BR102013031014A2 - Método de controle de praga - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE CONTROLE DE PRAGA. A presente invenção refere-se a um método para o controle da Athetis lepigone, que compreende o contacto da Athetis lepigone com a proteína Cry1A. A presente invenção alcança o controle da Athetis lepigone por permitir que as plantas produzam a proteína Cry1A in vivo, que é letal para a Athetis lepigone. Em comparação com os métodos de controle agrícola e química atuais, o método da presente invenção pode controlar a Athetis lepigone durante todo o período de crescimento das plantas e provê as plantas com uma proteção completa. Além disso, o método é estável, completo, simples, conveniente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE CONTROLE DE PRAGA".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método para o controle de pragas, especificamente um método para impedir que a Athetis Iepigone faça danos às plantas através da expressão nos mesmos da proteína Cry 1 a. Antecedentes

A Athetis Iepigone pertence à Lepidoptera, Noctuidae. Como uma praga onívora ela se alimenta principalmente de milho. Ela habita prin10 cipalmente o distrito agrícola de verão da região de Huang-Huai-Hai na China, e também tem sido encontrada no Japão, Coreia, Rússia e na Europa. Ela causa danos principalmente nas raízes aéreas do milho na superfície do solo, come as raízes de suporte e as hastes, distorce ou mesmo mata as plantas de milho. O campo de milho danificado irá exibir grandes áreas vazi15 as ou mesmo se tornar estéril de sob ataques mais graves.

O milho é a principal cultura alimentar na China. Em 9 de julho de 2011, o "News Broadcast" da CCTV reportou primeiramente surtos de Athetis Iepigone na China. A partir do outono de 2011 até maio de 2012 várias pesquisas de campo feitas pelo Pest Prevention and Control Laboratory 20 of National Maize Industry descobriram que a Athetis Iepigone de 2012 compreendia um grande número de populações de inverno de grande número com uma alta densidade de larvas, indicando que o surto de Athetis Iepigone e provável de irromper de novo na região de Huang-Huai-Hai. Existem dois métodos de controle da Athetis Iepigone comumente usados, mé25 todos de controle agrícola e métodos químicos.

O método de controle agrícola é um gerenciamento integrado e coordenado de múltiplos fatores com relação a todo o sistema de terras de agricultura, que regula os fatores de culturas, pragas e de meio ambiente e estabelece um ecossistema de terras agrícolas que leva a um crescimento 30 da cultura, porém não favorável a Athetis lepigone. Por exemplo, a imediata remoção das palhas, ervas daninhas e outras coberturas dos rebentos das plantas de milho até um maior espaço entre as linhas de milho bem distante das plantas de modo a expor o solo é comumente usado com a finalidade de tornar segura a etapa seguinte de pulverização do pesticida pode levar a um contato direto com a Athetis lepigone. No entanto, uma vez que o controle agrícola deve obedecer às exigências com relação ao Iayout da cultura e ao 5 aumento de produção, esse método tem aplicações limitadas e não pode ser usado como uma medida de emergência quando do surto da Athetis lepigone.

O controle químico também conhecido como o controle com pesticida, é para matar as pragas com a utilização de pesticidas. Como um dispositivo importante para o gerenciamento abrangente de controle, ele é um método rápido, conveniente, simples e altamente rentável. Especificamente, ele pode ser usado como uma prática essencial de emergência para a redução da densidade da Athetis lepigone antes que os danos tenham sido feitos. Correntemente, as medidas principais de controle químico incluem iscas envenenadas, solo envenenado, bem como encharcamento e pulverização com pesticida. No entanto, o controle químico tem as suas limitações: o uso impróprio do mesmo pode ocasionar conseqüências devastadoras, tais como o envenenamento das colheitas, resistência às pragas, morte dos predadores e poluição do meio ambiente de tal forma a destruir os eco sistemas das terras agrícolas; os resíduos dos pesticidas representam uma ameaça à segurança local de serem humanos e de gado, e como a Athetis lepigone prefere um micro habitat úmido e escuro, ela geralmente se esconde sob as coberturas como a palha do trigo, ou a abaixo do solo superficial tornando o contato direto entre os produtos químicos e a Athetis lepigone difícil, o que torna o controle químico ineficaz.

Para superar as limitações dos métodos de controle agrícola e de controle químico nas aplicações, pesquisas descobriram que a inserção de genes de codificação de proteínas pesticida dentro do genoma da planta pode produzir plantas resistentes a pragas, A proteína pesticida Cry 1A entre 30 um grande grupo de proteínas pesticidas, é uma proteína parasporal cristalífera produzida por uma subespécie de Bacillus thuríngiensis (Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki, B.t.k). A proteína Cry 1A é ingerida pelas pragas, é dissolvida no ambiente alcalino do intestino médio da praga e libera uma pro toxina, um precursor de uma toxina. Alem disso a protease alcalina digere a pro toxina nos terminais N e C da s mesmas e produz um fragmento ativo que poderá em 5 seguida se ligar a um receptor da membrana das células epiteliais do intestino médio da praga e inserir ela própria dentro da membrana intestinal, resultando em uma perfuração da membrana da célula, desequilibrando a homeostase do pH e a pressão osmótica através da membrana da célula, perturbando a digestão da praga e eventualmente levando a morte das pragas.

Foi confirmado que as plantas transgênicas Cry 1A podem resis

tir às pragas Lepidoptera tais como a broca do milho, lagarta do algodão e broca de tronco. No entanto, até o presente, não existem relatórios com relação ao controle da Athetis lepigone através da geração de plantas transgênicas que produzem a proteína Cry 1A.

A finalidade da presente invenção é a de prover um método de

controle de pragas, usando pela primeira vez plantas transgênicas que expressam a proteína Cry 1A para o controle de danos causados pela Athetis lepigone. O referido método supera de forma efetiva as limitações técnicas dos métodos de controle agrícola e de controle químico.

Para o alcance da finalidade como mencionada acima, a presen

te invenção proporciona um método para o controle da Athetis lepigone, o referido método compreendendo por em contato a Athetis lepigone com a proteína Cry 1 A. De preferência a proteína Cry 1A é a proteína Cry 1 Ab.

Além disso, a presente invenção proporciona uma planta trans

gênica que expressa a proteína Cry 1A e o material de reprodução da mesma, tal como sementes, mudas e semelhantes.

Também, a proteína Cry 1Ab está presente em uma célula que expressa a referida proteína a partir de uma planta, e é posta em contato com a Athetis lepigone através da ingestão da célula.

Além disso, a proteína Cry 1Ab está presente em uma em uma

planta que expressa a proteína Cry 1 Ab, e a Athetis lepigone entra em contato com a proteína Cry 1 Ab através da ingestão de um tecido da planta transgênica. Como uma conseqüência, o crescimento da Athetis lepigone é inibido, levando eventualmente à morte da Athetis lepigone e em seguida os danos da Athetis lepigone à planta são controlados.

A planta transgênica pode ter qualquer período de crescimento.

O tecido da planta transgênica pode ser as raízes, folhas, cau

les, franjas, espigas, anteras ou filamentos.

O controle dos danos da Athetis lepigone para a planta não depende da localização da plantação.

O controle dos danos da Athetis lepigone para a planta não depende do tempo do plantio.

As plantas são as plantas de milho.

Antes da etapa de por em contato, é plantar uma muda transgênica que contenha um polinucleotideo que codifique a proteína Cry 1 Ab.

De preferência a seqüência de aminoácidos da proteína Cry 1 Ab compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. A seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína Cry 1 Ab compreende uma seqüência de nucleotídeos das SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:

4.

Embora a Athetis lepigone e a Agrotis ypsilon Rottemberg pertençam à ordem de Lepidoptera da família Noctudiae, e elas tenham objetivos similares e uma morfologia próxima, elas são duas espécies distintas e claramente diferentes em biologia a Athetis lepigone e a Agrotis ypsilon Rottemberg tem pelo menos as diferenças que se seguem:

1. Hábitos de alimentação diferentes: Além dos graves danos ao milho de verão a Athetis lepigone também possui uma ameaça ao amendoim

e à soja. Enquanto que a Agrotis ypsilon Rottemberg, como uma praga polifágica não somente prejudica o milho, sorgo e o painço, porem também ocasiona severos danos a uma ampla faixa de mudas incluindo pinheiro lariço, ashe Chinês e nogueira da Mandchuria mo nordeste, pinho Masson, abeto, 30 amoreira e chá no sul bem como o pinho vermelho da China, oleastro e outras arvores frutíferas no noroeste.

2. Habitações geográficas diferentes: Atualmente, a Athetis Iepigone tem sido encontrada primariamente no distrito de milho de verão em Huang-Huai-Hai, incluindo as seis províncias de Hebei, Shandong, Henan, Shanxi, Jiangsu e Anhui, um total de 47 cidades e 297 aldeias. Ao passo que a Agrotis ypsilon Rottemberg, é em sua maioria encontrada em locais com 5 clima úmido e chuva abundante na China, tal como no Changjiang River Valley, e nas áreas úmidas da costa sudoeste e áreas úmidas do leste e do sudoeste do Noroeste da China.

3. Hábitos de infestação diferentes. A Athetis lepigone causa graves problemas em alguns distritos de milho de verão de Hebei, especifi10 camente em campos imper plantados com trigo, as larvas da mesmas se escondem por baixo da palha de trigo amassada em torno das mudas de milho ou se enterram 2 a 3 cm da superfície do solo para danificar as raízes das mudas. Existem normalmente de 1 a 2 e até de 10 a 20 larvas por muda individual. Quando as mudas do milho chegam ao estagio de 3 a 5 folhas, as 15 larvas se alimentam principalmente na base do caule e deixam por trás furos circulares ou ovais de 3 a 4 mm de tamanho, resultando na ruptura do transporte da nutrição para as folhas e eventualmente no murchamento e morte das folhas interiores acima do solo. Quando se objetivando a mudas de milho no estágio de 8 até 10 folhas, as parvas se alimentam principalmente das 20 raízes, incluindo as raízes aéreas e da raízes principais, resultando na acomodação ou na morte das plantas. As plantas danificadas contam para de 1% até 5% em geral e alcançam até de 15 a 20% em áreas mais seriamente danificadas. As larvas da Agrotis ypsilon Rottemberg, em torno de instars de

1 - 2 podem de juntar nas folhas de topo da muda dia e noite e de alimen25 tam com as mesmas, porem irão se dispersar depois do instar 3. As larvas são rápidas e tem o habito de parecerem mortas. Elas são extremamente sensíveis à Iuz e irão se amontoar elas próprias quanto perturbadas. Durante o dia elas se escondem entre as camadas da superfície do solo úmidas e secas, enquanto que elas podem escavar o solo à noite para morder as mu30 das de plantas e arrastas as plantas danificadas para dentro de furos no subsolo, ou morder as sementes desenterradas. Na medida em que os caules das mudas se tornam mais rígidos, elas irão se alimentar nas folhas frescas e nas plantas em crescimento. No entanto, quando falta alimento ou a descoberta de locais próximos de hibernação, a migração ocorre para elas.

4. Características morfológicas diferentes:

(1) Morfologia diferente dos óvulos: Os óvulos da Athetis Iepigo5 ne têm o formato de pão de vapor com uma crista longitudinal. Os ovos postos de fresco são amarelo-esverdeados e se tornam de cor caqui nos últimos estágios. Os óvulos da Agrotis ypsilon Rottemberg, também têm o formato de pão de vapor, porém com carina em cruz. Os ovos postos de fresco são de cor branca cremosa e se tornam gradualmente amarelos e um ponto ne

gro poderá emergir em um topo dos ovos antes do nascimento.

(2) Morfologia diferente das larvas: As larvas adultas da Athetis lepigone são de cerca de 20 mm de comprimento com um corpo amareloclaro e cabeça marrom. As larvas recém-nascidas são de 14 a 18 mm de comprimento e de cor amarelo-acinzentada ou marrom-escuro. As caracte

rísticas salientes das mesmas são um formato de triângulo invertido salpicado marrom-escuro nos somitos individuais e duas linhas dorsais marrons a partir do abdome dorsal até o segmento torácico. Em contraste, as larvas da Agrotis ypsilon Rottemberg, têm o formato cilíndrico e as larvas adultas das mesmas são de 37 - 50 mm de comprimento e com a cabeça marrom com

tiras reticuladas marrom escuro irregulares. Elas têm um corpo cinza e fusco e uma superfície áspera pontilhada com partículas de tamanhos diferentes. A sua linha dorsal, linha subdorsal e linha espiracular são todas marromnegras, o protorax é fusco, o pigídio é fulvo com duas faixas verticais distintas marrom-escuras e a bacnopoda e propernas são fulvas.

(3) Morfologia diferente das pupas: As pupas da Athetis lepigone

são de 10 mm de comprimento, tendo um corpo fulvo e em u m primeiro estagio e em seguida gradualmente se tornando marrom, e as larvas adultas se tornam em pupas sem baixo do solo no casulo. Por contraste, as pupas da Agrotis ypsilon Rottemberg, são de 18 a 24 mm de comprimento e de cor

ruiva brilhante. A parte da boca é alinhada com o final dos gomos das asas, ambos alcançando o fim do quarto segmento abdominal. O centro da parte anterior dos segmentos abdominais de 4 a 7 são marrom escuro com pintas rugosas e tem pequenas pintas bilaterais prolongadas no espiráculo. A parte anterior dos segmentos abdominais de 5 a 7 também tem pequenas pintas. O final do abdome tem um par de espinas finais.

(4) Morfologia diferente do imago: A Athetis lepigone adulta tem de 10 a 12 mm de comprimento e 20 mm com a envergadura das asas. A fêmea é ligeiramente maior que o macho. Sua cabeça, tórax e abdome são cinzentas. As azas da frente também são cinzentas, porém com marcas mais escuras, interior fusco e a linha de borda externa, marcadores anulares de ponto negro e pequenos padrões reniformes. Pontos pretos estão presentes na borda com côncavo esterno com um ponto branco. A linha de borda externa é ondulada, a borda das asas tem um ponto preto. As suas asas traseiras são brancas e ligeiramente marrons, e gradualmente de tornam foscas na borda. O seu abdome é cinza. As vulvas da genitália masculina têm uma abertura meio aberta, a margem dorsal é côncava com um uncus saliente no meio, e o edeago tem agulhas espinhosas por dentro. Em contraste, a Agrotis ypsilon Rottemberg adulta tem de 17 a 23 mm de comprimento, 40 - 54 mm de envergadura das asas. Sua cabeça e a parte detrás do tórax são fuscos, e as patas são marrons. O tarso e a tíbia das patas da frente são cinzentos e o terminal de todos os segmentos das patas do meio e da meta-patas têm faixas anulares cinzentas. As asas da frente marrons têm áreas anteriores de preto amarronzado, bordas externas foscas, linhas de base marrom-claro e linhas tendo transversais onduladas pretas duplas. Existe um ponto redondo cinzento dentro das faixas anulares pretas. O formato anular reniforme é preto e tem bordas pretas. O meio da parte de fora do formato anular reniforme tem um formato anular preto com bordas em forma de cunha, que alcança as linhas transversais externas. A linha transversal do meio é de formato fosco ondulado. As linhas duplas onduladas transversais são marrons. A linha da borda subexterna é irregular com formato de serra e cinza, o meio da borda interna da qual tem três dentes pontudos. Existem pequenos pontos pretos em cada veio entre a linha de borda externa e a linha transversal externa. A linha da borda externa é preta. A cor entre a linha transversal externa e a linha de borda sub externa é marromclaro. A cor da linha de borda subexterna é preta amarronzada. As asas traseiras são encanecida. O veio longitudinal e a linha da borda são marrons. A parte detrás do abdome é cinza.

(5) Diferente hábito de crescimento e padrão de rompimento. As larvas da Athetis lepigone têm 6 instares que duram cerca de 18 dias e elas têm uma forte resistência ao estresse. O rompimento do adulto tem dois picos distintos. O primeiro ocorre antes do início de julho enquanto que o segundo é a partir do meio de julho até o meio de agosto. Os adultos têm uma forte capacidade de reprodução: cada fêmea tem uma produção de 300 a 500 óvulos em media e o período de postura dos óvulos dura de 3 a 7 dias, enquanto que a taxa de eclosão pode chegar a 100%. Elas ocasionam mais danos nos campos de milho de plantação rotativa depois do algodão do que na plantação continua coberta com a palha do trigo do que sem a palha do trigo, semeadura tardia do que semeadura imediata e tendo uma alta unidade do campo do que tendo baixa unidade do campo. A Athetis lepigone favorece ambientes escuros e úmidos e quase sempre se esconde sob a palha ou o solo ocasionando uma grande inconveniência com relação à pulverização do pesticida. Em contraste, a Agrotis ypsilon Rottemberg tem de 3 a 4 gerações em um ano. As larvas adultas ou as pupas hibernam no solo e os imagos começam a aparecer em março. Em geral dois picos mensais irão ocorrer, um no fim de março e o outro no meio de abril. As adultas ficam inativas durante o dia e se tornam ativos na tarde até a meia noite. Elas têm fototaxia e favorecem fermentações amargas, doces e avinhadas e diversos tipos de néctares. As larvas passam por seis instares, nos instares 1 e 2 as larvas se escondem dentro das ervas daninhas ou nas folhas interiores das plantas, se alimentando elas próprias dia e noite com pouco apetite, e por esse motivo causam poucos danos; depois do instar 3 elas de escondem por baixo do solo durante 0 dia e saem para se alimentarem de noite; nos instares 5 e 6, as larvas começam a ter um apetite significativamente mais aumentado e cada indivíduo pode quebras de 4 a 5 mudas em mediam até 10 em casos fortes e deste o instar 3 a resistência ao pesticida das mesmas aumenta de forma significativa. Os danos mais graves causados pela primeira geração de larvas ocorrem entre o final de março e o meio de abril. As gerações ocorrem a partir de outubro até abril do ano seguinte e fazem danos. O número de gerações em um ano varia de forma geográfica; 2 a 3 gerações no noroeste, 2 a 3 gerações no norte da Grande Muralha, 3 gerações 5 na área entre o sul da Grande Muralha e o norte do Rio Amarelo, 4 gerações na área entre o sul do Rio Amarelo e o Rio Yangtze; 4 a 5 gerações no sul do rio Yangtze e de 6 a 7 gerações na área tropical no sul da Ásia. No entanto, independentemente das diferenças no número de gerações em um ano os danos mais graves são sempre causados pelas larvas da primeira gera10 ção. Os imagos da geração de hibernação aparecem em fevereiro. No entanto, o pico da eclosão ocorre normalmente a partir do final de março até o meio de abril na maioria do pais exceto em Nlngxia e Mongólia interior na qual ela ocorre no final de abril. Os imagos da Agrotis ypsilon Rottemberg são mais prováveis de iniciar a eclosão a partir das 15:00 até as 22:00.Elas 15 se escondem sob os restos e fendas durante o dia e se tornam aditas depois do escurecer, voando e se alimentando. Depois de 3 a 4 dias elas iniciam o acasalamento e a postura de óvulos. Os óvulos são opostos principalmente nas ervas daninhas curtas de alta densidade e nas mudas e algumas vezes em folhas mortas e fendas. A maioria dos óvulos está próxima do solo. Cada 20 fêmea pode por de 800 a 1000 óvulos, ou mesmo até 2000 durante o seu período de oviposição de cerca de 5 dias. O estagio de larva consiste em 6 instares e em alguns indivíduos de 7 a 8 instares. O estágio de larvas varia em fases diferentes, porém normalmente dura de 30 a 40 dias com relação à primeira geração. Uma vez totalmente atingindo a maturidade elas se de25 senvolvem em pupas em uma câmara no solo em torno de 5 cm abaixo da superfície e o estágio de pupa é de 9 a 19 dias. A temperatura elevada é prejudicial ao desenvolvimento e a reprodução da Agrotis ypsilon Rottemberg, dessa forma menos das mesmas aparecem durante o verão. A temperatura ótima de sobrevivência é de 15°C a 25°C. A mortalidade das larvas da 30 Agrotis ypsilon Rottemberg aumenta quanto a temperatura e inverno fica muito baixa e diminui em locais nos quais o r-terreno é baixo, úmido e tem chuvas abundantes. Além disso, as condições que levam a oviposição e a alimentação das larvas tais como as chuvas abundantes de outono, elevada unidade do solo e o supercrescimento das ervas daninhas podem levar a uma quebra no ano seguinte. No entanto, a pluviosidade excessiva e muita unidade são prejudiciais para o desenvolvimento das larvas, à medida que 5 as larvas no primeiro instar podem se afogar com facilidade em tal ambiente. As regiões que têm de 15 a 20% de teor de unidade do solo durante o período de pico da oviposição poderão sofrer danos graves. O solo arenoso é mais adaptado do que o solo de argila e areia com relação à reprodução da Agrotis ypsilon Rottemberg, devido a melhor permeabilidade da água e a 10 drenagem rápida.

Coletivamente é evidente que a Athetis lepigone a Agrotis ypsilon Rottemberg, são duas espécies distintas de pragas e não podem se cruzar. Além do mais, foi registrado que o padrão pesticida do gene da Cry 1Ab não inclui a Agrotis ypsilon Rottemberg. Esta invenção tem em primeiro lugar reportado os efeitos venenosos da Cry 1 Ab sobre a Athetis lepigone.

Na presente invenção, o genoma das plantas, tecidos das plantas ou células das plantas se referem a qualquer material genético nas plantas, tecidos ou células, incluindo o núcleo, plastídio e o genoma mitocondrial.

Na presente invenção, os polinucleotídeos e/ou os nucleotídeos 20 constituem um gene completo, e codificam uma proteína ou polipeptídio em células hospedeiras desejadas. A pessoa versada na técnica poderá reconhecer com facilidade que os polinucleotídeos e/ou os nucleotídeos poderão ser colocados sob o controle de seqüências reguladoras de hospedeiros objetivados.

É bem conhecido da pessoa versada na técnica que o DNA exis

te normalmente em uma forma conhecida como estrutura de duplo filamento. Nessa disposição, um filamento é complementar como outro filamento e vice-versa. O DNA gera outros filamentos complementares durante a replicação em plantas e dessa forma a presente invenção inclui o uso do polinucle30 otideo exemplificado na relação de seqüências e os seus filamentos complementares. "Filamento de codificação" comumente usado na técnica se refere à ligação do filamento ao filamento antisenso. Com a finalidade de expressar proteínas in vivo um filamento de DNA é tipicamente transcrito em um filamento complementar como mRNA que e usado como um gabarito a ser traduzido em uma proteína. De fato, o mRNA é transcrito a partir do filamento anti senso do DNA. O filamento "senso" ou "codificante" tem uma se5 rie de códons (um códon contém três nucleotídeos que codifica um amino ácido especifico)e o filamento pode ser usado como uma janela de leitura aberta (ORF) e ser transcrito em uma proteína ou peptídeo. A presente invenção também engloba RNA e peptídeo de ácido nucléico (PNA) que tem funções consideráveis como o DNA exemplificado.

Na presente invenção, as moléculas ou os fragmentos de ácido

nucléico hibridizam o gene Cry 1Ab da presente invenção sob condições rigorosas. Qualquer método convencional de hibridização ou amplificação de ácido nucléico pode ser usado para identificar a presença do gene Cry 1Ab da presente invenção. As moléculas de ácido nucléico ou os fragmentos das 15 mesmas em determinados casos podem especificamente se hibridizar a outras moléculas de ácido nucléico. Na presente invenção, se duas moléculas de ácido nucléico podem formar uma estrutura de ácido nucléico de filamento duplo antiparalelas, pode-se dizer que aquelas duas moléculas de ácido nucléico podem especificamente se hibridizar uma com a outra. Se duas mo20 léculas de ácido nucléico exibirem complementaridade completas, uma molécula de ácido nucléico é denominada de "complemento" da outra molécula de ácido nucléico. Na presente invenção, quando cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nucléico é complementar ao nucleotídeo correspondente de outra molécula de ácido nucléico, as duas moléculas de ácido nucléico 25 são consideradas como exibindo "complementaridade completa". Se duas moléculas de ácido nucléico podem se hibridizar uma com a outra em um estado eficientemente estável, e se ligar uma à outra depois de hibridização sob pelo menos "baixa rigidez", essas duas moléculas de ácido nucléico são consideradas de "complementaridade mínima".

Da mesma forma, se duas moléculas de ácido nucléico podem

se hibridizar uma com a outra em um estado eficientemente estável, e se ligam uma com a outra depois da hibridização sob condições convencionais de "alta rigidez", essas duas moléculas de ácido nucléico são consideradas como tendo "complementaridade". O desvio a partir da complementaridade completa é aceitável contanto que esse desvio não impeça completamente as duas moléculas de formarem uma estrutura de filamento duplo. Com a 5 finalidade de assegurar que uma molécula de ácido nucléico possa ser usada como um iniciador ou sonda, a seqüência da mesma tem que ter complementaridade suficiente de modo que ela possa formar uma estrutura de filamento duplo estável em concentrações específicas de solventes e de sais.

Na presente invenção, uma seqüência substancialmente homó

loga é uma molécula de ácido nucléico, que, sob condições altamente rigorosas pode se hibridizar especificamente com o filamento complementar igual da outra molécula de ácido nucléico. As condições rigorosas adequadas à hibridização do DNA, como por exemplo, o processamento com 6,0 x clo15 reto de sódio/ citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, e em seguida lavando com 2,0 x SSC a 50°C poderá ser bem conhecida da pessoa versada na técnica. Por exemplo, durante a etapa de lavagem a concentração do sal pode ser selecionada a partir de uma condição rigorosa baixa de cerca de 2,0 x SSC até uma condição rigorosa alta de cerca de 2,0 x SSC a 50°C. 20 Além disso, a temperatura da etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de condições rigorosas baixas de temperatura ambiente de cerca de 22°C até condições rigorosas altas de cerca de 65°C. Ambas, a temperatura e a concentração de sal podem ser mudadas, ou uma pode permanecer intacta, enquanto a outra é mudada. De preferência, as condições rigorosas de a25 cordo com a invenção são especificas hibridização com a SEQ ID NO: 3 ou a SEQ ID NO: 4 em uma 6 x SSC, 0,5% solução de SDS a 65°C e em seguida a lavagem de membranas com 2 x SSC, 0,1% de solução de SDS e 1 x SSC, 0,1% SDS uma vez cada.

Por esse motivo, as seqüências que tenham uma atividade pósresistência e capazes de se hibridizar com a SEQ ID NO:3 e/ou a SEQ ID NO: 4 sob condições rigorosas estão englobadas na presente invenção. Essas seqüências são de pelo menos de cerca de 40% - 50% de homologia ás seqüências da presente invenção, cerca de 60%, 65% ou 70% de homologia ou mesmo de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior homologia com as seqüências da presente invenção.

Os genes e as proteínas descritas na presente invenção incluem

não somente as seqüências especificamente exemplificadas, porém também as partes e/ou fragmentos (incluindo aqueles que tenham cancelamentos internos e/ou terminais em comparação com as proteínas de comprimento total). Variantes, mutantes, substitutos (proteínas com aminoácidos substitu10 idos), proteínas quiméricas e de fusão das mesmas que tenham a atividade pesticida das proteínas exemplificadas. Os "mutantes" ou "variantes" se referem a seqüências de nucleotídeos que codifiquem a mesma proteína ou uma proteína equivalente com a atividade pesticida. A "proteína equivalente" se refere a uma proteína que apresente a mesma ou substancialmente a mes15 ma atividade biológica de resistência a Athetis lepigone como as proteínas reivindicadas.

O "fragmento" ou "truncamento" do DNA ou das seqüências de proteínas descritas na presente invenção se refere a uma parte ou uma forma artificialmente modificada (tal como seqüências adequadas para a ex20 pressão em plantas) do DNA original ou seqüências de proteínas (nucleotídeos ou aminoácidos). O comprimento das seqüências acima pode ser variável, porém ele deve ser suficiente para assegurar a proteína (codificada) como uma toxina para a praga.

Os genes podem ser modificados com facilidade como variantes 25 de gene através de técnicas-padrão. Por exemplo, a tecnologia de ponto de mutação é bastante conhecida na técnica. Outro exemplo com base na Patente U. S. Nq 5605793 descreve um método em que o DNA pode ser remontado para a geração de outra diversidade molecular depois de fratura aleatória. As endonucleases fabricadas comercialmente podem ser usadas 30 para a formação de fragmentos de genes de comprimento total, e as exonucleases podem ser usadas de acordo com procedimentos-padrão. Por exemplo, as enzimas como a Bal 31 ou metagênese direcionada ao sítio podem ser usadas para a remoção sistematicamente de nucleotídeos a partir do final de tais genes. Uma variedade de endonucleases de restrição também pode ser usada para serem obtidos genes que codifiquem fragmentos ativos. As proteases também podem ser usadas para serem obtidos fragmentos ativos dessas toxinas diretamente.

Na presente invenção, proteínas equivalentes e/ou genes que codifiquem essas proteínas equivalentes podem ser derivados a partir de isolados de B. t. ou de conjuntos de DNA. Existem várias maneiras de serem obtidas as proteínas pesticidas da presente invenção. Por exemplo, anticorpos de proteínas pesticidas descritas e obtidas através da presente invenção podem ser usados para a identificação e isolamento de outras proteínas a partir de uma mistura de proteínas. Especificamente, podem ser produzidos anticorpos através das partes mais constantes e mais diferentes de outras proteínas B.t. Através de imunoprecipitação, análise imunoabsorvente ligada à enzima (ELISA) ou western blot, esses anticorpos podem ser usados para identificar especificamente proteínas equivalentes com atividades características. Os procedimentos-padrão na técnica podem ser usados para a preparação de anticorpos das proteínas ou equivalentes ou fragmentos das mesmas descritas na presente invenção. Também, os genes que codificam essas proteínas podem ser obtidos a partir de microorganismos.

Devido à redundância dos códigos genéticos, uma variedade de seqüências de DNA diferentes pode codificar as mesmas seqüências de aminoácidos. A pessoa habilitada na técnica será capaz de gerar seqüências de DNA alternativas para codificar a mesma ou substancialmente a mesma 25 proteína. Essas seqüências de DNA diferentes estão incluídas dentro do âmbito da presente invenção. A "substancialmente as mesmas" seqüências incluindo fragmentos com a atividade pesticida, se referem a seqüências com substituição, cancelamento, adição ou inserção de aminoácidos, porém a atividade pesticida das mesmas não é essencialmente afetada.

Na presente invenção, as substituições, cancelamentos ou adi

ções nas seqüências de aminoácidos são técnicas convencionais na técnica. De preferência, a alteração de seqüências de aminoácidos são: uma ligeira mudança de características, isto é, substituições conservadoras de aminoácidos que não afetem de forma significativa a dobragem e/ou a atividade das proteínas; um cancelamento curto de 1 a 30 aminoácidos; uma pequena extensão de aminoácidos ou de terminal carboxila, tal como uma extensão do 5 terminal amino de um resíduo de metionina, uma ligeira ligação de peptídeo com um comprimento de cerca de 20 a 25 resíduos, por exemplo.

Os exemplos de substituições conservadoras são selecionados a partir dos grupos de aminoácidos que se seguem: aminoácidos básicos, tais como a arginina, Iisina e histidina; aminoácidos ácidos tais como o ácido glutâmico e o ácido aspártico; aminoácidos polares, tais como a glutamina, asparagina; aminoácidos hidrófobos, tais como a leucina, isoleucina e valina; aminoácidos aromáticos, tais como a fenilalanina, triptofano e tirosinel; e aminoácidos de molécula pequena, tais como a glicina, alanina, serina, treonina e a metionina. Tipicamente, as substituições de aminoácidos sem mudar especificamente as atividades são bem conhecidas na técnica, e elas têm sido descritas, por exemplo, em "Protein" por N. Neurath e R. L. Hill in 1979, publicado por Academic Press, New York. As substituições mais comuns são: AIa/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/P he, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, e as substituições opostas as mesmas.

Será obvio para a pessoa habilitada na técnica que essas substituições podem ocorrer fora das regiões que desempenham papéis importantes nas funções moleculares, porém ainda produzem um polipeptídio ativo. 25 Com relação aos polipeptídios de acorro com a presente invenção, os resíduos de aminoácidos que são necessários para a atividade dos mesmos e dessa forma são selecionados para não serem substituídos podem ser identificados através de métodos conhecidos na técnica, tais como a metagênese direcionada ao sítio, ou metagênese de varredura de alanina (com refe30 rencia a Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). A última técnica é a introdução de mutação (ões) a cada resíduo de carga positiva em uma molécula e detectando atividade pós-resistência nos mutantes resultantes, e em seguida determinando quais resíduos de aminoácido são importantes com relação à atividade da molécula. Os sítios de interação substratoenzima podem ser identificados através da análise das estruturas tridimensionais dos mesmos que podem ser determinadas através de análise 5 de ressonância magnética, cristalografia ou marcação por fotoafinidade, etc. (com referência a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

Na presente invenção, as proteínas Cry 1 A incluem, porém não estão limitadas às proteínas CryIAb, Cry1Ab.105 e CryIAc , fragmentos ou regiões funcionais pesticidas que sejam pelo menos 70% homologas as seqüências de aminoácidos das proteínas acima mencionadas e que tenham a atividade pesticida com relação a Athetis lepigone.

Por esse motivo, as seqüências de aminoácidos com determinada homologia à SEQ ID NO: 1 e/ou 2 também estão incluídas na presente invenção. Tipicamente, a homologia/ similaridade/ identidade dessas seqüências com relação às seqüências da presente invenção é maior do que 60%, de preferência maior do que 75%, de mais preferência, maior do que 80%, ainda de mais preferência maior do que 90% e podem ser maior do que 95%. Também os polinucleotídeos de preferência e proteínas da presente invenção podem ser definidos através de uma faixa mais especifica de identidade e/ou similaridade e/ou homologia, por exemplo, de 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade e/ou similaridade e/ou homologia com relação às seqüências exemplificadas da presente invenção.

As seqüências reguladoras descritas na presente invenção incluem, porém não estão limitadas a: promotoras, peptídios de transito, terminadoras, melhoradoras, sequências-líder, íntrons e outras seqüências reguladoras que podem estar ligadas de forma operativa à proteína Cry 1 A. As promotoras são aquelas que podem ser expressas em plantas: as "promotoras que podem ser expressas em plantas" se referem às promotoras que asseguram a expressão das seqüências codificadoras conectadas a elas em células de plantas. As promotoras que podem ser ex5 pressas em plantas podem ser promotoras constitutivas. Os exemplos de promotoras que direcionam a expressão constitutiva nas plantas incluem, porém não estão limitadas à promotora 35S do vírus de mosaico da couveflor, promotora Ubi, promotora do gene GOS2 do arroz, etc. Alternativamente, as promotoras que podem ser expressas em plantas podem ser específi10 cas para o tecido, isto é, a expressão de seqüências codificadoras direcionadas a essas promotoras em alguns tecidos de plantas, tais como os tecidos verdes, é mais alta do que em outros tecidos, como determinado através de testes de RNA de rotina, como por exemplo, a promotora da carboxilase PEP. Alternativamente, as promotoras que podem ser expressas em plantas 15 podem ser promotoras indutoras de ferimentos. As promotoras indutoras de ferimentos ou promotoras direcionadas a padrões de expressão de ferimentos induzidos se referem a que a expressão de seqüências codificadoras reguladas através de tais promotoras é significativamente mais alta nas plantas que sofrem a partir de ferimentos mecânicos ocasionados pela mastiga20 ção de pragas em plantas sob condições normais de crescimento. Os exemplos de promotores indutoras de ferimento incluem, porém não estão limitados a, promotoras de genes inibidores da protease da batata e do tomate (,pin I e pin II) e gene inibidor da protease do milho (MP1)

Os peptídeos de trânsito, também conhecidos como seqüências 25 secretoras de sinal ou sequências-guia, direcionam produtos transgênicos para organelas específicas de compartimentos celulares. Os peptídios de trânsito podem ser heterólogos com relação às proteínas-alvo. Por exemplo, as seqüências que codificam o peptídeo de trânsito cloroplasto ou as seqüências retentoras "KDEL" são usadas para objetivar retículos endoplásmi30 cos, ou CTPP do gene da Iecitina da cevada são usados para objetivar vacúolos.

As sequências-líder incluem, porém não estão limitadas a sequências-líder de vírus de RNA pequeno, tais como a sequência-líder EMCV(região não codificante do terminal) 5’ da EMCV (vírus da encefalomiocardite), sequência-líder do polivírus, tais como a sequência-líder de MDVM (vírus do mosaico do milho anão); proteína de ligação da imunoglobulina 5 humana de cadeia pesada (BIP) sequência-líder não traduzida do mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA4); e a sequência-líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV).

As potenciadoras incluem, porem não estão limitadas a potenciadora do vírus do mosaico da couve flor (CaMV), potenciadora do vírus do 10 mosaico da escrofulária (FMV), potenciadora do vírus do anel de eflorescência do cravo (CERV), potenciadora do mosaico da veia da mandioca (CaVMV), potenciadora do vírus do mosaico mirabilis (MMV), potenciadora do vírus enrolador de folha amarela (CmYLCV), potenciadora do enrolador de folha Multam do algodão (CLCuMV), potenciadora do commelina vírus 15 mosqueado amarelo (CoYMV) e potenciadora do streak vírus das folhas cloroticas do amendoim (PCLSV).

Para as aplicações em monocotiledôneas, os íntrons incluem, porém não estão limitados a íntron hsp70 do milho, íntron da ubiquitina do milho, intron 1 Adh, íntron da sintase da sacarose ou íntron Actl do arroz. 20 Para aplicação nas dicotiledôneas, os íntrons incluem, porém não estão limitados a íntron CAT-1, intron pKANNIBAL, íntron PIV2 e intron da "superubiquitina".

As terminadoras podem ser seqüências de sinais adequadas para a poliadenilação e funcionamento em plantas, incluem, porém não estão 25 limitadas a seqüências de sinal de poliadenilação derivadas a partir do gene da sintase nopalina (NOS) da Agrobacterium tumefaciens, a partir do gene do inibidor da protease Il (pin II), a partir do gene ssRUBISCO E9 da ervilha e a partir do gene da a-tubulina.

As "conexões efetivas" descritas na presente invenção significam as conexões das seqüências de ácidos nucléicos e as conexões permitem as seqüências de prover funções desejada com relação às seqüências conectadas. As "conexões efetivas" descritas na presente invenção podem ser a conexão entre as promotoras e as seqüências de interesse e, por meio do que a transcrição das seqüências de interesse é controlada e regulada pelas promotoras. Quando as seqüências de interesse codificam proteínas e a expressão das proteínas é desejada, a "conexão efetiva" significa que as 5 promotoras estão conectadas com as seqüências de uma tal forma que torna os transcritos resultantes traduzidos com uma alta eficiência. Se a conexão das promotoras e das seqüências codificando resulta em transcritos de fusão e a expressão das proteínas codificadas é desejada, essas conexões permitem que o códon de partida dos transcritos resultantes seja o códon de 10 inicio das seqüências codificadoras. Alternativamente, se as conexões de promotoras e seqüências codificadoras resultam em traduções de fusão e a expressão da proteína é desejada, essas conexões permitem que o primeiro códon de partida contido no 5’ das seqüências não traduzidas ser conectado com as promotoras e os produtos resultantes da tradução estarem em estru15 tura com relação às estruturas abertas de leitura das proteínas derivadas. As seqüências de ácidos nucleicos com relação as "conexões efetivas" incluem, porem não estão limitadas a seqüências provendo genes com função de expressão, isto é, elementos de expressão de gene, tais como as promotoras, região 5’ não traduzida, íntrons, regiões que codificam proteínas, regiões 3’ 20 não traduzidas, sítios de poliadenilação e/ou terminadoras de transcrição, seqüências provendo transferência e/ou interação de DNA, isto é, seqüências de fronteira de T-DNA, sítios de reconhecimento de recombinase específica para sítio; seqüências provendo seleção, isto é, marcadores de resistência a antibióticos, genes biossintéticos; seqüências provendo marcadores 25 de classificação e operações de assistência in vitro ou in vivo, isto é, seqüências de multiligações específicas para o sítio de seqüências de recombinação; e seqüências provendo a aplicação de replicações, isto é, origem bacteriana de replicações, replicando as seqüências de forma autônoma e seqüências "centomere".

O "pesticida" descrito na presente invenção significa que ele é

tóxico para pragas de lavouras e de forma mais especifica para a Athetis lepigone. Na presente invenção a proteína Cry 1A exibe cititoxicidade com relação ao Athetis lepigone. As plantas transgênicas, especialmente o milho, nas quais o seu genoma contém DNA exógeno compreendendo seqüências de nucleotídeos codificando a proteína Cry 1Am pode levar a supressão do 5 crescimento e a eventual morte da Athetis lepigone através do contato da mesma com a proteína depois da ingestão de tecidos da planta. A supressão se refere a letal ou subletal. Enquanto isso, as plantas devem ser morfologicamente normais e podem ser cultivadas através de métodos convencionais para o consumo e/ou a geração de produtos. Alem disso, as plantas trans10 gênicas podem basicamente terminar o uso de pesticidas químicos e biológicos que são objetivados pela Cry 1A para a Athetis lepigone.

O nível de expressão de proteínas cristalinas pesticidas (ICP) em tecidos de plantas pode ser determinada por uma variedade de métodos na técnica, como por exemplo, quantificação de mRNA que codifica a proteína pesticida através de iniciadores específicos ou quantificação direta de proteínas pesticidas.

Vários testes podem ser aplicados para determinar os efeitos de pesticidas em plantas ICP. O principal alvo da presente invenção é Athetis lepigone.

Na presente invenção a proteína Cry 1A pode ter as seqüências

de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NO: 1 e/ou na SEQ ID NO: 2 da lista de seqüências. Alem da região da codificação da proteína Cry 1A, outros componentes, tais como as regiões que codificam uma segunda proteína pesticida, uma seleção de proteínas marcadoras ou uma proteína de resistência a herbicidas podem estar contidas.

Na presente invenção, proteína CryIA pode ser expressa simultaneamente com um ou mais proteínas pesticidas Vip-e / ou do tipo da Cry em uma planta transgênica. Essa expressão simultânea de mais do que uma proteína pesticida em uma planta transgênica pode ser conseguida através 30 de permitir que a planta contenha os genes desejados com a utilização da engenharia genética. Além do mais, uma planta que expressa a proteína Cry 1A (a primeira origem P1) e outra planta que expressa proteínas pesticidas Vip ou do tipo da Gry (a segunda origem P2) podem ser obtidas através de engenharia genética e em seguida a cruza entre P1 e P2 pode gerar crias com todos os genes introduzidos em P1 e P2.

Além disso, a cassete de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína CrylA, pode expressar adicionalmente pelo menos um ou mais genes que codificam proteínas de resistência a herbicidas. Os genes de resistência a herbicidas incluem, porem não estão limitados a genes de resistência ao glufosinato, tais como o gene bare gene pat; genes de resistência a fenemedifame, tais como o gene pmph; genes de resistência ao glifosato tais como o gene EPSPS; genes de resistência ao bromoxinil; genes de resistência ao sulfonilureia; genes de resistência ao herbicida dalapon; genes de resistência à cianamida ou genes de resistência à glutamina sintase tais como o PPT; obtendo por meio disso plantas transgênicas que tenham ambas alta atividade pesticida e resistência a herbicida.

Na presente invenção, o DNA estranho é introduzido em plantas, por exemplo, genes ou cassetes de expressão e vetores recombinantes que codificam a proteína CryIA são introduzidos em células de planta. Os métodos convencionais de transformação incluem, porem não estão limitados a, 20 transformação mediada através da Agrobacterium, bombardeamento de micro emissão, captação de DNA direta de protoplastos, eletroporação, ou introdução de DNA mediada por "wisker" de sílica.

A presente invenção proporciona um método para o controle de pragas com as seguintes vantagens:

(1) Controle interno. As tecnologias existentes são principalmen

te através de ação externa, isto é, fatores externos para o controle da infestação da Athetis lepigone, como controle agrícola e controle químico. Enquanto a presente invenção é através CryIA produzido em plantas para matar a Athetis lepigone e subsequentemente controlar a Athetis lepigone, isto é, através de fatores internos de controle.

(2) Nenhuma poluição e nenhum resíduo. O controle químico na técnica desempenha um certo papel no controle da Athetis lepigone, porem ele trás poluição, destruição e resíduos para as pessoas, gado e sistemas de terás de plantio. O método para o controle da Athetis lepigone da presente invenção pode eliminar as conseqüências adversas acima descritas.

(3) Controle através do período de crescimento. Os métodos pa5 ra o controle da Athetis lepigone na técnica são em etapas, enquanto que a presente invenção proporciona plantas com a produção através de todo o período de crescimento das mesmas. Isto é, as plantas transgênicas (com a Cry 1A) a partir da germinação, crescimento até a formação de flores, frutos podem evitar os danos a partir da Athetis lepigone.

(4) Controle de plantas individuais inteiras. Os métodos para o

controle da Athetis lepigone na técnica, por exemplo, a pulverização foliar, são na maior parte localizados. Embora a presente invenção proporcione uma proteção para as plantas individuais inteiras, por exemplo, as raízes, folhas, caules, pendões, espigas, anteras, filamentos etc., das plantas trans

gênicas individuais (com a Cry 1 A) são resistentes a Athetis lepigone.

(5) efeitos estáveis. O método corrente de pulverização de pesticida requer a pulverização direta para a superfície das lavouras o que é provável de ocasionar uma pulverização heterogênea ou nenhuma pulverização. A presente invenção gera plantas que expressam a proteína Cry 1A

com um nível constante in vivo. Também, as plantas transgênicas (com a proteína Cry 1A) tem um efeito consistentemente estável de controle em localizações diferentes e em tempos diferentes e em diferentes origens genéticas.

(6) Simples, conveniente e econômico. Devido à ocorrência de

cautela especial e danos da Athetis lepigone, o acompanhamento e a prevenção da mesma é difícil, ocasionando um aumento substancial de custos de plantio. Em contraste, a presente invenção necessita somente de plantas transgênicas que expressem a proteína Cry 1A, dessa forma ela economiza uma grande quantidade de mão de obra e de recursos financeiros.

(7) Efeito completo. Os métodos para o controle da Athetis lepi

gone na técnica não são completamente eficientes e reduzem ligeiramente somente os danos. Em contraste, as plantas transgênicas (com a Cry 1A) na presente invenção podem levar a 100% de morte das larvas recémeclodidas da Athetis lepigone. Raras larvas podem sobreviver, porém elas serão muito pequenas devido a subdesenvolvimento óbvio ou mesmo parando o desenvolvimento e dificilmente causando quaisquer danos às plantas de milho.

A presente invenção será descrita em detalhe através dos desenhos e exemplos que se seguem.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 é um diagrama de fluxo para a construção do vetor de clonagem recombinante DBN01-T que compreende a seqüência de nucleotídeos da Cry 1Ab-01 no método de controle de pragas da presente invenção.

A Fig. 2 é um diagrama de fluxo para a construção do vetor de clonagem recombinante DBN100124 que compreende a seqüência de nucleotídeos da Cry 1Ab-01 no método de controle de pragas da presente invenção.

A Fig. 3 mostra os danos às folhas das plantas de milho transgênico com a inoculação da Athetis lepigone mo método de controle de pragas da presente invenção.

A Fig. 4 mostra o desenvolvimento das larvas da Athetis lepigo

ne que são inoculadas as plantas de milho transgênico no método de controle de pragas da presente invenção.

Exemplos

Exemplos que ilustram o método para o controle de pragas da presente invenção estão descritos como se segue.

Exemplo 1. Aquisição e síntese do gene Cry 1 Ab.

I. Aquisição da seqüência de nucleotídeos do Cry 1 Ab.

A seqüência de aminoácidos (818 aminoácidos) da proteína pesticida Cry 1Ab-01 é mostrada como a SEQ ID NO: 1 na relação de sequências; a seqüência de nucleotídeos (2457 nucleotídeos) do Cry 1Ab-01 que codifica a referida seqüência de aminoácidos (818 aminoácidos) da proteína pesticida Cry 1Ab-01 está mostrada na SEQ ID NO: 3 na relação das sequências.

A seqüência de aminoácidos (615 aminoácidos) da proteína pesticida Cry 1Ab-02 é mostrada como a SEQ ID NO: 2 na relação de seqüências; a seqüência de nucleotídeos (1848 nucleotídeos) do Cry 1Ab-02 que 5 codifica a referida seqüência de aminoácidos (615 aminoácidos) da proteína pesticida Cry 1Ab-01 está mostrada na SEQ ID NO: 4 na relação das seqüências.

II. Síntese das seqüências de nucleotídeos de Cry 1Ab.

As seqüências de nucleotídeos de Cry 1 Ab-01 (mostrada como a 10 SEQ ID NO: 3 na relação de seqüências) e de Cry 1Ab-02 (mostrada como a SEQ ID NO: 4 na relação de seqüências) foram sintetizadas por Nanjing GenScript Ltd. A seqüência de nucleotídeos sintetizada de Cry 1 Ab-01 (SEQ ID NO: 3) está ainda conectada com um sitio de restrição de Ncol no seu final 5’ e a um sitio de restrição de Spel no seu final 3’. Também, a sequên15 cia de nucleotídeos de Cry 1Ab-02 (SEQ ID NO: 4) está também conectada com um sitio de restrição de Ncol no final 5’ e a um sitio de restrição de BamHI no final 3.

Exemplo 2 : Construção de vetores de expressão recombinante e transformação dos mesmo em Agrobacterium.

I. Construção de vetores recombinantes de clonagem que com

preendem o gene Cry 1Ab.

Como mostrado na Fig. 1, a seqüência de nucleotídeos sintetizada de Cry 1 Ab-01 estava ligada com o vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, USA, CAT: A3600) de acordo com o protocolo do fabricante 25 para a geração do vetor de clonagem recombinante DBN01-T.(Nota: Amp representa gene de resistência a Ampicilina, f1 ori representa a origem da replicação do fago fl; LacZ é no códon de partida de LacZ; SP6 é a promotora de polimerase SP6 RNA; T7 é a promotora de polimerase T7 RNA; Cry

1 Ab-01 é a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 3) e MCS é um sítio de multiclonagem)

A segunda etapa foi a de transformar o vetor de clonagem recombinante DBN01-T em células competentes de Tl do E. coli (Transgen, Beijing, China, CAT: CD501) através de um método de choque de calor. Especificamente 50 ul das células competentes Ti do E. coli foram misturados com 10 ul do DNA do plasmidio (o vetor de clonagem recombinante DBN01- T) incubadas em um banho de água a 42°C durante 30 segundos e em se5 guida em um banho de água a 37°C durante 1 hora (em um agitador a 100 rpm). A mistura foi em seguida deixada crescer de um dia para o outro em um prato LB (triptona 10g/I, extrato de levedura 5 g/l, NaCI 10 g/L, ágar 15 g/L, o valor do pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) com Ampicilina (100 mg/l) da qual a superfície foi revestida com IPTG (isopropil-tio-p-D10 galactosídio) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosídio). As colônias brancas foram colhidas e cultivadas ainda mais a 37°C de um dia para

o outro em meio LB (triptona 10g/I, extrato de levedura 5 g/l, NaCI 10 g/L, Ampicilina 100 g/L, o valor do pH foi ajustado para 7,5 co NaOH).

Os plasmídios foram extraídos através de um método alcalino. Especificamente, as bactérias cultivadas no meio foram centrifugadas a 12000 rpm durante 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e as células precipitadas foram de novo suspensas em 100 μΙ de solução I gelada ((25 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA (ácido etilenodiamina tetra-acético), 50 mM glicose, pH 8,0)). Em seguida, a adição de 150 μΙ de solução Il preparada de fresco (0,2M NaOH, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio)), o tubo foi invertido quatro vezes e colocado em gelo durante de 3 a 5 minutos. 150 μΙ de solução Ill gelada (4 M acetato de potássio, 2 M ácido acético) foram adicionados à mistura e misturados imediatamente e completamente e em seguida colocado em gelo durante de 5 a 10 minutos, seguidos por centrifugação a 12000 rpm durante 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi adicionado em 2 volumes de etanol anidro, misturado completamente e em seguida incubado durante 5 minutos em temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada a 12000 rpm durante 5 minutos a 4°C e o sobrenadante foi descartado. A pélete foi lavada com etanol a 70% (v/v) e em seguida secada no ar seguida pela adição de 30 ul de TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, PH 8,0) contendo RNase (20 pg/ml) para dissolver o pélete e digerir o RNA em um banho de água a 37°C durante 30 minutos. Os plasmídios obtidos foram armazenados a -20 °C antes de serem usados.

Os Kpnl e Bglll foram usados para identificar os plasmídios extraídos e os clones positivos foram ainda verificados por sequenciação. Os resultados mostram que a seqüência de nucleotídeos inserida dentro do ve5 tor de clonagem recombinante DBN01-T foi CrylAb-01 mostrado como a SEQ ID NO: 3 na relação de seqüências, indicando a inserção apropriada da seqüência de nucleotídeos do Cryl Ab-01.

Como o método acima para a construção do vetor de clonagem recombinante DBN01-T, a seqüência de nucleotídeos sintetizada do Cry 1A10 02 (mostrada como s SEQ ID NO: 4) foi ligada com o vetor de clonagem pGEM-T para a geração do vetor de clonagem recombinante DBN02-T. A digestão enzimática e sequenciação foram utilizados para verificar a inserção correta da seqüência de nucleotídeos de Cry1Ab-02 no vetor de clonagem recombinante DBN02-T.

II. A construção de vetores de expressão recombinantes com

preendendo genes CryIAb.

Os métodos para a construção de vetores através da digestão enzimática convencional são bem conhecidos na técnica. Como mostrado na Figura 2 o vetor recombinante de clonagem DBN01-T e o vetor de ex20 pressão DBNBC-01 (esqueleto do vetor: pCAMBIA2301 (disponível da instituição CAMBIA)) foram digeridos respectivamente pelas enzimas de restrição Ncol e Spel e o fragmento resultante da seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-01 foi em seguida inserido no vetor de expressão digerido DBNBC

01 entre os sítios Ncol e Spel para a geração do vetor de expressão recom25 binante DBN100124. (Nota: Kan representa gene da canamicina; RB representa margem direita; Ubi representa o promotor do gene da ubiquitina de milho (SEQ ID NO: 5); Cryl Ab-01 representa a seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-01 (SEQ ID NO: 3); n representa o terminador do gene da nopalina sintase (SEQ ID NO: 6); PMI representa gene de isomerase fosfomanose 30 (SEQ ID NO: 7), e LB representa margem esquerda).

O vetor de expressão recombinante DBN100124 foi transformado em células competentes T1 de E. coli através de um método de choque de calor. Especificamente, 50 ul de células competentes de E. coli T1 foram misturados com 10 ul de ADN de plasmídio (o vetor de expressão recombinante DBN100124), incubada num banho de água a 42°C durante 30 segundos e, em seguida, num banho de água a 37°C durante 1 hora (em um 5 agitador a 100 rpm). A mistura foi, em seguida cultivada em 37°C durante 12 horas em uma placa de LB (triptona 10 g / L, extrato de levedura 5 g / L, NaCl a 10 g / L, agar 15 g / L, o valor de pH foi ajustado para 7,5 com NaOH ) com 50 mg /1 de canamicina. As colônias brancas foram recolhidas e cultivadas ainda mais a 37°C de um dia para o outro em meio LB (triptona a 10 g 10 / L, extrato de levedura 5 g / L, NaCI a 10 g / L, canamicina 50 mg / L, o valor de pH foi ajustado para 7,5 com NaOH).

Os plasmídios foram extraídos por um método alcalino. A digestão enzimática com Ncol e Spel foi usada para identificar os plasmídios extraídos, e os clones positivos foram ainda verificados por sequenciação. Os 15 resultados mostraram que, a seqüência de nucleotídeos inserida no vetor de expressão recombinante DBN100124 entre Ncol e sítios Spel foi Cryl Ab-01 apresentada como SEQ ID NO: 3 na relação de seqüências.

Como o método anterior para a construção do vetor de expressão recombinante DBN100124, o vetor de clonagem recombinante DBN02-T 20 foi enzimaticamente digerido por Ncol e BamHI, para gerar a seqüência de nucleotídeos de Cry1Ab-02, o qual foi inserido no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100106. Tal como verificado através de digestão enzimática e sequenciação, a seqüência de nucleotídeos inserida no vetor de expressão recombinante 25 DBN100106 entre os sítios Ncol e BamHI foi a seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-02.

IN. Os vetores de expressão recombinante foram transformados em Agrobacterium.

Os vetores de expressão recombinante construídos de forma correta, DBN100124 ou DBN100106, foram transformados em Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Chicago, EUA; Cat No: 18313-015), através de um método de nitrogênio líquido. Especificamente, 100 uL de Agrobacterium LBA4404 e 3 ul de plasmidio de ADN (um vetor de expressão recombinante DBN100124 ou DBN100106) foram colocadas em nitrogênio líquido durante 10 minutos, seguido por incubação em um banho de água a 37°C durante 10 minutos. As Agrobacterium LBA4404 transformadas foram inoculadas em 5 um tubo de LB e em seguida foram cultivados a 28°C , 200 rpm durante 2 horas. Em seguida, a cultura foi aplicada para uma placa de LB contendo 50 mg / L de Rifampicina e 100 mg /1 de canamicina até o crescimento dos clones individuais positivos. Os clones individuais foram escolhidos para posterior cultura para a extração plasmídios. Os vetores de expressão recombi10 nantes foram identificados por digestão enzimática, isto é, o vetor de expressão recombinante DBN100124 foi digerido com as enzimas de restrição Aatll e ahdi, e o vetor de expressão recombinante DBN100106 foi digerido com as enzimas de restrição Bgll e EcoRV, indicando a construção correta dos vetores de expressão recombinantes, DBN100124 e DBN100106.

Exemplo 3. Aquisição e verificação de plantas de milho trans

formadas com os genes Cry 1Ab.

1. Geração e identificação de plantas de milho transformadas com os genes Cry 1Ab.

De acordo como método convencional de infecção com a Agro20 bacterium, os embriões estéreis imaturos de Maize Z31 foram cultivados com cepas de Agrobacterium obtidas em III, no Exemplo 2, e modo a transformar o T-DNA nos vetores de expressão recombinante DBN100124 e DBN100106 (que compreendem a seqüência da promotora do gene da ubiquitina de milho, a seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-01 ou Cry1Ab-02, 25 o gene de PMI e a seqüência do terminador Nos, respectivamente) para o genoma do milho, gerando as plantas de milho transformadas com a seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-01 e as plantas de milho transformadas com Cry1Ab-02. As plantas de milho do tipo natural foram usadas como o controle.

O processo da transformação do milho mediado pela Agrobaete

rium foi descrito de forma resumida como se segue. Os embriões imaturos, isolado a partir do milho, foram postos em contacto com a suspensão de Agrobacterium, por meio do que as seqüências de nucleotídeos de Cryl Ab-01 e / ou Cry1Ab-02 foram entregue em pelo menos uma célula de cada embrião imaturo através da Agrobacterium (etapa 1: Infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos foram de preferência imersos em uma suspensão Agro5 bacterium (D0660 = 0,4 - 0,6, meio de infecção (sal de MS 4,3 g / L, vitaminas de MS, caseína 300 mg / L, sacarose 68,5 g / L, glicose 36 g / L , acetossiringona (AS) 40 mg /1, ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4-D) a 1 mg / L, pH 5,3)) para dar inicio a inoculação. Os embriões imaturos foram cultivados com Agrobacterium durante um período de tempo (3 dias) (etapa 2: Co10 cultura). De preferência, após a etapa de infecção, os embriões imaturos foram cultivados num meio sólido (sal de MS 4,3 g / L, vitaminas de MS, caseína de 300 mg / L, sacarose 20 g / L, glicose a 10 g / L, acetossiringona (AS) 100 mg /1, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 1 mg / L, agar de 8 g / L, pH 5,8). Depois da etapa de co-cultura, uma etapa de "recuperação" é 15 facultativa, em que existe pelo menos um antibiótico conhecido como inibidor do crescimento da Agrobacterium (cefalosporinas) e nenhum agente de seleção para os transformantes de plantas no meio de regeneração (sal de MS 4,3 g / L, vitaminas de MS, caseína de 300 mg / L, sacarose 30 g /1, ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4-D) 1 mg / L, agar 8 g / L, pH 5,8) (etapa 3: Re20 cuperação). De preferência os embriões imaturos foram cultivados no meio sólido com um antibiótico, porem sem agentes de seleção para a eliminação da Agrobaeterium e proporcionar um período de recuperação de células transformadas. Em seguida, os embriões imaturos inoculados foram cultivados no meio com um agente de seleção (manose) e os "callus" em cresci25 mento transformados foram selecionados (etapa 4: Seleção). De preferência, os embriões imaturos foram cultivados em um meio de seleção sólido com um agente de seleção (sal de MS 4,3 g /1, vitaminas de MS, caseína de 300 mg / I, sacarose 5 g / I, manose 12. 5g / I, ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4-D) 1 mg / L, agar 8 g / L, pH 5,8), o que resultou num crescimento sele30 tivo de células transformadas. Além disso, os "callus" foram regenerados em plantas (etapa 5: Regeneração). De preferência, os calos cultivados no meio com o agente de seleção foram cultivados em um meio sólido (meio MS de diferenciação e meio MS de enraizamento) para a regeneração das plantas.

O callus resistentes selecionados foram transferidos para dentro de um meio de diferenciação MS (sal de MS 4,3 g/l, vitaminas MS, caseína 300 mg/l, sacarose 30 g/l, 6-benzlladenilil 2 mg/l, manose 5 g/l, agar 8 g/l, pH 5 518), e cultivados sob 25°C para diferenciação. As mudas diferenciadas foram transferidas para o maio de formação de raízes (sal MS 2,15 g/l, vitaminas MS, caseína 300 mg /1, sacarose 30 g /1, ácido indol-3-acetico1 mg /I, agar, 8 g /1, pH 5,8), e cultivadas em 25 C até a altura de cerca de 10 cm. As plantas foram em seguida transferidas para uma estufa e cresceram até fruti10 ficar. Durante o cultivo em estufa, as plantas foram incubadas a 28°C durante 16 horas e, em seguida, incubadas a 20°C durante 8 horas cada dia.

II. Verificação das plantas de milho transformadas com os genes Cry 1Ab através do método TaqMan.

Com a utilização de cerca de 100 mg de folhas de plantas de mi15 Iho transformadas com a seqüência de nucleotídeos do Cryl Ab-01 ou 02- CryIAb como amostras, o DNA genômico foi extraído com DNeasy Plant Maxi Kit da Qiagen, e os números de cópias de genes de CryIAb foram determinados através de uma analise de PCR quantitativo de fluorescência com a sonda Taqman. As plantas de milho do tipo natural foram analisadas 20 como o controle de acordo com o método acima mencionado. Os experimentos foram repetidos por 3 vezes e os resultados foram tomados como a média.

O protocolo detalhado para a determinação do número de cópias do gene de CryIAb foi como se segue:

Etapa 11: 100mg das folhas das plantas de milho transformadas

com a seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-01 ou Cry1Ab-02 ou aquelas em que as plantas de milho do tipo natural foram amostradas, e homogeneizadas em um almofariz com nitrogênio líquido. Cada uma das amostras foi em triplicata.

Etapa 12: O DNA genômico das amostras acima mencionadas

foi extraído com o DNeasy Plant Maxi Kit da Qiagen, e o método detalhado se refere ao protocolo do fabricante. Etapa 13: O Nano Drop 2000 (Thermo Scientific) foi utilizado para medir as concentrações de ADN genômico das amostras acima mencionadas.

Etapa 14: As concentrações de DNA genômico das amostras acima mencionadas foram ajustadas com relação às mesmas concentrações em uma faixa de 80 -100 ng / ml.

Etapa 15: Os números de cópia das amostras foram determinados por um método quantitativo de PCR por fluorescência com a sonda Taqman. Uma amostra que tinha um número de cópias conhecido foi utiliza10 da como padrão, e uma amostra a partir de plantas de milho do tipo natural, foi utilizada como controle. Cada amostra foi em triplicata e os resultados foram transformados em médias. Os iniciadores e as sondas utilizadas no método de PCR quantitativo por fluorescência são as que se seguem.

Os iniciadores e as sondas que se seguem foram usados para a detecção da seqüência de nucleotídeo do Cry 1 Ab-01:

Iniciador 1 (CF1): CGAACTACGACTCCCGCAC, mostrado como a SEQ ID NO: 8 na relação de seqüências.

Iniciador 2 (CR1): GTAGATTTCGCGGGTCAGTTG, mostrado como SEQ ID NO: 9 na relação de seqüências.

Sonda 1 (CP1): CTACCCGATCCGCACCGTGTCC, mostrado

como SEQ ID NO: 10 na relação de seqüências.

Os iniciadores e as sondas que se seguem foram usados para a detecção da seqüência de nucleotídeo do Cry 1 Ab-02:

Iniciador 3 (CF2): TGCGTATTCAATTCAACGACATG, mostrado como a SEQ ID NO: 11 na relação de seqüências;

Iniciador 4 (CR2): CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC, mostrado como a SEQ ID NO: 12 na relação de seqüências;

Sonda 2 (CP2): CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC, mostrado como a SEQ ID NO: 13 na relação de seqüências.

Sistema de reação PCR:

JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma) 10 μΙ 50 x misturas de iniciadores e de sondas 1 μΙ DNA genômico 3 μΙ

Água (dd H2O) 6 μΙ

A mistura de 50X de iniciadores e de sondas contendo 45 μΙ de 1mM de cada iniciador, 50 μΙ de 100 mM de sonda e 860 μΙ de 1 x tampão de TE em um tubo âmbar a 4°C.

As condições do PCR foram como se seguem:

Etapa Temperatura Tempo

21 95° 5 min

22 95° 30 seg 23 60° 1 min

24 voltando a etapa 22, repetindo 40 vezes

Os dados foram analisados através do software SDS2.3 (Applied Biosystems).

Como mostrado através dos resultados, a seqüência de nucleo15 tídeos do Cry 1Ab-01 e do Cry 1 Ab-02 foram ambas impregnadas dentro do genoma das plantas de milho detectadas; e as plantas de milho transformadas com a seqüência de nucleotídeos de Cry1Ab-01, bem como as plantas de milho transformadas com a seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-02 tinham obtido uma única cópia do gene de CryIAb nas respectivas plantas de 20 milho transgênicas.

Exemplo 4: Detecção das proteínas pesticidas nas plantas de milho transgênicas.

1. Detecção dos teores de proteína pesticida nas plantas de milho transgênicas.

As soluções evolvidas no experimento são como se seguem:

Tampão de extração: 8 g/l NaCI, 0,2 g/l KH2PO4, 2,9 g/l Na2HPO4eI 2H20, 0,2 g/l KCI, 5,5 ml/L Tween-20, pH 7,4;

Tampão de lavagem PBST: 8 g/l NaCI, 0,2 g/l KH2PO4, 2,9 g/l Na2HPO4eI 2H20, 0,2 g/l KCI, 0,5 ml/L Tween-20, pH 7,4;

Solução de finalização: 1M HCI.

3 mg de folhas frescas de plantas de milho transformadas com a seqüência de nucleotídeos de Cry1Ab-01 ou Cryl Ab-02 foram amostrados e homogeneizados com nitrogênio líquido, seguida da adição de 800 ul de tampão de extração. A mistura foi centrifugada a 4000 rpm durante 10 min, em seguida, o sobrenadante foi diluído 40 vezes com o tampão de extração e 80 ul do sobrenadante diluído foram utilizados para o teste de ELISA. O kit 5 de ELISA (análise de imunoabsorção ligada à enzima) (empresa ENVIRLOGIX, kit Cry1Ab/Cry1Ac) foi empregado para a determinação da relação entre o teor de proteína pesticida (proteína CryIAb) dividido pelo peso das folhas frescas. O método detalhado se refere ao protocolo do fabricante.

Enquanto isso, as plantas de milho do tipo natural e as plantas 10 de milho não transgênicas identificadas através de Taqman foram utilizadas como controles, e a determinação seguiram os métodos como descritos acima. Com relação as três linhas transformadas com Cry1Ab-01 (S1, S2 e S3), três linhas transformadas com Cryl Ab-02 (S4, S5 e S6), uma linha identificada como planta não transgênica (NGM) pelo Taqman e uma linha de 15 tipo natural (CK), foram utilizadas três plantas de cada linha e cada planta foi repetido seis vezes.

Os resultados experimentais dos conteúdos da proteína pesticida (Cry 1 Ab) nas plantas transgênicas foram mostrados na Tabela 1. As proporções das expressões tomadas em média da proteína pesticida (Cry 1 20 Ab) divididas pelo peso das folhas frescas nas plantas de milho transformada com as seqüências dos nucleotídeos de Cry1Ab-01 e Cryl Ab-02 foram determinados como 8536,2 e 8234,7, respectivamente, o que indica uma maior expressão e estabilidade para ambas as proteínas CryIAb no milho.

Tabela 1 A quantidade media da proteína CryIAb expressa nas plantas de milho transgênicas._

Quantidade da proteína CryIAb ex¬ Quantidade da proteína pressa em cada planta (ng/g) (repetido CryIAb expressa em cada ti¬ seis vezes por planta) po de linhas (ng/g) Linha 1 2 3 Quantidade média (ng/g) S1 7160,2 10444,4 9080,8 S2 8534,4 8581,2 7330,2 8536,2 S3 8817,4 9185,7 7691,2 S4 7088,4 9837,5 10626,4 S5 9866,7 6863,3 4222,4 8234,7 S6 9912,1 7724,1 7970,9 NGM -1,7 0 -1,0 0 CK 0 -4,2 2,3 0 II. Detecção da resistência a pragas das plantas de milho trans

gênicas.

As plantas de milho transformadas com a seqüência de nucleotídeos de CrylAb-01 ou Cryl Ab-02, as plantas de milho do tipo selvagem e as plantas de milho não transgênicas identificados através de Taqman, foram detectadas com relação à resistência das mesmas à Athetis lepigone.

As folhas frescas de plantas de milho transformadas com a seqüência de nucleotídeos de CrylAb-01 ou CrylAb-02, de plantas de milho do tipo natural e de plantas de milho identificadas como plantas não trans10 gênicas (etapa V3-V4) através de Taqman foram amostradas, respectivamente. As folhas foram enxaguadas com água estéril e a água nas folhas foi secada com gaze. As veias das folhas foram removidas e as folhas foram cortadas em tiras de aproximadamente 1 cm x 4 cm. Duas tiras das folhas foram colocadas no filtro de papel umedecido com água no fundo de pratos 15 Petri redondos. 10 cabeças de Athetis lepigone (larvas recém eclodidas) foram colocadas em cada prato, e os pratos com as pragas foram cobertos com tampas e colocados em de 25 - 280C , umidade relativa de 70% - 80% e foto período (claro / escuro) 16:08 durante 3 dias. De acordo com três indicadores, o progresso do desenvolvimento, mortalidade e taxa de dano nas 20 folhas das larvas da Athetis lepigone, foi considerada uma pontuação de resistência: Pontuação = 100 x mortalidade + [100 x mortalidade + 90 x (o número de pragas recém-nascidas / o número total de pragas inoculadas) + 60 x (o número de recém-nascidas, o número de pragas de controle negativo / o número total de parasitos inoculados) + 10 x (o número de pragas de contro25 Ie negativo / o número total de parasitos inoculados)] + 100 x (proporção de danos de 1 folha). Com relação as três linhas transformadas com a seqüência de nucleotídeos de Cry1Ab-01 (S1, S2 e S3), três linhas transformadas com a seqüência de nucleotídeos de Cryl Ab-02 (S4, S5 e S6), uma linha identificada como plantas não transgênicas (NGM) através de Taqman, e uma linha como do tipo natural (CK), três plantas para cada linha foram usadas e cada planta foi repetida seis vezes. Os resultados foram mostrados na Tabela 2, bem como nas Figuras 3 e 4.

Tabela 2. A resistência a pragas das plantas de milho transgêni

cas inoculadas com a Athetis lepigone

Taxa Progresso do desenvolvi¬ Mortalidade da de fo¬ mento da Athetis lepigone Athetis lepigone (cada linha) (cada linha) Li¬ lhas Re- Recen > contro¬ Número Morta¬ Class. Mé¬ nha danifi¬ cem nascidos le nega¬ total de lidade (cada dia cadas nas¬ controle tivo pragas (%) linha) (%) cidos negativo inocula¬ das S1 0 0 0 0 10 100 300 S2 0 0 0 0 10 100 300 300 S3 0 0 0 0 10 100 300 S4 0 0 0 0 10 100 300 S5 1 0,3 0 0 10 97 296 297 S6 1 0,5 0 0 10 95 294 NG 63 0,7 0 9,3 10 0 53 53 M CK 50 2,3 0 7,4 10 3 84 84 Como mostrado na Tabela 2, os resultados das plantas de milho transformadas com as seqüências de nucleotídeos de CrylAb-01 e CryIAb02 ficaram ambos em torno da marca cheia - 300, enquanto que a pontuação das plantas de milho do tipo natural foi em geral de cerca de 80 ou menos.

Como mostrado nas Figuras 3 e 4, em comparação com as plantas de milho do tipo natural, as plantas de milho transformadas com a sequência de nucleotídeos de Cry1Ab-01 ou 02-Cry1Ab mataram quase 100% das larvas da Athetis lepigone recém-eclodidas, e suprimindo grandemente o desenvolvimento das larvas que sobreviveram raramente, de tal modo que as larvas ainda permaneciam no estado de chocadas recentemente depois de 3 dias. Além disso, as plantas de milho transformadas com a seqüência 5 de nucleotídeos do CrylAb-01 ou CrylAb-02 só tinha um dano menor, apresentando uma quantidade muito pequena de danos de furos de alfinete semelhantes em algumas folhas, que só puderam ser observados com uma lupa.

Desse modo, fica provado que as plantas de milho transformadas com a seqüência de nucleotídeos de Cry1Ab-01 ou Cryl Ab-02 todas mostraram uma elevada resistência a Athetis lepigone, o que é suficiente para ocasionar efeitos adversos o crescimento da Athetis lepigone de tal forma que o crescimento da mesma pode ser controlado.

Os resultados acima também mostraram que o controle efetivo 15 da Athetis lepigone resultou a partir da proteína CryIA produzida pelas plantas de milho. Ficou bem conhecido que poderiam ser produzidas plantas transgênicas semelhantes, capazes de expressar CryIA para o controle da Athetis lepigone, com base no mesmo efeito tóxico da proteína CryIA na Athetis lepigone. As proteínas CryIAb descritas na presente invenção inclu20 em, mas não estão limitadas as proteínas crylA mostradas nas modalidades especificas através das seqüências específicas. As plantas transgênicas também podem gerar pelo menos um tipo de proteína pesticida adicional que seja diferente da CryIAb, como por exemplo, as proteínas do tipo Vip e do tipo Cry.

Em conclusão, a presente invenção pode controlar a Athetis le

pigone permitindo as plantas produzir a proteína CryIA in vivo, que é tóxica para Athetis lepigone. Em comparação com os métodos de controle agrícola e química atuais, o método descrito pela presente invenção pode controlar a Athetis lepigone durante todo o período de crescimento das plantas e pro30 porcionar uma proteção total para as plantas. Além disso, o método é estável, completo, simples, prático, econômico, livre de resíduos e livre de poluição. Finalmente, deve ser observado que as modalidades acima são meramente ilustrativas das soluções técnicas da presente invenção e que não estão limitadas às mesmas, embora as modalidades de preferência com relação a presente invenção tenham sido descritas em detalhe a pessoa 5 versada na técnica poderá apreciar que as soluções técnicas da presente invenção podem ser modificadas ou substituídas de modo equivalente sem que se afastem do espírito da invenção e do âmbito da presente invenção.

Claims (13)

1. Método para o controle da Athetis lepigone, em que o método compreende o contacto da Athetis lepigone com a proteína Cryl A.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteína Cry 1A é a proteína Cry 1 Ab.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual a proteína Cry 1Ab está presente em uma célula de uma planta que expressa a proteína Cry 1Ab, e a Athetis lepigone entra em contato com a proteína Cry 1Ab através de ingestão da célula.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual a proteína Cry 1Ab está presente em uma planta transgênica que expressa a proteína Cry 1Ab e a Athetis lepigone entra em contato com a proteína Cry 1Ab através de ingestão de um tecido da planta transgênica, em seguida o crescimento da Athetis lepigone é suprimido e que eventualmente leva a morte da Athetis lepigone e consegue controlar os danos da Athetis lepigone para a planta.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual a planta transgênica está em qualquer um dos períodos de crescimento.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, o tecido da planta transgênica são raízes, folhas, caules, borlas, sabugos, anteras ou filamentos.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual o controle dos danos da Athetis lepigone para a planta não depende da localização do plantio.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual o controle dos danos da Athetis lepigone para a planta não depende do tempo do plantio.

9. Método de qualquer uma das reivindicações de 3 a 8, no qual a planta é o milho.

10. Método de qualquer uma das reivindicações de 2 a 9, no qual antes da etapa de contato, o método compreende uma etapa de plantar uma muda de uma planta transgênica que contenha um polinucleotideo que codifique a proteína Cry 1Ab.

11. Método de qualquer uma das reivindicações de 2 a 10, no qual a seqüência de aminoácidos da proteína CryIAb compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, no qual a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína Cry 1Ab compreende uma seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2.

13. Uso da proteína Cry 1A no controle da Athetis lepigone.