BR112021009540B1 - Método para combate da praga helicoverpa gelotopoeon por meio do contato da dita praga com a proteína vip3aa e uso da dita proteína vip3aa no combate à praga helicoverpa gelotopoeon - Google Patents

Método para combate da praga helicoverpa gelotopoeon por meio do contato da dita praga com a proteína vip3aa e uso da dita proteína vip3aa no combate à praga helicoverpa gelotopoeon Download PDF

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Abstract

USO DE PROTEÍNA INSETICIDA. Um uso de uma proteína inseticida, compreendendo: colocação da praga Helicoverpa gelotopoeon em contato com pelo menos uma proteína Vip3Aa e controle da praga Helicoverpa gelotopoeon por meio da produção em uma planta de uma proteína Vip3Aa capaz de matar o Helicoverpa gelotopoeon.

Description

[0001] Campo da Invenção
[0002] A presente invenção refere-se ao uso de proteína inseticida e, em particular, refere-se ao uso de uma proteína Vip3Aa na proteção de plantas contra os danos de Helicoverpa gelotopoeon pela expressão da proteína Vip3Aa nas plantas.
[0003] Antecedentes da Invenção
[0004] Helicoverpa gelotopoeon pertence a Lepidoptera, Ncctuidae, Helicoverpa e é principalmente distribuído em países e regiões da América do Sul, tais como, Brasil, Argentina, Bolívia, Paraguai e Uruguai. Helicoverpa gelotopoeon é uma praga polífaga e ataca principalmente culturas econômicas, como soja, algodão, alfafa, girassol, grão de bico e milho, e seus danos são caracterizados pelo fato de que Helicoverpa gelotopoeon em estágio de larva pode atacar a maioria dos tecidos vegetais como o caule, folha, inflorescência e fruta e semelhantes. Helicoverpa gelotopoeon prefere comer soja. Em particular, as larvas de Helicoverpa gelotopoeon podem comer 81,8% do tecido de soja acima do solo, e uma larva pode consumir 340 cm2 de folhas de soja e 15 sementes de soja, o que afetará seriamente o rendimento.
[0005] Glycine max (L.) Merri, uma importante safra econômica cultivada globalmente como as principais fontes de óleo vegetal e proteína, é uma importante safra de alimentos e rações na China. A soja é uma das plantas favoritas do Helicoverpa gelotopoeon. Na Argentina, o rendimento da soja sofre de 5% a 30% de redução a cada ano devido aos danos do Helicoverpa gelotopoeon, que causa sérias perdas econômicas. Para controlar Helicoverpa gelotopoeon, os principais métodos comumente usados são o controle agrícola, o controle químico, o controle físico e o controle biológico.
[0006] O controle agrícola é um método para gerenciar de forma abrangente vários fatores de todo o sistema ecológico de terras agrícolas; por meio da regulação de culturas, pragas e fatores ambientais, é criado um ambiente ecológico de terras agrícolas, que é propício ao crescimento da cultura e não vantajoso para o surgimento de Helicoverpa gelotopoeon. No entanto, na América do Sul, a maioria das terras agrícolas está na forma de "plantio direto", ou seja, substancialmente sem quaisquer medidas de controle agrícola. Portanto, é muito provável que o aumento da população de invernada no ano anterior cause um surto no ano seguinte, causando prejuízo econômico para a soja e outras culturas.
[0007] O controle químico, ou seja, o controle de pesticidas, usa pesticidas químicos para matar pragas e é uma parte importante do tratamento abrangente de Helicoverpa gelotopoeon. O controle químico é rápido, conveniente, simples e altamente econômico, e é uma medida indispensável para emergências quando o Helicoverpa gelotopoeon surge. Os métodos de controle químico atuais envolvem principalmente pulverização de líquido químico e pulverização de pó, e têm bom efeito de controle antes do terceiro instar larval de Helicoverpa gelotopoeon, uma vez que nesta fase, as larvas precisam de baixa ingestão de alimentos e tem fraca resistência aos medicamentos. O estágio de larvas de 1o- 2o instar pode ser determinado de acordo com o pico de atração pela lâmpada, ou o tempo de controle pode ser determinado de acordo com a posição de dano das larvas incipientes. Normalmente, suspensão de clorantraniliprol a 20%, suspensão de flubendiamida a 48%, suspensão de microcápsula de betacflutrina a 25% ou clorpirifos a 48% é selecionada e usada para pulverização de líquido. Mas o controle químico também tem suas limitações. Por exemplo, a aplicação inadequada de pesticidas químicos pode geralmente causar fitotoxicidade das culturas e resistência a pragas a pesticidas, matar os inimigos naturais das pragas, poluir o meio ambiente e destruir o ecossistema da terra. Enquanto isso, resíduos de pesticidas podem representar uma ameaça à segurança de pessoas e animais e levar a outros resultados adversos.
[0008] O controle físico é controlar as pragas usando vários fatores físicos (como luz, eletricidade, cor, umidade e temperatura) e dispositivos mecânicos para capturar e matar as pragas e esterilizar as pragas por irradiação com base na resposta de pragas a vários fatores físicos nas condições ambientais. Os adultos são mortos com redes ou luzes quando estão no período de pico de crescimento. Utilizando o forte fototropismo de Helicoverpa gelotopoeon adulto, uma lâmpada de luz negra foi instalada para capturar e matar os adultos em seu estágio de emergência, de modo a reduzir o número de ovos e a densidade de larvas no campo. No entanto, a sujeira no filtro da lâmpada de luz negra precisa ser limpa todos os dias; caso contrário, a emissão de luz negra é afetada e, consequentemente, o efeito inseticida. Além disso, a lâmpada de luz negra tem requisitos relativamente altos para a estabilidade da tensão da fonte de alimentação e o risco de prejudicar os olhos humanos em operação. Além disso, o custo único de instalação da lâmpada é alto.
[0009] O controle biológico consiste em reduzir ou eliminar as pragas usando alguns organismos benéficos ou metabólitos biológicos para controlar a população de pragas, por exemplo, selecionando pesticidas com baixa toxicidade aos inimigos naturais das pragas e regulando o tempo de aplicação de acordo com as diferenças entre os períodos de ocorrência no campo de pragas e seus inimigos naturais, de modo a proteger os inimigos naturais evitando a pulverização quando ocorrem em grande número. Em segundo lugar, Helicoverpa gelotopoeon é controlado pela liberação de Trichogrammatidae ou pulverização de preparação de vírus nucleopoliedrose de Bacillus thuringiensis SD-5 ou Helicoverpa gelotopoeon. O controle biológico tem as seguintes propriedades: ser seguro para humanos e animais, menos poluição ambiental e controle de longo prazo de algumas pragas. No entanto, o efeito do controle biológico geralmente é instável e o custo não pode ser ajustado de acordo com a extensão das ocorrências de Helicoverpa gelotopoeon.
[00010] A fim de superar as limitações no controle agrícola, controle químico, controle físico e controle biológico na aplicação prática, os cientistas descobriram que, por meio da transfecção dos genes resistentes a insetos que codificam a proteína inseticida do Bacillus thuringiensis para as plantas, alguns plantas transgênicas resistentes a insetos foram obtidas para controlar pragas de plantas.
[00011] A proteína inseticida Vip3Aa, uma das numerosas proteínas inseticidas, é uma proteína específica produzida por Bacillus thuringiensis. A proteína Vip3Aa mostra seu efeito tóxico em insetos sensíveis ao desencadear a morte celular programada do tipo apoptose. A proteína Vip3Aa é hidrolisada em quatro produtos proteicos principais nos intestinos dos insetos, em que apenas um produto (66 kD) é a estrutura central tóxica da proteína Vip3Aa. A proteína Vip3Aa inicia a morte celular programada ao se ligar às células epiteliais do intestino médio de insetos sensíveis. Então, as células epiteliais do intestino médio são dissolvidas, resultando na morte dos insetos. Vip3Aa não resultaria em quaisquer distúrbios em insetos insensíveis, nem em apoptose e dissolução das células epiteliais do intestino médio.
[00012] Foi provado que as plantas transfectadas com o gene Vip3Aa podem resistir ao ataque de pragas de Lepidoptera, tais como Agrotisypsilon Rottemberg, Helicoverpa armigera e Spodoptera frugiperda. No entanto, até o momento não há relatos sobre o controle dos danos do Helicoverpa gelotopoeon pela produção de plantas transgênicas que expressam a proteína Vip3Aa.
[00013] Sumário da Invenção
[00014] A presente invenção tem como objetivo fornecer o uso de uma proteína inseticida e, pela primeira vez, fornece um método para controlar os danos de Helicoverpa gelotopoeon às plantas pela produção de plantas transgênicas que expressam a proteína Vip3Aa, que efetivamente supera os defeitos técnicos no estado da técnica, como controle agrícola, controle químico, controle físico e controle biológicolo.
[00015] A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção fornece um método para controlar a praga Helicoverpa gelotopoeon, compreendendo o contato de Helicoverpa gelotopoeon com pelo menos a proteína Vip3Aa.
[00016] Além disso, a proteína Vip3Aa existe nas células hospedeiras, pelo menos produzindo a proteína Vip3Aa, e os contatos da praga gelotopoeon Helicoverpa com pelo menos a proteína Vip3Aa por ingestão das células hospedeiras.
[00017] Além disso, a proteína Vip3Aa existe nas bactérias ou plantas transgênicas, pelo menos produzindo a proteína Vip3Aa, e a praga Helicoverpa gelotopoeon contata com pelo menos a proteína Vip3Aa por ingestão da bactéria ou de um tecido das plantas transgênicas; após o contato, o crescimento de Helicoverpa gelotopoeon é inibido e / ou Helicoverpa gelotopoeon morre de modo a obter o controle dos danos do Helicoverpa gelotopoeon às plantas.
[00018] Os tecidos da planta transgênica são raízes, folhas, caules, frutos, borlas, espigas, anteras ou filamentos.
[00019] A planta é soja, feijão mungo, feijão-nhemba, colza, repolho, couve- flor, couve chinesa ou rabanete.
[00020] A planta transgênica pode estar em qualquer período de crescimento.
[00021] O controle dos danos do Helicoverpa gelotopoeon à planta não muda conforme o local de plantio e / ou a hora de plantio mudam.
[00022] Antes da etapa de contato é uma etapa de plantio de uma planta contendo o polinucleotídeo que codifica a proteína Vip3Aa.
[00023] Preferivelmente, a proteína Vip3Aa compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Vip3Aa compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8.
[00024] Nas soluções técnicas acima, a planta também contém pelo menos uma segunda sequência de nucleotídeos diferente da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Vip3Aa.
[00025] Além disso, a segunda sequência de nucleotídeos codifica uma proteína inseticida do tipo Cry, uma proteína inseticida do tipo Vip, um inibidor de protease, uma lectina, α-amilase ou uma peroxidase.
[00026] Na presente invenção, a expressão da proteína Vip3Aa em uma planta transgênica pode ser acompanhada pelas expressões de uma ou mais proteínas inseticidas do tipo Cry e / ou proteínas inseticidas do tipo Vip. Esta co- expressão de mais de uma toxina inseticida em uma única planta transgênica pode ser realizada usando engenharia genética para fazer com que a planta contenha e expresse os genes de interesse. Além disso, a proteína Vip3Aa pode ser expressa em uma primeira planta (Progenitor 1) por meio de manipulação de engenharia genética, e as proteínas inseticidas do tipo Cry e / ou proteínas inseticidas do tipo Vip podem ser expressas em uma segunda planta (Pai 2) por meio de manipulação de engenharia genética. Ao cruzar o Pai 1 e o Pai 2, a progênie vegetal resultante expressa todos os genes introduzidos no parental 1 e no parental 2.
[00027] Preferivelmente, a segunda sequência de nucleotídeos codifica a proteína Cry1Ab ou Cry2Ab.
[00028] Além disso, a proteína Cry1Ab compreende a sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 9. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Cry1Ab compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 10. A proteína Cry2Ab compreende a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 11. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Cry2Ab compreende a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 12.
[00029] Opcionalmente, a segunda sequência de nucleotídeos é um dsRNA que inibe o (s) gene (s) importante (is) na praga de inseto alvo.
[00030] A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece o uso da proteína Vip3Aa para controlar Helicoverpa gelotopoeon.
[00031] A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para a produção de uma planta que controla Helicoverpa gelotopoeon, compreendendo a introdução de uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína Vip3Aa no genoma da planta.
[00032] A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para a produção de um propágulo de planta que controla Helicoverpa gelotopoeon, compreendendo o cruzamento de uma primeira planta e uma segunda planta produzida pelo método acima, e / ou remoção e cultivo do tecido com capacidade reprodutiva da planta produzida pelo método acima, produzindo assim um propágulo da planta contendo a sequência polinucleotídica que codifica a proteína Vip3Aa.
[00033] A fim de atingir o objetivo acima, a presente invenção também fornece um método para o cultivo de uma planta que controla Helicoverpa gelotopoeon, compreendendo:
[00034] - plantio de pelo menos um propágulo vegetal cujo genoma contém a sequência polinucleotídica que codifica a proteína Vip3Aa;
[00035] - crescimento do propágulo da planta em uma planta;
[00036] - cultivo da planta sob a condição de inoculação artificial e / ou ocorrência natural de Helicoverpa gelotopoeon, e
[00037] - colheita da planta com danos à planta reduzidos e / ou maior rendimento da planta em comparação com outras plantas sem a sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína Vip3Aa.
[00038] O termo "propágulo vegetal" na presente invenção inclui, mas não se limita a, propágulo sexual vegetal e propágulo vegetal de planta. O propágulo sexual da planta inclui, mas não está limitado a, sementes da planta; o propágulo assexuado da planta se refere aos órgãos vegetativos da planta ou a um tecido vegetal especial que pode produzir novas plantas in vitro; os órgãos vegetativos ou tecidos especiais incluem, mas não estão limitados a, raízes, caules e folhas; por exemplo, as plantas com raiz como propágulo vegetativo incluem morango e batata doce, etc .; as plantas com caule como propágulo vegetativo incluem cana-de-açúcar e batata (tubérculo), etc .; e as plantas com folhas como propágulo vegetativo incluem babosa e begônia, etc.
[00039] O termo "contato" na presente invenção compreende toque, permanência e / ou ingestão, particularmente insetos e / ou pragas tocam, permanecem e / ou ingerem plantas, órgãos vegetais, tecidos vegetais ou células vegetais. As plantas, órgãos de plantas, tecidos de plantas ou células de plantas podem expressar proteínas inseticidas in vivo, ou ter proteínas inseticidas e / ou microrganismos produtores de proteínas inseticidas em sua superfície.
[00040] Os termos "controlar" e / ou "prevenir" na presente invenção se referem a que a praga Helicoverpa gelotopoeon entra em contato com pelo menos a proteína Vip3Aa e, após o contato, o crescimento de Helicoverpa gelotopoeon é inibido e / ou Helicoverpa gelotopoeon morre. Além disso, a praga Helicoverpa gelotopoeon entra em contato com pelo menos a proteína Vip3Aa através da ingestão de tecidos vegetais; após o contato, o crescimento de todas ou algumas das pragas Helicoverpa gelotopoeon é inibido e / ou todas ou algumas delas morrem. A inibição se refere a subletal, ou seja, não causa a morte, mas causa certos efeitos em alguns aspectos, como crescimento e desenvolvimento, comportamento, fisiologia, bioquímica e tecidos, por exemplo, crescimento e desenvolvimento lento e / ou interrompido. Entretanto, a planta deve ter morfologia normal e pode ser cultivada por métodos convencionais de consumo e / ou produção de produtos. Além disso, em comparação com plantas não transgênicas de tipo selvagem, as plantas e / ou sementes de plantas contendo a sequência polinucleotídica que codifica a proteína Vip3Aa para controlar a praga Helicoverpa gelotopoeon, reduziram os danos às plantas sob as condições de inoculação artificial e / ou ocorrência natural da praga Helicoverpa gelotopoeon. Os desempenhos específicos incluem, mas não estão limitados a, resistência da folha melhorada, peso de grão aumentado e / ou rendimento aumentado. O efeito de “controle” e / ou “prevenção” da proteína Vip3Aa na praga Helicoverpa gelotopoeon pode existir independentemente; especificamente, se quaisquer tecidos da planta transgênica (contendo a sequência polinucleotídica que codifica a proteína Vip3Aa) simultaneamente e / ou assincronamente contiverem e / ou gerarem a proteína Vip3Aa e / ou outra substância que possa controlar a praga Helicoverpa, gelotopoeon então a existência de outra substância não irá fazer com que o efeito de “controle” e / ou “prevenção” seja total e / ou parcialmente realizado pela referida outra substância, embora seja irrelevante com a proteína Vip3Aa. Normalmente, no campo, o processo de ingestão de tecidos vegetais pela praga Helicoverpa gelotopoeon é curto e dificilmente pode ser observado visualmente; portanto, sob as condições de inoculação artificial e / ou ocorrência natural da praga Helicoverpa gelotopoeon, se qualquer tecido da planta transgênica (contendo a sequência polinucleotídica que codifica a proteína Vip3Aa) contiver a praga Helicoverpa gelotopoeon morta e / ou tem a praga Helicoverpa gelotopoeon cujo o crescimento é inibido e / ou reduziu os danos à planta em comparação com a planta não transgênica de tipo selvagem, então o método e / ou uso da presente invenção serão realizados, isto é, o método e / ou uso para controlar a praga Helicoverpa gelotopoeon é realizado pelo contato da praga Helicoverpa gelotopoeon com pelo menos a proteína Vip3Aa.
[00041] Na presente invenção, a expressão da proteína Vip3Aa em uma planta transgênica pode ser acompanhada pelas expressões de uma ou mais proteínas inseticidas do tipo Cry e / ou proteínas inseticidas do tipo Vip. Esta co- expressão de mais de uma toxina inseticida em uma única planta transgênica pode ser alcançada usando a engenharia genética para fazer a planta conter e expressar os genes de interesse. Além disso, a proteína Vip3Aa pode ser expressa em uma primeira planta (parental 1) por meio de manipulação de engenharia genética, e a (s) proteína (s) inseticida (s) do tipo Cry e / ou a (s) proteína (s) inseticida (s) do tipo Vip podem ser expressas (s) na segunda planta (parental 2) por meio da manipulação de engenharia genética. Ao cruzar o parental 1 e o parental 2, a progênie vegetal resultante expressa todos os genes introduzidos no parental 1 e no parental 2.
[00042] Interferência de RNA (RNAi) se refere a uma degradação efetiva e específica de mRNA homólogo que é altamente conservado durante a evolução e induzida por RNA de fita dupla (dsRNA). Portanto, a tecnologia de RNAi pode ser usada para nocautear ou desligar especificamente a expressão de um gene específico da praga de inseto alvo na presente invenção, especialmente os genes relacionados ao crescimento e desenvolvimento de insetos e pragas alvo.
[00043] O adulto de Helicoverpa gelotopoeon tem uma extensão de asa de 30 a 40 mm com antenas filamentosas delgadas. O primeiro par de asas tem uma cor que muda gradualmente de castanho claro para castanho escuro, com manchas evidentes em formato de rim próximas ao centro. A faixa da borda das asas é marrom claro, enquanto a segunda faixa da borda é mais larga e mais escura do que o restante das asas. O segundo par de asas é marrom claro, com uma tendência clara para o escurecimento na borda externa. O ovo é hemisférico e branco perolado, com listras no ápice. As larvas maduras têm cerca de 35 mm de comprimento e várias cores no corpo, que podem ser verdes, rosa, amarelas, marrons ou mesmo pretas, e têm uma faixa branca em zigue-zague em cada lado do corpo com protuberâncias de cerdas pretas brilhantes.
[00044] Helicoverpa gelotopoeon é amplamente distribuído em países e regiões da América do Sul, tais como, Brasil, Argentina, Bolívia, Paraguai e Uruguai. Helicoverpa gelotopoeon ocorre de 3 a 5 gerações a cada ano na Argentina, de novembro a abril do próximo ano, e cada geração dura cerca de 30 a 40 dias. A praga hiberna como pupa, a praga adulta após a emergência põe ovos nos botões e folhas, e a produção de uma única fêmea chega a 300-1000 ovos. Leva de 5 a 10 dias para os ovos se transformarem em larvas. Após a eclosão, as larvas começam a comer mesofilo, deixando a epiderme. O consumo de alimentos de larvas de 3° a 5° instar aumenta muito, resultando em muitos cortes e buracos nas folhas. O estágio de larva dura 12-20 dias. Larvas maduras perfuram e penetram no subsolo para fazer casulos e pupas. Os danos causados pela Helicoverpa gelotopoeon são afetados principalmente pela base, temperatura e umidade da fonte do inseto. A alta umidade e baixa temperatura no verão são propícias à ocorrência de Helicoverpa gelotopoeon, mas as chuvas fortes na fase de ovo e na fase de larvas jovens não são propícias à ocorrência.
[00045] No sistema de classificação, geralmente, Lepidoptera é dividida em subordem, superfamília, família, etc. de acordo com as características morfológicas, tais como, a venação da asa, modo de acoplamento da asa e tipo de antena da praga adulta. Ncctuidae é uma família de lepidópteros com as espécies mais abundantes, e mais de 20.000 espécies foram encontradas em todo o mundo, milhares de espécies apenas na China. A maioria dos insetos de Ncctuidae são pragas agrícolas que comem folhas e criam cápsulas e semelhantes, como Helicoverpa armigera e Spodoptera litura. Embora Helicoverpa armigera, Spodoptera litura e Helicoverpa gelotopoeon pertençam a Ncctuidae de Lepidoptera, exceto pela semelhança nos critérios de classificação, elas têm diferenças significativas em outras estruturas morfológicas; é semelhante a morangos e maçãs em plantas (ambos pertencentes a Rosales de Rosaceae), que têm características como flores bissexuais, simetria de radiação e 5 pétalas, mas são muito diferentes em frutos e morfologia das plantas. No entanto, como as pessoas têm menos contato com insetos, especialmente pragas agrícolas, e prestam menos atenção às diferenças de morfologia dos insetos, elas pensariam que os morfos dos insetos são semelhantes. Na verdade, Helicoverpa gelotopoeon tem suas características únicas em morfos larvais e adultos. Por exemplo, as larvas de Helicoverpa armigera e Helicoverpa gelotopoeon têm um grande espinígero apical e 1-3 espinígeros mais finos e decrescentes no lado medial da pata anterior e 2-4 espinígeros reduzidos e robustos no lado lateral. As pragas adultas femininas de Helicoverpa armigera e Helicoverpa gelotopoeon têm asas dianteiras amarelo-oliva, enquanto as pragas adultas masculinas têm asas anteriores amarelo-ferrugem. As larvas de Helicoverpa gelotopoeon, também pertencentes a Ncctuidae, têm 3-6 espinígeros finos na face medial da pata anterior e 1 espinígero apical fino na face lateral, enquanto as pragas adultas têm asas anteriores marrons.
[00046] Os insetos de Ncctuidae não eram apenas muito diferentes nas características morfológicas e no hábito alimentar. Por exemplo, Helicoverpa armigera ataca cápsulas de algodão ou borlas de milho perfurando-as, enquanto Helicoverpa gelotopoeon prefere soja. Diferentes hábitos alimentares também sugerem que a enzima e a proteína receptora produzida pelo sistema digestivo in vivo são diferentes. A enzima produzida no trato digestivo é o fator crucial para a função do gene Bt, pois somente quando um inseto pode produzir a enzima ou proteína receptora que pode se ligar a um determinado gene Bt, o gene Bt pode resistir efetivamente ao inseto. Cada vez mais relatos mostram que insetos em diferentes famílias da mesma ordem, e mesmo em diferentes espécies da mesma família, podem ter diferentes sensibilidades em relação ao mesmo gene Bt. Por exemplo, a proteína Vip3Aa mostra atividade resistente a insetos contra Chilo suppressalis e Ostrinia furnacalis de Pyralidae, mas nenhuma atividade resistente a insetos contra Plodia interpunctella e Ostrinia nubilalis, que também pertencem a Pyralidae. Todas as pragas acima pertencem a Lepidoptera de Pyralidae, mas a mesma proteína Bt apresenta resistências diferentes contra essas pragas de Pyralidae. Em particular, Ostrinia nubilalis e Ostrinia furnacalis pertencem ao gênero Ostrinia de Pyralidae (o mesmo gênero da mesma família da mesma ordem), mas têm respostas diferentes à mesma proteína Bt, que demonstram que as interações entre a proteína Bt e as enzimas e receptores em insetos são complexos e imprevisíveis.
[00047] O genoma das plantas, tecidos vegetais ou células vegetais na presente invenção, se refere a qualquer material genético nas plantas, tecidos vegetais ou células vegetais, incluindo os genomas do núcleo celular, plastídio e mitocôndria.
[00048] Os polinucleotídeos e / ou nucleotídeos da presente invenção formam um "gene" completo, codificando proteínas ou polipeptídeos nas células hospedeiras de interesse. Os versados na técnica podem facilmente perceber que os polinucleotídeos e / ou nucleotídeos na presente invenção podem ser introduzidos sob o controle das sequências regulatórias do hospedeiro alvo.
[00049] Como bem conhecido por aqueles versados na técnica, o DNA é tipicamente de fita dupla. Nesse arranjo, uma fita é complementar à outra, vice- versa. Uma vez que a replicação de DNA em plantas produziria cadeias complementares, a presente invenção compreende o uso dos polinucleotídeos exemplificados na listagem de sequências e suas cadeias complementares. A "fita de codificação" geralmente usada no estado da técnica se refere à ligação da fita à fita anti-sentido. Para a expressão da proteína in vivo, uma fita de DNA é tipicamente transcrita em uma fita de mRNA complementar que serve como molde da expressão da proteína. Na verdade, o mRNA é transcrito da fita de DNA “anti-sentido”. Uma "fita anti-sentido" ou "fita de codificação" contém uma série de códons (um códon é um tripleto de nucleotídeos que codifica para um aminoácido específico), que pode ser lido como uma estrutura de leitura aberta (ORF) para expressar a proteína alvo ou peptídeo. A presente invenção também contempla o RNA que é funcionalmente equivalente ao DNA exemplificado.
[00050] As moléculas de ácido nucleico ou seus fragmentos da presente invenção podem ser hibridizados com o gene Vip3Aa sob condição estringente. Quaisquer métodos convencionais de hibridização ou amplificação de ácido nucleico podem ser usados para identificar a presença do gene Vip3Aa na presente invenção. As moléculas de ácido nucleico ou seus fragmentos são capazes de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico sob certas condições. Na presente invenção, se duas moléculas de ácido nucleico podem formar uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla antiparalela, então essas duas moléculas poderão ser consideradas como sendo hibridizadas uma com a outra especificamente. Se duas moléculas de ácido nucleico mostram complementaridade completa, uma das duas moléculas é referida como o "complemento" da outra. Na presente invenção, quando cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é complementar com o nucleotídeo correspondente de outra molécula de ácido nucleico, então essas duas moléculas de ácido nucleico mostram "complementaridade completa". Se duas moléculas de ácido nucleico podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para que possam anelar e se ligar uma à outra sob pelo menos uma condição convencional de "baixa estringência", então essas duas moléculas de ácido nucleico serão referidas como sendo "minimamente complementares " . Da mesma forma, se duas moléculas de ácido nucleico puderem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para que possam anelar e se ligar uma à outra sob condições convencionais de "alta estringência", então essas duas moléculas de ácido nucleico serão referidas como tendo "complementaridade". O desvio da "complementaridade completa" é permitido, desde que o desvio não impeça completamente as duas moléculas de formar uma estrutura de fita dupla. Para ser usada como um iniciador ou uma sonda, uma molécula de ácido nucleico precisa apenas ter complementaridade suficiente na sequência de modo a formar uma estrutura de fita dupla estável no solvente específico e sob a concentração de sal específica.
[00051] Na presente invenção, uma sequência substancialmente homóloga se refere a uma molécula de ácido nucleico que pode hibridizar especificamente com a fita complementar de outra molécula de ácido nucleico combinada sob condição de alta estringência. As condições estringentes adequadas para a hibridação de DNA são bem conhecidas dos versados na técnica, tais como tratamento com 6,0 x solução de cloreto de sódio / citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 ° C seguido de lavagem com 2,0 x SSC a 50 ° C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de 2,0 x SSC e 50 ° C para condições de baixa estringência e 0,2 x SSC e 50 ° C para condições de alta estringência. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem varia de 22 ° C para condições de baixa estringência a 65 ° C para condições de alta estringência. Tanto a temperatura quanto a concentração de sal podem variar, ou apenas uma delas varia, enquanto a outra é mantida inalterada. Preferivelmente, a condição estringente usada na presente invenção pode ser a seguinte: hibridização específica com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8 em 6,0 x SSC e 0,5% de solução de SDS a 65 ° C, seguida de lavagem da membrana, respectivamente, com 2 x SSC e solução de SDS a 0,1% (uma vez) e 1 x SSC e solução de SDS a 0,1% (uma vez).
[00052] Portanto, a sequência que tem atividade resistente a insetos e pode hibridizar com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8 sob condições estringentes estão compreendidas na presente invenção. Estas sequências têm pelo menos cerca de 40% -50% de homologia, cerca de 60%, 65% ou 70% de homologia, mesmo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou homologia superior com as sequências da presente invenção.
[00053] Os genes e proteínas da presente invenção incluem não apenas as sequências específicas exemplificadas, mas também partes e / ou fragmentos (incluindo deleção (ões) interna (s) ou terminal (is) da proteína de comprimento total), variantes, mutantes , substitutos (proteínas contendo aminoácido (s) substituído (s)), quimeras e proteínas de fusão que mantêm a atividade inseticida dos mesmos. As "variantes" ou "variação" se referem às sequências de nucleotídeos que codificam a mesma proteína ou que codificam uma proteína equivalente com atividade inseticida. A "proteína equivalente" se refere às proteínas que têm a mesma ou substancialmente a mesma bioatividade contra Helicoverpa gelotopoeon que as proteínas nas reivindicações.
[00054] O "fragmento" ou "truncamento" do DNA ou sequências de proteínas, conforme descrito na presente invenção, se refere a uma parte do DNA original ou sequências de proteínas (nucleotídeos ou aminoácidos) da presente invenção ou uma forma artificialmente modificada dos mesmos (por exemplo, sequências adequadas para expressão em plantas). O comprimento da sequência acima é variável, mas é longa o suficiente para garantir que a proteína (codificada) seja uma toxina de inseto.
[00055] É fácil modificar genes e construir mutantes de genes usando tecnologia padrão, como a tecnologia bem conhecida para mutação pontual no estado da técnica e o método para produzir outra diversidade molecular por clivagem aleatória e remontagem de moléculas de DNA , conforme descrito no documento de patente US Pat. No. 5.605.793. Endonucleases comercialmente disponíveis podem ser usadas para produzir fragmentos de genes completos. A exonuclease também pode ser usada seguindo os procedimentos padrão. Por exemplo, as enzimas como Bal31 ou mutagênese dirigida ao sítio podem ser usadas para remover sistematicamente nucleotídeos das extremidades dos genes. Várias enzimas de restrição também podem ser usadas para obter os genes que codificam fragmentos ativos. Além disso, as proteases podem ser usadas para obter fragmentos ativos das toxinas.
[00056] Na presente invenção, as proteínas e / ou genes equivalentes que codificam essas proteínas podem ser derivados de isolado de Bt e / ou biblioteca de DNA. Existem muitas maneiras de obter as proteínas inseticidas da presente invenção. Por exemplo, os anticorpos contra a proteína inseticida divulgada e reivindicada pela presente invenção podem ser usados para identificar e isolar outras proteínas de misturas de proteínas. Em particular, o anticorpo pode ser criado contra a parte mais constante da proteína e a parte mais diferente de outras proteínas Bt. Estes anticorpos podem então ser usados para identificar especificamente as proteínas equivalentes com a atividade característica através de imuno-precipitação, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou ensaio de Western blotting. É fácil preparar os anticorpos contra as proteínas, proteínas equivalentes ou seus fragmentos divulgados na presente invenção por meio de procedimentos padrão nesta técnica. Os genes que codificam essas proteínas podem então ser obtidos a partir de microrganismos.
[00057] Devido à redundância de códons genéticos, muitas sequências de DNA diferentes podem codificar a mesma sequência de aminoácidos. A preparação dessas sequências de DNA alternativas que codificam a mesma ou substancialmente a mesma proteína está dentro da capacidade técnica dos versados na técnica. Estas diferentes sequências de DNA estão incluídas na presente invenção. A referida sequência "substancialmente a mesma" se refere a uma sequência que inclui a substituição, deleção, adição ou inserção de aminoácidos que não afetam substancialmente a atividade inseticida e também inclui os fragmentos que mantêm a atividade inseticida.
[00058] A substituição, deleção ou adição de aminoácidos na presente invenção é tecnologia convencional no estado da técnica. As alterações de aminoácidos preferidas incluem: pequena alteração de propriedade, i.e. substituição conservativa de aminoácidos que não afeta significativamente a ligação e / ou atividade da proteína; deleção curta, geralmente uma deleção de cerca de 1-30 aminoácidos; alongamento curto do terminal amino ou carboxila, tal como um alongamento do resíduo de metionina no terminal amino; peptídeo de ligação curto, tal como cerca de 20-25 resíduos de comprimento.
[00059] Os exemplos de substituição conservativa são as substituições dentro dos seguintes grupos de aminoácidos: aminoácidos básicos (como arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (como ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (por exemplo , glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (como leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (por exemplo, fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos moleculares (como glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que geralmente não alteram atividades específicas são bem conhecidas no estado da técnica e foram descritas em, por exemplo, Protein, editado por N. Neurath e RL Hill, Academic Press, New York, 1979. As substituições mais comuns são Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thu / Ser, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu e Asp / Gly, e suas substituições reversas.
[00060] Obviamente, para aqueles versados na técnica, tal substituição pode ocorrer fora das regiões importantes para a função molecular e ainda resultar em polipeptídeos ativos. Para o polipeptídeo da presente invenção, os resíduos de aminoácidos que são necessários para a atividade e, portanto, selecionados para não serem substituídos podem ser identificados de acordo com os métodos conhecidos no estado da técnica, tais como mutagênese dirigida ao sítio ou mutagênese por varredura de alanina (ver, por exemplo Cunningham e Wells, Science, 1989, 244: 1081-1085). A última tecnologia é realizada através da introdução de mutações em cada resíduo carregado positivamente em uma molécula e detecção da atividade resistente a insetos das moléculas mutantes resultantes, de modo a identificar os resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade da molécula. Os sítios de interação enzima-substrato também podem ser determinados analisando sua estrutura tridimensional, que pode ser determinada por meio de tecnologias, tais como, análise de ressonância magnética nuclear (NMR), cristalografia ou marcação de fotoafinidade (ver, por exemplo de Vos et al., Science, 1992, 255:306-312; Smith et al., J. Mol. Biol, 1992, 224:899-904; e Wlodaver et al., FEBS Letters, 1992, 309:59-64).
[00061] Na presente invenção, a proteína Vip3Aa inclui, mas não está limitada a, sequências de aminoácidos com certa homologia com as sequências de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7. A similaridade / identidade de sequência entre essas sequências e as sequências da presente invenção são tipicamente mais de 60%, preferivelmente mais de 75%, mais preferivelmente mais de 90%, ainda mais preferivelmente mais de 95%, e mais de 99%. Os polinucleotídeos e proteínas preferidos na presente invenção também podem ser definidos por faixas mais específicas de identidade e / ou semelhança. Por exemplo, eles têm uma identidade e / ou semelhança de 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% , 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com as sequências da presente invenção.
[00062] As sequências regulatórias da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, promotor, peptídeo de trânsito, terminador, potencializador, sequência líder, íntron e outras sequências regulatórias que podem ser operacionalmente ligadas à proteína Vip3Aa.
[00063] O promotor é um promotor expressável em planta, em que "um promotor expressável em planta" se refere a um promotor que garante que as sequências de codificação ligadas ao promotor podem ser expressas em células vegetais. O promotor expressável em plantas pode ser um promotor constitutivo. Os exemplos de promotores capazes de dirigir a expressão constitutiva em plantas incluem, mas não estão limitados a, promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, promotor Ubi10 de arabidopsis, promotor Ubi de milho e o promotor do gene GOS2 do gene do arroz. Alternativamente, o promotor expressável em plantas pode ser um promotor específico a tecido; ou seja, o nível de expressão da sequência de codificação dirigida por este promotor em alguns tecidos vegetais, como o clorênquima, é maior do que em outros tecidos vegetais (pode ser determinado por meio de teste de RNA convencional), como o promotor PEP carboxilase. Alternativamente, o promotor expressável em planta pode ser um promotor induzível por ferimento. O promotor induzível por ferimento ou o promotor que direciona os modos de expressão induzíveis por ferimento significa que quando as plantas são submetidas a ferida mecânica ou ferida causada por mastigação de inseto, o nível de expressão das sequências de codificação dirigidas pelo promotor é significativamente aumentado em comparação com aquele em condições de crescimento normal. Os exemplos de promotores induzíveis por ferimento incluem, mas não estão limitados a, os promotores dos genes inibidores da protease da batata e do tomate (pin I e pin II) e o promotor do gene inibidor da protease do milho (MPI).
[00064] O peptídeo de trânsito (também referido como sequência de sinal secretário ou sequência de direcionamento) direciona os produtos transgênicos em organismos ou compartimentos celulares específicos. Para a proteína receptora, o peptídeo de trânsito pode ser heterogêneo. Por exemplo, a sequência que codifica o peptídeo de trânsito do cloroplasto é usada para atingir o cloroplasto; ou a sequência de consenso ‘KDEL’ é usada para direcionar o retículo endoplasmático; ou CTPP do gene da lectina da cevada é usado para atingir o vacúolo.
[00065] As sequências líderes incluem, mas não estão limitadas a, pequenas sequências líderes de vírus de RNA, como a sequência líder EMCV (região não codificadora 5 'do vírus da encefalomiocardite); sequência líder Y do vírus da batata, tal como sequência líder MDMV (vírus do mosaico de milhão anão); proteína de ligação da cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP); sequência líder não traduzida do mRNA da proteína da cápside do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA4); sequência líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV).
[00066] O potencializador inclui, mas não está limitado a, potencializador do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), potencializador do vírus do mosaico da escrofulária (FMV), potencializador do vírus do anel gravado em cravo (CERV), potencializador do vírus do mosaico das nervuras da mandioca (CsVMV), vírus do mosaico mirabilis (MMV), intensificador do vírus do frisado amarelo do Cestrum (CmYLCV), intensificador do vírus do frisado do algodão (CLCuMV), potencializador do vírus do mosqueado amarelo da Commelina (CoYMV) e potencializador do caulimovírus da estria clorótica do amendoim (PCLSV).
[00067] Para a aplicação de monocotiledônea, o íntron inclui, mas está limitado a, íntron hsp70 de milho, íntron de ubiquitina de milho, íntron 1 de Adh, íntron de sintase de sacarose ou íntron Act1 de arroz. Para a aplicação de plantas dicotiledôneas, o intron inclui, mas não está limitado a, intron CAT-1, intron pKANNIBAL, intron PIV2 e intron "super ubiquitina".
[00068] O terminador pode ser a sequência de sinal de poliadenilação adequada que funciona em plantas, que inclui, mas não está limitada a, sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene da nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene do inibidor de protease II (pin II), sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene SSRUBISCO E9 da ervilha e sequência sinal de poliadenilação derivada do gene α-tubulina.
[00069] O termo "operacionalmente ligado" da presente invenção se refere à ligação de sequências de ácido nucleico, o que faz com que uma sequência forneça a função exigida pela sequência ligada. O termo "operacionalmente ligado" da presente invenção significa que um promotor está ligado a uma sequência de interesse de modo que a transcrição da sequência de interesse esteja sob o controle e regulação do promotor. Quando a sequência de interesse codifica uma proteína e a expressão desta proteína é desejada, o termo "operacionalmente ligado" indica que um promotor está ligado à sequência de modo que o transcrito obtido seja efetivamente traduzido. Se a ligação de um promotor e uma sequência de codificação for fundir os transcritos e a expressão da proteína codificada for necessária, tal ligação será gerada de modo que o primeiro códon de iniciação da translação do transcrito obtido seja o códon de iniciação da sequência de codificação. Alternativamente, se a ligação do promotor e da sequência de codificação for para fundir os produtos de translação e a expressão da proteína codificada for necessária, tal ligação será gerada de modo que o primeiro códon de iniciação da translação da sequência 5 'não transladada esteja ligado ao promotor e a relação entre a janela de leitura aberta dos produtos de translação obtidos e a janela de leitura aberta que codifica a proteína de interesse está de acordo com a janela de leitura. As sequências de ácido nucleico que podem ser operativamente ligadas incluem, mas não estão limitadas a, as sequências que fornecem a função de expressão gênica (isto é, elementos de expressão gênica, tais como promotor, região 5 'não transladada, íntron, região codificadora de proteína, região não transladada 3', sítio de poliadenilação e / ou terminador de transcrição); as sequências que proporcionam a função de transferência e / ou integração de DNA (ou seja, sequência limite de T-DNA, sítio de reconhecimento da recombinase específica do sítio, sítio de reconhecimento da integrase); as sequências que fornecem função seletiva (isto é, marcador de resistência a antibióticos, gene biossintético); as sequências que fornecem a função de marcador de pontuação; as sequências que facilitam a manipulação de sequência in vitro ou in vivo (ou seja, sequência poliligante, sequência recombinante específica do sítio) e as sequências que fornecem a função de replicação (ou seja, origens de replicação de bactérias, sequência de replicação autônoma, sequência de centrômero).
[00070] O termo "inseticida" ou "resistente a insetos" da presente invenção significa que é tóxico para as pragas das culturas, a fim de "controlar" e / ou "prevenir" as pragas das culturas. Preferivelmente, o referido "inseticida" ou "resistente a insetos" significa matar as pragas das colheitas. Mais especificamente, o inseto alvo é a praga Helicoverpa gelotopoeon.
[00071] A proteína Vip3Aa da presente invenção é tóxica para a praga Helicoverpa gelotopoeon. As plantas na presente invenção, especialmente soja, contêm DNA exógeno em seu genoma, em que o DNA exógeno contém a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Vip3Aa; assim, a praga Helicoverpa gelotopoeon é inibida e / ou morta após entrar em contato com a proteína através da ingestão de tecidos vegetais. A inibição se refere a letal ou subletal. Enquanto isso, a planta deve ter morfologia normal e pode ser cultivada por métodos convencionais de consumo e / ou geração de produtos. Além disso, a planta pode essencialmente eliminar a necessidade de pesticidas químicos ou biológicos (os pesticidas químicos ou biológicos são aqueles contra a praga Helicoverpa gelotopoeon direcionada pela proteína Vip3Aa).
[00072] O nível de expressão de proteínas de cristal inseticida (ICP) nos materiais vegetais pode ser determinado usando vários métodos neste campo, como o método de quantificar o mRNA que codifica a proteína inseticida no tecido por meio de iniciadores específicos, ou o método de quantificando direta e especificamente a proteína inseticida.
[00073] O efeito inseticida do ICP nas plantas pode ser detectado usando diferentes testes. Os insetos alvo da presente invenção são principalmente a praga Helicoverpa gelotopoeon.
[00074] Na presente invenção, a proteína Vip3Aa pode ter as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 na listagem de sequências. Além da região de codificação da proteína Vip3Aa, outros elementos também podem ser incluídos, tais como, os elementos que codificam o marcador seletivo.
[00075] Além disso, o cassete de expressão contendo a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Vip3Aa da presente invenção também pode ser expresso em conjunto com pelo menos um gene que codifica uma proteína de resistência a herbicida. O gene de resistência a herbicida inclui, sem limitação, gene de resistência à fosfinotricina (como, gene bar e gene pat), gene de resistência a fenmedifam (como gene pmph), gene de resistência a glifosato (como gene EPSPS), gene de resistência a bromoxinila, gene de resistência a sulfonilureia, gene de resistência a herbicida dalapon, gene de resistência a p- cianamida ou gene de resistência a inibidor de glutamina sintetase (como PPT), obtendo assim a planta transgênica com alta atividade inseticida e resistência a herbicida.
[00076] Na presente invenção, o DNA exógeno é introduzido nas plantas. Por exemplo, o gene ou cassete de expressão ou vetor recombinante que codifica a proteína Vip3Aa é introduzido em células vegetais, em que os métodos de transformação convencionais incluem, sem limitação: transformação mediada por agrobacterium, bombardeamento de emissão de traços, ingestão direta de DNA em protoplasto, eletroporação ou introdução de DNA mediado por filamentos de sílica.
[00077] A presente invenção fornece um método para controlar pragas, que tem as seguintes vantagens:
[00078] 1. O controle baseado em fator interno. O estado da técnica controla pragas Helicoverpa gelotopoeon principalmente por ação externa (isto é, fator externo), tais como controle agrícola, controle químico, controle físico e controle biológico; enquanto a presente invenção controla pragas Helicoverpa gelotopoeon pela produção da proteína Vip3Aa nas plantas, que pode inibir o crescimento de pragas Helicoverpa Gelotopoeon, isto é, para controlar com base no fator interno.
[00079] 2. Sem poluição e sem resíduos. Embora o controle químico usado no estado da técnica pudesse controlar pragas Helicoverpa gelotopoeon até certo ponto, ele também causa poluição, destruição e resíduos para o ecossistema humano, de gado e de terras agrícolas. Em contratos, através da utilização do método da presente invenção para controlar pragas de Helicoverpa gelotopoeon, as consequências adversas acima podem ser eliminadas.
[00080] 3. Controle em todo o período de crescimento. Todos os métodos para controlar pragas de Helicoverpa gelotopoeon no estado da técnica são periódicos, enquanto o método da presente invenção pode proteger as plantas durante todo o seu período de crescimento. Plantas transgênicas (proteína Vip3Aa) podem resistir a pragas de Helicoverpa gelotopoeon desde a germinação, crescimento, até a produção de flores e frutos.
[00081] 4. Controle de toda a planta. A maioria dos métodos para controlar pragas de Helicoverpa gelotopoeon no estado da técnica são locais, tais como pulverização da superfície da folha. Embora a presente invenção seja para proteger as plantas inteiras de pragas Helicoverpa gelotopoeon, como raiz, folha, caule, fruto, borla, espiga e antera da planta transgênica (proteína Vip3Aa).
[00082] 5. Os efeitos estáveis. A lâmpada inseticida de oscilação de frequência no estado da técnica não só requer a limpeza oportuna da sujeira na grade de alta tensão todos os dias, mas também não pode ser usada durante tempestades. Em contrapartida, a proteína Vip3Aa na presente invenção é expressa na planta, evitando assim eficazmente o defeito de que o efeito da lâmpada inseticida de oscilação de frequência seja afetado por fator externo. Além disso, os efeitos de controle das plantas transgênicas (proteína Vip3Aa) da presente invenção são estáveis e consistentes em diferentes locais, diferentes épocas e diferentes origens genéticas.
[00083] 6. Simples, prático e econômico. A lâmpada inseticida de oscilação de frequência no estado da técnica requer um grande investimento único e há o risco de eletrocussão devido à operação inadequada. A presente invenção necessita apenas plantar plantas transgênicas expressando a proteína Vip3Aa, sem a necessidade de outras medidas, para que haja economia de mão de obra, recursos materiais e financeiros.
[00084] 7. Efeito completo. O efeito de controle do método de controle de pragas Helicoverpa gelotopoeon no estado da técnica é incompleto e só pode trazer um efeito de alívio. Em contrapartida, as plantas transgênicas (proteína Vip3Aa) da presente invenção podem produzir um efeito de controle percentual de quase 100% nas larvas recém-eclodidas de Helicoverpa gelotopoeon, enquanto as poucas larvas sobreviventes também param substancialmente o desenvolvimento: após 3 dias, as larvas ainda permanecem no estado de incubação inicial, indicando óbvio mau desenvolvimento, e interrompe o desenvolvimento e, portanto, não podem sobreviver no ambiente natural do campo. No entanto, as plantas transgênicas são apenas ligeiramente danificadas em geral.
[00085] As soluções técnicas da presente invenção serão ainda descritas em detalhes com referência às seguintes figuras e exemplos.
[00086] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00087] A figura 1 é o fluxograma que mostra a construção do vetor de clonagem recombinante DBN01-T contendo a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 usada para a proteína inseticida da presente invenção;
[00088] A figura 2 é o fluxograma que mostra a construção do vetor de clonagem recombinante DBN100002 contendo a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 usada para a proteína inseticida da presente invenção.
[00089] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.
[00090] As soluções técnicas relativas ao uso da proteína inseticida da presente invenção serão ainda ilustradas através dos seguintes exemplos.
[00091] Exemplo 1 A obtenção e síntese do gene Vip3Aa
[00092] 1. Obtenção da sequência de nucleotídeos
[00093] A sequência de aminoácidos da proteína inseticida Vip3Aa-01 (789 aminoácidos) é mostrada na SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 (2370 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína inseticida Vip3Aa-01 é como mostrada na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequências.
[00094] A sequência de aminoácidos da proteína inseticida Vip3Aa-02 (789 aminoácidos) é mostrada na SEQ ID NO: 3 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02 (2370 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína inseticida Vip3Aa-02 é como mostrado na SEQ ID NO: 4 na listagem de sequências.
[00095] A sequência de aminoácidos da proteína inseticida Vip3Aa-03 (789 aminoácidos) é mostrada na SEQ ID NO: 5 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03 (2370 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína inseticida Vip3Aa-03 é como mostrado na SEQ ID NO: 6 na listagem de sequências.
[00096] A sequência de aminoácidos da proteína inseticida Vip3Aa-04 (789 aminoácidos) é como mostrada na SEQ ID NO: 7 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04 (2370 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína inseticida Vip3Aa-04 é como mostrado na SEQ ID NO: 8 na listagem de sequências.
[00097] A sequência de aminoácidos da proteína inseticida Cry1Ab (615 aminoácidos) é mostrada na SEQ ID NO: 9 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos Cry1Ab (1848 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína inseticida Cry1Ab é como mostrado na SEQ ID NO: 10 na listagem de sequências.
[00098] A sequência de aminoácidos da proteína inseticida Cry2Ab (634 aminoácidos) é mostrada na SEQ ID NO: 11 na listagem de sequências; a sequência de nucleotídeos Cry2Ab (1905 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína inseticida Cry2Ab é como mostrado na SEQ ID NO: 12 na listagem de sequência.
[00099] 2. Síntese das sequências de nucleotídeos acima
[000100] A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 (como mostrado na SEQ ID NO: 2 na lista de sequências), sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02 (como mostrado na SEQ ID NO: 4 na lista de sequências), sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03 como mostrado em SEQ ID NO: 6), sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04 (como mostrado em SEQ ID NO: 8 na lista de sequências), sequência de nucleotídeos Cry1Ab (como mostrado em SEQ ID NO: 10 na lista de sequências) e sequência de nucleotídeos Cry2Ab (como mostrado na SEQ ID NO: 12 na lista de sequências) foram sintetizadas. A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 sintetizada (SEQ ID NO: 2) tinha um sítio de restrição Sca I na extremidade 5 'e um sítio de restrição Spe I na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02 sintetizada (SEQ ID NO: 4) tinha um sítio de restrição Sca I na extremidade 5 'e um sítio de restrição Spe I na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03 sintetizada (SEQ ID NO: 6) tinha um sítio de restrição Sca I na extremidade 5 'e um sítio de restrição Spe I na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04 sintetizada (SEQ ID NO: 8) tinha um sítio de restrição Sca I na extremidade 5 'e um sítio de restrição Spe I na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeos sintetizada de Cry1Ab (SEQ ID NO: 10) tinha um sítio de restrição Kas I na extremidade 5 'e um sítio de restrição BamH I na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeos sintetizada de Cry2Ab (SEQ ID NO: 12) tinha um sítio de restrição Nco I na extremidade 5 'e um sítio de restrição Spe I na extremidade 3'.
[000101] Exemplo 2: Construção dos vetores de expressão recombinantes e transformação de Agrobacterium com os vetores de expressão recombinantes
[000102] 1. Construção dos vetores de clonagem recombinantes contendo o gene Vip3Aa
[000103] A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 sintetizada foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, EUA, CAT: A3600) para obter o vetor de clonagem recombinante DBN01-T, seguindo as instruções do vetor pGEM-T do produto Promega , e o processo de construção foi mostrado na figura 1 (em que Amp representa o gene de resistência à ampicilina; f1ori representa a origem de replicação do fago f1; LacZ representa o códon de iniciação de LacZ; SP6 representa o promotor da polimerase de RNA de SP6; T7 representa o promotor da polimerase de RNA de T7; Vip3Aa-01 representa a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 (SEQ ID NO: 2); MCS representa múltiplos sítios de clonagem).
[000104] O vetor de clonagem recombinante DBN01-T foi então transformado em células competentes de E. coli T1 (Transgen, Beijing, China, o CAT: CD501) através do método de choque térmico. As condições de choque térmico foram as seguintes:
[000105] - 50 μl de célula competente T1 de E. coli e 10 μl de DNA de plasmídeo (vetor de clonagem recombinante DBN01-T) foram incubados em banho-maria a 42 ° C por 30 segundos;
[000106] - as células de E. coli foram vibradas e incubadas em banho-maria a 37 ° C por 1 h (100 rpm em uma incubadora sob agitação) e, em seguida, foram cultivadas em uma placa LB (10 g / L de Triptona, 5 g / L extrato de levedura, 10 g / L NaCl, 15 g / L Agar, e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) revestido com IPTG (Isopropil tio-beta-D-galactoseglucosídeo), X-gal (5-bromo-4-cloro- 3-indol- beta-D-galactosídeo) e ampicilina (100 mg / L) durante a noite;
[000107] - as colônias brancas foram selecionadas e cultivadas em caldo líquido LB (10 g / L de triptona, 5 g / L de extrato de levedura, 10 g / L de NaCl, 100 mg / L de ampicilina, e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH ) a 37 ° C durante a noite.
[000108] Os plasmídeos foram extraídos usando o método de lise alcalina da seguinte forma:
[000109] - o caldo bacteriano foi centrifugado por 1 min a 12000 rpm, o sobrenadante foi descartado e o grânulo foi ressuspenso em 100 μl de solução gelada I (25 mM de Tris-HCl, 10 mM de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) e 50 mM de glicose, pH 8,0);
[000110] - 200 μl de solução recém-preparada II (0,2 M de NaOH, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio)) foram adicionados e o tubo foi invertido 4 vezes, misturado e, em seguida, colocado em gelo por 3-5 min;
[000111] - 150 μl de solução fria III (acetato de potássio 3 M e ácido acético 5 M) foram adicionados, completamente misturados imediatamente e colocados em gelo por 5-10 min;
[000112] - a mistura foi centrifugada a 12000 rpm a 4 ° C por 5 min, e o sobrenadante foi adicionado com dois volumes de etanol anidro, misturado e então colocado em temperatura ambiente por 5 min;
[000113] - a mistura foi centrifugada a 12000 rpm a 4 ° C por 5 min, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi lavado com etanol 70% (V / V) e seco;
[000114] - ao grânulo foi adicionado 30 μl de TE (10 mM de Tris-HCl, 1mM de EDTA 1, pH 8,0) contendo RNase (20 μg / ml) para dissolução;
[000115] - a mistura foi incubada em banho-maria a 37 ° C por 30 min para digerir o RNA e armazenada a -20 ° C para uso.
[000116] Após os plasmídeos extraídos terem sido identificados enzimaticamente com as enzimas de restrição Sca I e Spe I, os clones positivos foram verificados por sequenciação. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01- T foi a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequências, indicando que a sequência de nucleotídeos de Vip3Aa-01 foi inserida corretamente.
[000117] A sequência de nucleotídeos sintetizada Vip3Aa-02 foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN02-T seguindo o processo para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T como descrito acima, em que o referido Vip3Aa-02 foi a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02 (SEQ ID NO: 4). A sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 02 no vetor de clonagem recombinante DBN02-T foi verificada como corretamente inserida com digestão enzimática e sequenciamento.
[000118] A sequência de nucleotídeos sintetizada Vip3Aa-03 foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN03-T seguindo o processo para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T como descrito acima, em que o referido Vip3Aa-03 foi a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03 (SEQ ID NO: 6). A sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 03 no vetor de clonagem recombinante DBN03-T foi verificada como corretamente inserida com digestão enzimática e sequenciamento.
[000119] A sequência de nucleotídeos sintetizada Vip3Aa-04 foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN04-T seguindo o processo para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T como descrito acima, em que o referido Vip3Aa-04 foi a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04 (SEQ ID NO: 8). A sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 04 no vetor de clonagem recombinante DBN04-T foi verificada como corretamente inserida com digestão enzimática e sequenciamento.
[000120] A sequência de nucleotídeos sintetizada Cry1Ab foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN05-T seguindo o processo de construção do vetor de clonagem recombinante DBN01- T como descrito acima, em que o referido Cry1Ab era a sequência de nucleotídeo Cry1Ab (SEQ ID NO: 10). A sequência de nucleotídeos Cry1Ab no vetor de clonagem recombinante DBN05-T foi verificada como inserida corretamente com digestão enzimática e sequenciamento.
[000121] A sequência de nucleotídeos sintetizada Cry2Ab foi ligada ao vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN06-T seguindo o processo de construção do vetor de clonagem recombinante DBN01- T como descrito acima, em que o referido Cry2Ab era a sequência de nucleotídeos Cry2Ab ( SEQ ID NO: 12). A sequência de nucleotídeos Cry2Ab no vetor de clonagem recombinante DBN06-T foi verificada como inserida corretamente com digestão enzimática e sequenciamento.
[000122] 2. Construção dos vetores de expressão recombinantes contendo o gene Vip3Aa
[000123] O vetor de clonagem recombinante DBN01-T e o vetor de expressão DBNBC-01 (Estrutura do vetor: pCAMBIA2301, disponível no Instituto CAMBIA) foram digeridos enzimaticamente com as enzimas de restrição Sca I e Spe I. O fragmento de sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01 clivado foi inserido entre os sítios de restrição Sca I e Spe I do vetor de expressão DBNBC-01 para construir o vetor de expressão recombinante DBN100002. Os versados na técnica sabem bem como construir um vetor usando o método convencional de digestão enzimática. O fluxograma de construção foi mostrado na figura 2 (Kan: gene canamicina; RB: borda direita; prAtUbi10: promotor do gene da ubiquitina de Arabidopsis (SEQ ID NO: 13); Vip3Aa-01; sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 01 (SEQ ID NO: 2); tNos, terminador do gene da nopalina sintetase (SEQ ID NO: 14); pr35S: promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO: 15); PAT; gene da fosfinotricina acetiltransferase (PAT) (SEQ ID NO: 16); T35S: terminador 35S do vírus do mosaico da couve-flor (SEQ ID NO : 17); LB: borda esquerda).
[000124] O vetor de expressão recombinante DBN100002 foi transformado em células competentes T1 de E. coli com método de choque térmico. As condições de choque térmico foram as seguintes:
[000125] - 50 μl de célula competente T1 de E. coli e 10 μl de DNA de plasmídeo (vetor de expressão recombinante DBN100002) foram incubados em banho-maria a 42 ° C por 30 segundos;
[000126] - as células de E. coli foram vibradas e incubadas em banho-maria a 37 ° C por 1 h (100 rpm em uma incubadora sob agitação) e, em seguida, foram cultivadas em uma placa sólida LB (10 g / L de triptona, 5 g / Extrato de levedura L, NaCl 10 g / L, Agar 15 g / L, e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) contendo canamicina 50 mg / L a 37 ° C durante 12 horas;
[000127] - as colônias brancas foram selecionadas e cultivadas em caldo líquido LB (10 g / L de triptona, 5 g / L de extrato de levedura, 10 g / L de NaCl, 50 mg / L de canamicina e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) a 37 ° C durante a noite.
[000128] Os plasmídeos foram extraídos usando o método de lise alcalina. Após os plasmídeos extraídos terem sido identificados enzimaticamente com as enzimas de restrição Sca I e Spe I, os clones positivos foram verificados por sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Sca I e Spe I no vetor de expressão recombinante DBN100002 era a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01.
[000129] Seguindo o processo de construção do vetor recombinante DBN100002 como descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN02-T foi digerido com as enzimas Sca I e Spe I para obter a sequência de nu-cleotídeo Vip3Aa-02, que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC-01 para produzir o vetor recombinante DBN100741. A digestão com enzima de restrição e sequenciamento verificou que o vetor de expressão recombinante DBN100741 continha a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 4 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02. A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02 pode ser ligada ao promotor prAtUbi10 e ao terminador tNos.
[000130] Seguindo o processo de construção do vetor recombinante DBN100002 conforme descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN03-T foi digerido pelas enzimas Sca I e Spe I para obter a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, que foi então inserida na expressão vetor DBNBC0-1 para produzir o vetor recombinante DBN100742. A digestão com enzima de restrição e a sequenciamento verificaram que o vetor de expressão recombinante DBN100742 continha a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 6 na listagem de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03. A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03 pode ser ligada ao promotor prAtUbi10 e ao terminador tNos.
[000131] Seguindo o processo para a construção do vetor recombinante DBN100002 como descrito acima, o vetor de clonagem recombinante DBN04-T digeriu as enzimas Sca I e Spe I para obter a sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 04, que foi então inserida no vetor de expressão DBNBC0-1 para produzir o vetor recombinante DBN100743. A digestão e o sequenciamento da enzima de restrição verificaram que o vector de expressão recombinante DBN100743 continha a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 8 na lista de sequências, ou seja, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04. A sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04 pode ser ligada ao promotor prAtUbi10 e ao terminador tNos.
[000132] Seguindo o processo de construção do vetor recombinante DBN100002 conforme descrito acima, os vetores de clonagem recombinante DBN02-T e DBN05-T foram digeridos respectivamente com as enzimas Sca I e Spe I, e Kas I e BamH I para obter o Vip3Aa-02 e Cry1 Sequências de nucleotídeos Ab, que foram então inseridas no vetor de expressão DBNBC-01 para produzir o vetor recombinante DBN1000003. A digestão e o sequenciamento da enzima de restrição verificaram que o vetor de expressão recombinante DBN100003 continha as sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 10 na listagem de sequências, ou seja, as sequências de nucleotídeos Vip3Aa-02 e Cry1Ab.
[000133] Seguindo o processo de construção do vetor recombinante DBN100002 como descrito acima, os vetores de clonagem recombinante DBN01-T e DBN06-T foram respectivamente digeridos com as enzimas Sca I e Spe I, e Nco I e Spe I para obter as sequências de nucleotídeos o Vip3Aa- 01 e Cry2 Ab, que foram então inseridas no vetor de expressão DBNBC-01 para produzir o vetor recombinante DBN1000370. A digestão e o sequenciamento da enzima de restrição verificaram que o vetor de expressão recombinante DBN100370 continha as sequências de nucleotídeos estabelecidas em SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 12 na listagem de sequências, ou seja, as sequências de nucleotídeos Vip3Aa-01 e Cry2Ab.
[000134] 3. Transformação de Agrobacterium com os vetores de expressão recombinantes
[000135] Os vetores de expressão recombinantes corretamente construídos DBN100002, DBN100741, DBN100742, DBN100743, DBN100003 e DBN100370 foram transformados em Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Chicago, EUA, Cat. No: 18313-015) pelo método de nitrogênio líquido. As condições de transformação são as seguintes:
[000136] - 100 μL de Agrobacterium LBA4404 e 3 μL de DNA de plasmídeo (vetor de expressão recombinante) foram congelados em nitrogênio líquido por 10 min e depois incubados em banho-maria a 37 ° C por 10 min;
[000137] - as células transformadas de Agrobacterium LBA4404 foram inoculadas em caldo LB em um tubo de ensaio e cultivadas a 28 ° C e sob 200 rpm por 2 horas, e aplicadas em uma placa LB contendo 50 mg / L de rifampicina (rifampicina) e 100 mg / L de canamicina (Canamicina) até o aparecimento de uma única colônia positiva;
[000138] - as colônias únicas positivas foram tomadas e cultivadas;
[000139] - os plasmídeos foram extraídos.
[000140] Os vetores de expressão recombinantes DBN100002, DBN100741, DBN100742, DBN100743, DBN100003 e DBN100370 foram verificados enzimaticamente por digestão enzimática. Os resultados mostraram que os vetores de expressão recombinantes DBN100002, DBN100741, DBN100742, DBN100743, DBN100003 e DBN100370 estavam corretos na estrutura, respectivamente.
[000141] Exemplo 3 Obtenção da planta transgênica
[000142] 1. Obtenção da planta de soja transgênica
[000143] De acordo com o método convencional de transfecção de Agrobacterium, a cultivar de soja Zhonghuang 13 foi cultivada sob condições esterilizadas e o tecido dos nós cotiledonares foi co-cultivado com as cepas de Agrobacterium da parte 3 do Exemplo 2, de modo a introduzir T-DNAs no vetores de expressão recombinantes DBN100002, DBN100741, DBN100742, DBN100743, DBN100003 e DBN100370 da parte 2 do Exemplo 2 (incluindo a sequência promotora do gene da ubiquitina de Arabidopsis, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02-Cry1 Ab, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01-Cry2Ab, o gene PAT e o terminador tNos) no genoma da soja. Plantas de soja contendo, respectivamente, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 02-Cry1Ab e a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01-Cry2Ab foram obtidas, com a planta de soja de tipo selvagem como controle.
[000144] Quanto à transfecção de soja mediada por Agrobacterium, em resumo, sementes de soja maduras foram germinadas em meio de germinação de soja (3,1 g / L de sal B5, vitamina B5, 20 g / L de sacarose, 8 g / L de ágar, pH = 5,6), e as sementes foram inoculadas no meio de germinação e cultivadas nas seguintes condições: temperatura de 25 ± 1 ° C; e um fotoperíodo (claro / escuro) de 16/8 hs. Após 4-6 dias de germinação, sementes assépticas de soja expandidas no nó cotiledonar verde brilhante foram tomadas, o hipocótilo foi cortado 3-4 mm abaixo dos nós cotiledonares, as cotiledôneas foram cortadas longitudinalmente e os botões superiores, brotos laterais e raízes de sementes foram cortados. O nó cotiledonar foi ferido com a parte de trás do bisturi e o tecido do nó cotiledonar ferido foi colocado em contato com a suspensão de Agrobacterium, em que o Agrobacterium foi capaz de transferir a sequência de nucleotídeos Vip3Aa para o tecido do nó cotiledonar ferido (Etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, preferivelmente, o tecido do nó cotiledonar foi imerso em suspensão de Agrobacterium (OD660 = 0,5 -0,8) e meio de infecção (2,15 g / L de sal MS, vitaminas B5, 20 g / L de sacarose, 10 g / L de glicose, 40 mg / L de Acetosiringona (AS), 4 g / L de ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), 2 mg / L de zeatina (ZT), pH = 5,3) para iniciar a inoculação. O tecido do nó cotiledonar e Agrobacterium foram co-cultivados por um período (3 dias) (Etapa 2: etapa de co-cultivo). Preferivelmente, após a etapa de infecção, o tecido do nó cotiledonar foi cultivado em meio sólido (4,3 g / L de sal MS, vitaminas B5, 20 g / L de sacarose, 10 g / L de glicose, 4 g / L de MES, 2 mg / L de ZT, 8 g / L de ágar, pH = 5,6). Após esta etapa de co-cultivo, uma etapa opcional de “recuperação” pode ser realizada. Na etapa de "recuperação", o meio de recuperação (3,1 g / L de sais B5, vitaminas B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 2 mg / L de ZT, 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefamicina, 100 mg / L de ácido glutâmico, 100 mg / L de ácido aspártico, pH = 5,6) contém pelo menos um antibiótico inibidor de Agrobacterium conhecido (cefamicina) sem o agente seletivo para transformantes de plantas (Etapa 3: etapa de recuperação). Preferivelmente, o bloco de tecido gerado a partir do nó cotiledonar foi cultivado em uma cultura de meio sólido contendo antibióticos sem agente seletivo, de modo a eliminar Agrobacterium e fornecer um período de recuperação para as células infectadas. Em seguida, o bloco de tecido gerado a partir do nó cotiledonar foi cultivado em meio contendo agente seletivo (glufosinato) e o calo transfectado em crescimento foi selecionado (Etapa 4: etapa de seleção). Preferivelmente, o bloco de tecido gerado a partir do nó cotiledonar foi cultivado em um meio sólido seletivo contendo agente seletivo (3,1 g / L de sais de vitamina B5, B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 1 mg / L de 6-benzilaminopurina (6-BAP), 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefamicina, 100 mg / L de ácido glutâmico, 100 mg / L de ácido aspártico, 6 mg / L de glufosinato, pH = 5,6), resultando no crescimento seletivo das células transfectadas. Em seguida, as células transfectadas foram regeneradas em plantas (Etapa 5: etapa de regeneração). Preferivelmente, o bloco de tecido gerado a partir do nó cotiledonar cultivado no meio contendo o agente seletivo foi cultivado em meios sólidos (meio de diferenciação B5 e meio de enraizamento B5) para ser regenerado em plantas.
[000145] O bloco de tecido resistente obtido foi transferido para o meio de diferenciação B5 (3,1 g / L de sais B5, vitaminas B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 1 mg / L de ZT, 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefamicina, 50 mg / L de ácido glutâmico, 50 mg / L de ácido aspártico, 1 mg / L de giberelina, 1 mg / L de auxina, 6 mg / L de glufosinato, pH = 5,6), cultivado e diferenciado a 25 ° C. As mudas diferenciadas foram transferidas para o meio de enraizamento B5 (3,1 g / L de sais B5, vitaminas B5, 1 g / L de MES, 30 g / L de sacarose, 8 g / L de ágar, 150 mg / L de cefamicina, e 1 mg / L de ácido indol-3-butírico (IBA)), e cultivadas a cerca de 10 cm de altura a 25 ° C no meio de enraizamento. Em seguida, as mudas foram transferidas e cultivadas em estufa até a frutificação. Em estufa, as plantas de soja foram cultivadas a 26 ° C por 16 horas e a 20 ° C por 8 horas todos os dias.
[000146] Exemplo 4 Verificação de plantas de soja transgênicas usando o ensaio Taq-Man
[000147] A partir das plantas de soja transfectadas contendo, respectivamente, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02-Cry1Ab e sequência de nucleotídeos Vip3Aa -01-Cry2 Ab, 100 mg de folhas foram tomadas como amostras. O DNA genômico foi extraído com o kit DNeasy Plant Maxi (Qiagen) e o número de cópias do gene PAT foi quantificado por meio de ensaio de PCR quantitativo de fluorescência baseado em sonda Taqman, a fim de determinar o número de cópias do gene Vip3Aa. A planta de soja de tipo selvagem foi tomada como controle e analisada de acordo com o processo descrito acima. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados foram os valores médios.
[000148] O método específico para determinar o número de cópias do gene PAT foi o seguinte.
[000149] Etapa 11: a partir das plantas de soja transfectadas, contendo respectivamente as sequências de nucleotídeos de Vip3Aa-01, Vip3Aa-02, Vip3Aa-03, Vip3Aa-04, Vip3Aa-02-Cry1Ab, Vip3Aa-01-Cry2Ab e planta de soja tipo selvagem, 100 mg de folhas foram retirados e triturados até homogeneizar em um almofariz com nitrogênio líquido, respectivamente. Cada amostra foi realizada em triplicata.
[000150] Etapa 12: os DNAs genômicos das amostras acima foram extraídos usando DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) seguindo as instruções do produto.
[000151] Etapa 13: as concentrações de DNA do genoma das amostras acima foram determinadas usando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
[000152] Etapa 14: as concentrações de DNA do genoma das amostras acima foram ajustadas para a mesma faixa de concentração de 80-100 ng / μl.
[000153] Etapa 15: os números de cópias das amostras foram quantificados usando ensaio de PCR quantitativo de fluorescência baseado em sonda Taqman com a amostra tendo o número de cópias conhecido como uma amostra padrão e a planta de soja de tipo selvagem como um controle. Cada amostra foi realizada em triplicata e os resultados foram os valores médios. Os iniciadores e sondas de PCR usados na PCR quantitativa de fluorescência foram mostrados a seguir.
[000154] Os seguintes iniciadores e sonda foram usados para detectar a sequência de nucleotídeos PAT Iniciador 1: gagggtgttgtggctggtattg, como mostrado na SEQ ID NO: 18 na listagem de sequências; Iniciador 2: tctcaactgtccaatcgtaagcg, como mostrado na SEQ ID NO: 19 na listagem de sequências; Amostra 1: cttacgctgggccctggaaggctag, como mostrado na SEQ ID NO: 20 na listagem de sequências O sistema de reação de PCR foi o seguinte: JumpStart ™ Taq ReadyMix ™ (Sigma) 10 μl Mistura 50 x iniciador/amostra 1 μl DNA genômico 3 μl Água (ddH2O) 6 μl
[000155] A mistura 50 x iniciador / sonda continha 45 μl de cada iniciador (1 mM), 50 μl da sonda (100 μM) e 860 μl de tampão TE 1 x e foi armazenada em um tubo âmbar a 4 ° C.
[000156] A condição da reação de PCR foi a seguinte
Figure img0001
[000157] Os dados foram analisados usando o software SDS 2.3 (Applied Biosystems).
[000158] Os resultados experimentais mostraram que todas as sequências de nucleotídeos de Vip3A-01, Vip3Aa-02, Vip3A-03, Vip3A-04, Vip3Aa-02- Cry1Ab e Vip3Aa-01-Cry2Ab foram integradas nos genomas do plantas de soja detectadas, respectivamente. Além disso, as plantas de soja transfectadas contendo respectivamente as sequências de nucleotídeos de Vip3Aa-01, Vip3Aa-02, Vip3Aa-03, Vip3Aa-04, Vip3Aa-02-Cry1Ab e Vip3Aa-01-Cry2Ab eram plantas de soja transgênica de cópia única.
[000159] Exemplo 5 Teste de efeito de resistência a insetos das plantas transgênicas
[000160] As plantas de soja transfectadas respectivamente com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vipa3Aa- 04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02-Cry1 Ab e a sequência de nucleotídeos Vip3Aa -01-Cry2Ab, as plantas de soja de tipo selvagem e as plantas de soja identificadas como não transgênicas com o ensaio Taqman foram testadas para os efeitos de resistência a insetos contra Helicoverpa gelotopoeon e Helicoverpa armigera.
[000161] As plantas de soja (período V3, segunda folha superior), respectivamente, transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeo Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeo Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeo Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02- Cry1 Ab e a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01-Cry2Ab, a planta de soja de tipo selvagem e a planta de soja identificada como não transgênica com o ensaio Taqman, folhas frescas foram retiradas e lavadas com água estéril, e a água permaneceram nas superfícies das folhas foram secas com um pedaço de bandagem. As nervuras das folhas foram removidas e as folhas foram cortadas em forma circular com um diâmetro de cerca de 1 cm. 1-3 pedaços (o número é determinado de acordo com o apetite do inseto) de folhas circulares foram colocadas em um papel de filtro dentro do orifício da placa de bioensaio. O papel de filtro foi molhado com água destilada e 1 larva recém-eclodida foi colocada em cada furo. Em seguida, a placa de bioensaio foi coberta e mantida por 5 dias sob a condição de temperatura de 26-28 ° C, umidade relativa de 70% -80% e fotoperíodo (claro / escuro) 16: 8. A mortalidade e taxa de danos foliares (taxa de dano foliar se refere à razão entre a área foliar ingerida por pragas e a área foliar total) de Helicoverpa gelotopoeon e Helicoverpa armigera foram calculados. Duas cepas (S1, S2) transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, duas cepas (S3, S4) transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, duas cepas (S5, S6) transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, duas cepas (S7, S8) transfectado com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, duas cepas (S9, S10) transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02-Cry1Ab, duas cepas (S11, S12) transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01-Cry2Ab, uma cepa (NGM) identificada como não transgênica por meio do ensaio Taqman e uma cepa de tipo selvagem (controle negativo, CK) foram selecionadas. Seis plantas de cada cepa foram testadas, e cada planta foi repetida em 32 furos de bioensaio. Entre os testes relativos ao efeito resistente a insetos das plantas transgênicas, o teste de Helicoverpa gelotopoeon foi realizado na Argentina, América do Sul. Os resultados são mostrados nas Tabelas 1-4.
[000162] Tabela 1. Mortalidade de Helicoverpa gelotopoeon após inoculação das plantas de soja transgênicas
Figure img0002
[000163] Tabela 2. Mortalidade de Helicoverpa armigera após a inoculação das plantas de soja transgênicas
Figure img0003
[000164] Tabela 3 Danos nas folhas das plantas de soja transgênicas inoculadas com Helicoverpa gelotopoeo
Figure img0004
[000165] Tabela 4 : Danos nas folhas das plantas de soja transgênicas inoculadas com Helicoverpa armigera
Figure img0005
[000166] Os Resultados Nas Tabelas 1 E 3 Indicam Que As Plantas De Soja, Respectivamente, Transfectadas Com A Sequência De Nucleotídeos Vip3aa-01, A Sequência De Nucleotídeos Vip3aa-02, A Sequência De Nucleotídeos Vip3aa-03, A Sequência De Nucleotídeos Vip3aa-04, A Sequência De Nucleotídeos Vip3aa- 02, A Sequência De Nucleotídeos -cry1ab E A Sequência De Nucleotídeos Vip3aa- 01-cry2ab Têm Bom Efeito Inseticida Em Helicoverpa Gelotopoeon E A Mortalidade Média De Helicoverpa Gelotopoeon É Superior A 90%. Enquanto Isso, As Plantas De Soja Acima São Geralmente Ligeiramente Danificadas Por Helicoverpa Gelotopoeon E A Taxa De Danos Às Folhas É Inferior A 10%. A Mortalidade De Helicoverpa Gelotopoeon E A Taxa De Danos À Folha Na Planta De Soja Identificada Como Não Transgênica Pelo Ensaio Taqman E Na Planta De Soja De Tipo Selvagem São Cerca De 7% E 47%, Respectivamente.
[000167] Os resultados nas Tabelas 2 e 4 indicam que as plantas de soja respectivamente transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 02, a sequência de nucleotídeos -Cry1Ab e a sequência de nucleotídeos Vip3Aa- 01-Cry2Ab têm efeito inseticida contra Helicoverpa armigera que pertence à resistência moderada, e a mortalidade média de Helicoverpa armigera é de cerca de 78%. Enquanto isso, as plantas de soja são geralmente ligeiramente danificadas por Helicoverpa armigera e a taxa de danos às folhas é de cerca de 18%. A taxa de mortalidade de Helicoverpa armigera e a taxa de dano foliar na planta de soja identificada como não transgênica pelo ensaio Taqman e na planta de soja de tipo selvagem são cerca de 6% e 46%, respectivamente.
[000168] Enquanto isso, os resultados nas Tabelas 1-4 também indicam que nas plantas de soja respectivamente transfectadas com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02-Cry1Ab e a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01-Cry2Ab, a mortalidade das larvas recém-presas de Helicoverpa gelotopoeon é obviamente maior e a taxa de danos às folhas das plantas de soja causada por Helicoverpa gelotopoeon é menor em comparação com Helicoverpa armigera.
[000169] Foi assim demonstrado que as plantas de soja transfectadas respectivamente com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vipa3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02-Cry1Ab , e o Vip3Aa-01-Cry2Ab todos exibem atividade inibitória contra Helicoverpa gelotopoeon. A atividade inibitória é suficiente para produzir efeitos adversos no crescimento de Helicoverpa gelotopoeon de forma que possa ser controlada em campo, e é inesperadamente superior à de Helicoverpa armigera.
[000170] Os resultados experimentais acima também mostraram que as plantas de soja transfectadas respectivamente com a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-03, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-04, a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-02-Cry1, e a sequência de nucleotídeos Vip3Aa-01- Cry2Ab controlam e / ou evitam Helicoverpa gelotopoeon por proteínas Vip3Aa expressas nessas próprias plantas. Portanto, como bem conhecido por aqueles versados na técnica, com base na ação tóxica das proteínas Vip3Aa para Helicoverpa gelotopoeon, as plantas transfectadas com a proteína Vip3Aa da presente invenção podem produzir pelo menos uma segunda proteína inseticida diferente da proteína Vip3Aa, como proteínas do tipo Cry.
[000171] Em conclusão, a aplicação da proteína inseticida da presente invenção controla a praga Helicoverpa gelotopoeon através da proteína Vip3Aa produzida nas plantas, que pode matar Helicoverpa gelotopoeon. Em comparação com o controle agrícola, controle químico, controle físico e controle biológico atualmente no estado da técnica, a presente invenção pode proteger toda a planta durante todo o período de crescimento em relação aos danos da Helicoverpa gelotopoeon, embora tenha as vantagens ainda de não poluição, nenhum resíduo, efeito estável e completo, simplicidade, conveniência e economia.
[000172] Finalmente, todos os exemplos acima meramente ilustram as soluções técnicas da presente invenção ao invés de serem limitativos. Embora a presente invenção tenha sido descrita detalhadamente com referência aos exemplos preferidos, aqueles versados na técnica devem entender que as soluções técnicas da presente invenção podem ser modificadas ou equivalentemente substituídas, embora ainda estejam dentro do espírito e escopo da presente invenção.

Claims (15)

1. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, caracterizado por compreender pelo menos o contato da praga Helicoverpa gelotopoeon com a proteína Vip3Aa, em que a sequência de aminoácidos da proteína Vip3Aa é como mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.
2. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína Vip3Aa existir em uma célula hospedeira que produz pelo menos a proteína Vip3Aa, e a praga Helicoverpa gelotopoeon pelo menos entrar em contato com a proteína Vip3Aa por ingestão da célula hospedeira.
3. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a proteína Vip3Aa existir em bactérias ou plantas transgênicas que produzem pelo menos a proteína Vip3Aa, a praga Helicoverpa gelotopoeon pelo menos entrar em contato com a proteína Vip3Aa por ingestão da bactéria ou de um tecido da planta transgênica, e o crescimento da praga Helicoverpa gelotopoeon ser inibido e / ou a praga Helicoverpa gelotopoeon morrer após o contato, de modo a alcançar o controle do ataque daHelicoverpa gelotopoeon à planta.
4. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoéon, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por os tecidos da planta transgênica serem raízes, folhas, caules, frutos, borlas, espigas, anteras ou filamentos, a planta ser soja, algodão, alfafa, girassol, grão de bico ou milho.
5. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a sequência de nucleotídeos da proteína Vip3Aa compreender a sequência de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8.
6. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoéon, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado por a planta também conter pelo menos uma segunda sequência de nucleotídeos diferente da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Vip3Aa.
7. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a planta também conter pelo menos uma segunda sequência de nucleotídeos diferente da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína Vip3Aa.
8. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoéon, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a segunda sequência de nucleotídeos codificar uma proteína inseticida do tipo Cry, uma proteína inseticida do tipo Vip, um inibidor de protease, uma lectina, α-amilase ou uma peroxidase.
9. Método para combate da praga de Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a segunda sequência de nucleotídeos codifica uma proteína inseticida do tipo Cry, uma proteína inseticida do tipo Vip, um inibidor de protease, uma lectina, α-amilase ou uma peroxidase.
10. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoéon, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por a segunda sequência de nucleotídeos codificar a proteína Cry1Ab ou proteína Cry2Ab.
11. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a sequência de aminoácidos da proteína Cry1Ab compreender a sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 9, ou a sequência de aminoácidos da proteína Cry2Ab compreende a sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 11.
12. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a sequência de nucleotídeos da proteína Cry1Ab compreender a sequência de nucleotídeos como mostrado na SEQ ID NO: 10, ou a sequência de nucleotídeos da proteína Cry2Ab compreender a sequência de nucleotídeos conforme mostrado na SEQ ID NO: 12.
13. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a segunda sequência de nucleotídeos ser um dsRNA que inibe um gene relacionado ao crescimento e ao desenvolvimento na praga de inseto alvo.
14. Método para combate da praga Helicoverpa gelotopoeon, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a segunda sequência de nucleotídeos ser um dsRNA que inibe um gene relacionado ao crescimento e ao desenvolvimento na praga de inseto alvo.
15. Uso da proteína Vip3Aa, caracterizado por ele se destinar a combater a praga Helicoverpa gelotopoeon.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111440814A (zh) * 2020-02-26 2020-07-24 中国农业科学院作物科学研究所 抗虫融合基因mCry1AbVip3A、其表达载体及应用
CN117396609A (zh) * 2022-05-11 2024-01-12 北京大北农生物技术有限公司 杀虫蛋白的用途
CN116948046B (zh) * 2023-09-21 2023-11-24 莱肯生物科技(海南)有限公司 人工智能辅助生成的杀虫蛋白及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR035799A1 (es) * 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
JP4132853B2 (ja) * 2002-02-07 2008-08-13 フマキラー株式会社 ハチ用食毒剤およびそれを用いたハチの駆除方法
MX2010011925A (es) * 2008-05-01 2010-11-30 Bayer Bioscience Nv Manejo en plantas transgenicas de la resistencia de la oruga militar tardia.
UA111592C2 (uk) * 2010-07-07 2016-05-25 Сінгента Партісіпейшнс Аг Спосіб контролю над твердокрилими комахами-шкідниками
CN103160449A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 河北农业大学 苏云金芽孢杆菌mb-15菌株及其可湿性粉剂的制备方法
CN102796183B (zh) * 2012-08-02 2013-12-18 北京大北农科技集团股份有限公司 杀虫蛋白质、其编码基因及用途
CN103039494A (zh) * 2012-12-05 2013-04-17 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
CN103719136A (zh) * 2013-11-15 2014-04-16 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
CN108611362B (zh) * 2018-03-30 2020-08-28 北京大北农生物技术有限公司 杀虫蛋白的用途
CN109679992B (zh) * 2019-01-31 2023-04-28 北京大北农生物技术有限公司 杀虫蛋白的用途

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