficial das linhagens Pseudomonas aeruginosa ARS-NRRL B-59183, Pseudomonas aeruginosa ARS-NRRL B-59184, Enterobacter hormaechei ARS-NRRL B-59185, Pseudomonas aeruginosa ARS-NRRL B-59188, Enterobacter buriae ARS-NRRL B-59189 e Pseudomonas aeruginosa ARSNRRL B-59193, utilizando glicose, murumuru e andiroba.

[0038] Figura 2: Gráfico do perfil cinético da produção de ramnolipídeos após retiradas diárias de amostras durante 240 horas de cultivo

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17/23 de Pseudomonas aeruginosa em meio mineral com 10% dos resíduos andiroba, murumuru ou a mistura de ambos como substratos de crescimento em incubador rotativo a 180 rpm, a 30°C.

[0039] Figura 3: Gráfico do perfil da tensão superficial medida de amostras retiradas diariamente ao longo de 240 horas de cultivo de Pseudomonas aeruginosa em meio mineral com 10% dos resíduos andiroba, murumuru ou a mistura de ambos como substratos de crescimento em incubador rotativo a 180 rpm, a 30°C.

[0040] Figura 4: Gráfico do perfil cinético da produção de ramnolipídeo em biorreator no sistema livre de bolhas com controle de pressão de oxigênio e pH, conduzido em meio mineral com 10% de resíduos de semente de andiroba e com glicose 2% e 3g/L de sulfato de amônia.

[0041] Figura 5: Gráfico do perfil cinético da tensão superficial em biorreator no sistema livre de bolhas com controle de pressão de oxigênio e pH, conduzido em meio mineral com 10% de resíduo de semente de andiroba e com glicose 2% e 3g/L de sulfato de amônia.

[0042] Figura 6: Gráfico relativo a teste de espumação comparativo entre o ramnolipídeo produzido com o resíduo da semente de andiroba e com ramnolipídeo comercial (Sigma Aldrich).

[0043] Figura 7: Gráfico relativo a avaliação comparativa da estabilidade da espuma utilizando o ramnolipídeo produzido com o resíduo da semente de andiroba e com ramnolipídeo comercial (Sigma Aldrich). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0044] A produção de ramnolipídeo é realizada de acordo com as etapas:

[0045] A etapa (a) do processo consiste em reativar o microrganismo mantido em refrigeração em temperatura compreendida entre 70 a -100°C por meio de crescimento em caldo nutrie nte durante 10 a 30 horas, preferencialmente 15 a 25 horas, preferencialmente 21 ho

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18/23 ras, entre 25 e 40Ό, preferencialmente a 28°C e 35 °C, mais especificamente 30Ό, em uma plataforma agitadora com velocidade de agitação de 170 rpm a 200 rpm, preferencialmente 180 rpm.

[0046] O microrganismo da etapa (a) consiste em uma das bactérias listadas na Tabela 1, preferencialmente Pseudomonas aeruginosa, que é mantida refrigerada preferencialmente em criopreservação em ultrafreezer a uma temperatura entre cerca de -70 a -100°C, o caldo nutriente compreende preferencialmente extrato de carne na concentração de 3 g/L e peptona, a uma concentração de 5 g/L. Estes nutrientes são misturados com o auxílio de agitador magnético e submetidos ao processo de esterilização por calor úmido a 121°C, 1 atm, durante 15 minutos.

[0047] A etapa (b) consiste na preparação do inóculo, sendo que cada 1 ml proveniente da etapa (a) de reativação (a) é transferido, preferencialmente em 50 ml do caldo nutriente, durante 4 a 12 horas, preferencialmente entre 6 e 10 horas, mais especificamente cerca de 8 horas, em temperatura entre 20°C a 40°C, preferenci almente cerca de 28°C a 35°C, mais especificamente a 30°C, em uma pl ataforma agitadora com velocidade de agitação de 170 a 200 rpm, preferencialmente 180 rpm.

[0048] A etapa (c) consiste em bioprocesso em batelada em reator de tanque agitado e com aeração, preferencialmente com membranas microporosas, mais especificamente de tubos de silicone que permitem o fornecimento de oxigênio por difusão isento de bolhas, evitando a formação de espuma.

[0049] Este tipo de aeração permite diferentes configurações, preferencialmente a de a membrana/tubo poroso ser localizado internamente no líquido do biorreator na forma de serpentina. Por esta mangueira passa-se oxigênio puro com pressão e vazão adequada para manter a pressão de O₂ no biorreator em preferencialmente em 20%

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19/23 nas primeiras 24 horas. A agitação deve variar de 300 a 700 rpm, ajustados de acordo com o crescimento dos microrganismos de forma a manter sempre em 20% de saturação de O₂ utilizando impelidores radiais e ajuste manual ou automático conforme a diminuição da concentração de oxigênio dissolvido, sendo este um diferencial do processo em relação aos anteriormente citados no estado da técnica.

[0050] O cultivo em biorreator da etapa (c) é realizado em meio mineral constituído de sais e elementos traços de acordo com RAMSAY e colaboradores (RAMSAY, B. A.; LOMALIZA, K.; CHAVARIE, C.; DUBE, B.; BATAILLE, P.; RAMSAY, J. A. Production of Poly-(P-Hydroxybutyric-Co-3-Hydroxyvaleric) Acids. Applied and Environmental Microbiology, p. 2093-2098 v. 56 (7), 1990) conforme descrito nas Tabelas 2A e 2B. O processo deve ser mantido constante em temperatura de 28°C a 37°C , preferencialmente 30°C e pH de 6,5 a 7,2, preferencialmente pH 6,8, podendo ser controlado automaticamente pela adição de NaOH, preferencialmente na concentração de 4 mol/L, ou adição manual de H₂SO₄, preferencialmente na concentração de 2 mol/L.

Tabela1: Lista das linhagens bacterianas utilizadas nas etapas para a produção de ramnolipídeo.

Nome da Linhagem	Banco de Origem e número de registro	Número IPT
Pseudomonas aeruginosa (Schroeter 1872) Migula 1900 E03-31	ARS-NRRL B-59183	998
Pseudomonas aeruginosa (Schroeter 1872) Migula 1900 E03-36	ARS-NRRL B-59184	999
Enterobacter hormaechei O'Hara et al. 1990E03-50	ARS-NRRL B-59185	1000
Pseudomonas aeruginosa (Schroeter 1872) Migula 1900H05-11	ARS-NRRL B-59188	1001
Enterobacter buriae Brenner et al. 1988 H05-14	ARS-NRRL B-59189	1002
Pseudomonas aeruginosa (Schroeter 1872) Migula 1900 H05-45	ARS-NRRL B-59193	1005

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20/23

Tabela 2 A: Composição do meio mineral utilizado para crescimento e produção de ramnolipídeos.

Componentes do meio mineral	Concentração (g/L)
Fosfato de sódio dibásico (Na₂HPO₄)	3,5
Fosfato de potássio (KH₂PO₄)	1,5
Sulfeto de amônio (NH₄)₂SO₄	1,0 a 3,0
Sulfeto de magnésio (MgSO₄.7H₂O)	0,2
Cloreto de cálcio (CaCl₂.2H₂0)	0,01
Citrato férrico amoniacal	0,06
Solução de elementos traços (Tabela 3)	1,0 ml
Glicose	0 a 2,0
Resíduo sólido de Andiroba	100
H₂O destilada	q.s.p. 1 L
Tabela 2 B: Composição da solução de elementos traços.
Componentes da solução de elementos traço	Concentração (g/L)
Ácido Bórico (H₃BO₃)	0,3
Cloreto de cobalto (CoCl₂.6H₂0)	0,2
Sulfato de Zinco (ZnSO₄.7H₂0)	0,1
Cloreto de manganês (MnCl₂.4H₂O)	0,03
Molibidato de sódio (NaMoO₄.2H₂O)	0,03
Cloreto de níquel (NiCl₂.6H₂O)	0,02
Sulfato de cobre (CuSO₄.5H₂O)	0,01
H₂O destilada	q.s.p. 1L
CONCRETIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0051] Todas as linhagens apresentadas na Tabela 1 apresentaram produção de ramnolipídeo utilizando o resíduo de sementes de murumuru e andiroba indicando suas aplicações para a obtenção de tensoativo.

[0052] Entre as linhagens avaliadas todas apresentaram resulta

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21/23 dos semelhantes entre si de tensão superficial utilizando o resíduo da semente de andiroba e de murumuru.

[0053] A produção de ramnolipídeo foi realizada de acordo com: [0054] A etapa (a) do processo consistiu em reativar Pseudomonas aeruginosa, ou Enterobacter hormaechei ou Enterobacter buriae durante 21 horas em temperatura de 30°C, em uma plataforma agitadora com velocidade de agitação de 180 rpm, contendo o caldo nutriente de extrato de carne e peptona a uma concentração de 3 g/L e 5 g/L, respectivamente.

[0055] A etapa (b) consistiu na preparação do inoculo, sendo que cada 1 ml proveniente da etapa (a) de reativação foi inoculado em 50 ml do caldo nutriente, durante cerca de 8 horas, em temperatura de 30°C, em uma plataforma agitadora com velocidade de agitação de 180 rpm.

[0056] A etapa (c) consistiu em bioprocesso em batelada em reator de tanque agitado e com aeração por meio de tubos de silicone que permitiram o fornecimento de oxigênio puro por difusão isenta de bolhas, com pressão e vazão adequada para manter a pressão de O2 em 20% nas primeiras 24 horas, evitando a formação de espuma. Uma agitação de 300 rpm a 700 rpm no reator foi realizada por impelidores radiais e ajustou-se manualmente a diminuição da concentração de oxigênio dissolvido.

[0057] O processo foi mantido constante em temperatura de 30°C e pH de pH 6,8, sendo controlado pela adição de NaOH na concentração de 4 mol/L, ou adição de H₂SO₄ na concentração de 2 mol/L.

[0058] Os resíduos de andiroba e murumuru utilizados nos ensaios foram triturados previamente, utilizando processador doméstico com pulsos de 10 segundos ou liquidificador industrial com copo de inox de alta rotação (22.000 rpm), e potência de 1200 w. Após trituração, quando necessário, os resíduos foram peneirados por um conjunto de

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22/23 peneiras variando de 1,0 a 0,25 mm.

Resultados [0059] A linhagem Pseudomonas aeruginosa apresentou capacidade para sintetizar em torno de 10 g/L de ramnolipídeo a partir de resíduos de semente de andiroba triturada utilizada como substrato alternativo na concentração de 100 g/L.

[0060] A produção de ramnolipídeo utilizando o resíduo de semente de andiroba foi em torno de 4 vezes superior à produção obtida com o resíduo de semente de murumuru. A tensão superficial do sobrenadante do cultivo com o resíduo da semente de andiroba (< 35 dina/cm) também foi melhor que a tensão obtida com o resíduo de semente de murumuru (> 35 dina/cm).

[0061] Os resíduos de semente de andiroba e de murumuru foram caracterizados com relação à sua composição, mostrando a presença carboidratos, lipídios e proteínas em ambos os resíduos. Resíduo de semente de murumuru apresentou 53,4% de carboidratos, 29,0% de lipídios e 6,8% de proteínas. Resíduo de semente de andiroba apresentou 63,4% de carboidratos, 14,8% de lipídios e 10,4% de proteínas. Outros componentes como cinzas e umidade também foram quantificados, sendo 1,4% de cinzas em resíduo de semente de murumuru e 4,3% de cinzas em resíduo de semente de andiroba.

[0062] A molécula de biossurfactante ramnolipídica produzida utilizando resíduo de semente de andiroba apresentou tensão superficial de 30 a 40 dina/cm e índice de emulsificação superior a 60%. Com resíduo de murumuru, a tensão superficial obtida foi de 40 a 50 dina/cm e o índice de emulsificação também superior a 60%.

[0063] O ramnolipídeo produzido não apresentou citotoxicidade nos ensaios in vitro e apresentou bom desempenho nas propriedades tensoativas e de formação de espuma. Este desempenho em equipamento que permite verificar a capacidade espumógena de soluções,

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23/23 que contêm tensoativo, através da agitação e aferição da estabilidade da espuma obtida por essa agitação. As medidas de espumação média são obtidas após quatro leituras do decaimento de espuma durante tempo de cinco minutos. Nesta avaliação, foi utilizada concentração corrigida de tensoativos levando em consideração o teor das amostras para 0,1% de ativo. Os testes foram feitos com o ramnolipídeo produzido em biorreator e seco em liofilizador versus ramnolipídeo padrão Sigma Aldrich.

[0064] Os resultados de espumação média do ramnolipídeos produzido com o resíduo de semente de andiroba mostram-se melhores que os obtidos pelo ramnolipídeo padrão Sigma Aldrich.

[0065] Observou-se que a estabilidade de espuma do ramnolipídeo é muito boa quando comparamos ao padrão de ramnolipídeo, o que torna o produto interessante para aplicação em cosméticos, uma vez que mantem a espuma estável durante o tempo de análise.

[0066] A molécula de ramnolipídeo também se mostrou bastante estável, indicando que esse biossurfactante produzido tem aplicação na indústria de cosmético devido sua capacidade de emulsificação, estabilidade e não toxicidade in vitro.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando o resíduo sólido resultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru, de acordo com as seguintes etapas:

(a) reativar o microrganismo criopreservado emmeio de crescimento caldo de nutriente; uma etapa (b) preparação do inóculo;

c) bioprocessamento em batelada em reator de tanque contendo o resíduo sólidos resultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru , agitado e com aeração, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende reativar microrganismos das espécies Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter hormaechei ou Enterobacter buriae, mantidos em criopreservação em temperatura compreendida entre -70 a -100°C, por meio de crescimento em caldo nutriente durante 10 a 30 horas, em temperatura entre 25 e 40°C, em uma plataforma agitadora com velocidade de agitação de 170 rpm a 200 rpm, e o caldo nutriente compreender extrato de carne e peptona, nutrientes esses misturados com o auxílio de agitador e submetidos a processo de esterilização por calor úmido a 121°C, 1 atm, durante 15 minutos, ;

a etapa (b) preparação do inóculo, transferindo o material proveniente da etapa (a) de reativação para caldo nutriente, durante 4 a 12 horas, em temperatura entre 20°C a 40°C, em um a plataforma agitadora com velocidade de agitação de 170 a 200 rpm; a etapa (c) consistir em bioprocesso em batelada em reator de tanque agitado de 300 a 700 rpm e com aeração com membranas microporosas por onde se passa oxigênio puro com pressão e vazão adequada para manter a pressão de O2 no biorreator em 20% nas primeiras 24 horas, sendo que a agitação deve variar em ajuste de acordo com o crescimento

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2/4 dos microrganismos, de forma a manter sempre em 20% de saturação de O2 pela utilização de impelidores radiais e ajuste manual ou automático conforme a diminuição da concentração de oxigênio dissolvido, mantendo-se o processo constante em temperatura de 28°C a 37°C , e pH de 6,5 a 7,2, sendo o meio mineral desta etapa constituído de sais e elementos traços.

2. Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando o resíduo sólido resultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por etapa (a) reativar os microrganismos em caldo nutriente durante 15 a 25 horas, em temperatura entre 28°C e 35°C, em uma plataforma agitadora com velocidade de agitação de 180 rpm, e o caldo nutriente compreender extrato de carne na concentração de 3 g/L e peptona a uma concentração de 5 g/L; a etapa (b) preparação do inóculo pela transferência de 1 mL do material da etapa (a) em 50 mL do caldo nutriente durante 6 e 10 horas, em temperatura entre 28°C a 35°C, em uma plataforma agitadora com velocidade de agitação de 180 rpm; a etapa (c) bioprocesso em batelada em reator de tanque agitado e com aeração com membranas microporosas de tubos de silicone localizados internamente no líquido do biorreator na forma de serpentina, mantendo-se o processo constante em temperatura de 30°C e pH 6,8, podendo ser controlado pela adição de NaOH, na concentração de 4 mol/L, ou adição de H2SO4, na concentração de 2 mol/L.
3. Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando o resíduo sólido resultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por etapa (a) reativar o microrganismo em caldo nutriente durante 21 horas, em temperatura de 30°C; a etapa (b) preparação do inóculo pela transferência

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3/4 do material da etapa (a) ao caldo nutriente durante 8 horas, em temperatura de 30°C.
4. Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando o resíduo sólido resultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar as bactérias Pseudomonas aeruginosa ARS-NRRL B-59183 ou ARS-NRRL B59184 ou ARS-NRRL B-59188 ou ARS-NRRL B-59193; ou Enterobacter hormaechei ARS-NRRL B-59185 ou Enterobacter buriae ARSNRRL B-59189.
5. Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando o resíduo sólido resultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado por se utilizar as bactérias Pseudomonas aeruginosa ARS-NRRL B-59183 ou ARSNRRL B-59184 ou ARS-NRRL B-59188 ou ARS-NRRL B-59193.
6. Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando o resíduo sólido resultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o cultivo em biorreator da etapa (c) ser realizado em meio mineral constituído de 3,5 g/L Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4), 1,5 g/L Fosfato de potássio (KH2PO4), 1,0 a 3,0 g/L Sulfato de amônio (NH4)2SO4, 0,2 g/L Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O), 0,01 g/L Cloreto de cálcio (CaCl2.2H20); 0,06 g/L Citrato férrico amoniacal, 0 a 2,0 g/L Glicose, 100 g/L Resíduo sólido de Andiroba, 1,0 ml / g/L Solução de elementos traços, q.s.p. 1 L H2O destilada; e a Solução de elementos traço ser constituída de 0,3 g/L Ácido Bórico (H3BO3), 0,2 g/L Cloreto de cobalto (CoCl2.6H20); 0,1 Sulfato de Zinco (ZnSO4.7H20) g/L, 0,03 g/L Cloreto de manganês (MnCl2.4H2O), 0,03 g/L Molibidato de sódio (NaMoO4.2H2O), 0,02 g/L

Petição 870190009024, de 28/01/2019, pág. 6/15

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Cloreto de níquel (NÍCI2.6H2O), 0,01 g/L Sulfato de cobre (CUSO4.5H2O), q.s.p. 1L H2O destilada.
7. Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por Pseudomonas ou Enterobacter utilizando o resíduo sólidoresultante do processo de extração de óleo de sementes de andiroba ou murumuru, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos resíduos resultantes do processo de extração de óleo de sementes de andiroba e murumuru utilizados serem triturados previamente e, após trituração, quando necessário, os resíduos serem peneirados por um conjunto de peneiras variando de 1,0 a 0,25 mm.