BR102016031053A2 - método para aumento da tolerância de plantas a seca e plantas transgênicas - Google Patents
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Abstract
método para aumento da tolerância de plantas a seca e plantas transgenicas a presente invenção descreve um método para aumento da tolerância de plantas a seca, a qual é conferida por meio da superexpressão do gene scbhlh47, homólogo ao gene atbhlh47de arabidopsisthaliana. ainda, a invenção pode ser ampliada para os genes homólogos de outras espécies de plantas. ainda, esta invenção se refere às plantas transgênicas obtidas, as quais compreendem a sequência de polinucleotídeo scbhlh47 da cana-de-açúcar.
Description
(54) Título: MÉTODO PARA AUMENTO DA TOLERÂNCIA DE PLANTAS A SECA E PLANTAS TRANSGÊNICAS (51) Int. Cl.: C12N 15/29; C12N 15/84; A01H 6/20; A01H 6/00 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP (72) Inventor(es): VANESSA REGINA GONÇALVES; ISABELLA DE OLIVEIRA CONTE POLETTO; GLAUCIA MENDES SOUZA; CAROLINA LEMBKE; MARCELO MENOSSI TEIXEIRA (85) Data do Início da Fase Nacional:
22/12/2016 (57) Resumo: MÉTODO PARA AUMENTO DA TOLERÂNCIA DE PLANTAS A SECA E PLANTAS TRANSGÊNICAS A presente invenção descreve um método para aumento da tolerância de plantas a seca, a qual é conferida por meio da superexpressão do gene ScbHLH47, homólogo ao gene AtbHLH47de Arabidopsisthaliana. Ainda, a invenção pode ser ampliada para os genes homólogos de outras espécies de plantas. Ainda, esta invenção se refere às plantas transgênicas obtidas, as quais compreendem a sequência de polinucleotídeo ScbHLH47 da cana-de-açúcar.
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MÉTODO PARA AUMENTO DA TOLERÂNCIA DE PLANTAS A SECA E PLANTAS TRANSGÊNICAS
Campo da invenção:
[1] Esta invenção se insere no campo da biotecnologia, mais especificamente no que diz respeito à produtividade vegetal, e descreve um método para aumento da tolerância de plantas a seca pela superexpressão de gene da cana-de-açúcar em outras espécies de plantas.
[2] Adicionalmente, a presente invenção se refere às plantas transgênicas obtidas de acordo com o método descrito e compreendendo a sequência de polinucleotídeodo gene alvo da cana-de-açúcar.
Fundamentos da invenção:
[3] O aumento do crescimento populacional, bem como a redução de terras disponíveis para a agricultura, afeta a produção total das plantas cultivadas.
[4] Adicionalmente, um fator importante que reduz produtividade são os estresses abióticos, sendo que, de todos os recursos físico-químicos utilizados pelas plantas (água, nutrientes, gás carbônico, oxigênio e luz solar), a água é o recurso mais limitante.
[5] A seca é um dos principais estresses abióticos no cultivo da cana-de-açúcar. As instabilidadesclimáticas alteram drasticamente os períodos de seca em diferentes regiões do planeta e a redução da disponibilidade de água no solo é a principal causa de prejuízos econômicos na agricultura. Ainda, com o aumento da temperatura global decorrente das mudanças climáticas, espera-se que os efeitos da seca nas plantas cresçam.
[6] Tendo em vista os eventos de escassez hídrica que
2/8 ocorrem em todas as áreas cultivadas, faz-se necessário o desenvolvimento de variedades que apresentem uma tolerância . ao déficit hídrico melhorada.
[7] Em vista desse fato, a análise do conhecimento adquirido acerca dos fatores de transcrição pode contribuir para modular a tolerância ao déficit hídrico, pois: (i) os fatores de transcrição atuam upstream nas vias de regulação; (ii) existe um crosstalk com outros genes relacionados funcionalmente para conferir tolerância a estresses; (iii) são conservados, com o qual podem ser validados em outras plantas e (iv) já existem relatos na literatura de genes homólogos aos genes da cana que protegem contra o estresse.
[8] Sendo assim, a presente invenção propõe um método para aumento da tolerância de plantas à seca, em especial a Arabidopsis thaliana, pela inserção de um vetor contendo a sequência de polinucleotídeo ScbHLH47 de cana-de-açúcar.
[9] 0 uso da A.thaliana na validação de genes da canade-açúcar é uma alternativa interessante, devido ao amplo conhecimento adquirido sobre essa planta nos estudos funcionais de genes.
[10] O gene ScbHLH47 tem homologia com o gene AtbHLH47 conhecido em A. thaliana e as plantas que o superexpressam podem aumentar a produtividade no campo em condições de estresse hídrico. Ainda, a invenção pode ser ampliada para os genes homólogos de outras espécies de plantas.
Estado da técnica:
[11] Alguns documentos do estado da técnica descrevem a superexpressão de genes para conferir tolerância às mais diversas situações, tais como os documentos US 2015/0197764
3/8
Al e US 2015/0101079 Al.
[12] No estudo OsbHLH148, a basíchelix-loop, helixprotein, ÍnteractswithOsJAZproteins in a jasmonãtesignalingpathwayleadingtodroughttolerance in rice (Seo, J. S. et al·., 2011), plantas transgênicas superexpressando o gene OsbHLHl48 também conferem tolerância ao estresse por seca severa. Entretanto, a porcentagem de identidade global entre as proteínas codificadas pelos genes ScbHLH47 e OsbHLHl48 é de apenas 13,75%.
[13] Em bHLH122 isimportant for droughtandosmotic stress resistance in Arabidopsisand in therepressionof ABA catabolism (Liu, W., 2014) e A novel bHLHtranscriptionfactor PebHLH35 fromPopuluseuphraticaconfersdroughttolerancethroughregulati ngstomataldevelopment, photosynthesisandgrowth in Arabidopsis (Dong, Y., 2014), plantas transgênicas superexpressando os genes bHLH122 e bHLH35 também conferem tolerância ao estresse por seca severo, no entanto, a porcentagem de identidade global entre as proteínas codificadas pelos genes ScbHLH47 e bHLH122 é de 14,58% e entre ScbHLH47 e PebHLH35 é de 12,9%.
[14] Genes como o bHLH92 e o AtMYC2 também conferem, respectivamente, tolerância ao estresse osmótico por manitol (Jiang, Y. et al·., 2009) e sensibilidade ao ABA {Abe, H. et al., 2003), mas não foi identificada tolerância à seca nas plantas transgênicas superexpressando os referidos genes.
Breve descrição da invenção:
[15] A presente invenção descreve um método para aumento da tolerância de plantas a seca, a qual é conferida por meio da superexpressâo do gene ScbHLH47da cana-de4/8 açúcar .
[16] Ainda, a referida invenção se refere às plantas transgênicas obtidas, as quais compreendem a sequência de polinucleotídeoScb/íi/í-í 7.
Breve descrição das figuras:
[17] A Figura 1 representa esquematicamente o vetor pGWB608 contendo o gene ScbHLH47controlado pelo promotor
CamV35S.
[18] A Figura 2 representa graficamente a análise por PCR quantitativa (qPCR) da expressão do gene ScbHLH47em duas variedades de cana-de-açúcar, em que a barra preta indica condições irrigadas e a barra cinza condições de estresse hídrico.
[19] A Figura 3 mostra a expressão do gene ScbHLH47 em plantas transgênicas de A.thaliana por RT-PCR de 3 eventos homozigóticos independentes.
[20] A Figura 4 mostra o ensaio de sobrevivência com suspensão de rega, em que 'Bll', 'B12', 'B13' e 'Bl4'são eventos homozigóticos independentes para o gene ScbHLH47 e 'VV1' e VV2 indicam eventos independentes contendo somente o vetor vazio.
[21] A Figura 5 representa graficamente a análise de área foliar de 3 eventos independentes superexpressando o gene ScbHLH47, e VV contendo somente o vetor vazio sob estresse moderado ao estresse hídrico.
[22] As Figuras 6A e 6B representam graficamente o teor de clorofilas 'a' e 'b' em 3 eventos independentes superexpressando o gene ScbHLH47 após o tratamento de rega moderada.
Descrição detalhada da invenção:
5/8 [23] Esta invenção descreve um método para aumento da tolerância de plantas a seca, bem como as referidas plantas transgênicas obtidas.
[24] As plantas transgênicas compreendem a sequência de um polinucleotídeoda cana-de-açúcar o qual codifica um polipeptídeo apresentando 33,3% de homologia com a proteína de A.thaliana denominada bHLH47.Ainda, a invenção pode ser ampliada para os genes homólogos de outras espécies de plantas.
[25] A sequência do polinucleotídeo está indicada na SEQ. ID. n° 1 e o polipeptídeo traduzido a partir desta sequência está indicado na SEQ. ID. n° 2. 0 polinucleotídeo controla direta ou indiretamente a resposta de plantas contra o estresse hídrico.
[26] 0 método compreende as etapas de:
(a) Amplificação da sequência do gene ScbHLH47 da canade-açúcar;
(b) Inserção do produto da amplificação no vetor Gateway;
(c) Extração do plasmídeo resultante e clonagem no vetor pGWB608, de forma que a região codificante do gene ScbHLH47 (Seq ID No 1) esteja operacionalmente ligada a um promotor e um terminador; e (d) Transformação das plantas.
[27] Na etapa (a), a amplificação da sequência do gene ScbHLH47 da cana-de-açúcar foi realizada por meio do uso dos oligonucleotídeos específicos indicados na SEQ. ID. n° 3 e na SEQ. ID. n° 4.
[28] Ao final da etapa (c) , a construção recombínante inclui o promotor 35S do vírus do mosaico de couve-flor (CamV35S) e o terminador do gene da Nopalinasintase (NOS),
6/8 tal· como mostrado na Figura 1.
[29] Por fim, na etapa (d), as plantas selvagens de A. thaliana são transformadas utilizando o método floral dip, ou seja, mediado por Agrobacterium, em especial Agrobacterium tumefaciens GV3101.
[30] As plantas transgênicas obtidas compreendem a sequência ScbHLH47 da cana-de-açúcar, tal como definida na SEQ. ID. n° 1, a qual traduz o polipeptídeo indicado na SEQ. ID. n° 2.
Testes realizados:
- Avaliação da expressão gêníca de 5cbHLH47 em plantas de cana-de-açúcar:
[31] Para avaliar o nível de expressão do gene ScbHLH47, foram utilizadas folhas de dois cultivares de cana-deaçúcar, a saber, RB867515 (maior tolerância à seca) e RB855536 (menor tolerância à seca), crescidas sob irrigação ou suspensão de rega (sequeiro).
[32] Como gene de referência, foi utilizado o gene que codifica a poliubiquitina da cana-de-açúcar. As folhas foram coletadas 7 meses após o plantio e as reações de PCR quantitativo (qPCR) usou oligonucleotídeos específicos.
[33] O resultado da qPCR mostrou que o gene ScbHLH47 é induzido por estresse de déficit hídrico nas duas variedades de cana analisadas. Os valores estatísticos foram significativos no cultivar mais tolerante ao estresse por seca (RB867515), conforme mostrado na Figura 2.
Produção das plantas transgênicas e análise da expressão do gene ScbHLH47;
[34] As sementes selvagens de A.thaliana foram incubadas por 4 dias e depois semeadas diretamente no solo,
7/8 sendo a transformação realizada pelo método floral dip. As folhas das plantas transgênicas foram coletadas para extração de DNA e confirmação da presença do transgene por PCR. As sementes das plantas com inserção confirmada do gene ScbHLH47 foram cultivadas para seleção de eventos com cópias únicas do gene ScbHLH47. Em seguida, os eventos de cópias únicas foram selecionados para a produção de eventos em homozigose e as folhas de plantas homozigóticas foram utilizadas na extração de RNA após 3 semanas de germinação.
[35] 0 resultado da amplificação de cDNA confirmando a expressão do gene ScbHLH47 em plantas de Arabidopsis é mostrado na Figura 3.
- Teste de sobrevivência por suspensão de rega:
[36] Sementes de 3 eventos das plantas de Arabidopsis transgênicas homozigotas e plantas de Arabidopsis contendo somente o vetor vazio (VV) foram cultivadas em substrato especifico. As plantas cresceram em condições normais e, após 10 dias de rega normal, o peso dos potes foi normalizado para 100% da capacidade de água e a rega foi suspensa por 2 semanas, até a maioria das plantas apresentarem sinais claros de murchamento.
[37] Após esse período, as plantas foram reidratadas e, após 48h, foi determinado o número de plantas que sobreviveram.
[38] A Figura 4 mostra que um dos eventos das plantas de A. thalianasuperexpressando o gene ScbHLH47, chamado de B12”, apresentou uma taxa de sobrevivência de 50% após a reidratação e nenhuma planta usada como controle sobreviveu (VV). Assim, podemos concluir que a superexpressão do gene ScbHLH47 em plantas de A. thalianacontribui para maior
8/8 sobrevivência ao estresse hídrico por suspensão de rega. - Teste de sobrevivência em ensaio de rega moderada:
[39] Sementes de 3 eventos das plantas de A. thalianatransgênicas homozigotas e plantas de A. thaiianacontendo somente o vetor vazio (VV) foram cultivadas em substrato específico. As plantas cresceram em condições normais e foram submetidas ao estresse moderado (1,2 g de água / g de solo seco) por 21 dias. Ao final do tratamento, as rosetas foram coletadas para análises de: área foliar e clorofila.
[40] Para medição de área foliar, as folhas foram cortadas e a área da roseta foi medida com o programa ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij). Os eventos transgênicos apresentaram maior área foliar do que o vetor vazio sob condições de rega moderada com diferenças estatísticas (conforme pode ser observado na Figura 5).
~ Ensaio de teor de clorofila:
[41] Ά extração de clorofila foi feita com Acetona 80 % a partir de 200 mg de folha fresca, conforme protocolo de Arnon (1949). 0 sobrenadante foi lido em espectrofotômetro a 645 nm para a clorofila 'a' e 663 nm para a clorofila 'b'.
[42] A medição das clorofilas demonstrou que os eventos transgênicos apresentaram diferença estatística ao serem comparados ao vetor vazio para ambos os pigmentos, sendo que os níveis de clorofila 'b' foram ainda mais elevados (vide Figura 6).
1/2
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para aumento da tolerância de plantas a seca caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) Amplificação da sequência do gene ScbHLH47 da canade-açúcar;(b) inserção do produto da amplificação no vetor Gateway;(c) Extração do plasmideo resultante e clonagem no vetor pGWB608, de forma que a região codificante do gene ScbHLH47 (Seq ID No 1) esteja operacionalmente ligada a um promotor e um terminador; e (d) Transformação das plantas.
- 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa (a), a amplificação da sequência do gene ScbHLH47 da cana-de-açúcar ser realizada por meio do uso dos oligonucleotideos específicos indicados na SEQ. ID. n° 3 e na SEQ. ID. n° 4.
- 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
pelo fato de, ao final da etapa (d) , a construção recombinante incluir o promotor 35S do vírus do mosaico de couve-flor (CamV35S ) e 0 terminador do gene da Nopalinasintase (NOS). - 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa (e), as sementes selvagens deA.thaliana serem transformadas utilizando o método floral dip.
- 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o método floral dip” ser mediado por Agrobacterium, em especial Agrobacterium tumefaciens GV3101.
- 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser aplicável aos genes2/2 homólogos de outras espécies de plantas.
- 7. Plantas transgênicas caracterizadas pelo fato de serem transformadas de acordo com o método tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
- 8. Plantas transgênicas, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadas pelo fato de compreender o gene SchHLH47 da cana-de-açúcar, tal como definido na SEQ. ID. n° 1, que codifica o polipeptídeo indicado na SEQ. ID. n° 2, em que o referido polipeptídeo apresenta 33,3% de homologia com o gene AtbHLH47.1/3FIGURA 1Expressão relativa de ScbHLH47RB855536RB867515FIGURA 22/3FIGURA 3FIGURA 43/3Conteúdo de Clorofila a (mg/LjFIGURA 6AFIGURA 6B1/1
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