BR102013021499A2 - preparação de vírus flavivírus inativado essencialmente puro - Google Patents

Abstract

“preparaqao de virus flavivirus inativado es sencialmente puro”e aqui descrito um prooesso de formulaoao e puri?oaoao devirus para puri?car um ?avivirus representado por um dentre um virus dafebre amarela, virus da encefalite japonesa, virus da dengue, e 0 virus do ilo ocidental. o produto de virus ?avivims altamente puri?cado é caracterizado por ter um nivel baixo de sacarose sern perda signi?cativa de virus, tal como 0 que é normalmente encontrado por processos de puri?oagzao de virus da técnioa anterior. o processo desorito oaptura e puri?ca o virus,separando-o do dna e proteinas da célula hospedeira, e deixando dna e proteinas. da oélula hospedeira para tras. o processo também pode ser utilizado para inativar e/ou ooncentrar o virus de forma su?ciente para o uso em formulaooes.

Description

“PREPARAÇÃO DE VÍRUS FLAVIVÍRUS INATIVADO ESSENCIALMENTE PURO” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere geralmente a um método de purificação de produtos biológicos, tais como um vírus ou um vírus modificado, e um método de formulação do produto biológico, por exemplo, um vírus e adjuvante.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A fim de purificar o vírus, é necessário remover DNA e proteínas das células hospedeiras a partir da amostra de vírus. Infelizmente, os métodos atuais de! remoção de DNA e proteínas das células hospedeiras são acompanhados por perda de uma quantidade significativa de vírus. Tipicamente, para um flavivírus, a recuperação do vírus a partir de processos de filtração é geralmente de cerca de dez a vinte por cento e tipicamente menos do que 10 por cento. Após a purificação, outro problema é a agregação ou aglomeração das partículas de vírus purificado.

Os métodos da técnica anterior de purificação e concentração de um vírus, por exemplo, utilizam frequentemente a ultracentrifugação, em que a sacarose é necessária, a fim de executar o gradiente para a separação. Tal ultracentrifugação geralmente resulta na presença indesejável de sacarose na amostra de vírus final. A fim de obter uma amostra de vírus, que é livre de sacarose, a filtração de fluxo tangencial (TFF) é frequentemente usada para separar o vírus a partir de proteínas e outros compostos. No entanto, o uso de TFF para tal purificação tende a resultar em perda significativa de vírus.

Os métodos da técnica anterior de purificação e concentração de um vírus, por exemplo, utilizam frequentemente a ultracentrifugação, em que a sacarose é necessária, a fim de executar o gradiente para a separação. Tal ultracentrifugação geralmente resulta na presença indesejável de sacarose na amostra de vírus final. A fim de obter uma amostra de vírus, que é livre de sacarose, a filtração de fluxo tangencial (TFF) é frequentemente usada para separar o vírus a partir de proteínas e outros compostos. No entanto, o uso de TFF para tal purificação tende a resultar em perda significativa de vírus. Assim, os métodos utilizados atualmente de purificação do vírus têm sido acompanhados por problemas em curso, incluindo baixo rendimento ou perda de vírus, os níveis de proteína da célula hospedeira maiores do que altos níveis de sacarose desejáveis, e agregação das partículas de vírus purificado. Estes métodos também têm sido difíceis de usar em tecnologias de uso único ou descartáveis.

BREVE SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

De acordo com a presente invenção é provido um processo de purificação de vírus para a produção de produto de vírus altamente purificado não tendo sacarose residual sem perda significativa de vírus, tais como o que é normalmente encontrado por processos de purificação de vírus da técnica anterior. O processo descrito captura e purifica o vírus, separando-o do DNA e proteínas da célula hospedeira, e deixando o DNA e proteínas da célula hospedeira para trás. O processo também pode ser utilizado para inativar e/ou concentrar o vírus de modo suficiente para o uso em formulações.

Também aqui é descrito um processo de uma etapa para a produção de uma formulação em que as partículas de vírus concentrado não são agregadas ou aglomeradas. O processo descrito utiliza trocas de tampão e adjuvantes para processar o vírus, e resulta em. uma formulação final de vírus tamponado. Uma forma de realização do processo pode também ser utilizada para a formulação de outros produtos biológicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As formas de realização da invenção encontram-se adicionalmente descritas a seguir, com referência aos desenhos anexos, nos quais: A FIG. 1 é um cromatograma de processo para o Experimento Υ1626Α, uma forma de realização do novo processo a jusante aqui descrito que é usado para purificar e formular uma colheita de vírus YF modificado. A FIG. 2 é um cromatograma de processo para o Experimento Y1632A, uma forma de realização do novo processo a jusante aqui descrito que é usado para purificar e formular uma colheita de vírus YF modificado, comparando eluições utilizando sulfato de CELLUFINE® e CAPTO Core™ 700. A FIG. 3 é um cromatograma de processo para o Experimento Y1637A. A FIG. 4 é um cromatograma de processo para o Experimento Y1639A utilizando uma coluna de sulfato de CELLUFINE®. A FIG. 5 é um cromatograma processo para o Experimento Y163 9A usando coluna de CAPTO™ DeVirS. A FIG. 6 é um íluxograma de uma forma de realização do antigo processo de purificação a jusante e um íluxograma de urna forma de realização do novo processo de purificação a jusante. A FIG. 7 é um íluxograma para a forma de realização do antigo processo de purificação a jusante mostrada na FIG. 6 e um íluxograma de uma forma de realização do novo e melhorado processo de purificação a jusante.

A FIG. 8 é um fluxograma para outra forma de realização de um antigo processo de purificação a jusante e um fluxograma de uma forma de realização do novo e melhorado processo de purificação a jusante, No. 3. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS

Os inventores da presente matéria objeto verificaram agora um processo para a preparação de uma composição biológica altamente purificada, tal como, por exemplo, um vírus. O processo é particularmente útil para a purificação de um flavivírus, por exemplo, um vírus da Febre Amarela, vírus da Encefalite Japonesa, vírus da Dengue, e o vírus do Nilo Ocidental. Os exemplos aqui apresentados são para a purificação de um vírus da Febre Amarela, mas com não mais do que experimentação de rotina, podem ser usados para purificar os outros tipos de vírus. O processo descrito reduz significativamente a perda de partículas virais, em comparação com os métodos da técnica anterior para a obtenção de uma amostra altamente purificada de um produto biológico. A utilização de uma forma de realização do método descrito também reduz significativamente a quantidade de sacarose no produto final purificado em comparação com os métodos de purificação do estado da técnica. É descrito agora o desenvolvimento de um processo cromatográfico, resultando em material de vacina com níveis de contaminantes de célula hospedeira e DNA ou abaixo do nível de detecção, mantendo níveis elevados de recuperação do vírus. Aqui descrito é um processo de purificação a jusante da vacina de Febre Amarela (YF) destinado a inativar vírus da febre amarela vivo, o fragmento de DNA Vero, e remover quaisquer contaminantes de processo, tais como DNA e proteínas de células hospedeiras Vero residuais, BENZONASE® residual e beta-propiolactona (BPL). O vírus de YF pode ser cultivado em células Vero, colhido, inativado e purificado. Tipicamente, os métodos da técnica anterior para a purificação a jusante de um vírus proporciona uma recuperação do vírus de YF de apenas cerca de 20 por cento (%), e o produto final do vírus para a dosagem inclui uma quantidade relativamente elevada de proteína da célula hospedeira (HPC). Uma dose de vacina de YF típica para um ensaio clínico de fase 1 pode ser de cerca de 0,5 mililitros (ml) de vírus de YF em uma suspensão. A HCP restante em uma dose purificada por métodos da técnica anterior pode ser tipicamente cerca de quarenta e cinco mil nanogramas (45.000 ng/dose), em que a dose é de cerca de 8,3 loglO equivalentes virais (VE). VE é a unidade de Elisa para a YF.

Em contraste, o método descrito proporciona, para os testes de purificação de vírus de YF modificado executados até a data, uma recuperação de vírus a jusante de cerca de 30 por cento a cerca de 100 por cento, e para uma dose de cerca de 0,5 mililitros (ml) de vírus de YF, um nível de E1CP que está abaixo do limite de detecção do ensaio de HCP de células Vero utilizado comercialmente.

Para purificar o produto de vírus final reduzindo as proteínas da célula hospedeira, maximizando a recuperação de vírus, projetou-se e executou-se uma série de experimentos. O vírus da febre amarela modificado foi preparado a partir do vírus de YF atenuado 17D disponível comercialmente como a vacina, YF-VAX® (Sanofi Pasteur, Swiftwater PA). O vírus de YF atenuado 17D foi adaptado por passagem em série para replicar de forma mais eficiente em células Vero derivadas da W1 IO Vero 10-87 Cell Bank e passadas em meio isento de soro. 10 passagens em série foram utilizadas para modificar a sequência de nucleotídeos do genoma viral para desenvolver um vírus semente com um maior crescimento em células Vero para a preparação de um vírus de febre amarela inativado candidato. Ver PCT/US2010/043010, “High Yield Yellow Fever Virus Strain With Increased Propagation In Cells”, depositado em 23 de Julho de 2010 e publicado em 03 de fevereiro de 2011 como WO 2011/014416, e PCT/US2011/022347, depositado em 25 de Janeiro de 2011. Os ensinamentos inteiros dos pedidos PCT referenciados são aqui incorporados por referência.

As sementes de vírus mestre e de trabalho foram fabricadas a partir do meio de cultura celular condicionado colhido a partir de culturas estacionárias de células Vero preparadas a partir de Manufactures’ Working Cell bank (MWCB). Para a produção de vacina, a semente do vírus de trabalho foi utilizada para infectar células Vero preparadas a partir do MWCB cultivadas em microveículos CYTODEX™ 1 tanto em um biorreator de uso único de 50 litros (volume de trabalho de 25 a 40 L) quanto em um biorreator de vidro de 10 L (volume de trabalho de 8 L) (Xcellerex, Inc., Marlborough, MA). O vírus liberado no meio de cultura celular foi colhido a partir de cerca de 5 a cerca de 7 dias após a infecção. De cerca de 2 dias até cerca de 3 dias antes da colheita do vírus, a cultura foi realimentada com meio fresco. Esta etapa de realimentação demonstrou um aumento de rendimento de vírus. Ver PCT/US2010/043013, “Drain Down and Re-Feed of Microcarrier Bioreactor”, depositado em 23 de Julho de 2010 e publicado em 27 de Janeiro de 2011 como WO 2011/011660, os ensinamentos inteiros dos quais são aqui incorporados por referência.

Alguns dos nossos ensaios iniciais de desenvolvimento de um processo de purificação para o vírus estão esquematicamente representados no fluxograma do lado esquerdo de cada uma das FTG. 6 e FIG. 7, “Antigo Processo a Jusante”. Um conjunto de etapas foi: Clarificação de Colheita e Adição de BENZONASE®; Ultrafiltração e DiaFiltração (UF/DF); Inativação de BPL; coluna de purificação com Sulfato de CELLUFINE® (Chisso Corporation, Osalca JAPAN); Diluição de Eluído e Criação de Sublotes; Formulação com Alúmen, e Formulação de Produtos de Drogas de Vacina em volume.

Os estudos adicionais de desenvolvimento do processo foram iniciados, com as metas de redução de FICP Vero residual, aumentando a recuperação global de vírus, remoção de sacarose residual na amostra do vírus e minimização da agregação das partículas de vírus purificado. O resultado do trabalho de desenvolvimento foi um processo de purificação a jusante melhorado, cujo esquema geral é representado em no fluxograma no lado direito de cada uma das FIG. 6 e FIG. 7, “Novo Processo a Jusante”.

Em uma forma de realização da invenção, o Novo Processo a Jusante descrito no lado direito da FIG. 6, pode ter as seguintes etapas, cada uma representada por um retângulo na figura: A seguir à colheita do vírus, (1) Clarificação usando um filtro de profundidade, e ajuste do tampão. (2) Digestão com BENZONASE® e filtração de 0,2 mícron, produzindo grandes quantidades de vírus vivo. (3) Purificação usando Cromatografia com sulfato de CELLUFINE® e diluição para a etapa de inativação. (4) Inativação de vírus e filtração de 0,45 mícron. (5) Ultracentrifugação de Gradiente de sacarose. (6) Identificação de frações; Frações de pool; aquecimento de cerca de 25°C até cerca de 30°C, filtração de 0,2 mícron, formando substância de droga em massa, um vírus inativado purificado. (7) Formulação e Ligação de alúmen.

Em outra forma de realização da invenção, o novo e melhorado processo a j usante delineado no lado direito da FIG. 7 pode ter as etapas como no novo processo a jusante mostrado na FIG. 6, com as seguintes alterações. Pouco antes da etapa de inativação do vírus, há uma etapa de purificação utilizando GE CAPTO™ Core 7FT com um por cento (Albumina de Soro Humano) de EISA ou ri ISA e ajuste a 20 por cento de sacarose/0,0005 por cento de TWEEN™ -20. Em seguida, após a inativação do vírus, há um ajuste com um por cento de albumina humana ou albumina rhumana e filtração de 0,2 mícron para fornecer a substância de droga em massa que pode, então, ser formulada com alúmen, troca de tampão e estabilizantes.

Deve se notar que os dados de vírus determinados através do anticorpo monoclonal 2E10 são elevados quando ligado a alúmen. Embora não sendo limitados pela teoria, foi postulado que a partícula de vírus é disposta sobre a superfície do hidrogel de alúmen de modo que o epítopo pode ser apresentado de uma forma mais aberta. Outra hipótese é a de que as partículas são dispostas de uma maneira mais simétrica, impedindo assim a formação de agregados, que poderíam mascarar exposição do epítopo.

Estes experimentos indicam que a recuperação do vírus intacto pode ser de alguma forma dependente da presença de uma pequena quantidade de proteína “chaperon”. Foi verificado, inesperadamente, que o aumento da temperatura do pool purificado do gradiente pós-sacarose antes da filtração resulta em recuperação significativamente maior de vírus antes da ligação de alúmen, resultando assim em um aumento da recuperação de vírus. Este efeito da temperatura pode ser dependente da presença da proteína “chaperon” a uma concentração suficiente.

Colheita vírus e Tratamento com BENZONASE® O meio de cultura de células condicionado contendo o vírus foi removido a partir do biorreator e clarificado por filtração em profundidade. Um filtro de profundidade Millipore DE50 foi usado para clarificar a colheita de vírus. O filtro de profundidade foi lavado duas vezes, uma vez com H20 purificada com USP seguido por tampão com a formulação alvo Tris a 20 mM, NaCl a 145 mM, pH 8. O material de colheita foi passado através do filtro de profundidade a uma vazão de aproximadamente 500 ml/min. e a uma pressão não superior a 172,37 kPa. O material filtrado foi coletado em uma bolsa de uso único de bioprocesso. O filtro de profundidade foi gravado com o mesmo tampão e o volume de gravação foi combinado com o filtrado original. Após filtração em profundidade, o material foi ajustado para uma formulação alvo de Tris a 50 mM, pH 8 e MgCfi a 2 mM, em preparação para a subsequente etapa de tratamento com BENZONASE®. A colheita clarificada ajustada foi misturada durante cerca de 10 min. à temperatura ambiente. O intermediário de vírus clarificado ajustado foi tratado com BENZONASE® a fim de fragmentar DNA de células Vero. BENZONASE® foi adicionada ao vírus clarificado ajustado a uma concentração alvo final de 3 unidades/mL, e a suspensão foi misturada durante 16 a 18 horas à temperatura ambiente. Após o tratamento com BENZONASE® o pool de produto era de 0,5 pm de filtrado.

Sulfato de CELLUFINE® O vírus foi adicionalmente purificado e concentrado por . cromatografia de sulfato de CELLUFINE®. O sulfato de CELLUFINE® (Chisso, Tóquio, Japão), é uma resina de afinidade com vírus projetada para concentrar, purificar e despirogenar vírus. Esta etapa do processo reduz significativamente as proteínas de células Vero, endotoxinas e DNA de células Vero. Ο 2E10 ELISA que detecta um epítopo de envelope viral de YF é utilizada para medir a concentração de vírus em uma amostra do vírus vivo tratado com BENZONASE® e clarificado para assegurar a coluna é de tamanho adequado para processar um desafio de massa de vírus não superior a 5-6E + 09 VE per/ml de resina de sulfato de CELLUFINE®, Antes de carregar o material de vírus vivo, a coluna foi carregada com tampão de NaOH a 0,1 M/NaCl a 0,5 M a uma vazão linear aproximada de 200 cm/h. A coluna foi então equilibrada com tampão de equilíbrio, Tris a 10 mM, NaCl a 145 mM, pi I 7,5 a urna vazão linear aproximada de 200 cm/h. Após equilíbrio, o volume apropriado do vírus foi carregado na coluna a uma vazão linear aproximada de 200 cm/h.

Após a carga, a coluna foi lavada com tampão de Tris a 10 mM, NaCl a 145 mM, pIT 7,5 a uma vazão linear aproximada de 200 cm/h. O vírus ligado foi eluído a partir da coluna utilizando tampão de Tris a 10 mM, NaCl a 1,5 M, pH 7,5, a uma vazão linear reduzida de aproximadamente 100 cm/h. A diminuição da vazão de eluição aumenta o tempo de residência de tampão e, portanto, diminui o volume de eluição. O pool de eluição foi imediatamente diluído 2 vezes (1 parte de eluído para 1 parte de tampão de diluição) com tampão de HEPES a 62,5 mM, pH 8 (formulação alvo) para reduzir a precipitação do vírus. Após a eluição, a resina foi limpa com NaOH a 0,1 N/NaCl a 0,5 M a uma vazão linear aproximada de 200 cm/h. A coluna foi armazenada em NaOH a 0,1 N/NaCl a 0,5 M à temperatura ambiente. GE CAPTO™ Core 700 O pool de eluição de sulfato de CELLUFINE® diluído 2 vezes foi então carregado em uma coluna de CAPTO™ Core 700. Antes da carga, a coluna foi regenerada com NaOH a 0,1 N/NaCl a 0,5 M a uma vazão linear de 300 cm/h. Um volume de coluna de um tampão de reequilíbrio de Tris a 500 mM/NaCl a 145 mM, pEl 7,5 foi aplicado antes do tampão de equilíbrio constituído por MES a 20 mM/NaCl a 100 mM, pH 7, a uma vazão linear de 300 cm/h.

Após a carga, a coluna foi lavada com MES a 20 mM/NaCl a 100 mM, pH 7, a uma vazão linear de 300 cm/h, O fluxo que atravessa e lava foi coletado como produto. Esta fração foi então diluída 2 vezes com HEPES a 50 mM /20 % de Sacarose/0,001 % de TWEEN™ - 20, pH 8. A resina foi limpa com NaOH a ΙΝ/NaCl a 1M a uma vazão linear de 300 cm/h. A coluna foi armazenada em NaOH a Ο,ΓΝ/NaCl a 0,5M à temperatura ambiente. Inativação de β-PL

Uma solução a 10% de BPL foi preparada por diluição de BPL com água para injeção (WF1). O BPL a 10% foi armazenado em alíquotas de uso único a < -60°C. A concentração de BPL nesta solução a 10% foi confirmada por análise de cromatografia gasosa (GC). A albumina do soro humano (HSA) foi adicionada à amostra para ajustar a concentração para lmg/ml de HSA. Uma quantidade suficiente de 10% de BPL foi descongelada e adicionada durante a mistura ao pool de vírus vivo para trazer a concentração de BPL a cerca de 0,1% (v/v) de BPL. A mistura de inativação foi misturada durante cerca de 3 horas à temperatura ambiente em uma placa de agitação de baixa geração de calor. Este material foi então incubado a 30°C durante 60 minutos, e filtrado utilizando um filtro PES de 0,2 μιη.

Formulação e Ligação de alúmen 0,2 pm de vírus inativado purificado filtrado foi ligado a “alúmen” [hidróxido de alumínio hidróxido de alumínio (ALHYDROGEL® de Alúmen)] e tampão trocado para o tampão de formulação final. Todas as etapas do processo foram realizadas assepticamente.

Uma parte de 2% de alúmen foi adicionada para 9 partes de 0,2 pm de vírus inativado purificado em gradiente de sacarose filtrado para atingir uma concentração alvo de alúmen final de 0,2 %. Referência é feita ao produto resultante como o pool de vírus ligado ao alúmen original. O pool foi misturado para um alvo de 1 - 4 horas à temperatura ambiente. O vírus ligado ao alúmen foi trocado em tampão assepticamente em Tris a 10 mM/MgCL a 1,2 mM/ácido L-glutâmico a 10 mM/D-manitol a 0,11 mM/di-hidrato de trimetilamina-N-óxido a 2mM, pi I 7,5. O vírus ligado ao alúmen foi sedimentado por centrifugação ou filtração por membranas. Após a sedimentação, o sobrenadante foi decantado. O grânulo de vírus ligado ao alúmen foi resuspenso com tampão de formulação para um volume igual ao volume do pool de vírus ligado ao alúmen original e misturado para um alvo de 10 minutos a temperatura ambiente. Este processo foi repetido de 3 a 4 vezes até que o pool de vírus ligado ao alúmen foi trocado para o tampão da formulação final. O vírus ligado ao alúmen e trocado em tampão foi armazenado a 2 - 8°C. Isto é referido aqui como o “produto de droga em massa”. A potência do produto de droga em massa foi medida utilizando ELISA que detecta YF ligado ao alúmen.

Cromatogramas para recuperação de processo para os 1 Experimentos Y1626A, Y1632A e Y1637A são mostrados na FIG. 1 a FIG. 4, respectivamente.

Um cromatograma para recuperação de processo para o Experimento 163 9A utilizando uma coluna de sulfato de CELLUFINE® é mostrado na FIG. 4 e para o Experimento 1639A utilizando uma coluna CAPTO™ DeVirS na FIG. 5.

Duas outras formas de realização do processo descrito são mostradas na FIG. 8, “Novo e melhorado processo a jusante # 3”.

Deve se notar que os experimentos foram executados usando materiais congelados/descongelados e que não havia nenhum material nãoGMP restante. Recomenda-se o uso de material de GMP armazenado para desenvolvimento adicional do processo descrito. No entanto, os resultados experimentais obtidos com o material não GMP demonstram que o processo descrito reduz significativamente os níveis de HCP e DNA. O processo de purificação cromatográfica descrito proporcionou recuperação de vírus suficiente e reduziu os níveis de proteína da célula hospedeira para abaixo do limite de detecção do ensaio de HCP de célula Vero comercial. Estes resultados de HCP e recuperações de vírus eram comparáveis aos resultados obtidos por um processo de purificação semelhante utilizando ultracentrifugação de gradiente de sacarose. Uma vantagem do processo descrito é que, ao contrário dos métodos de centrifugação, ele é adequado para uso em sistemas de uso único. A próxima fase do desenvolvimento de purificação de Febre Amarela é substituir a resina de Sulfato de Chisso CELLUFINE® com uma resina de GE Healthcare equivalente. A resina de sulfato de CELLUFINE® pode, potencialmente, ser substituída por resina de CAPTO™ DeVirS da GE Healthcare. O CAPTO™ DeVirS é parte de programa de Media Designed Custom da GE Healthcare, e é uma resina de cromatografia por afinidade com o sulfato de dextrano de ligando, que é conhecido por ter um comportamento do tipo por afinidade aos diferentes tipos de vírus. CAPTO™ DeVirS oferece certo número de vantagens para a purificação do vírus, incluindo, por exemplo, uma produtividade excelente, boa estabilidade química e comportamento do tipo por afinidade para vários vírus.

Os próximos experimentos planejados incluem seguir o uso de CAPTO™ DeVirS com GE CAPTO™ Core 700. Também será investigada a utilização de uma membrana de troca aniônica tal como um monólito Q (BIA), ou uma membrana Q (Natrix, Pall, Sartorius) entre a etapa utilizando CAPTO™ DeVirS e a etapa utilizando GE CAPTO™ Core 700. EQUIVALENTES

Características, totalidade, traços, compostos, porções ou grupos químicos descritos em conjunto com um aspecto particular, forma de realização ou exemplo da invenção são para ser entendidos para ser aplicáveis a qualquer outro aspecto, forma de realização ou exemplo aqui descrito, a menos que incompatível com a mesma. Todas as características descritas neste relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações anexas, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo assim descrito, podem ser combinados em qualquer combinação, exceto combinações onde pelo menos algumas de tais características e/ou etapas sejam mutuamente exclusivas. A invenção não está restringida aos detalhes de quaisquer formas de realização precedentes. A invenção se estende a qualquer nova característica, ou qualquer combinação nova, das características descritas neste relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações anexas, resumo e desenhos), ou a qualquer etapa nova, ou qualquer combinação nova, das etapas de qualquer método ou processo assim descrito.

REIVINDICAÇÃO

Claims (2)

1.

Preparação de vírus flavivírus inativado essencialmente puro, caracterizada pelo fato de que é purificada pelo processo que compreende: a. obter uma composição adequada para a purificação da cultura de células infectadas com vírus; b. clarificar a composição obtida na etapa “a”, removendo as células e detritos de células a partir da referida composição por filtração em profundidade; c. submeter o filtrado na etapa “b” à digestão com Benzonase e filtração a 0,2 mícron suficiente para fragmentar o DNA de célula Vero seguido por filtração; d. purificar o filtrado obtido na etapa “c” por meio de cromatografia em sulfato de CELLUFINE® para alcançar despirogenação do referido vírus no referido filtrado; e. estabilizar e inativar o produto viral obtido na etapa “d”, com uma quantidade de inativação de β-PL,. f. formular o produto obtido na etapa ligado a alúmen.