BR102014003636B1 - Peptídeos recombinantes miméticos a antígenos da m. leprae e suas aplicações diagnósticas e imunogênicas - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEOS RECOMBINANTES MIMÉTICOS A ANTÍGENOS DO M. LEPRAE E SUAS APLICAÇÕES DIAGNÕSTICAS E IMUNOGÊNICAS. A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes, suas sequências reversas e motivos proteicos que mimetizam regiões antigênicas de proteínas do Mycobacterium Ieprae. Os peptídeos desta invenção são moléculas a serem utilizadas em imunodiagnósticos e composições imunogênicas para o controle da hanseníase. O uso de antígenos específicos do M. Ieprae em plataformas nanobiotecnológicas representa uma importante ferramenta de diagnóstico complementar, tendo sido avaliados, ainda, como possíveis unidades imunogênicas. Os peptídeos miméticos são promissores por serem de fácil síntese e apresentarem flexibilidade de uso em diferentes plataformas diagnósticas. Pela tecnologia de phage display foram selecionados peptideos miméticos que reconhecem anticorpos policlonais, lgG e IgM, e peptideos miméticos de PGL1, LAM, GroEL e GroES, importantes antígenos naturais do M. Ieprae. Os peptídeos miméticos podem ser úteis no diagnóstico da hanseníase, especialmente em formas paucibacilares, bem como serem utilizados como marcadores de exposição ou estado reacional.

Description

[1], Campo da Invenção: A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes, suas sequências Ireversas e motivos proteicos que mimetizam regiões antigênicas de proteínas do Mycobacterium leprae. Os peptídeos desta invenção são moléculas a serem utilizadas em imunodiagnósticos e composições imunogênicas para o controle da hanseníase.

[2], Estado da Técnica: A hanseníase é uma doença infecto- contagiosa crônica, dermato/neurológica e incapacitante, que tem como agente etiológico o M. leprae (FOSS, NT. Medicina, Ribeirão Preto, v. 30, n.3, p335339, 1997; GOULART, IM., PENNA, GO., CUNHA, G. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 35, n. 4, p.365-75, 2002). Suas formas clínicas são definidas por padrões imunológicos, formando um amplo espectro intimamente proporcional à potencialidade de resposta do hospedeiro ao parasita (FOSS, NT. Medicina, Ribeirão Preto, v. 30, n.3, p335-339, 1997). Apesar de ser uma doença muito antiga, os mecanismos imunopatológicos continuam pouco entendidos e reclamam um esforço concentrado no sentido de esclarecer as relações entre o parasita e o hospedeiro (MODLIN, RL, REA, TH. J Am Acad Dermatol, v. 17, n. 1, p. 113, 1987).

[3] . O M. leprae é a única espécie de micobactéria que infecta nervos periféricos, e não cresce em meios de cultura artificiais (MINISTÉRIO DA SAÚDE/Guia de vigilância epidemiológica 7o ed.; caderno 7 pág 1 - Brasília: 2009.), gerando um obstáculo na pesquisa de novos testes diagnósticos pela dificuldade na obtenção de antígenos naturais. O bacilo é considerado de alta infectividade, mas de baixa patogenicidade, (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Guia para o Controle da Hanseníase: Cadernos de atenção básica. Brasília, 2002). A infectividade pelo M. leprae pode resultar em danos progressivos, com padrões característicos de deficiência que incluem ulceração da pele e deformidades nas articulações, provocando um problema de saúde pública especial devido ao fato de poder causar incapacidades permanentes, bem como por suas consequências sociais, tais como discriminação e estigma.

[4] . A principal via de eliminação dos bacilos dos pacientes multibacilares (MB) é a via aérea superior, sendo o trato respiratório a mais provável via de entrada do M. leprae no corpo. Os doentes paucibacilares (PB), com poucos bacilos, não são considerados importantes como fonte de transmissão da doença, devido à baixa carga bacilar. Os pacientes multibacilares, no entanto, constituem o grupo contagiante, assim se mantendo como fonte de infecção, enquanto o tratamento específico não for iniciado. (MINISTÉRIO DA SAÚDE/Guia de Vigil. Epidemiológica 7°ed.; caderno 7 pág 1-Brasília: 2009).

[5] . Entre as doenças transmissíveis, a hanseníase continua sendo uma das principais causas de neuropatia periférica e incapacidades no mundo, apesar de grandes esforços para reduzir a carga da doença. O sucesso da poliquimioterapia (PQT), introduzida em 1981, incentivou a Assembléia Mundial da Saúde a se esforçar para eliminar a hanseníase - ou seja, reduzir a sua prevalência global para 1 caso por 10 000 habitantes - até o ano de 2000 (BULLETIN OF THE WORLD HEALTH ORGANIZATION 2011 ;89:487-495. doi: 10.2471/BLT. 10.085662). O Brasil ainda não atingiu esta meta e ocupa o segundo lugar no mundo em casos de hanseníase, com taxa de prevalência de 1,51 casos por 10 mil habitantes (prevalência de 29 311 casos na população de 193 946 886 em 2012). Dos 36 178 casos novos registrados em 2012 nas Américas, 33 303 foram notificados no Brasil (WORLD HEALTH ORGANIZATION, Weekly Epidemiological Record, No 35,2013,88,365380).

[6], Indicadores alternativos, tais como a fração de pessoas com hanseníase que tem grau 2 de incapacidade, têm sido sugeridos para monitorar os resultados das atividades de controle da hanseníase (BULLETIN OF THE WORLD HEALTH ORGANIZATION 2011,89:487-495. doi: 10.2471/BLT.10.085662). A Estratégia Global Aprimorada, para aumentar a redução da incidência de doenças devido à hanseníase 2011-2015, está sendo implementada por programas nacionais em países endêmicos. A estratégia visa reduzir a taxa global de casos novos com grau 2 incapacitante (ou seja, visível) por 100 000 habitantes em pelo menos 35% até o final de 2015, em comparação com dados base do final de 2010. A abordagem evidencia a importância do diagnóstico precoce e a qualidade dos cuidados na definição do atendimento de forma integrada. A estratégia é esperada para reduzir a ocorrência de novos casos e, portanto, menor transmissão da doença na comunidade (WORLD HEALTH ORGANIZATION, Weekly Epidemiological Record, No. 34, 2012, 87, 317-328).

[7]. Apesar de melhora significativa no controle da hanseníase novos casos continuam a ocorrer em quase todos os países endêmicos e bolsões de alta carga podem existir num contexto de baixa carga. Dados epidemiológicos demonstram que a transmissão ativa está ocorrendo, mesmo com o uso da poliquimioterapia como estratégia de eliminação da hanseníase (WORLD HEALTH ORGANIZATION, Weekly Epidemiological Record, No. 34, 2012, 87, 317-328). Esta transmissão pode ser causada pelo reservatório permanente de M. leprae em contatos infectados e pessoas com hanseníase subclínica (GELUK, A., et al, Clinical and Vaccine Immunology, v. 16, n. 3, p. 352-359, 2009). O que reforça a necessidade de métodos diagnósticos mais sensíveis, utilizando marcadores de exposição e risco de adoecimento.

[8]. Em 1966, Ridley e Jopling propuseram um espectro clínico caracterizando a hanseníase em duas formas polares e estáveis, com diferenças evolutivas, clínicas e imunológicas: uma tuberculóide (T) e outra virchoviana (V), e em formas intermediárias como dimorfa tuberculóide (DT), dimorfa-dimorfa (DD) e dimorfa virchoviana (DV) (Ridley, DS, Jopling, WH. 1966. Int J. Lepr. Other Mycobact Dis. 34: 255-273). A hanseníase caracterizada como indeterminada (Hl) é um estágio precoce e instável da doença e, dependendo da resistência do hospedeiro, pode migrar para uma das formas definitivas ou, ainda, se curar espontaneamente (ARAÓZ, RN., et al, 2006. Infect Immun. 74(1): 175-82).

[9], A Organização Mundial de Saúde (1982) estabeleceu uma classificação operacional, na qual os pacientes são divididos em paucibacilares (PB) ou multibacilares (MB). Essa classificação é baseada no número de lesões cutâneas, de modo que os pacientes com até cinco lesões de pele são classificados como paucibacilares, e aqueles com mais de cinco lesões, como multibacilares (MINISTÉRIO DA SAÚDE/Guia de vigilância epidemiológica 7° ed.; caderno 7 pág 1 - Brasília: 2009.) Além disso, considerando-se a apresentação clínica e, na prerrogativa de evitar ineficiência do tratamento, todos os casos com baciloscopia positiva são classificados como multibacilares, enquanto os casos com baciloscopia negativa, como paucibacilares (WORLD HEALTH ORGANIZATION. Technical Report Series. Expert Committee on Leprosy. Geneva, 1988. 768 n.).

[10], A hanseníase é uma doença considerada espectral, na qual as manifestações clínicas correlacionam-se com a resposta imune do hospedeiro ao patógeno. Em um dos pólos desse espectro encontram-se os pacientes com hanseníase tuberculóide, apresentando uma resposta típica de resistência e controle do crescimento do patógeno. Em oposição, pacientes com hanseníase virchorviana representam o extremo susceptível à infecção pelo M. leprae. Essas apresentações clínicas correlacionam-se com o grau de imunidade mediada por células (MODLIN, RL. J Invest Dermatol, v.102, n. 6, p. 828-832, 1994).

[11]. A avaliação da resposta humoral em pacientes V e DV evidencia altos títulos de anticorpos específicos contra o glicolipídeo fenólico 1 (PGL1), componente da parede celular do M. leprae, refletindo a acentuada carga bacilar nesses pacientes. Nas formas tuberculóides os níveis desse anticorpo apresentam-se semelhantes aos dos controles normais (ARAÚJO, MG. 2003. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 36(3): 373-382; GOULART, IM., PENNA, GO., CUNHA, G. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 35, n. 4, p.365-75, 2002 ). Apesar da produção aumentada de anticorpos específicos nas formas multibacilares, esta é ineficaz para a eliminação dos bacilos de Hansen (JM. leprae). A defesa é efetuada pela resposta imunológica celular, capaz de fagocitar e destruir os bacilos, mediada por citocinas e mediadores da oxidação como os intermediários reativos do oxigênio (ROI) e do nitrogênio (RNI), fundamentais na destruição bacilar no interior dos macrófagos (ARAÚJO, MG. 2003. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 36(3): 373-382).

[12], Nas lesões tuberculóides há predominância de células T auxiliares CD4+ e citocinas Th1, como interleucina 2 (IL-2), interferon gama (IFN- y), IL-1, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α ) e IL-12. Em contraste, nas lesões virchovianas o predomínio é de células T supressoras, CD8+ e citocinas Th2 como IL-4, IL-5 e IL-10. A citocina IL-12 estimula diretamente células NK (Natural Killer) que passam a produzir IFN-y, o qual estimula o macrófago e associado à ação de TNF-a atuam incrementando a ativação macrofágica. Ao contrário, as citocinas Th2, juntamente com a citocina TGF-β-1, são supressoras da atividade macrofágica (ARAÚJO, MG. 2003. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 36(3): 373-382; Foss, NT. 1999. Anais Brasileiros de Dermatologia. 75: 113-119; GOULART, IM„ et al, 1996. Am. J. Pathol. 148(3): 911-7).

[13] . A classificação atual de células T tipo 1 (Th1) ou tipo 2 (Th2) produzidas em resposta ao M. leprae é baseada na produção exclusiva ou predominante de IFN-y ou IL-4, respectivamente. O perfil de secreção restrita de citocinas pode não refletir o complexo papel regulatório das células T In vivo (VERHAGEN, CE., et al, 1998. The Journal of Immunology, 160: 2380-2387). Portanto, dependendo da subpopulação de células T e da atividade macrofágica, haverá predominância de mecanismos de defesa ou de disseminação da doença, expressos clinicamente pelas formas tuberculóide e virchoviana, respectivamente. A produção dos antígenos PGL1 e LAM (lipoarabinomanana) pelo bacilo no interior do macrófago favorece o escape à oxidação intramacrofágica, pois estes possuem função supressora da atividade dos macrófagos e favorecem a sua disseminação (FOSS, NT. 1999. Anais Brasileiros de Dermatologia. 75: 113-119).

[14] . O diagnóstico da hanseníase é essencialmente clínico e epidemiológico, realizado por meio da análise da história e condições de vida do paciente e do exame dermato-neurológico, para identificar lesões ou áreas da pele com alteração de sensibilidade e/ou comprometimento de nervos periféricos: sensitivo, motor e/ou autonômico (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Departamento de Vigilância em Saúde. Programa Nacional de Controle da Hanseníase. Hanseníase no Brasil: dados e indicadores selecionados. Brasília, 2009). O exame clínico dermato-neurológico e a baciloscopia, ainda, são considerados o padrão ouro de diagnóstico em hanseníase. No exame histopatológico são necessários no mínimo 10.000 bacilos por grama de tecido para que a detecção pela coloração de BAAR seja confiável (SHEPARD, CC., McRAE, DH. Int. J. Lepr. [S.I.], v. 36, p. 78-82, 1968). Este exame apresenta baixa sensibilidade, principalmente em pacientes com características tuberculóides da doença, na qual os bacilos são raros ou ausentes (ILA. Lepr Rev. v. 70, p. s23-s31, 2002).

[15] . A capacidade de resposta imunológica pode ser avaliada por meio da reação de Mitsuda (inoculação intradérmica de suspensão de bacilos mortos pelo calor), que resulta, após 3 ou 4 semanas, em reação positiva com formação de pápula infiltrada (forma clínica T) ou reação negativa com ausência de alteração cutânea (forma clínica V). O resultado desta reação associado à carga bacilar (baciloscopia) pode assinalar a potencialidade de resposta imune celular do paciente (GOULART, IM., PENNA, GO., CUNHA, G. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 35, n. 4, p.365-75, 2002).

[16], Testes baseados em antígenos proteicos ou peptídicos sintéticos oferecem maior possibilidade de identificar pessoas recentemente infectadas, permitindo um diagnóstico precoce da hanseníase. Nesse sentido, algumas proteínas ou lipoproteínas do M. leprae tem sido alvo de pesquisas, a fim de produzi-las utilizando ferramentas pós-genômicas.

[17]. O PGL-1 é um componente da parede celular, específico do M. leprae, o qual é encontrado em grandes quantidades em tecidos humanos infectados com a micobactéria (BRET, SJ., et al, 1984. Infect Immun. 46(3): 802-808). Sua estrutura é composta de um trissacarídeo (principal determinante antigênico), fenol, fitiocerol e de ácido micoseossídico. (CHO, SN., et al, 2001. Clin Diagn Lab Immunol. 8(1): 38-142; HUNTER, SW., BRENNAN, PJ. 1981. J Bacteriol. 147(3): 728-735). Este antígeno não apresenta reação cruzada com M. tuberculosis ou outras micobactérias, sendo único para M. leprae. A elucidação da estrutura química do glicolipídeo PGL-1, específico do M. leprae (HUNTER, SW., BRENNAN, PJ. Jornal of Bacteriology, v. 147, p. 728-735, 1981.) e a comprovação da sua antigenicidade (PAYNE, SN., DRAPER, P„ REES, RJ. Int J Lepr Other Mycobact Dis, v. 50, p. 220-221, 1982), possibilitaram grandes inovações na pesquisa em hanseníase (MOURA, RS., et al. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 41 (Suplemento II), p. 11-18, 2008.), uma vez que esse componente antigênico tem sido explorado no soro diagnóstico por ELISA e ML-Flow (MOET, FJ., OSKAM, L, FABER, R„ PAHAN, D., RICHARDUS, JH. Leprosy Review, v. 75, p. 376-388, 2004).

[18]. As arabinomanas de LAM têm demonstrado ser expostas na superfície celular e também estão diretamente ligadas à imunopatogênese da hanseníase e tuberculose (BRENNAN, PJ., et al, 1990. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 55). A molécula de LAM parece estar ligada firmemente a parede celular, mas não completamente. O anticorpo monoclonal de LAM reconhece a célula micobacteriana inteira em experimentos de ELISA, sugerindo que parte desta molécula está situada no exterior da célula, sendo acessível ao ambiente (GAYLORD, H., et al, 1987. Infect. Immun. 55:2860).

[19], A família das proteínas de Heat shock (HSPs) inclui proteínas que se encontram conservadas ao longo da evolução, e participam de processos celulares fundamentais. Os níveis aumentados de expressão destas moléculas sob estresse celular somados à possibilidade da condição inflamatória alterar o reconhecimento e a apresentação de antígenos, direcionando e amplificando a resposta imune para a HSP60, sustentam a participação destas moléculas em processos crônicos degenerativos (MARENGO, EB AND SANT’ANA, AO. 2009. ConScientiae. 8:451). Membros de HSP60 e HSP70 têm sido identificados como alvos de resposta imune de mamíferos contra micobactérias (YOUNG, R.A. 1990. Rev.lmmunol. 8:401).

[20] . Recentemente as duas HSPs do M. leprae, GroEL (ML0317) e GroES (ML0380), demonstraram ser as proteínas mais abundantes deste bacilo, chegando a 2.4x1O10 de intensidade (WIKER, HG., TOMAZELLA, GG. AND DE SOUZA, GA. 2011.J Proteomics. doi:10.1016/j.jprot.2011.01.004.). O GroES do M. leprae é reconhecido por um terço de precursores de células T humanas específicas do M. leprae e, devido a estas características, este antígeno demonstra ser um adequado candidato para reagentes de diagnóstico para a hanseníase (MEHRA, V., etal, 1992. J Exp Med. 175:275).

[21] . Dos antígenos de M. leprae que foram caracterizados e clonados, as HSPs mostram serem alvos de fortes respostas de células T em pacientes com hanseníase do polo tuberculóide ou com doença autoimune (YOUNG, D., et al, 1988. Proc Natl Acad Sei USA. 85: 4267). Devido a esta forte indução de respostas de células T em pacientes tuberculóides (MEHRA, V., et al, 1992. J Exp Med. 175:275; KIM, J., et al, 1997. J Immunol. 159:335) e em contatos sadios de pacientes com hanseníase (LAUNOIS, P., et al, 1995. Infect Immun. 63:88) este antígeno tem sido foco de estudo como candidato potencial para vacina.

[22] . As proteínas GroES e GroEL tem sido investigadas por compor antígenos com alta imunogenicidade. A patente US4906742(A) isolou genes que codificam cinco antígenos proteicos imunodominantes do M. leprae, dentre eles a proteína de 65kD, que também é uma HSPs, entretanto não existe nenhuma conclusão desses antígenos sobre o potencial para diagnóstico em imunoensaios.

[23], Vários grupos têm utilizado procedimentos pós-genômicos para a descoberta de novos antígenos que possam ser utilizados no diagnóstico da hanseníase ou como unidades vacinais (SPENCER, JS., et al. Infect Immun, v. 72, p. 3161-3170, 2004;; SPENCER, JS„ DOCKRELL, HM., KIM, HJ. et al. The Journal of Immunology, v. 175, p. 7930-7938, 2005.; REECE, ST., et al. Clinical and Vaccine Immunology, v. 13, p. 333-340, 2006.; ARÁOZ, R., et al, 2006. Infect Immun. 74(1): 175-82).; DUTHIE, MS., et al. Clinical and vaccine immunology, v. 15, n. 11, p. 1659-1665, 2008). Estes estudos têm explorado sequências de genes do M. leprae para a identificação de proteínas ou peptídeos que possam ser adequados ao sorodiagnóstico das diferentes formas clínicas da hanseníase.

[24], A obtenção da sequência completa do genoma do M. leprae permitiu a utilização de ferramentas pós-genômicas para o mapeamento, identificação e caracterização de possíveis antígenos específicos dessa micobactéria. Nesse sentido, o uso de bibliotecas randômicas de peptídeos apresentados em fagos representa uma ferramenta para os estudos de interações existentes entre antígeno e anticorpo, tornando possível a caracterização de mimotopos com potencial antigênico e auxiliando na elucidação de mecanismos básicos da regulação da resposta imune para diversas doenças (OLIVEIRA, JDD. 2001. 104f. Tese, Doutorado em Genética e Bioquímica - Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia. Uberlândia. 2007).

[25], A técnica de phage display tem se apresentado como uma ferramenta útil na seleção de porções antigênicas proteicas e não proteicas, pois consiste em um processo seletivo na qual uma biblioteca de peptídeos com sequências randomizadas expressas na superfície de uma partícula virai se liga a alvos específicos. Os peptídeos expressos possuem material genético codificante no genoma virai. Com isto, é possível a correlação de cada sequência de DNA com uma variedade de moléculas alvo, permitindo rápida identificação e caracterização de peptídeos ligantes, por um processo de seleção in vitro chamado biopanning (PARMLEY, SF., SMITH, GP. 1988. Gene, 73(2): 305-18). A tecnologia de phage display pode levar à produção de uma grande variedade de ligantes, incluindo anticorpos recombinantes e peptfdeos, com especificidades já predefinidas. Peptídeos miméticos selecionados contra anticorpos monoclonais são utilizados para diversas patologias, auxiliando no desenvolvimento de novos testes para um diagnóstico mais sensível e específico (GOULART, LR., et al. Crit Rev Immunol, v. 30, n. 2, p. 201-222, 2010).

[26] . O interesse pela estrutura do PGL-1 já foi relatado em duas patentes. O depósito CA2092637(A1)-1993-11-12 descreve glicolipídeos para o sorodiagnóstico de hanseníase e tuberculose, sendo que estes foram produzidos por síntese química. Existe também o depósito de um mimetopo do PGL-1 de M. leprae com o n° KR20040020246 (A) com a abordagem de um kit sorodiagnóstico. Entretanto, nenhum desses antígenos apresentou flexibilidade para serem utilizados em diferentes plataformas, com diversidade de fluídos corporais, como no caso dos peptídeos miméticos obtidos na presente invenção.

[27] . Uma das grandes vantagens dos peptídeos obtidos por "phage display” é a flexibilidade de serem utilizados em diferentes plataformas diagnósticas, desde imunoensaios tradicionais como Elisa, ML-Flow até plataformas nanobiotecnológicas que envolvem testes de fluxo lateral e biossensores. Entre os biossensores se destacam os ópticos, baseados no princípio de ressonância plasmônica de superfície (SPR), que se destacam na investigação de interações biomoleculares por, dentre outros, não necessitarem de marcadores e por possuírem alta seletividade e sensibilidade, permitindo, ainda, a análise de amostras em tempo real (YANG, C., et al. Lab Chip. p.1017-1023, 2005).

[28] . Essa flexibilidade é ampliada para os diferentes fluídos biológicos (sangue, secreções e saliva) que podem ser utilizados numa plataforma que tenha peptídeos miméticos como antígenos. Assim, essas novas plataformas diagnósticas podem ser menos invasivas com a possibilidade de se utilizar saliva como fluído biológico em investigação.A saliva, mistura complexa de fluidos glandulares, tem sido objeto de estudo de diversos pesquisadores com o intuito de acrescentar uma possibilidade de exame complementar para diagnóstico e monitoramento de doenças orais e sistêmicas (LAWRENCE, HP. J Can Dent Assoc, Toronto, v. 68, n. 3, p. 170-174, Mar. 2002; YARAT, A., et al. Clin Oral Investig, Berlin, v. 8, n. 1, p. 36-39, Mar. 2004).

[29] . A facilidade de coleta da saliva, bem como o fato de oferecer menor risco de contaminação para o operador quando do manuseio da mesma, representam aspectos importantes para subsidiar a escolha da mesma como meio de diagnóstico. Aliado a isso, os estudos realizados comparando resultados dos testes salivares com outros métodos de credibilidade científica comprovada, como dosagens sanguíneas de substâncias, têm tornado o método confiável (MOURA, SAB., et al. Pesq Bras Odontoped Clin Integr. v.7, p. 187-194, 2007). A análise da saliva, bem como a análise do sangue, tem duas finalidades: a primeira é identificar indivíduos com doença, e a segunda, seguir o progresso do indivíduo afetado, avaliando inclusive a efetividade do tratamento empregado (MOURA, SAB., et al. Pesq Bras Odontoped Clin Integr. v.7, p. 187-194, 2007).

[30] . Além da abordagem diagnóstica peptídeos obtidos por phage display podem ser utilizados como unidades imunogênicas, uma vez que mimetizam regiões antigênicas de patógenos, nesse caso do M. leprae, podendo ser utilizados em testes de estimulação da resposta imunológica protetora tanto in vitro quanto in vivo. Na literatura só existem relatos de peptídeos obtidos por expressão heteróloga de antígenos recombinantes. A utilização do antígeno ML0276 como subunidade vacinai conseguiu estimular a produção de interferon gama (IFNy) durante a infecção experimental pelo M. leprae, apresentando-se como adjuvante potente para estimular uma resposta Th1 (RAMAN, VS., et al. Infect Immun, v. 77, n. 12, p. 5623-5630, 2009). A avaliação da imunogenicidade de 17 proteínas recombinantes em células mononucleares de 127 brasileiros mostrou que cinco antígenos (ML0576, ML1989, ML2283 ML1990 e ML2567) induziram aumento nas quantidades de interferon-y em pacientes paucibacilares, pacientes com hanseníase reacional e em contatos saudáveis, mas não tiveram efeito para maioria dos pacientes com hanseníase multibacilar (GELUK, A., et al . Infect Immun, v. 73, n. 9, p. 5636-5644, 2005). Esse tipo de abordagem representa uma perspectiva positiva, onde os peptídeos validados podem ser avaliados quanto a sua capacidade em estimular células mononucleares de sangue periférico de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares na produção de citocinas importantes dentro da resposta imunológica da hanseníase.

[31] . Os exemplos a seguir mostram uma descrição detalhada dos resultados experimentais obtidos. A invenção poderá ser melhor compreendida por meio dessa descrição, em consonância com as figuras que seguem em anexo. Os procedimentos experimentais envolvidos serão detalhados no final desse relatório.

[32] . Descrição das Figuras e Tabelas:

[33] . Tabela 1: apresenta a identificação das sequências dos peptídeos miméticos do M. leprae obtidos por phage display e peptídeos sintéticos desenhados a partir das sequências miméticas.

[34], Tabela 2: apresenta os resultados do Teste de Redução de Colônias.

[35], Tabela 3: Cálculo das chances de desenvolver estado reacional pela positividade no ELISA.

[36], Figura 1: Sequências dos peptídeos imunorreativos (ID N°09 a ID N°14) contra o anticorpo monoclonal anti-PGL-1 selecionados por phage display.

[37], Figura 2: Reatividade dos peptídeos miméticos sintéticos de PGL1 (A: ID N°33 e B: ID N°34) em soro de pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares.

[38], Figura 3: Reatividade do peptídeo mimético sintético de PGL1 ID N°33 na saliva de um mesmo grupo de pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares. Figura 3A - Peptídeo Mimético Sintético de PGL-1; Figura 3B - PGL-1 Nativo.

[39] . Figura 4: Sensorgrama que mostra a reatividade do peptídeo mimético sintético de PGL1 (ID N°33) em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares avaliados por ressonância plasmônica de superfície em unidades de resposta (RU).

[40], Figura 5: Resultados do alinhamento tridimensional de peptídeos miméticos contra IgG contra proteínas do M. leprae.

[41] . Figura 6: Resultado do ELISA mostrando a reatividade do peptídeo mimético sintético contra IgG ID N°27 em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares.

[42] . Figura 7: Resultado do ELISA mostrando a reatividade do peptídeo mimético de GroEL ID N°19 em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares.

[43] . Figura 8: Resultado do ELISA mostrando a reatividade do peptídeo mimético de LAM IDN°15.

[44] . Exemplo 1

[45] . O primeiro exemplo mostra as aplicações dos peptídeos que mimetizam o glicolipídeo PGL-1. Onde na Tabela 1 temos apresentado a identificação das sequências dos peptídeos miméticos do M. leprae obtidos por phage display e peptídeos sintéticos desenhados a partir das sequências miméticas.

[46] . A Figura 1 mostra as sequências dos peptídeos imunorreativos contra o anticorpo monoclonal anti-PGL-1, suas respectivas frequências e índices de antigenicidade, destacando que estas são regiões imunogênicas.

[47], A Figura 2 apresenta a reatividade dos peptídeos miméticos sintéticos de PGL1 (A: ID N°33 e B: ID N°34) em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares. Sendo: TT- Tuberculoides; BT- Dimorfos- Tuberculoídes; BB- Dimorfo-dimorfo; BL-Dimorfo-virchoviano; LL- Virchoviano; CT- Contatos Intradomiciliares. Pacientes com índice ELISA maior que 1,1 (acima da linha pontilhada) são considerados positivos. A reatividade dos peptídeos miméticos sintéticos, avaliados por ELISA utilizando soro, demonstrou que estes detectam 100% dos pacientes Virchovianos corroborando com os achados para o PGL-1 nativo, o que demonstra que estes mimetopos apresentam a mesma função que o antígeno natural.

[48], TABELA 1

[49], A Figura 3 apresenta a reatividade do peptídeo mimético sintético de PGL1 )D N°33 na saliva de um mesmo grupo de pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares. Sendo: TT- Tuberculoides; BT- Dimorfos- Tuberculoídes; BB- Dimorfo-dimorfo; BL-Dimorfo-virchoviano; LL- Virchoviano; HC- Contatos Intradomiciliares; PB-Paucibacilares; MB-Multibacilares. Em A temos os resultados do peptídeo mimético sintético de PGL1 sendo comparado em B com o resultado do PGL1 nativo também avaliado na saliva, demonstrando que a reatividade do peptídeo mimético sintético de PGL1 foi observada também na saliva, com o índice de positividade de 100% em multibacilares e ainda detectando contactantes saudáveis, sendo, portanto um importante marcador de exposição. O peptídeo mimético sintético de PGL1 obteve o mesmo perfil de positividade quando comparado com o PGL1 nativo, mostrando que este consegue exercer a mesma função do PGL1 nativo.

[50], A Figura 4 apresenta um sensograma que mostra a reatividade do peptídeo mimético sintético de PGL1 (ID N°33) em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares avaliados por ressonância plasmônica de superfície em unidades de resposta (RU). Sendo: TT- Tuberculoides; DT- Dimorfos-Tuberculoídes; DD- Dimorfo-dimorfo; DV-Dimorfo- virchoviano; W- Virchoviano; Negative- Contatos Intradomiciliares; Buffer- somente tampão; Healthy- indivíduos saudáveis. Em A temos os resultados para todas as formas clinicas da hanseníase; Em B mostrando a diferenciação entre pacientes tuberculóides e negativos; Em C mostrando a diferenciação entre pacientes virchovianos e negativos. Estes gráficos apresentam que além da versatilidade do tipo amostrai, esses peptídeos foram acoplados em plataformas mais sensíveis de biossensores. Nos biosensores ópticos é utilizado o princípio de ressonância plasmônica de superfície. Nessas plataformas os peptídeos foram ainda mais sensíveis conseguindo distinguir todas as formas clinicas da hanseníase, sendo uma importante ferramenta para a correta classificação dos pacientes. Esses resultados reforçam a possibilidade da construção de um dispositivo portátil para o diagnóstico rápido e seguro da hanseníase.

[51], Exemplo 2

[52], No segundo exemplo apresentamos os resultados dos peptídeos miméticos que foram selecionados contra anticorpos policlonais IgM e IgG total, com o intuito de mapear novos antígenos imunogênicos que estejam envolvidos na interação entre o M. leprae e o hospedeiro.

[53], TABELA 2

[54], A Tabela 2 apresenta os resultados do Teste de Redução de Colônias que avalia a capacidade de anticorpos presentes no soro dos pacientes reconhecerem os peptídeos ainda no fago, bloqueando-os, o que resulta na diminuição de infectividade destes em E. coli. Esse tipo de teste não é diagnóstico, mas permite avaliar a especificidade dos anticorpos em reconhecerem os peptídeos miméticos selecionados contra IgM total. Houve um percentual em redução de colônias de 89,9% quando os fagos foram incubados com soros de pacientes Tuberculóides, demonstrando que estes pacientes possuem anticorpos que são reconhecidos por esses peptídeos miméticos, os resultados foram indicados pela média do número de colônias (pfu) obtidas a partir de dois ensaios, com a mistura de soro dos grupos contatos intradomiciliares (Cl), tuberculóide (T) e virchoviano (V) com quatro diferentes fagótopos e a infecção em E. coli ER2738. Como controle do teste, bactérias ER2738 foram infectadas somente com os referidos fagos. A contagem foi realizada pela diluição de fagos a 10'8.

[55], A análise de Bioinformática revelou que estes alinham com proteínas de choque térmico HSP60, que já tem potencial imunogênico reconhecido. Na Figura 5 temos: Em A o alinhamento do peptídeo mimético ID N°06 com a estrutura de groEL (domínio apical) cadeia A; Em B temos o alinhamento do peptídeo mimético ID N°06 com a estrutura do epítopo de HSP60 de Mycobacterium com a molécula H-2DB do MHC classe I de murino; Em C temos o alinhamento do peptídeo mimético ID N°07 com a estrutura de groEL (domínio apical) cadeia A.

[56], Os imunoensaios de ELISA, apresentados na Figura 6, confirmaram a sensibilidade desses peptídeos miméticos em reagirem com 62,2% dos pacientes paucibacilares, um grupo que reconhecidamente apresenta dificuldade no diagnóstico. Outra importante descoberta dessa invenção consta do design de peptídeos sintéticos, demonstrando que a inserção de aminoácidos da proteína Plll original do fago aumenta a sensibilidade desses peptídeos miméticos, provavelmente por que esta inserção promove uma maior estabilidade do peptídeo. A Figura 6 apresenta o resultado do ELISA mostrando a reatividade do peptídeo mimético sintético contra IgG ID N°27 em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares. Sendo: TT- Tuberculoides; BT- Dimorfos-Tuberculoídes; BB- Dimorfo-dimorfo; BL-Dimorfo-virchoviano; LL- Virchoviano; CT- Contatos Intradomiciliares. Em A mostrando a reatividade do peptídeo ID N°27 em virchovianos, tuberculoides e contatos; em B comparando a reatividade dos peptídeos ID N°26 e ID N°27 em virchovianos, tuberculoides e contatos, para demonstrar a importância dos aminoácidos proteína Pill no design do peptídeo; em C mostrando a reatividade do peptídeo ID N°27 em todas as formas clínicas da hanseníase.

[57] . Exemplo

[58] . O exemplo 3 mostra os resultados com os peptídeos miméticos obtidos de uma seleção contra anticorpos monoclonais anti-GroES e anti- GroEL, duas proteínas de choque térmico (HSP) reconhecidamente importantes para o M. leprae. Essas proteínas tem sido amplamente estudadas por compor antígenos com alta imunogenicidade. Os peptídeos miméticos de GroEL obtidos na presente invenção apresentam-se como marcadores em potencial para o diagnóstico das formas paucibacilares da hanseníase, reconhecendo 66% desses pacientes e 33% de contatos intradomiciliares. A Figura 7 apresenta o resultado do ELISA mostrando a reatividade do peptídeo mimético de GroEL ID N°19 em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares. Sendo: TT- Tuberculoides; BT- Dimorfos-Tuberculoídes; BB- Dimoiío-dimorfo; BL-Dimorfo-virchoviano; LL- Virchoviano; CT- Contatos Intradomiciliares. Em A mostrando a reatividade do peptídeo com todas as formas clinicas da hanseníase e com o grupo de contactantes; em B mostrando a reatividade do peptídeo estratificando os pacientes em paucibacilares (PB) ou multibacilares (MB).

[59] . Foi produzido também um peptídeo mimético anti-LAM, outro importante antígeno imunogênico do M. leprae. A Figura 8 mostra os resultados do ELISA realizado com peptídeo mimético de LAM, ID N°15 em pacientes que não desenvolveram estado reacional e naqueles que desenvolveram reação tipo I ou tipo II. Em A temos a tabela que mostra a analise estatística de chances de risco (ODDS ratio); Em B o resultado de ELISA nos pacientes com ou sem reação, estratificados em multibacilares (bolinhas escuras) e paucibacilares (bolinhas claras). Pacientes com índice Elisa maior que 1,1 foram considerados positivos.

[60]. TABELA 3

[61], Estes dados apontam este peptídeo como um marcador de estado reacional na hanseníase. Os pacientes positivos para o peptídeo mimético de LAM apresentaram cinco vezes mais chances de desenvolver reação do tipo I e nove vezes mais chances de desenvolver reações do tipo II, como pode-se observar na Tabela 3.

Metodologia empregada

[62], Descrevemos agora a metodologia utilizada para obtenção dos peptídeos miméticos utilizando a metodologia de phage display.

[63]. Foram realizadas diferentes estratégias de seleção (biopanning) de acordo com cada objetivo. Para obtenção de peptídeos miméticos do M. leprae contra IgM ou IgG total foram utilizados como alvo anticorpos purificados de pacientes ou contactantes (grupo controle). Para obtenção de peptídeos miméticos de PGL1, LAM, GroEL e GroES foram utilizados como alvo anticorpos monoclonais anti-PGL1, anti-LAM, anti-GroEL e anti-GroES, respectivamente, obtidos comercialmente.

[64]. A Estratégia de Seleção para obtenção dos peptídeos miméticos contra IgG ou IgM total é descrita a seguir: Para purificação das imunoglobulinas, IgM ou IgG, foram utilizadas amostras de soro de 20 pacientes com hanseníase, sendo 10 Tuberculóides (TT) e 10 Virchovianos (W), além de 10 Contatos Intradomiciliares (CT) sadios como grupo controle. Todos foram atendidos no Centro de Referência Nacional em Dermatologia Sanitária e Hanseníase (CREDESH), Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Uberlândia (HC/UFU), em suas duas Unidades, Ambulatório Central e Centro de Saúde- Escola (CSE) - Jaraguá. Os pacientes foram submetidos a um protocolo clínico-laboratorial para diagnóstico e classificação da hanseníase, seguindo os critérios de Ridley & Jopling (1966) incluindo a realização dos testes de Mitsuda; ML-Flow; ELISA para PGL-1; índice baciloscópico de esfregaço cutâneo e biópsias das lesões para exame histopatológico. Os contatos também foram acompanhados, verificando-se a quantidade de marcas da vacina BCG, como recomendado pelo Ministério da Saúde do Brasil, além da realização de exames complementares como ML- FLOW; ELISA para PGL-1 e Mitsuda. Foram considerados para formar o grupo controle, portanto, somente contatos que apresentassem ELISA e ML-FLOW negativos, com Mitsuda superior a oito milímetros.

[65], A purificação de IgG ou IgM total foi realizada utilizando uma suspensão salina de resina anti-lgG ou anti-lgM humana com capacidade de ligação de 2mg/mL. A resina foi lavada com TBS-Tween 0,1%, sendo peletizada por centrifugação. Em seguida, o pool de soro diluído em TBS- Tween 0,1% foi adicionado à resina pré-lavada e incubado em temperatura ambiente. A mistura (resina+soro) foi lavada com TBS-Tween 0,1 % para remoção de produtos não ligantes. As IgGs ou IgMs ligadas à resina foram eluídas com tampão glicina, recuperadas e neutralizadas com Tris (1,0 M pH 9,1). Para quantificação das amostras foi utilizado espectrofotômetro a 280 nm.

[66]. Para seleção dos peptídeos miméticos foi utilizada uma biblioteca Ph.D.-C7C™ (NEW ENGLAND BioLabs® Inc.) de peptídeos randômicos fusionados à proteína pill de bacteriófagos filamentosos M13. Foram realizados quatro Biopanning, sendo dois para o polo tuberculóide (IgG ou IgM) e dois para o polo virchoviano (IgG ou IgM), utilizando como estratégia uma seleção negativa, onde a biblioteca de fagos era exposta com pool de IgGs ou IgMs purificadas do grupo controle, seguida de uma seleção positiva, no qual os fagos que não se ligavam nas IgGs ou IgMs dos controles eram expostos com as IgGs ou IgMs de pacientes tuberculoides ou virchovianos.

[67]. Foram realizados cinco ciclos de seleção de fagos com anticorpos humanos, IgG ou IgM total, onde a biblioteca de fagos Ph.D.-C7C foi utilizada em biopanning líquido com resina anti-lgG ou anti-lgM, a mesma utilizada no processo de purificação. Inicialmente, a resina foi lavada 1 vez com TBS- Tween 0,1% e bloqueada por 1 hora em tampão bicarbonato (0,1M NaHCOg pH 8,6; 5.0 mg/mL de BSA) a uma temperatura de 4°C. A resina bloqueada foi, então, lavada 4 vezes com TBS-Tween 0,1%. Uma quantidade de 300 ng do anticorpo purificado de cada grupo foi incubado em TBS-Tween 0,1% com 1,2 x 1010 pfu da biblioteca de fagos Ph.D.-C7C no primeiro ciclo de seleção e nos ciclos subsequentes com partículas de fagos amplificados obtidas no ciclo anterior. A mistura fago-anticorpo foi transferida para o tubo contendo a resina bloqueada e lavada, incubando-os por 15 minutos em temperatura ambiente. Os fagos não ligantes foram removidos por dez lavagens com TBS-Tween 0,1% no primeiro ciclo de seleção e nos ciclos subsequentes com TBS-Tween 0,5%. Os fagos ligantes foram eluídos com tampão glicina (0,2M pH 2,2; 1 mg/mL de BSA) até o 3° ciclo de seleção. A partir do 4o ciclo, os fagos foram eluídos com Mitsudina, uma suspensão de bacilos do M. leprae mortos pelo calor (12 x 104 do bacilo em 500 μL de TBS) e incubados por 1 hora, com inversões do tubo a cada 5 minutos, à temperatura ambiente. A resina foi precipitada e o sobrenadante recuperado foi neutralizado com Tris-HCI (1M, pH 9,1). Foram feitas pequenas alíquotas do eluato de fagos recuperados para serem utilizadas na titulação e o restante foi amplificado.

[68]- A Estratégia de Seleção para obtenção dos peptídeos miméticos de PGL1 é descrita a seguir: O anticorpo monoclonal anti-PGL-1, da subclasse IgG, foi purificado de camundongos (mAb CS-48). Foram realizados 3 ciclos de seleção de fagos com anticorpos antiPGL.1, onde a biblioteca de fagos Ph.D.-C7C (NEW ENGLAND BioLabs®lnc) foi usada em seleção líquida (biopanning) com agarose específica para IgG (rProtein G Agarose - Invitrogen-Life Technologies). Primeiramente, 50 pL de uma suspensão a 50% de agarose rPtoteína G, foi lavada uma vez em TBST (0,1% de Tween) e em seguida bloqueada por 60 minutos a 4 °C em tampão de bloqueio (0,1M NaHCO3 pH8.6, 5.0 mg/ml BSA). Nesse intervalo de tempo, 500 ng de anticorpo mAb CS-48 foram incubados, por 20 min em temperatura ambiente num volume final de 200 uL de TBST, com 1,2 x 1010pfu da biblioteca de fagos Ph.D.-C7C no primeiro ciclo e nos ciclos subsequentes com partículas de fagos amplificados nos ciclos de seleção. A resina bloqueada foi lavada quatro vezes com 1,0 mL de TBST. A mistura fago-anticorpo foi transferida para o tubo contendo a resina bloqueada e lavada e incubou-se em temperatura ambiente por 15 minutos, misturando-se ocasionalmente. Os fagos não ligantes foram removidos por dez lavagens com TBST (0,1% Tween-20) no primeiro ciclo de seleção e nos ciclos subsequentes com TBST (0,5% Tween-20). Os fagos ligantes foram eluídos em cada ciclo com 1,0 mL de tampão glicina (0,2M pH 2,2, 1 mg/mL de BSA). A resina foi precipitada e o sobrenadante recuperado e neutralizado com 150 uL de Tris-HCI (1M, pH 9,1). Pequenas alíquotas do eluato de fagos foram utilizadas para a titulação.

[69]. A Estratégia de Seleção para obtenção dos peptídeos miméticos de LAM, GroEL e GroES é descrita a seguir: Para seleção dos peptídeos miméticos de U\M foi utilizado um anticorpo monoclonal CS-35, que é um anticorpo de isotipo lgG3 contra LAM do M. leprae. Já para a seleção dos peptídeos miméticos de GroEL e GroES foram utilizados dois anticorpos diferentes: o anticorpo monoclonal CS-01, que é um anticorpo monoclonal de isotipo lgG3 contra GroES do M. leprae (NR-19364) e o CS-44, um anticorpo monoclonal de isotipo lgG2a contra GroEL do M. leprae.

[70]. Uma biblioteca de Ph.D.-C7C (NEW ENGLAND Biolabs®lnc) de peptídeos randômicos fusionados à proteína plll de bacteriófagos filamentosos M13 foi utilizada. Foram utilizadas 5μL (1x1011 partículas virais) da biblioteca Ph.D.-C7C e realizado três ciclos de seleção de fagos ligantes ao respectivo anticorpo monoclonal. Em cada um dos ciclos, um poço de uma microplaca de 96 poços (Maxisorp-Nunc®) foi previamente adsorvido com anticorpo monoclonal CS-35 (100μg/mL em 0,1 M NaHCO3, pH 8,6) a 4C por 12-16 horas (overnight), a placa foi bloqueada com 300μL de tampão de bloqueio por uma hora a 4C; e lavada seis vezes com TBS-T(TBS contendo 0,1% tween- 20). Acrescentou-se, no mesmo orifício da placa, 5μL da biblioteca diluídos em 100μL de TBS-T agitando por uma hora a temperatura ambiente. Fagos não ligantes foram removidos com seis lavagens de TBS-T 0,1% no primeiro ciclo de seleção e nos dois ciclos subsequentes com TBS-T 0,5%. Os fagos ligantes foram retirados por eluição ácida com glicina e neutralizadas com Tris-HCI. Pequenas alíquotas do eluato foram utilizadas para titulação.

[71], Os processos de titulações, amplificação e purificação de fagos, extração de DNA, seguenciamento e análise de bioinformática descritos a seguir foram os mesmos para as diferentes estratégias de seleção: Para as titulações os eluatos foram submetidos a diluições seriadas exponenciais (log 10) crescentes em meio LB, sendo as diluições de 10’1 até 10'4 para eluatos não amplificados e de 10'8 a 10'11 para eluatos amplificados. A cada diluição foi acrescido 200 μL da cultura de E. coli ER2738 na fase mid-log (OD60o ~0,5). Após a infecção, a cultura foi transferida para tubos contendo 3mL de Agar-Top (10g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCI, 7g Agarose normal, 1 g de MgCh.δ H2O / litro) e espalhadas sobre uma placa de Petri contendo meio LB sólido, com IPTG (0,5mM) / Xgal (40μg/ml_) e tetraciclina (20mg/mL). Para cada diluição foi confeccionada uma placa. As placas foram incubadas à 37°C overnight. Após este período, as colônias que se apresentavam azuis e bem individualizadas foram contadas manualmente. Para estimar os valores dos títulos multiplicou-se o número total de colônias pelo fator de diluição em cada placa.

[72]. Para a amplificação, distribui-se 1 ml_ da cultura de E. coli ER2738 em fase early-log (OD eoo~O,3) em cada poço de uma placa Deepwell. Com palitos de dente esterilizados, colônias azuis foram retiradas da placa de Petri (ciclos não-amplificados) e transferidas para a Deepwell. A cada poço foi adicionado apenas uma colônia de fago, totalizando 96 colônias em cada Deepwell. A placa foi vedada e incubada por 5 horas sob agitação a 37°C. Após a incubação, a placa foi centrifugada por 20 minutos a 3700 rpm, transferindo o sobrenadante para outra Deepwell. A esta segunda placa foi adicionado 1/6 do volume total de PEG/NaCI, sendo incubada por 14 horas a 4°C. Após esse tempo a placa foi centrifugada por 1 hora, o sobrenadante foi dispensado e o precipitado foi ressuspendido em PBS 1X (Tampão Fosfato Salina).

[73], Na extração de DNA dos fagos, colônias azuis provenientes do ultimo ciclo de seleção (eluato não amplificado), foram transferidas para placas Deepwell contendo cultura de E. coli ER2738, sendo então incubadas. Após o tempo de incubação seguem-se os mesmos procedimentos da amplificação até a última centrifugação de 1 hora, onde é acrescentado ao precipitado tampão iodeto (10mM de Tris-HCI pH 8,0; 1mM de EDTA e 4M de Nal). As placas foram agitadas vigorosamente e, em seguida, se adicionou etanol absoluto. Após uma incubação de 10 minutos, as placas foram centrifugadas (3700 rpm, 4°C, 10 minutos) e o sobrenadante descartado. O precipitado de DNA foi lavado com 500 μL de Etanol 70% e recentrifugado. Finalmente, o DNA foi diluído em 20 μL de água ultrapura e sua qualidade foi verificada pela corrida eletroforética em gel de agarose 0,8% corado com solução de brometo de etideo (10 mg/mL).

[74], O sequenciamento foi realizado com 500ng DNA molde dos fagos selecionados no biopanning, 5 pmol do primer- 96 gill (5’-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’ - Biolabs) e o pré-mix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit.- Amersham Biosciences). A reação de 35 ciclos ocorreu em urn termociclador de placas nas seguintes condições: desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento a 58°C por 15 segundos e extensão a 60°C por 60 segundos. Os amplicons gerados da reação de sequenciamento foram precipitados com 1μL de acetato de amónio e 27,5μL de etanol absoluto. A placa foi centrifugada por 45 minutos a 4000 rpm e o sobrenadante descartado. Adicionou-se ao pellet 150 μL de Etanol 70%, centrifugando-o por 10 minutos, a 4000 rpm, descartando posteriormente o sobrenadante. A placa permaneceu invertida sobre um papel toalha e nesta posição foi centrifugada a 800 rpm, durante 1 minuto. Em seguida, a placa foi coberta com papel alumínio, ficando assim por cinco minutos para evaporar o etanol remanescente. O precipitado resultante foi ressuspendido no tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit. - Amersham Biosciences) e a leitura foi realizada em um sequenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences).

[75] . A bioinformática foi realizada inicialmente para a tradução dos aminoácidos foi realizada pelo programa DNA2PRO12, que é designado para tradução de sequências de insertos tanto de bibliotecas da New England Biolabs (Ph.D.-12™ ou Ph.D.-C7C™) quanto de outras bibliotecas de interesse que contiverem as sequências inicial e final do vetor. O programa automaticamente localiza a posição do insecto, traduz o mesmo e indica os possíveis erros na tradução (tais como códons inesperados ou erros na sequência próxima). As sequências que não puderam ser traduzidas pelo programa foram analisadas manualmente. As homologias entre os peptídeos selecionados foram testadas utilizando o programa CLUSTAL W (1.83). Os peptídeos foram alinhados com proteínas depositadas no BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que consta de um conjunto de programas que buscam similaridades entre diferentes sequências. O alinhamento das sequências a serem investigadas é realizado com o bancos de dados de ácidos nucléicos e/ou proteínas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Dentro do BLAST a busca foi realizada no “Protein blast utilizando como database o “swissprot protein sequence (swissprot)1’, algoritmo - blastp (protein BLAST) e a pesquisa foi restrita ao Mycobacterium leprae (taxid: 1769). Para obter informações detalhadas sobre as proteínas que alinharam com os peptídeos selecionados foi utilizado o banco de dados UniProtKB Swiss-Prot (http://www.uniprot.org/). Para identificar possíveis epítopos antigênicos lineares foi utilizado o programa Bepipred (http://www.cbs.dtu.dk/services/bepipred), visando avaliar se os alinhamentos fornecidos pelo programa blast-p prediz com uma possível região estimuladora na produção de anticorpos. O programa usa métodos que utilizam uma escala de tendências como estrutura secundária, hidrofilicidade, acessibilidade, randomicidade, dando valores para cada aminoácido. A estratégia de testar o alinhamento dos peptídeos com proteínas específicas do M. leprae também foi realizada utilizando o programa Pepsurf (MAYROSE et al, 2007). Este programa tem como entrada um conjunto de proteínas no formato PDB. O algoritmo procura agrupar um subconjunto dos peptídeos para identificar uma região na proteína alvo que potencialmente é mimetizada por aquele grupo de peptídeos específicos.

[76] . Serão descritos as estratégias utilizadas para que os peptídeos miméticos obtidos com as diferentes estratégias de seleção fossem devidamente validados.

[77] . Para validação dos peptídeos miméticos, ainda no fago, foram realizados diferentes ensaios: Teste de redução de colônias e diferentes estratégias de ELISA.

[78], O teste de redução de colônias proposto por Yang & Shiuan (2003) se baseia na neutralização da proteína plll presente nos fagos pela adição do soro contendo anticorpos que se ligam aos peptídeos expressos na região da plll, impedindo assim que os bacteriófagos consigam infectar E. coli. Os clones foram diluídos (1 μL de fago em 9 μl_ de meio de cultura LB) até o fator que correspondesse à formação de aproximadamente 500 colônias azuis, havendo uma variação de 10'6 a 10’8 entre os fagos testados. Um volume de 10 μL da diluição foi misturado com 8 uL dos soros (pool de 10) de pacientes e controles, nas diluições de 1:8 e 1:256 e incubados por 1 hora a uma temperatura de 37°C. Após esse intervalo, a mistura fago-soro foi utilizada para infectar 200 pL de cultura de E. coli ER2738 em fase early-log (OD6oo~0,5) por incubação à temperatura ambiente por 5 minutos. A cultura foi misturada com 3 ml_ de Ágar-Top, plaqueada em meio LB sólido contendo IPTG/Xgal e incubada a 37°C durante a noite. As colônias de fagos produzidas em cada placa foram contadas e comparadas com uma placa controle, onde foi realizada uma titulação normal do fago sem a incubação com soro, de forma que a possível redução fosse validada.

[79]. Os Ensaios de ELISA foram divididos em dois momentos: para a pré-validação inicialmente se testou a reatividade de todos os peptídeos miméticos contra pool de soros de pacientes das diferentes formas clínicas da hanseníase e contactantes intradomiciliares. Posteriormente, se testou a reatividade de todos os peptídeos miméticos contra soros individuais de pacientes e contactantes. Nos ensaios de ELISA para a pré-validação foram utilizados pools com 10 soros de pacientes tuberculóides, virchovianos ou controles, com os seguintes procedimentos experimentais: as placas de microtitulação (Polysorp™) foram sensibilizadas com 1pg/poço de anticorpo anti-M13 diluído em tampão carbonato (50mM; pH 9,6) sendo incubado overnight a 4°C. Decorrido o tempo de incubação as placas foram lavadas 3X com PBS-Tween 0,5% e bloqueadas por 1 hora em tampão de bloqueio (PBS 0,5% suplementado com 5% de BSA) numa temperatura de 37°C. As placas foram lavadas por seis vezes com PBS-Tween 0,5% e incubadas por 1 hora a 37°C com 50pL/poço de sobrenadante dos fagos selecionados. Como controles da reação foram utilizados o fago selvagem (fago que não expressa nenhuma proteína exógena) e meio de cultura sem fago em alguns poços da placa. Posteriormente, as placas foram novamente lavadas por seis vezes com PBS-Tween 0,5% e incubadas a 37°C por 1 hora com pool de soros de pacientes ou contatos na concentração de 1:100, diluídos em PBS 0,5% suplementado com 5% de leite desnatado. Após este período, as placas foram lavadas seis vezes e incubadas com anti-lgG conjugado com peroxidase (Sigma), diluído 1:5000 em PBS 0,5% suplementado com 5% de leite desnatado por 1 hora a 37°C. Depois desse período de incubação as placas foram novamente lavadas e a ligação antígeno/anticorpo foi detectada pela adição do tampão orto-fenilenodiamina (OPD) na concentração de 1mg/mL. A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 4N. A reatividade foi medida pelos valores de absorbância obtidos em leitor de placas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA) com leitura no comprimento de onda de 492nm. O procedimento experimental para os ensaios com soros individuais diferem do que foi descrito acima nos seguintes aspectos: as placas (Maxisorp™) foram sensibilizadas diretamente com os fagos purificados (1010 a 1011); os soros de cada paciente ou contato foram diluídos (1:100) e testados individualmente.

[80], Para verificar se houve diferenças estatisticamente significativas na reatividade dos fagos, avaliados pelo ELISA, comparando os soros de controles com os soros de pacientes o teste ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni, com intervalo de confiança de 95%.

[81], Com os resultados da reatividade dos peptídeos miméticos ainda no fago, foram selecionados aqueles que apresentaram maior reatividade para realização da síntese química dos peptídeos, que passaram a ser denominados peptídeos sintéticos. Todas as estratégias utilizadas para realizar as diferentes combinações dos peptídeos sintéticos estão descritas na Tabela 1.

[82]. A síntese química foi realizada utilizando resina do tipo Fmoc em sintetizador automático. Para validar se os peptídeos sintético apresentavam reatividade com amostras biológicas de pacientes com hanseníase e contactantes intradomiciliares foram utilizados ensaios de ELISA e Ressonância plasmônica de superfície. Por ELISA, os peptídeos sintéticos foram testados tanto em amostras de soro quanto de saliva de pacientes com todas as formas clínicas da hanseníase.

[83]. Os dados suportam que os Peptídeos recombinantes produtos desta invenção apresentam potencial para serem empregados em processos de imunodiagnóstico in vitro e in vivo como sondas a serem utilizadas em ensaios imunológicos, como por exemplo, testes imunoenzimáticos (tais como ELISA, Western Blot, imunofluorescência, imunohistoquímica, e outros), testes por imunoaglutinação (ML-FLOW, Testes de fluxo lateral e outros), biosensores (Sensores eletroquímicos, Sensores ópticos por ressonância plasmônica de Superfície, ou utilização de quantum dots, microscopia de força atômica, espectroscopia de fluorescência e outros) ou de qualquer outra forma de detecção relacionada direta ou indiretamente em amostras de fluídos corporais, como saliva, sangue, soro, plasma, urina dentre outros.

Claims (7)

1. Peptídeo recombinante sintético mimético a antígeno do M. leprae caracterizado por compreender uma sequência selecionada da Seq ID N° 01 a Seq ID N° 80.

2. Combinações de peptídeos recombinantes sintéticos miméticos a antígenos do M. leprae descritos na reivindicação 1, caracterizadas por incluir espaçadores e sequências da proteína PII do fago M13.

3. Peptídeos de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizados por serem usados em processos de imunodiagnósticos como sondas para detecção in vitro e in vivo da presença de anticorpos circulantes ou outras moléculas ligantes contra doenças infecciosas tal como a hanseníase.

4. Peptídeos de acordo com a reivindicação 3 caracterizados pela detecção ser através de ensaios imunológicos por ensaios imunológicos, como por exemplo, testes imunoenzimáticos (tais como ELISA, Western Blot, imunofluorescência, imunohistoquímica, e outros), testes por imunoaglutinação (ML-FLOW, T estes de fluxo lateral e outros), biosensores (Sensores eletroquímicos, Sensores ópticos por ressonância plasmônica de Superfície, ou utilização de quantum dots, microscopia de força atômica, espectroscopia de fluorescência e outros) ou de qualquer outra forma de detecção relacionada direta ou indiretamente em amostras de fluídos corporais, como saliva, sangue, soro, plasma e urina.

5. Uso do peptídeo recombinante sintético mimético conforme descrito nas reivindicações 1 ou 2 caracterizado Petição 870220082870, de 12/09/2022, pág. 7/50 pelo fato de que é na preparação de uma composição imunogênica contra doenças infecciosas, em que a doença infecciosa é preferencialmente hanseníase.

6. Uso do peptídeo recombinante sintético mimético conforme descrito nas reivindicações 1 ou 2 caracterizado pelo fato de que é utilizado em processos de diagnóstico, prognóstico, marcadores de risco, adoecimento ou estado reacional in vitro de doenças infecciosas, em que a doença infecciosa é preferencialmente hanseníase.

7. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dos peptídeos selecionados das sequências Seq ID N° 01 a Seq ID N° 80.

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