BR102016009754A2 - Method of detection of proper intake of inhibiting medication of the inosine enzine dehydrogenase monophosphate ii, use of the method and kit for executing the method - Google Patents

Abstract

método de detecção de ingestão adequada de medicação inibidora da enzima inosina monofosfato dehidrogenase i e ii, uso do método e kit para executar o método a presente invenção se aplica no campo da ciência médica, de forma mais específica, na área de processos para fins de diagnose, e faz referência a um método de detecção de ingestão adequada de medicação inibidora da enzima inosina monofosfato dehidrogenase i e ii (impdh 1 e 2) através da formação de estruturas anéis e bastões (“rods and rings” - rr) em células circulantes como parâmetro. ainda, esta invenção descreve o uso do método ora proposto para investigar a adesão ao tratamento medicamentoso com ribavirina na hepatite c, podendo ser estendida para outros contextos clínicos que compreendam o uso de medicação que ocasione a formação de estruturas tipo rods and rings formadas por agregados da enzima impdh. adicionalmente, a presente invenção se refere a um kit para executar o método aqui descrito

Description

MÉTODO DE DETECÇÃO DE INGESTÃO ADEQUADA DE MEDICAÇÃO INIBIDORA DA ENZIMA INOSINA MONOFOSFATO DEHIDROGENASE I E II, USO DO MÉTODO E KIT PARA EXECUTAR O MÉTODO Campo da invenção: [001] A presente invenção se aplica no campo da ciência médica, de forma mais especifica, na área de processos para fins de diagnose, e faz referência a um método de detecção de ingestão adequada de medicação inibidora da enzima Inosina Monofosfato Dehidrogenase I e II (IMPDH 1 e 2) através da formação de estruturas anéis e bastões ("rods and rings" - RR ou Cytoophidium) em células circulantes como parâmetro.

[002] Ainda, esta invenção descreve o uso do método ora proposto para investigar a adesão ao tratamento medicamentoso com ribavirina na hepatite C. Adicionalmente, a presente invenção se refere a um kit para executar o método aqui descrito.

Fundamentos da invenção: [003] A hepatite C é uma doença crônica com expressividade epidemiológica que evolui de forma silenciosa e que, na maioria dos casos, só é diagnosticada em estágio avançado, com indícios de fibrose e insuficiência hepática.

[004] No Brasil, o Sistema Único de Saúde (SUS) garante atendimento ambulatorial e hospitalar para os portadores desta enfermidade, incluindo acesso gratuito aos medicamentos necessários, muitos destes considerados de alto custo. O tratamento da hepatite C envolve a utilização desses medicamentos por um período longo, em que o sucesso depende, em muito, da adesão do paciente às recomendações da equipe de saúde.

[005] A terapia atualmente recomendada para o tratamento da hepatite C (THC) é a combinação de ribavirina (RBV) e interferon (INF) . A RBV é administrada por via oral, na forma de cápsulas, e o INF é aplicado três vezes por semana, por via subcutânea.

[006] No contexto da hepatite C, "baixa adesão" é considerada como o não cumprimento da totalidade da dose prescrita, tanto de RBV quanto INF, dentro do tempo de tratamento estipulado. Trata-se como "boa adesão" ao THC pacientes que seguem a regra 80/80/80 (administração de 80% de RBV e 80% de INF durante 80% do tempo prescrito de tratamento). É sabido que a obtenção da resposta virológica sustentada (RVS) ocorre mais frequentemente nos tratamentos que seguem essa regra, por esse motivo, a adesão tem importância fundamental no desfecho do THC.

[007] No entanto, tem sido observado que a principal razão para a não adesão à terapia com IFN e RBV é o aparecimento de reações adversas (RA) . Entre as manifestações mais comuns com a utilização de RBV encontram-se a cefaleia, dores musculares, sensação de boca seca, náuseas, vômitos, perda de apetite, sensação de cansaço, irritabilidade, ansiedade e alterações de humor. Ademais, podem ocorrer citopenias e anemia, devido ao seu potencial hemolitico.

[008] Desse modo, é muito frequente que o paciente não responda ao THC pelo fato do mesmo não estar ingerindo corretamente as drogas, principalmente a ribavirina, devido aos efeitos colaterais causados. E, por esse motivo, pode influenciar a suspensão dos medicamentos fornecidos pelo governo e substituição por drogas de custo muito mais elevado.

[009] Portanto, a comprovação de que o paciente está ingerindo as drogas corretamente, tal como a RBV, é muito importante para o sucesso no tratamento e para evitar custos desnecessários, principalmente em serviços públicos em que a RBV é distribuída gratuitamente.

[010] Rastrear se os pacientes estão ingerindo adequadamente uma determinada droga e, portanto, aderindo adequadamente ao tratamento proposto pelo médico é um dos principais desafios da pesquisa atual.

[011] Por esse motivo, a presente invenção propõe um método de detecção de ingestão adequada da medicação inibidora de IMPDH, tal como as drogas ribavirina, micofenolado mofetil, azatioprina, metotrexato e aciclovir, dentre outros. A aplicação do método aqui proposto é muito ampla, desde que anteriormente seja comprovado, por experimentos laboratoriais, que tal droga induz a formação das estruturas anéis e bastões, do inglês "rods and rings" (RR), também chamada na literatura de Cytoophidium ou Cytoophidia (do grego "cobras celulares"). Além de sua vasta aplicação de cunho extremamente prático, o método é barato e rápido, sendo acessível através do sangue do paciente, o que evita procedimentos mais invasivos.

[012] A observação de tais estruturas em células circulantes do paciente serve como indicador da ingestão de drogas que interferem com as vias de síntese do nucleotídeo guanina, tais como os inibidores da enzima Inosina Monofosfato Dehidrogenase I e II (IMPDH 1 e 2) . Ao ser inibida, esta enzima se agrega sob a forma de característicos anéis e bastões no citoplasma celular, logo, a observação destas estruturas indica se o paciente ingeriu ou não corretamente as drogas.

[013] Assim, a presente invenção ainda descreve o uso do método em questão para investigar a adesão da ribavirina no tratamento medicamentoso contra a hepatite C. Adicionalmente, a presente invenção se refere a um kit para executar o método aqui descrito.

Estado da técnica: [014] Alguns documentos do estado da técnica descrevem um método para identificar um agente inibidor da enzima IMPDH 1 e 2.

[015] Em US6107052A, é descrito um método para determinar inibidores da enzima IMPDH em amostras biológicas através do monitoramento da produção de NADH.

[016] Diferentemente, a presente invenção descreve um método para identificar a formação de estruturas anéis e bastões, do inglês "rods and rings" (RR), em células circulantes como parâmetro para testemunhar a ingestão adequada da medicação inibidora de IMPDH. Além da diferença de etapas, o presente método é mais simples, rápido e barato.

[017] Em US2010015620A1, é descrito um método para identificar um agente inibidor da enzima IMPDH. Além das etapas descritas serem totalmente diferentes da invenção aqui proposta, a finalidade do método descrito no documento US2010015620A1 também é diferente, uma vez que se trata de um método para monitorar a atividade de agentes inibitórios da enzima IMPDH em pacientes com câncer.

[018] Já em "Ultrastructure of Cytoplasmic and Nuclear Inosine-5'- Monophosphate Dehydrogenase 2 "Rods and Rings" Inclusions" de Juda P. et al (2014), é revelado que o uso de inibidores da IMPDH2 in vitro gera estruturas RR em células vivas. No entanto, a presente invenção propõe um método pelo qual é possível observar essas estruturas (RR) em células circulantes de pessoas que ingerem esses medicamentos, tais como a ribavirina (geração de estruturas RR in vivo) .

[019] Portanto, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve um método de detecção de ingestão adequada da medicação inibidora da enzima Inosina Monofosfato Dehidrogenase I e II (IMPDH 1 e 2) através do uso da formação de estruturas RR em células circulantes como parâmetro, tal como o descrito na presente invenção. Consequentemente, também não há documentos que fazem referência ao uso desse método para investigar a adesão da ribavirina utilizada em tratamento medicamentoso na hepatite C, nem seu respectivo kit para executar o mesmo.

Breve descrição da invenção: [020] A presente invenção se refere a um método de detecção de ingestão adequada de medicação inibidora da enzima Inosina Monofosfato Dehidrogenase I e II (IMPDH 1 e 2) através do uso da formação de estruturas RR em células circulantes como parâmetro indicador. 0 presente método compreende as etapas de a) separação e isolamento de células obtidas a partir de amostras biológicas, b) preparação das lâminas, c) reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) ou imunoenzimática e d) observação das estruturas RR.

[021] Ainda, esta invenção descreve o uso do método ora proposto para investigar a adesão ao tratamento medicamentoso com ribavirina na hepatite C. Adicionalmente, a presente invenção se refere a um kit para executar o método aqui descrito.

Breve descrição das figuras: [022] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[023] A Figura 1 representa uma imagem das estruturas RR em vermelho com aumento de 400x após a aplicação do método aqui descrito indicando a ingestão adequada da medicação inibidora de IMPDH2.

[024] A Figura 2 representa uma observação detalhada das estruturas RR apenas no canal vermelho também com aumento de 400x, servindo de referência para a observação das estruturas.

[025] A Figura 3 é uma representação de como as estruturas RR serão observadas ao microscópio com aumento de lOOOx na cor verde.

Descrição detalhada da Invenção: [026] A presente invenção se refere a um método de detecção de ingestão adequada da medicação inibidora da enzima Inosina Monofosfato Dehidrogenase I e II (IMPDH 1 e 2), o qual compreende as etapas de: a) Separação e Isolamento de células obtidas a partir de amostras biológicas; b) Preparação das lâminas; c) Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) ou imunoenzimática; e d) Observação das estruturas anéis e bastões, do inglês "rods and rings" (RR), também chamada na literatura de Cytoophidium ou Cytoophidia (do grego "cobras celulares") .

[027] As etapas do presente método estão mais bem detalhadas a seguir. a) Separação e Isolamento de células obtidas a partir de amostras biológicas: [028] Nesta etapa, as referidas amostras biológicas são selecionadas do grupo que consiste em sangue, partes do corpo, tal como do figado, saliva, e outros, preferencialmente sangue.

[029] A titulo de exemplificação, as etapas do método em questão utilizam o sangue como amostra biológica. No entanto, esta exemplificação não implica em qualquer limitação da invenção aqui descrita.

[030] Primeiramente, obtém-se de 5ml a lOml de amostra biológica, preferencialmente sangue fresco, em tubo com heparina ou outro anticoagulante apropriado. O volume do tubo com heparina pode variar, assim como o volume de sangue coletado, recomenda-se coletar um ou dois tubos. Vale ressaltar que o procedimento do presente método deve ser realizado até 6 horas após a coleta.

[031] Assim, depois de transferir a amostra para recipiente adequado, adiciona-se o equivalente a 100% da amostra em tampão salina fosfato (PBS) ou tampão equivalente, mistura-se e adiciona-se o equivalente a 33% de amostra/PBS em solução geradora de gradiente (SGG), de modo que se acomode no fundo do recipiente para produzir um gradiente de densidade.

[032] A mistura entre o sangue, o PBS e a SGG deve ser feita na proporção 1:1:1 de modo a obter 100% do volume em três partes iguais, tal como 5ml de sangue, 5ml de PBS e 5ml de SGG.

[033] Logo após, a mistura obtida é centrifugada em temperatura ambiente (TA) sob rotação que varia de 1500 a 2500 rpm por um período de tempo que varia de 2 0 a 60 minutos.

[034] Após a centrifugação, forma-se uma nuvem de células gerada acima da SGG. A mesma é coletada e transferida para um recipiente adequado.

[035] As referidas células consistem em células mononucleares de sangue periférico (CMSP). Outras células do corpo, tal como do fígado, saliva e outros também podem ser utilizadas, porém recomenda-se preferencialmente CMSP.

[036] Desse modo, adicionam-se o equivalente a 5 até 10 vezes o volume da nuvem de células coletada em PBS, usualmente de 5ml a 15ml de PBS, acrescido de 3% a 5% de paraformaldeído nas células coletadas anteriormente.

[037] Posteriormente, a mistura é centrifugada à rotação que varia de 1000 a 3000 rpm durante pelo menos 15 minutos. As células irão se acomodar no fundo do recipiente/tubo formando um pellet.

[038] Logo após, descarta-se o sobrenadante, e adicionam-se o equivalente a 5 até 10 vezes o volume do pellet em PBS, usualmente de 5ml a 15ml de PBS, o qual será adicionado às células coletadas e misturado até a sua diluição.

[039] Logo após a dissolução, a mistura é centrifugada à rotação que varia de 1000 a 3000 rpm durante pelo menos 15 minutos e descarta-se o sobrenadante.

[040] Às células coletadas, adiciona-se novamente o equivalente a 5 ate 10 vezes o volume do pellet em PBS, usualmente 5ml a 15ml , mistura-se até a sua diluição e subsequentemente, centrifuga-se à rotação que varia de 1000 a 3000 rpm durante pelo menos 15 minutos.

[041] Desse modo, o sobrenadante resultante é descartado e, às células coletadas no fundo do tubo, são adicionados o equivalente a 1 até 3 vezes o volume do pellet em PBS, usualmente de 500μ1 a 2 ml de PBS, com 1% Albumina Bovina Sérica (ABS), que é misturado até a diluição do mesmo.

[042] Vale ressaltar que o volume da solução PBS+ABS adicionada varia de acordo com o tamanho do pellet e da quantidade de células recuperadas.

[043] Assim, após o procedimento aqui descrito, as células recuperadas são quantificadas em uma câmera de Neubauer, também chamada de Hemacitômetro e diluídas em PBS com 1% ABS de modo a obter uma concentração de pelo menos 4 a 6 x 105 células/ml. b) Preparação das lâminas: [044] Após a recuperação das células na etapa "a", adiciona-se 5 a 20% do volume obtido, usualmente 50μ1 por poço, de células no cone plástico de uma citocentrífuga, junto com papel absorvente e uma lâmina. Vale ressaltar que o volume por poço pode variar de acordo com a marca e modelo da citocentrífuga utilizada, e com a concentração de células obtida.

[045] Nesta etapa, a ordem de montagem na citocentrífuga consiste respectivamente em lâmina, papel absorvente e cone plástico.

[046] Assim, após a montagem, centrifuga-se à rotação de 900rpm por pelo menos 10 minutos. A velocidade da rotação e o tempo também podem variar de acordo com a marca e modelo da citocentrifuga utilizada, indo de 500rpm a 2000rpm durante 5 a 20 minutos.

[047] Logo depois, as células são fixadas através da imersão das lâminas em metanol por pelo menos 5 minutos e em acetona por pelo menos 2 minutos, ambos em temperatura que varia de -15 a -25 °C.

[048] Assim, depois de fixadas, as lâminas são secadas em temperatura ambiente.

[049] Ainda, vale ressaltar que após a secagem das lâminas, é recomendável a identificação das mesmas através da marcação com caneta especifica para vidro para facilitar suas identificações na seguinte etapa do presente método.

[050] Alternativamente, após a fixação das células, as lâminas podem ser embaladas com papel manteiga e recobertas com papel alumínio, e armazenadas por até 1 mês em temperatura menor que pelo menos -15°C ou por até 1 ano em temperatura menor que pelo menos -70°C. c) Reação de Imunofluorescêncla. Indireta. (IFI) : [051] Nessa etapa, adicionam-se de 50μ1 a 200 μΐ de PBS com 1% ABS nas lâminas preparadas na etapa "b" de modo que cubra as células fixadas e, posteriormente as mesmas são incubadas por período de tempo que varia de 1 a 2h em temperatura ambiente e em câmara úmida.

[052] Logo depois, dilui-se em recipiente adequado o anticorpo primário anti-IMPDH (ou soro anti-IMPDH positivo) na proporção 1:200, o qual corresponde a Ιμΐ de anticorpo em 199μ1 de PBS, ou em diluição apropriada.

[053] O referido anticorpo primário é selecionado do grupo que consistem em anticorpos monoclonais ou policlonais anti-IMPDH, preferencialmente um anticorpo policlonal anti-IMPDH2 de coelho purificado por afinidade. Alternativamente, o anticorpo primário pode ser substituído por soro com reatividade anti-RR que consiste em um pool de soros de paciente HCV anti-RR positivo ou um soro individual de paciente HCV anti-RR positivo.

[054] Após a diluição, escorre-se o líquido da lâmina e adicionam-se de 30% a 7 0% do volume do anticorpo primário diluído sobre as células o suficiente para cobrir as mesmas na área delimitada com a células citocentrifugadas, usualmente 90μ1 a ΙΙΟμΙ. Assim, as lâminas são incubadas por período de tempo que varia de 1 a 2h em temperatura ambiente e em câmara úmida.

[055] Vale ressaltar que a diluição recomendada de 1:200 e o tempo de incubação podem variar consideravelmente de 1:50 até 1:1000 (para a diluição) e de 30 minutos até 1 dia (para o tempo de incubação), dependendo do anticorpo primário utilizado, específico para reconhecer a enzima IMPDH.

[056] Em seguida as lâminas são lavadas, o que consiste em colocá-las em recipiente adequado com PBS durante um período de tempo que varia de 5 a 10 minutos. Esse procedimento deve se repetir 2 vezes.

[057] Após esse procedimento, dilui-se em recipiente adequado o anticorpo secundário na proporção 1:200, o qual corresponde a Ιμΐ de anticorpo em 199μ1 de PBS.

[058] Após a diluição, escorre-se o excesso de líquido da lâmina e adicionam-se de 30% a 70% do volume do anticorpo secundário diluído sobre as células o suficiente para cobrir as mesmas, usualmente 90μ1 a ΙΙΟμΙ. Assim, as lâminas são incubadas por período de tempo que varia de 30 a 90 minutos em temperatura ambiente e em câmara úmida escura.

[059] Vale ressaltar que a diluição recomendada de 1:200 e o tempo de incubação podem variar consideravelmente de 1:20 até 1:2000 (para a diluição) e de 30 a 120 minutos (para o tempo de incubação), dependendo do anticorpo secundário utilizado.

[060] Ainda, o referido anticorpo secundário é selecionado do grupo que consiste em anti-IgG humana, conjugado a uma molécula fluorescente que pode ser na cor verde ou vermelha. Alternativamente, o método pode ser adaptado para técnica imunoenzimática, utilizando um conjugado marcado com peroxidase ou outra enzima que se preste a este fim.

[061] Desse modo, as lâminas são colocadas em recipiente adequado com PBS durante período de tempo que varia de 5 a 10 minutos para lavá-las. Esse procedimento deve ser repetido 2 vezes.

[062] Depois de lavadas, as lâminas são montadas com lamínulas e meio de montagem. Para tal, deve-se pingar sobre o foco de células uma gota do meio de montagem preferencialmente com DAPI, cobrir com lamínula, secar o excesso e selar a mesma com esmalte. d) Observação das estruturas anéis e bastões (RR): [063] Após a montagem das lâminas, as mesmas devem ser observadas em microscópio de imunofluorescência com aumento de 400x ou lOOOx, com filtros para os canais azul, verde e vermelho para a identificação da formação de estruturas anéis e bastões (RR) em células circulantes como parâmetro para detecção de ingestão adequada da medicação inibidora de IMPDH. Caso tenha sido feita adaptação para técnica imunoenzimática, as lâminas serão observadas em microscópio óptico convencional.

[064] Vale ressaltar que, para a leitura das lâminas, é necessário um técnico com experiência no manuseio do microscópio e com experiência na leitura de lâminas com Imunofluorescência e reconhecimento de células e estruturas celulares.

[065] O mesmo deverá observar as estruturas conforme apresentadas nas Figuras 1, 2 e 3, sendo anéis (1) que variam de 5 a 10% e bastões (2) de 90 a 95% no citoplasma das células.

[066] As estruturas serão observadas na cor vermelha (vide Figura 1 e 2), no entanto, dependendo do anticorpo secundário utilizado na reação, também podem ser observadas na cor verde (Figura 3).

[067] A cor azul presente nas figuras 1 e 3 mostra o núcleo/DNA celular marcado pelo DAPI presente no meio de montagem e serve de referência para a observação de RR nas células, pois indica onde está a célula.

[068] Ainda, cabe salientar que a proporção de células apresentando as estruturas RR pode apresentar grande variação, dependendo do paciente e da droga que este tenha ingerido, bem como do tempo prévio de ingestão da droga, bem como da dose ingerida, podendo variar de 5% até 50% das células.

[069] O leitor da lâmina deve, portanto, procurar cuidadosamente a presença das estruturas RR na lâmina para evitar diagnóstico falso negativo. Como as células normalmente não apresentam as estruturas RR quando não estão na presença de drogas/medicamentos inibidores da enzima IMPDH, exceto situações raras como em células tronco, é altamente improvável a possibilidade de um resultado falso positivo.

[070] Desse modo, os medicamentos inibidores da enzima Inosina Monofosfato Dehidrogenase I e II (IMPDH) são selecionados do grupo que consiste em drogas indutoras de estruturas RR, tais como a ribavirina, micofenolado mofetil, azatioprina, metotrexato e aciclovir, dentre outros.

[071] Adicionalmente, a presente invenção ainda se refere ao uso do método em questão para investigar a adesão do usuário à medicação que ocasiona a formação de estruturas RR formada por agregados da enzima IMPDH, preferencialmente para investigar a adesão ao tratamento medicamentoso com ribavirina na hepatite C.

[072] Ainda, a presente invenção se refere a um kit para executar o método aqui descrito, o qual este compreende: - Solução geradora de Gradiente (SGG) com densidade de 1,077 gramas por ml (1,077 g/ml) , tal como Sigma Cat.: 10771; - Anticorpo primário anti-RR (pool de soros ou soro individual de paciente HCV anti-RR positivo); ou anticorpo policlonal de coelho, cabra ou outro animal com reatividade anti-IMPDH; ou anticorpo monoclonal anti-IMPDH; - Anticorpo secundário anti-IgG humana, conjugado a uma molécula fluorescente que pode ser na cor verde ou vermelha, tais como por exemplo Alexa Fluor 568 da Thermo cat.:A21090, ou FITC da Sigma cat.:F9512; alternativamente, pode-se utilizar conjugado marcado com enzima, caso a técnica seja adaptada para o método imunoenzimático; - Meio de montagem tal como glicerina tamponada pH9,5, ou outro desde que baseado em glicerol, preferencialmente com DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), tal como VECTASHIELD®Cat.: H-1200; - Esmalte para selar as lâminas/laminulas; - Tampão Salina fosfato (PBS); - PBS + 4% paraformaldeido; e - PBS + 1% Albumina Bovina Sérica ultrapura (ABS).

[073] Alternativamente, o soro anti-RR pode ser substituído por anticorpo policlonal anti-IMPDH2 de coelho, tal como ProteinTech Cat.:12948-1-AP, ou outro anticorpo comercial que seja especifico para a enzima IMPDH. A substituição do soro por um anticorpo comercial específico pode apresentar melhores resultados.

[074] Caso o soro anti-RR seja substituído por um anticorpo comercial, como por exemplo o anticorpo policlonal anti-IMPDH2 de coelho ou outro animal, o anticorpo secundário anti-IgG humana também deve ser substituído por um anticorpo secundário anti-IgG de coelho ou outro animal, sempre conjugado a uma molécula fluorescente que pode ser na cor verde ou vermelha.

[075] Ainda, em ambos os casos (soro humano ou monoclonal/policlonal) pode-se propor a alternativa de conjugar diretamente esses anticorpos com uma substância fluorófora (Alexa Fluor 568, FITC, TRITC ou equivalente), de forma a dispensar a necessidade do uso de anticorpo secundário anti-IgG humana. Esta possibilidade tornaria o procedimento mais simples e mais curto.

[076] Portanto, o kit aqui descrito compreende todos os reagentes necessários para a execução do presente método.

[077] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (34)

1. Método de detecção de ingestão adequada da medicação inibidora da enzima Inosina Monofosfato Dehidrogenase I e II (IMPDH 1 e 2) caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) Separação e Isolamento de células obtidas a partir de amostras biológicas; b) Preparação das lâminas; c) Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) ou imunoenzimática; e d) Observação das estruturas anéis e bastões (RR); em que o referido método é realizado até 6 horas após a coleta de amostra biológica.

2. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as referidas amostras biológicas serem selecionadas do grupo que consiste em sangue, partes do corpo, tal como do fígado, saliva, e outros, preferencialmente sangue.

3. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de, na etapa "a", primeiramente obter de 5ml a lOml de amostra biológica em tubo com heparina ou outro anticoagulante apropriado e transferir para recipiente adequado, em que adiciona-se o equivalente a 100% de tampão salina fosfato (PBS) ou tampão equivalente no referido recipiente, mistura-se e adiciona-se o equivalente a 33% de amostra/PBS em solução geradora de gradiente (SGG) , de modo que se acomode no fundo do recipiente para produzir um gradiente de densidade.

4. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de a mistura entre a amostra, o PBS e a SGG ser na proporção 1:1:1 de modo a obter 100% do volume em três partes iguais.

5. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "a", a mistura obtida ser centrifugada em temperatura ambiente (TA) sob rotação que varia de 1500 a 2500 rpm por um período de tempo que varia de 20 a 60 minutos, em que após a centrifugação, é coletado uma nuvem de células formada acima da SGG e transferida para um recipiente adequado.

6. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de as referidas células serem selecionadas do grupo que consiste em células mononucleares de sangue periférico (CMSP), células do corpo, tal como do fígado, saliva e outros, preferencialmente CMSP.

7. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "a", adicionar o equivalente a 5 até 10 vezes o volume da nuvem de células coletada em PBS, acrescido de 3% a 5% de paraformaldeído nas células coletadas anteriormente, em que a mistura obtida é centrifugada à rotação que varia de 1000 a 3000 rpm durante pelo menos 15 minutos por duas vezes, o qual o sobrenadante é descartado em ambas as vezes, e as células acomodadas no fundo do recipiente formam um pellet.

8. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "a", o processo de adicionar PBS às células recuperadas misturando até a sua diluição, seguido de centrifugação, e subsequente descarte do sobrenadante ser repetido por duas vezes seguidas na mesma ordem.

9. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de o pellet ser lavado com a adição de o equivalente a 5 até 10 vezes o volume em PBS e a centrifugação ser à rotação que varia de 1000 a 3000 rpm durante pelo menos 15 minutos.

10. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "a", ser adicionado o equivalente a 1 até 3 vezes o volume do pellet em PBS com 1% Albumina Bovina Sérica (ABS) em um pellet, em que este é adicionado às células anteriormente coletadas após o processo de centrifugação, misturando-o até a diluição do mesmo.

11. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "a", as células serem quantificadas em um hemacitômetro e diluídas em PBS com 1% ABS de modo a obter uma concentração que varia de 4 a 6 x 105 células/ml.

12. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa "b", adicionar de 5 a 20% por poço do volume obtido de células recuperadas na etapa "a" no cone plástico de uma citocentrífuga, junto com papel absorvente e uma lâmina, em que após a montagem é centrifugado à rotação de 500rpm a 2000rpm durante 5 a 20 minutos.

13. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "b" após a centrifugação, as células serem fixadas através da imersão das lâminas em metanol por pelo menos 5 minutos e em acetona por pelo menos 2 minutos, ambos em temperatura que varia de -15 a -25 °C.

14. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "b" após a fixação, as lâminas serem secadas em temperatura ambiente, em que alternativamente, as lâminas são embaladas com papel manteiga e recobertas com papel alumínio, e armazenadas por até 1 mês em temperatura menor que pelo menos -15°C ou por até 1 ano em temperatura menor que pelo menos -70°C.

15. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, na etapa "c", ser adicionado 50 a 200μ1 de PBS com 1% ABS nas lâminas preparadas na etapa "b" de modo que cubra as células fixadas, em que posteriormente as mesmas são incubadas por período de tempo que varia de 1 a 2h em temperatura ambiente e em câmara úmida.

16. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "c", o anticorpo primário anti-IMPDH (ou soro anti-IMPDH positivo) ser diluído em recipiente adequado na proporção que varia de 1:50 a 1:1000, preferencialmente 1:200, o qual corresponde a Ιμΐ de anticorpo em 199μ1 de PBS ou outro solvente adequado em diluição apropriada.

17. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "c" após a incubação das lâminas, escorrer o líquido das mesmas e adicionar de 30% a 70% do volume do anticorpo primário diluído sobre as células o suficiente para cobrir as mesmas na área delimitada com as células citocentrifugadas, preferencialmente 90 a 110μ1, em que posteriormente as lâminas são incubadas por período de tempo que varia de 30 minutos a 24h, preferencialmente de 1 a 2h em temperatura ambiente e em câmara úmida.

18. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de o referido anticorpo primário ser selecionado dos grupos que consistem em anticorpos monoclonais ou policlonais anti-IMPDH, preferencialmente um anticorpo policlonal anti-IMPDH2 de coelho purificado por afinidade, em que alternativamente o anticorpo primário é substituído por soro com reatividade anti-RR que consiste em um pool de soros de paciente HCV anti-RR positivo ou um soro individual de paciente HCV anti-RR positivo.

19. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "c" após a segunda incubação, as lâminas serem colocadas em recipiente adequado com PBS durante um período de tempo que varia de 5 a 10 minutos, em que esse procedimento de lavagem é repetido por duas vezes seguidas.

20. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "c" após a lavagem, o anticorpo secundário ser diluído em recipiente adequado na proporção que varia de 1:20 a 1:2000, preferencialmente 1:200, o qual corresponde a Ιμΐ de anticorpo em 199μ1 de PBS ou outro solvente adequado,

21. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "c" após a lavagem, o excesso de líquido da lâmina ser escorrido e ser adicionado de 30% a 70% do volume do anticorpo secundário diluído sobre as células o suficiente para cobrir as mesmas, preferencialmente 90 a 110μ1, em que posteriormente as lâminas são incubadas por período de tempo que varia de 30 a 120 minutos, preferencialmente de 30 a 90 minutos em temperatura ambiente e em câmara úmida escura.

22. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de o anticorpo secundário ser selecionado do grupo que consiste em anti-IgG humana, conjugado a uma molécula fluorescente, preferencialmente na cor verde ou na cor vermelha; ou anti-IgG humana, conjugado marcado com peroxidase ou outra enzima adequada, para o método imunoenzimático.

23. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "c", as lâminas serem colocadas em recipiente adequado com PBS durante período de tempo que varia de 5 a 10 minutos, em que esse procedimento de lavagem é repetido por duas vezes seguidas.

24. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de, ainda na etapa "c" após a lavagem, as lâminas serem montadas com lamínulas e meio de montagem, em que é pingada sobre o foco de células uma gota do meio de montagem com DAPI (ou outro reagente corante de DNA) antes de cobrir a lâmina com lamínula; e após a montagem, o excesso de meio das lâminas ser removido tornando as secas e posteriormente seladas com esmalte.

25. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de, na etapa "d", as lâminas serem observadas em microscópio de imunofluorescência com aumento de 400x ou lOOOx e com filtros para os canais azul, verde e vermelho; ou em microscópio óptico para reação imunoenzimática, em que é identificado a formação de estruturas anéis e bastões (RR) em células circulantes que estão na presença de medicamentos inibidores da enzima IMPDH I e II.

26. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de a proporção de células apresentando as estruturas RR variarem de 5% a 50% das células, em que os anéis variam de 5 a 10% e os bastões variam de 90 a 95% no citoplasma das referidas células.

27. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de as referidas estruturas serem observadas na cor vermelha ou verde de acordo com o anticorpo secundário utilizado.

28. Método de detecção, de acordo com a reivindicação 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de os referidos medicamentos inibidores da enzima IMPDH I e II serem selecionados do grupo que consiste em drogas indutoras de estruturas RR, tais como a ribavirina, micofenolado mofetil (MMF), azatioprina, metotrexato, aciclovir, entre outros.

29. Método de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de raramente se observar resultado falso positivo.

30. Uso do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de ser para investigar a adesão do usuário à medicação que ocasiona a formação de estruturas RR formada por agregados da enzima IMPDH, preferencialmente para investigar a adesão ao tratamento medicamentoso com ribavirina na hepatite C.

31. Kit para executar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de compreender: - Solução geradora de Gradiente (SGG) com densidade de 1,077 g/ml; - Anticorpo primário anti-RR; - Anticorpo secundário anti-IgG humana, conjugado a uma molécula fluorescente na cor verde ou vermelha; Meio de montagem baseado em glicerol preferencialmente com DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) ou outro reagente corante de DNA; - Esmalte para selar as lâminas/lamínulas; - Tampão Salina fosfato (PBS); - PBS + 4% paraformaldeído; e - PBS + 1% Albumina Bovina Sérica ultrapura (ABS).

32. Kit, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de o anticorpo primário anti-RR ser selecionado dos grupos que consistem em anticorpos monoclonais ou policlonais anti-IMPDH, preferencialmente um anticorpo policlonal anti-IMPDH2 de coelho purificado por afinidade, em que alternativamente o anticorpo primário é substituído por soro com reatividade anti-RR que consistem em um pool de soros de paciente HCV anti-RR positivo ou um soro individual de paciente HCV anti-RR positivo.

33. Kit, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de, alternativamente, o referido anticorpo secundário anti-IgG humana ser conjugado marcado com peroxidase ou outra enzima adequada, para o método imunoenzimático.

34. Kit, de acordo com a reivindicação 31, 32 ou 33, caracterizado pelo fato de, alternativamente, ambos os anticorpos primários possíveis, serem conjugados diretamente com uma substância fluorófora de forma a dispensar a necessidade do uso de anticorpo secundário anti-IgG humana.