BR102012033542A2

BR102012033542A2 - Moléculas variantes sintéticos de toxinas cry1ia12 com propriedades de controlar insetos-praga, composições contendo tais mutantes e método de utilização dos mesmos

Info

Publication number: BR102012033542A2
Application number: BR102012033542-5A
Authority: BR
Inventors: Maria Fatima Grossi De Sa; Maria Cristina Mattar Da Silva; Jose Edilson Junior Gomes; Isabela Tristan Lourenco; Leonardo Lima Pepino De Macedo; Wagner Alexandre Lucena; Fernando Campos De Assis Fonseca
Original assignee: Embrapa Pesquisa Agropecuaria; Univ Brasilia Fudacao; Univ Catolica De Brasilia
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-08-19
Also published as: WO2014100880A3; WO2014100880A2; BR102012033542B1; AR094338A1

Abstract

MOLÉCULAS VARIANTES SINTÉTICOS DE TOXINAS CRY1IA12 COM PROPRIEDADES DE CONTROLAR INSETOS-PRAGA, COMPOSIÇÕES CONTENDO TAIS MUTANTES E MÉTODO DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga, utilizando métodos e composições que compreendem análogos mutantes de <sym>-endotoxinas. Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo disponibilizar moléculas novas a partir do gene Cry1Ia12 com toxicidade melhorada para tornar as plantas de cana-de-açúcar resistentes à broca gigante da cana-de-açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica; disponibilizar <sym>-endotoxinas melhoradas por processos biotecnológicos; auxiliar para a redução das doses de aplicação de defensivos químicos com redução de custos sociais e ambientais e aumento da produtividade da cultura.São aspectos da invenção, construções gênicas contendo as moléculas de ácido nucleico, codificantes para Cry1Ia12 modificado, métodos para a expressão heteróloga das novas moléculas na forma ativa, bem como o uso das mesmas no controle de insetos-praga. A invenção também fornece genes análogos sintéticos os quais são otimizados para transformação e expressão dos mesmos em plantas.

Description

Relatório de Patente de Invenção: “MOLÉCULAS VARIANTES SINTÉTICAS DE TOXINAS CRYIIA12 COM PROPRIEDADES DE CONTROLAR INSETOSPRAGA, COMPOSIÇÕES CONTENDO TAIS MUTANTES E MÉTODO DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS”.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga, utilizando métodos e composições que compreendem análogos mutantes de δ-endotoxinas. Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo disponibilizar moléculas novas a partir do gene Cry IIal 2 com toxicidade melhorada para tornar as plantas de cana-de10 açúcar resistentes à broca gigante da cana-de-açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica; disponibilizar δendotoxinas melhoradas por processos biotecnológicos; auxiliar para a redução das doses de aplicação de defensivos químicos com redução de custos sociais e ambientais e aumento da produtividade da cultura.

São também aspectos da invenção, construções gênicas contendo as moléculas de

ácido nucléico, codifícantes para CrylIal2 modificado, métodos para a expressão heteróloga das novas moléculas na forma ativa, bem como o uso das mesmas no controle de insetos-praga. A invenção também fornece genes análogos sintéticos os quais são otimizados para transformação e expressão dos mesmos em plantas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A importância da cultura da cana-de-açúcar vem aumentando ao longo dos anos, uma vez que, além de ser utilizada para a produção de açúcar, alimentação animal, energia e fertilizantes, também se apresenta como uma fonte para a produção de combustíveis renováveis, possuindo rápido crescimento e alta produção de energia por 25 hectare (Hartemink, AE (2008) Sugarcane for Bioethanol: Soil and Environmental lssues. Advances in Agronomy. 99: 125-182). Para produzir biomassa em atendimento à necessidade energética da humanidade sem competir com a produção de alimentos, deve-se priorizar a produção de plantas fibrosas em vez de amiláceas e oleaginosas (Sticklen, MB (2008) Plant genetic engineering for biofuel production: towards 30 affordable cellulosic ethanol. Nature Reviews. 9: 433-443). Nesse contexto, plantas fibrosas, como a cultura da cana-de-açúcar, apresentam vantagens, como (i) plantas de alta eficiência energética, (ii) crescimento perene e dossel de longa duração para permitir a colheita durante a maior parte do ano, (iii) possibilidade de aplicação de tecnologia agrícola de produção em grande escala, (iv) serem de fácil e eficiente 5 transformação em formas utilizáveis de energia e (v) de possuírem exploração sustentável econômica e ambientalmente (Matsuoka, S, Bressiani, J, Maccheroni, W, Fouto, I (2010) Bioenergia da Cana. In: Cana-de-açúcar: bioenergia, açúcar e álcool tecnologias e perspectivas. Santos, F, Borém, A, Caldas, C (eds.), 487-517, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG).

Neste sentido o Brasil ocupa posição destacada na produção mundial de etanol a

partir da cana-de-açúcar. De acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB

2011 ,http://www.conab.gov.br/01alaCMS/uploads/arquivos/! l_01_06_09_14_50_bolet im_cana_3o_lev_safra_2010_201 l..pdf, acessado em Fevereiro/2012), a previsão do total de cana-de-açúcar a ser moída na safra 2011/2012 é de 571,5 milhões de toneladas em uma área total de aproximadamente oito milhões de hectares. Destes, 47,3% serão destinados à produção de açúcar enquanto que 52,7% à produção de etanol, o que permitirá produzir 22,8 bilhões de litros de álcool. Esses valores colocam o Brasil em primeiro lugar entre os maiores produtores de cana-de-açúcar, seguido por índia, Tailândia e China (USDA (2010) Sugar: World Production, Supply and Distribution). Os principais fatores que permitiram ao país chegar a esse patamar foram a disponibilidade de terras agricultáveis, um custo total de produção reduzido, a larga experiência nacional, a grande demanda por açúcar e o aumento da necessidade de utilização de fontes de energias limpas e renováveis (Goldemberg, J (2007) Ethanol for a Sustainable Energy Future. Science. 315: 808-810). Para aumentar a competitividade do etanol brasileiro no mercado internacional, serão necessários maiores investimentos em infraestrutura, construção de dutos para diminuir custos de transporte, formação de estoques reguladores e aumento no rendimento das plantas (BNDES (2008) Bioetanol de cana-de-açúcar: energia para o desenvolvimento sustentável, 316, Rio de JaneiroRJ). Os fatores abióticos, como os estresses hídrico e salino, e fatores abióticos, como vírus, fungos, nematóides e insetos-praga, sendo esse último de destacada importância, interferem no rendimento das plantas. Neste contexto, aproximadamente 85 espécies de insetos estão identificadas como causadoras de danos a lavoura canavieira no Brasil, diminuindo a sua produtividade e/ou a qualidade do produto. Dentre estas, algumas são consideradas pragas importantes, em alguns casos com abrangência nacional e em outros, regional (Macedo, 5 N, Macedo, D, Campos, MBS, Novaretti, WRT, Ferraz, LCCB (2010) Manejo de Pragas e Nematóides. In: Cana-de-açúcar: bioenergia, açúcar e álcool - tecnologias e perspectivas. Santos, F, Borém, A, Caldas, C (eds.) 119-159, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG).

No cenário brasileiro, um dos principais insetos-praga causadores de danos é a broca gigante da cana-de-açúcar, Telchin licus licus (Drury 1773; Lepidoptera: Castniidae), um inseto lepidóptero que, no final da fase larval, atinge até 90 mm, apresentando controle bastante difícil devido a inacessibilidade às lagartas que ficam no interior do colmo. As lagartas, quando atacam as plantas de cana-de-açúcar novas, causam os conhecidos “corações-mortos”. Em plantas adultas, ocorre perda de peso, brotação lateral, quebra e atrofiamento de entrenós. A penetração de fungos (Fusarium moniliforme e/ou Colletotrichum falcatum) nas galerias abertas pelas brocas, muito comum após o ataque das lagartas, ocasiona, por sua vez, a podridão vermelha, que determina a inversão da sacarose, diminuição da pureza do caldo, aumento de gomas e contaminantes, reduzindo o rendimento industrial da cana-de-açúcar (Planalsucar (1977) Guia das principais pragas da cana-de-açúcar no Brasil, Piracicaba-SP).

A broca gigante da cana-de-açúcar predomina na região Nordeste, especialmente nos estados de Alagoas, Pernambuco, Paraíba e Rio Grande do Norte (Mendonça, AF, Viveiros, AJA, Sampaio, FF (1996) A broca gigante da cana-de-açúcar, Castnia licus Drury, 1770 (Lep. Castniidae). Pragas da cana-de-açúcar, 133-167, Insetos, Cia. 25 Maceió). Este inseto-praga causa, anualmente, prejuízos na ordem de 35 milhões na região Nordeste e, projeta-se, até 400 milhões de reais, por safra, na região Sudeste (Almeida, LC, Dias Filho, MM, Arrigoni, EB (2007) First ocurrence of Telchin licus (Drury, 1773), the “giant sugarcane borer” in the state of São Paulo, Brazil. Revista de Agricultura (Piracicaba). 82: 223-225). Estes dados são alarmantes e requerem medidas 30 para evitar uma perda de competitividade do setor sucroalcooleiro nacional. E uma medida preventiva, seria tornar a cana-de-açúcar resistente a insetos-praga, através de transformação genética com genes de interesse ou por melhoramento genético clássico. A modificação genética da cana-de-açúcar pode ser uma ferramenta poderosa por introduzir características como resistência a patógenos e a doenças em variedades comerciais de cana-de-açúcar, aumentar seu desempenho agronômico e obtenção de açúcar (Borém, A, Silva, JÁ, Diola, V (2010) Biologia Molecular e Biotecnologia. In: 5 Cana-de-açúcar: bioenergia, açúcar e álcool - tecnologias e perspectivas. Santos, F, Borém, A, Caldas, C (eds.) 333-353, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG).

Diante do exposto neste documento, a presente invenção tem como objetivo tornar as plantas de cana-de-açúcar resistentes à broca gigante da cana-de-açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica, δ-endotoxinas originais e melhoradas por processos biotecnológicos, sanando e/ou minimizando o problema do uso abusivo de inseticidas químicos e suas conseqüências. As toxinas Cry são descritas como candidatas no controle de insetos-praga (Carlini, CR, Grossi-de-Sa, MF (2002) Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon. 40: 1515-1539; Christou, P, Capell, T, Kohli, A, Gatehouse, JA, Gatehouse, AMR (2006) Recent developments and future prospects in insect pest control in transgenic crops. TRENDS in Plant Science. 11, 302- 308). São amplamente descritas na literatura (Hõfte, H, Whiteley, HR (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiological Reviews. 53: 242-255; Schnepf, HE, Crickmore, N, Van Rie, J, Lereclus, D, Baum, JR, Feitelson, J, Zeigler, DR, Dean, DH (1998) Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62: 775-806; Bravo, A, Soberón, M (2008) How to cope with resistance to Bt toxins? TRENDS in Biotechnology. 26: 573- 579) e especialmente interessantes devido à sua especificidade e por serem inócuas a vertebrados e insetos não alvos. O efeito de culturas Bt em macroorganismos tem sido estudado em experimentos de laboratório e de campo, indicando que as toxinas Cry não são tóxicas a esses organismos (Liu, B, Wang, L, Zeng, Q, Meng, J, Hu, WJ, Li, XG, Zhou, KX, Xu, K, Liu, DD, Zheng, YP (2009) Assessing eflects of transgenic CrylAc cotton on the earthworm Eisenia fetida. Soil Biology & Biochemistry. 41: 1841-1846; Bai, YY, Yan, RH, Ye, GY, Huang, FN, Cheng, JA (2010) Effects of transgenic rice expressing Bacillus thuringiensis CrylAb protein on ground-dwelling collembolan community in postharvest seasons. Environmental Entomology. 39: 243-251). Paralelamente, à importância agronômica da cultura da cana-de-açúcar e dos insetos-praga, tais como a broca gigante da cana-de-açúcar, avanços nas técnicas de biologia molecular e nas técnicas aplicadas na área de biotecnologia permitiram que a recombinação gênica fosse empregada em experimentos de evolução molecular in vitro 5 para o desenvolvimento de novas seqüências de DNA e moléculas de proteínas (Peng, W, Levine, H, Hwa, T, Kessler, DA (2004) Analytical study of the effect of recombination on evolution via DNA shuffling. Physical Review E. 69: 051911). E dentre as técnicas, o embaralhamento de DNA tem sido utilizado para diversos fins, com objetivo de se obter moléculas com características desejadas, como a melhoria da 10 cinética enzimática, geração de novas especificidades para determinados substratos, formação de novos produtos ou modificação de enzimas para desempenho ótimo em ambientes específicos (Lassner, M, Bedbrook, J (2001) Directed molecular evolution in plant improvement. Current Opinion in Plant Biology. 4: 152-156).

A técnica de Embaralhamento de ADN consiste em uma evolução molecular dirigida, a qual gera mudanças pontuais na estrutura primária das moléculas de ADN por meio de mutações randômicas (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005; Stemmer, W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro By Embaralhamento de ADN. Nature. London, Vol. 370, p. 389 - 391, 1994, US5605793, US5811238, US5830721). Os genes de interesse são primeiramente fragmentados de forma aleatória em pequenas seqüências de 50-300 pares de base, sendo este produto recombinado em uma reação de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), a qual é conduzida sem adição de oligonucleotídeos. Em uma segunda reação consecutiva, são adicionados os produtos da primeira reação e oligonucleotídeos específicos. Permitindo, desta forma, a amplificação de uma população de genes análogos mutantes/ variantes (Stemmer, W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro by Embaralhamento de ADN. Nature. London, Vol. 370, p. 389 - 391, 1994; Zhao, H. and Arnold, F.H. Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., Vol. 94, p. 7997 8000, 1997).

A eficiência da técnica para produzir moléculas análogas de maior atividade biológica pôde ser comprovada em diversos trabalhos como, por exemplo, em Jager et al (Jager, S. A. W., Jekel, P. A. and Janssen, D. B. Hybrid penicillin acylases with improved properties for synthesis of β-lactam antibiotics. Enzyme And Mierobial Technology, Vol. 40, p. 1335 - 1344, 2007), onde a atividade enzimática da penicilina aciclase aumentou em 90%. A técnica pode utilizar um único ou mais genes homólogos 5 e seu sucesso dependente de um delicado arranjo entre o tamanho da biblioteca, a diversidade biológica originada e de uma metodologia de seleção das variantes com a característica desejada (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratorydirected protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 -392, 2005).

Um exemplo de sucesso na aplicação dessa técnica inclui a toxicidade adquirida

da toxina quimérica CrylBa/CrylDb contra Epiphyas postvittana (Knight, JS, Broadwell, AH, Grant, WN, Shoemaker, CB (2004) A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. Journal of Economic Entomology. 97: 1805-1813). Em outro estudo, uma variação da técnica de DNA shuflling resultou no 15 SPOP (“Shuffled Proteins on Phages”) que consiste de ciclos consecutivos de embaralhamento de DNA, seguido de Phage display e seleção funcional (Stoop, AA, Jespers, L, Eldering, E, Pannekoek, H (2000) High-density mutagenesis by combined DNA shuffling and Phage display to assign essencial amino acid residues in proteinprotein interactions: application to study structure-function of plasminogen activation 20 inhibitor 1 (PAI-I). Journal of Molecular Biology. 301: 1135-1147).

A técnica de Phage display envolve a expressão de proteínas ou peptídeos na superfície de fagos filamentosos, sendo apresentadas como um produto de fusão a uma das proteínas da capa protéica de um bacteriófago (Willats, WGT (2002) Phage display: practilities and prospects. Plant Molecular Biology. 50: 837-854).

Essa técnica constitui uma das opções para a seleção de proteínas ou peptídeos

recombinantes, apresentando êxito para selecionar peptídeos ou proteínas com propriedades específicas de ligação (Smith, GP (1985) Filamentous fusion phage-novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228: 1315-1317) e alterar a afinidade de proteínas por seus ligantes (Neri, D, Petrul, H, 30 Roncucci, G (1995) Engineering recombinant antibodies for immunotherapy. Cell Biophysics. 27: 47-61). Vários tipos de fagos já foram utilizados na seleção de proteínas Cry: a toxina CrylAc foi íusionada na proteína D do capsídeo do fago lambda, (Fernández, LE, Gómez, I, Pacheco, S, Arenas, I, Gill, SS, Bravo, A, Soberón, M (2008) Employing phage display to study the mode of action of Bacillus thuringiensis Cry toxins. Peptides. 29: 324-329).

Diante isso, a presente invenção tem como objetivo solucionar o problema do uso abusivo de inseticidas químicos, bem como aumentar a resistência de plantas, gerando plantas transgênicas, as quais sejam capazes de expressar genes que codificam para moléculas com alta atividade para análogos mutantes de δ-endotoxinas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga, utilizando 10 métodos e composições que compreendem análogos mutantes de δ-endotoxinas. Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo disponibilizar moléculas novas a partir do gene Cryl Ial 2 com toxicidade melhorada para tomar as plantas de cana-deaçúcar resistentes à broca gigante da cana-de-açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica; disponibilizar δ15 endotoxinas melhoradas por processos biotecnológicos; auxiliar para a redução das doses de aplicação de defensivos químicos com redução de custos sociais e ambientais e aumento da produtividade da cultura.

Uma concretização da presente invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico variantes sintéticas de toxinas CryIIal2 caracterizadas por compreender:

a) seqüências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID

NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;

b) complementos das seqüências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3,

SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;

c) complementos reversos das seqüências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;

d) seqüências reversas das seqüências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO

3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6.

Uma segunda concretização da presente invenção diz respeito a uma construção gênica contendo a molécula isolada de ácido nucleico. Uma terceira concretização da presente invenção diz respeito a um vetor binário caracterizado por conter uma construção gênica. Mais especificamente a presente invenção diz respeito a um vetor binário caracterizado por compreender:

a. um promotor opcionalmente ligado a uma seqüência líder e operacionalmente ligado a

b. seqüência selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6 operacionalmente ligada a

c. um sinal de terminação;

d. uma origem de replicação;

e. um marcador seletivo; e

f. um sítio de clonagem.

Uma quarta concretização da presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados, caracterizados por compreender seqüências substancialmente similares a qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 7- 12.

Uma quinta concretização da presente invenção diz respeito a uma célula transformada caracterizada pelo fato de conter uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção; ou um polipeptídeo da presente invenção.

Uma sexta concretização da presente invenção diz respeito a uma planta, ou uma

parte, ou um propágulo ou progênie da mesma caracterizada por compreender uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção; ou um polipeptídeo da presente invenção.

Uma sétima concretização da presente invenção diz respeito a um microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender uma

construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção; ou um polipeptídeo da presente invenção.

Uma oitava concretização da presente invenção diz respeito a um método para produzir um organismo geneticamente modificado caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com uma construção gênica ou um vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção;

b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;

c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de

células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);

d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo a construção gênica ou vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção.

Uma nona concretização da presente invenção diz respeito a um método para

produção de proteína recombinante caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com um vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção;

b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;

c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);

d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo vetor vetor binário contendo as moléculas de

ácido nucleico da presente invenção;

e. Fazer a extração da proteína recombinante produzida nos organismos selecionados na etapa (d).

Uma décima concretização da presente invenção diz respeito a uma proteína recombinante obtida através do método descrito na presente invenção.

Uma décima primeira concretização da presente invenção diz respeito a uma

composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender uma concentração eficaz do polipeptídeo isolado ou análogo mutante, em um veículo carreador agronomicamente aceitável.

Uma décima segunda concretização da presente invenção diz respeito a um

método para o controle de uma praga caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente; b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou com uma composição da invenção, em que a referida proteína consiste das seqüências selecionadas do grupo de seqüências de aminoácidos descritas em SEQ ID N0 7-12.

Uma décima terceira concretização da presente invenção diz respeito a um método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica ou um vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção;

b) regenerar linhagens transgênicas contendo a referida construção estavelmente integrada em seus genomas;

c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de expressão da δendotoxina da invenção.

BREVE DESCRICÂO DAS FIGURAS

Figura I. Eletroforese em gel de agarose 0,8%, mostrando o produto da reação do DNA shuffling para os genes cryl Aa e cryllal2. (A) Marcador de pesos moleculares - I Kb Plus Ladder, (B) controle positivo, (C) população de genes cryllal2 recombinados após o DNA shuffling.

Figura 2. Análise de mortalidade das larvas de T. 1. licus causadas pelas variantes da toxina CrylIal2 em bioensaios utilizando dieta artificial. Controle negativo, somente 20 dieta líquida artificial, CryIIa 12 selvagem, proteína original expressa em E. coli, Variantes I, II, III, IV e V, variantes da toxina CrylIal2 expressas em E. coli. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan no nível de 5% de significância.

Figuras 3a e 3b. Alinhamento das seqüências de resíduos de aminoácidos da toxina Cryl Ial2 selvagem e suas variantes geradas por embaralhamento de DNA (DNA shuffling), onde foram indicadas as alterações dos resíduos comparando-se com a toxina selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção descreve novas moléculas de δ-endotoxinas e métodos, os quais possibilitam a geração de tecnologias capazes de controlar insetos-praga de grande interesse econômico. Mais especificamente, os ácidos nucleicos (genes) da presente invenção, incluindo fragmentos e variantes dos mesmos, compreendem seqüências 5 nucleotídicas selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO I, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6, as quais codificam proteínas δ-endotoxinas substancialmente similares às seqüências identificadas como SEQ ID Nos 7-11. As proteínas δ-endotoxinas descritas são preferencialmente biologicamente ativas contra o inseto-praga pertencente à ordem Lepdóptera: a broca 10 gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus).

A invenção envolve uma estratégia para auxiliar no controle da praga, envolvendo as etapas de produção e seleção de genes novos para serem inseridos em plantas via transgenia, a fim de torná-las resistente a praga alvo. A produção envolve a recombinação e geração de novas moléculas e diz respeito ao produto da aplicação da 15 técnica de DNA shuffling. A seleção diz respeito à aplicação da técnica de Phage display - resulta em escolha de genes de acordo com uma característica desejada. As técnicas utilizadas para produção e seleção de genes novos já estão bem descritas no estado da técnica.

Além das seqüências nucleotídicas, a presente invenção também descreve uma construção gênica e um vetor binário compreendendo as seqüências gênicas codificadoras de proteínas com alta atividade δ-endotoxinas. O vetor binário é ainda caracterizado por compreender:

a. um promotor opcionalmente ligado a uma seqüência líder e operacionalmente ligado a b. seqüência selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO I, SEQ

ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6 operacionalmente ligada a;

c. um sinal de terminação;

d. uma origem de replicação;

e. um marcador seletivo; e

f. um sítio de clonagem A presente invenção provê ainda uma célula, planta, microorganismos contendo as moléculas de ácido nucleico e/ou peptídeo da presente invenção.

A presente invenção provê novas técnicas, as quais não dependem do uso dos pesticidas químicos sintéticos tradicionais. A invenção diz respeito a pesticidas biodegradáveis ocorrendo naturalmente e genes codificando os mesmos.

A invenção provê a criação de variantes sintéticas da toxina Cryl Ial2 (SEQ ID N0 1), isolados de Bacillus thuringiensis.

A invenção diz respeito também a um método para produzir um organismo geneticamente modificado caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com uma construção

gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção;

b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;

d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo a construção gênica ou vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção.

A presente invenção diz respeito ainda a um método para produção de proteína recombinante caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção;

b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;

d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção;

A presente invenção diz respeito também a uma composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender uma concentração eficaz do polipeptídeo isolado da presente invenção ou análogo mutante, em um veículo carreador agronomicamente aceitável.

A invenção diz respeito a um método para o controle de uma praga caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente;

b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou com uma composição da invenção, em que a referida proteína consiste das seqüências selecionadas do grupo de seqüências de aminoácidos descritas em SEQ ID N0 7-12.

A invenção diz respeito também a um método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção;

c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de entomotoxicidade da δ-endotoxina.

A construção de bibliotecas de genes análogos variantes, utilizando técnicas de evolução molecular in vilro, tem sido empregada nas últimas três décadas. Esse fato se deve ao surgimento de ferramentas biotecnológicas, as quais servem como plataforma de engenharia genética no desenvolvimento de novas moléculas com atividade melhorada, visando principalmente à agricultura e a indústria farmacêutica (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Review. Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005). Várias técnicas, incluindo modificações químicas, PCR induzido ao erro e mutagênese sítio dirigida podem ser aplicadas para gerar mutações em uma seqüência gênica (Neylon, C. Chemical and biochemical strategies fot the randomization of protein encoding DNA sequences: library construction methods for directed evolution. Nucleic Acids Research, vol. 32, N. 4, PP. 1448-1459, 2004). Preferencialmente na presente invenção destaca-se a técnica de Embaralhamento de ADN (Rosic, N. N., Huang, W., Johnston, W. A., James J. Devoss, J. J., Gillam, E. M. J. Extending the diversity of cytochrome P450 enzymes by ADN family shuffling. Gene, Vol. 35762, No of Pages 9, 2007; Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005; Abécassis, V., Pompon, D. and Truan, G. High efficiency family shuffling based on multi-stcp PCR and in vivo ADN recombination in yeast: statistical analysis of a 5 combinatorial library between human cytochrome P450 IAl and 1A2. Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 20: E 88, 2000; Zhao, H. and Arnold, F.H. Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., Vol. 94, p. 7997 - 8000, 1997; Stemmer, W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro By Embaralhamento de ADN. Nature. London, Vol. 370, 10 p. 389 - 391, 1994). A estratégia de Embaralhamento de ADN aplicada na presente invenção apresenta a vantagem de gerar ao mesmo tempo grande diversidade em mutantes contendo mutações produzidas aleatoriamente.

Na presente invenção, foi identificado e clonado um novo gene pertencente à família cryll, com alta toxicidade a insetos lepidópteros, especificamente a broca 15 gigante da cana-de-açúcar. Os códons desta seqüência foram otimizados para sua expressão em plantas, especificamente, para plantas monocotiledôneas. Além disso, foi construída uma biblioteca combinatória, através da técnica de embaralhamento de DNA, com o intuito de desenvolver genes análogos mutantes, os quais também codificam para a proteína da família Cryll. Os genes análogos mutantes gerados possuem potencial 20 efeito no controle da broca gigante da cana-de-açúcar.

Para obtenção de genes cry análogos, com alta entomotoxicidade para a broca gigante da cana-de-açúcar, foi utilizado o gene cryIIal2 (SEQ ID NO 1) isolado da cepa S811 de B. thuringiensis. Este gene foi utilizado como substrato no processo de originar genes variantes pela técnica de embaralhamento de DNA. Os variantes foram 25 selecionados quanto à capacidade de se ligarem a receptores presentes na membrana do intestino médio broca gigante da cana-de-açúcar (BBMVs)5 pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage display. Para a seleção dos variantes do gene cryIIal2 da presente invenção utilizamos a técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display.

Ao final, a toxina nativa CrylIal2 e seus análogos mutantes tiveram seus efeitos

entomotóxicos avaliados in vitro, por meio de bioensaios seletivos. Para isso, os genes análogos selecionados foram clonados em vetores de expressão heteróloga (E. coli) e as toxinas recombinantes geradas utilizadas em bioensaios contra larvas da broca gigante da cana-de-açúcar.

A invenção descreve novas entomotoxinas e métodos, os quais possibilitam a geração de tecnologias capazes de controlar insetos-praga de grande interesse econômico. Mais especificamente, os ácidos nucleicos (genes) da presente invenção, incluindo fragmentos e variantes dos genes cry em questão, compreendem seqüências nucleotídicas, as quais codificam proteínas (polipeptídeos) entomotóxicas.

Na descrição que segue, um número de termos são utilizados extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

O termo “molécula isolada de ácido nucleico” é utilizado para se referenciar aos

ácidos nucleicos da presente invenção. Este termo, quando aplicado para o DNA da presente invenção, refere-se à molécula de DNA que é originada do gene cryIIal2. Por exemplo, a “molécula isolada de ácido nucleico” pode estar inserida em um vetor, tal como um plasmídeo ou um vetor de vírus, ou integrado dentro de um DNA genômico 15 de um procarioto ou eucarioto. Uma “molécula isolada de ácido nucleico” pode compreender também uma molécula de cDNA. Uma molécula isolada de ácido nucleico inserida em um vetor é também referida às vezes aqui como molécula de ácido nucleico recombinante. O termo “molécula isolada de ácido nucleico” também poderá ser aplicado à moléculas de RNA transcritas de uma molécula de DNA conforme descrita 20 acima.

A definição dos termos “complemento”, “complemento reverso” e “seqüência reversa” como usados aqui é ilustrada pelo seguinte exemplo: para a seqüência 5’AGTGAAGT3’, o complemento é 3’TCACTTCA5’, o complemento reverso é 3’ACTTCACT5’ e a seqüência reversa é 5’TGAAGTGA3’.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” ou ainda

“análogo peptídico” ou “análogo mutante” compreende seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de seqüências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado e que pode ter sua atividade biológica alterada, auxiliada, aumentada ou diminuída quando 30 comparada com a proteína parental nativa ou não-mutada. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As seqüências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucleicos ou peptídeos que podem ser caracterizados pela porcentagem de identidade de suas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos com as seqüências de nucleotídeo (SEQ ID Nos 2-6) ou de aminoácidos (SEQ ID Nos 8-12) descritas aqui, como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os 5 fragmentos de ácidos nucleicos ou peptídeos preferidos são aqueles cujas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de seqüência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, mais 10 preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência quando comparada com a seqüência de referência. A identidade percentual é determinada pelo alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, 15 dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de ferramentas de domínio público, como BLASTN e BLASTP, disponíveis na página do Centro Nacional para Informação Biotecnológica/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). O alinhamento de seqüência e o cálculo de porcentagem de identidade da presente 20 invenção foram realizados conforme descrito com as seqüências depositadas no Banco de Genes. O termo “análogos sintéticos” como citado nesta invenção diz respeito a modificação das sequencias nucleotídica dos variantes selecionados. Modificaçoes em substituições de bases nucleotídicas apropriando ao códon preferencial de bases, próprio da planta utilizada na transformaçao genética. A nova sequencia é obtida por síntese 25 química e as substituições nos nucleotídeos não representam alterações na sequencia traduzida de aminácidos.

“Seqüência codificadora” refere-se à seqüência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a seqüência não codificadora. Uma “seqüência codificadora interrompida” significa a seqüência que atua como separadora (por exemplo, um ou 30 mais íntrons ligados através de junções). Um “íntron” é uma seqüência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré mRNA, mas é removida através de clivagem e a re-ligação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína. Exemplos de íntrons incluem, mas não são limitados a, íntron pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desnaturase de algodão, Delta 12 desnaturase de Arabidopsis, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40, íntrons do gene da malato sintase.

Uma “construção gênica” é um gene compreendendo um promotor e uma região

codificadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, a construção gênica compreende os polinucleotídeos da presente invenção ligados de forma associada ou isoladamente à regiões reguladoras da expressão, como promotores e sinais de terminação.

A obtenção de construções gênicas compreendendo promotores ligados a ácidos

nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

O termo “vetor” diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras seqüências genéticas ou elementos (sejam eles de ADN ou RNA) podem ser ligados. Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Preferencialmente um dos vetores de interesse da presente invenção diz respeito ao fagomídeo. O termo “fagomídeo” diz respeito a um vetor que contém seqüência para replicação em fago e em bactéria, este vetor tem características que atendem as especificações da célula hospedeira bem como agentes selecionadores e promotores. Um exemplo é o fagomídeo pComb3X (Andris-Widhopf, J.; Rader, C.; Steinberger, P.; Fuller, R., Barbas III, C. F. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181, 2000), que tem como característica fusionar a gene de interesse ao gene da proteína III, do bacteriófago filamentoso Ml3, localizada no capsídeo viral. O termo “vetor recombinante” é resultante da combinação de um vetor comercial com genes da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Paio Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados, são os vetores pGEM-T easy (Promega Corporation), pCambia 2300 (Canberra, Austrália), pComb3X (Andris-Widhopf, J.; Rader, C.; Steinberger, P.; Fuller, R., Barbas III, C. F. Methods for the generation of ehieken monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181, 2000), pAHC17 e pAHC20 (Christensen, A. H.

& Quail, P. H. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research, 5: 213-218, 1996). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory 10 Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).

Um “vetor binário” é um vetor derivado de plasmídios capazes de se replicar tanto em Escheriehia coli quanto em Agrobacterium. Preferencialmente para a presente invenção foram utilizados os vetores binários: pIPKb002 e pIPKb003 (Himmelbach, A.; Zierold, U.; Hensel, G.; Riechen, J.; Douchkov, D.; Schweizer, P.; Kumlehn, J. A Set of 15 Modular Binary Vectors for Transformation of Cereais. Breakthrough Technologies, 145: 1192-1200, 2000), além do vetor p7iU® (DNA Cloning Service e. K.). Um vetor de transformação de plantas baseado no sistema Agrobacterium do tipo binário deve conter uma origem de replicação apropriada e um gene de seleção em bactéria, geralmente resistência a um antibiótico. Além disso, é desejável que ele contenha uma região de 20 múltiplos sítios de clonagem (contendo seqüências de enzimas de restrição) entre as extremidades do T-DNA, para a inserção das sequencias gênicas desejadas, e uma região de transferência (ori I) e sítio de ativação para conjugação. Uma vez obtido o vetor binário com a seqüência desejada do gene, operalcionalmente ligado, ele deve ser transferido para Agrobacterium. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, 25 incluindo Clontech Laboratories, Inc (Paio Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.) ou adquridos por doação pública (série pCambia, Canberra, Austrália). O termo “operacionalmente ligado” significa que as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência codificante são colocadas na molécula de ADN em 30 posições apropriadas relativas à seqüência codificante para efeito de sua expressão. Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de seqüências codificantes e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, acentuadores ou “enhancers” e elementos de terminação) no vetor binário. Uma região codificante exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificante exógena em uma célula transformada (podendo ser microrganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica 5 operacionalmente ligada a uma região codificante exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucleico que pode causar transcrição de regiões codificantes exógenas, posicionado na região 5’ da região codificante exógena.

O termo “operacionalmente ligado” significa que as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência codificante são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativas à seqüência codificante para efeito de sua expressão. Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de seqüências codificantes e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, acentuadores ou “enhancers” e elementos de terminação) no vetor binário. Uma região codificante exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificante exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificante exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucleico que pode causar transcrição de regiões codificantes exógenas, posicionado na região 5’ da região codificante exógena. A presente invenção não está limitada para o uso de qualquer promotor em particular e uma ampla variedade de promotores são conhecidos no estado da técnica. Os promotores podem ser, mas não estão limitados a, induzíveis, constitutivos e tecido-específicos.

Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor constitutivo. Em outro aspecto da invenção, a atividade do promotor é estimulada por fatores externos ou 25 internos tais como, mas não limitado a, hormônios, compostos químicos, impulsos mecânicos, e condições de estresse biótico ou abiótico. A atividade do promotor também pode ser regulada de maneira temporal e espacial (como por exemplo, promotores tecido-específicos e promotores regulados durante o desenvolvimento).

O promotor pode conter elementos “enhancers”. Um “enhancer” é uma seqüência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecido-especificidade de um promotor. “Promotores constitutivos” referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos e durante todo tempo. Promotores “tecido-específicos” ou “desenvolvimento-específicos” são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese.

Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor expresso em plantas. Como usado aqui, o termo “promotor expresso em plantas” significa uma seqüência de ADN que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor de origem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal 10 que seja capaz de direcionar a síntese do gene presente no T-ADN de Agrobaterium; promotores tecido-específicos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (W08903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado no pedido de patente US20030175783, An, Y. Q., Huang, S., McDowell, J. M., McKinney, E. C., Meagher, R. B., Conserved expression 15 of the Arabidopsis ACTl and ACT3 actin subclass in organ primordia and mature pollen. The Plant Cell 8, 15-30, 1996), promotores específicos de caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller, B., Sauer, N., Lamb, C. J., Glycine-rich cell wall proteins in bean: Gene structure and association of the protein with the vascular system. EMBO J. 7: 3625-3633, 1988), promotores específicos de 20 folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth, R. L., Grula, J. W., Structure and expression of the maize gene encoding the phosphoenolpyruvate carboxylase involved in C4 photosynthesis. Plant Mol Biol 12:579-589, 1989), promotores específicos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller, B., Lamb, C. J., 25 Specific expression of a novel cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in lateral root initiation. Genes Devei. 3:1639-1646, 1989), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil, M., Sánchez-Serrano, J. J., Willmitzer, L., Both wound-inducible and tuber-spceific expression are mediated by the promoter of a single member of the potato proteinase inhibitor II gene family. 30 EMBO J. 8: 1323:1330, 1989), promotores específicos de tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman J., Saito, K., Cottyn, B., Engler, G., Seurinck, J., Van Montagu, M., Inze, D., Structure and expression analyses of the S-adenosylmethionine synthetase gene family in Arabidopsis thaliana. Gene 84: 359-369, 1989), promotores específicos de estames (W08910396, W09213956), promotores específicos da zona de deiscência (W09713865); e semelhantes. Preferencialmente, o promotor da presente invenção é escolhido do grupo dos promotores, podendo ser, mas não estando limitado a Ubil (Zea mays) (Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology, 18: 675-689, Christensen, A. H. & Quail, P. H. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research, 5: 213-218, 1996), Ubi9 (Saccharum officinarum) (Wei, H., Wang, M., Moore, P. H., Albert, Η. H. Comparative expression analysis of two sugarcane polyubiquitin promoters and flanking sequences in transgenic plants. Journal of Plant Physiology, 160: 1241-1251, 2003) e Actl (Oryza saliva) (McElroy, D., Blowers, A. D., Jenes, B., Wu, R. Construction of expression vectors based on rice actin

I (Aetl) 5’ region for use in monocot transformation. Molecular and General Genetics, 231: 150-160, 1991).

Como usado aqui, o termo “promotor expresso em bactérias” significa uma seqüência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula 20 bacteriana. Como usado aqui, o termo “promotor expresso em fungos” significa uma seqüência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de fungo. Como usado aqui, o termo “promotor expresso em insetos” significa uma seqüência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de inseto.

Uma “seqüência líder” ou “seqüência sinal” na presente invenção significa uma

sequencia de ácido nucleico que, quando operacionalmente ligada a uma molécula de ácido nucleico, permite a secreção do produto da molécula de ácido nucleico. A seqüência líder está preferencialmente localizada na região 5’ da molécula dc ácido nucleico. Preferencialmente, a seqüência líder é obtida do mesmo gene que o promotor 30 utilizado para dirigir a transcrição da molécula de ácido nucleico, ou é obtida do gene onde a molécula de ácido nucleico é derivada. Preferencialmente a presente invenção utiliza a seqüência sinal proveninente de uma cultivar de cana-de-açúcar. O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, 5 sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium sublerranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus 10 nidulans, e outros semelhantes.

Conforme descrito anteriormente, a expressão “vetores binários” pode compreender um promotor induzível operacionalmente ligado a uma seqüência de ácido nucleico codificando a proteína inseticida da presente invenção. Promotores “induzíveis” podem dirigir a expressão de um polinucleotídeo com o qual eles estejam 15 operacionalmente ligados, em um tecido ou estágio específico do desenvolvimento ou respondendo a condições ambientais. Em um dos aspectos da invenção, vetores de expressão compreendem um promotor induzível firmemente regulado operacionalmente ligado à uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida. Tal vetor binário pode adicionalmente compreender um gene marcador de seleção (por exemplo, 20 um gene codificando uma proteína que confere resistência a antibiótico) operacionalmente ligado a um promotor constitutivo ou a um promotor induzível firmemente regulado. Dependendo da aplicação, ele pode beneficiar a expressão da seqüência de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida através de um promotor induzível de inseto-praga. Em um aspecto da presente invenção pode ser 25 vantajoso utilizar promotores que são expressos localmente ou próximo do sítio de infecção da praga.

O termo “marcador seletivo” é referido aqui como sendo seqüências que conferem resistência a antibióticos ou serem marcadores visuais. Preferencialmente os marcadores podem ser selecionados do grupo de, mas não estando limitado a, seqüências 30 codifícadoras dos genes canamicina, neomicina, ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, higromicina, geneticina, fosfinotricina, glifosato, glufosinato de amônio, AHAS, BAR e GUS. Organismos (plantas ou bactérias) sobreviventes ao gene marcador (ou gene de resistência) em meio de cultivo ou em aplicações tópicas são indicados como transformantes positivos caracterizados pela presença de gene exógeno integrado ao genoma desse organismo.

O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucleico compreendendo de dez a noventa deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que oito. O tamanho exato dos oligonucleotídeos é dependente dos fatores experimentais particulares de cada etapa do processo.

Conforme usado na presente invenção, os termos “codificador”, “codificando” ou 10 “codificado” quando usados no contexto de uma seqüência nucleotídica específica significa a mesma possui uma informação, a qual será traduzida biologicamente da seqüência de nucleotídeo para uma sequencia proteica específica. A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Estes códons são explorados por cada organismo vivo de maneira diferenciada podendo partes de 15 seqüências nucleotídicas distintas serem traduzidas biologicamente em codons idênticos.

O termo “gene” corresponde a uma seqüência nucleotídica específica localizada em uma região em particular do cromossomo, sendo responsável por codificar um produto final específico. O gene também carrega em sua estrutura primária toda a 20 informação necessária para os processos de transcrição e tradução biológica, como por exemplo, regiões promotoras e reguladoras da transcrição. No caso da presente invenção, gene compreende as seqüências nucleotídicas codifícadoras correspondente ao gene cry IIa 12 e aos seus análogos.

Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma interrelacionados para referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se para polímeros de aminoácidos onde um ou mais resíduo de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido correspondente ocorrendo naturalmente, bem como para polímeros de aminoácidos ocorrendo naturalmente.

Polipeptídeos da invenção podem ser produzidos ou através de um ácido nucleico descrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular. Por exemplo, uma proteína truncada da invenção pode ser produzida pela expressão de um ácido nucleico recombinante da invenção em uma célula hospedeira apropriada, ou alternativamente pela combinação de procedimentos, tais como digestão utilizando protease e purificação.

Na presente invenção os polipeptídeos isolados são caracterizados por compreender seqüências substancialmente similares a qualquer uma das seqüências 5 selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 7-11 e exibirem atividade inseticida, quando administrado oralmente, a larvas de insetos susceptíveis. Os polipeptídeos da presente invenção são caracterizados por exibir atividade inseticida, quando fornecido em uma dieta administrada oralmente a uma larva de inseto lepidóptero, mais especificamente a larva de broca gigante da cana-de-açúcar. Mais 10 especificamente, os polipeptídeos isolados da presente invenção são caracterizados por ser uma δ-endotoxina.

Na presente invenção o termo “proteína recombinante” se refere às moléculas quiméricas obtidas a partir da aplicaçao da técnica de embaralhamento do DNA de genes (codificadores de Cry IIa 12). Podendo ser essas moléculas expressadas, mas não somente, em fagos, bactérias leveduras e plantas. Preferencialmente, a proteína recombinante da presente invenção é caracterizada por ter atividade δ-endotoxina.

O termo “substancialmente pura” refere-se a preparações compreendendo pelo menos 50-60% de peso do componente de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, polipeptídeo, proteína, etc). Mais preferencialmente, a preparação 20 compreende pelo menos 75% de peso, e mais preferencialmente 90-99% de peso do componente de interesse. A pureza é medida por meio de métodos apropriados para o componente de interesse (por exemplo, espectometria de massa e similares).

O termo “gene isolado” é utilizado na presente invenção. Este termo refere-se à seqüência nucleotídica existente em determinado genoma.

O termo “proteína isolada” ou “proteína isolada e purificada” é, às vezes, utilizado

na presente invenção. Este termo refere-se a uma proteína produzida pela expressão de uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção. Alternativamente, este termo pode referir-se a uma proteína que tem sido suficientemente separada de outras proteínas que ela poderia estar naturalmente associada, tal como ela existe na sua forma 30 “substancialmente pura”. O termo “isolado” não exclui misturas sintéticas ou artificiais com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interferem com a atividade fundamental da proteína, e que pode estar presente, por exemplo, em uma purificação incompleta, adição de estabilizadores, ou combinados dentro, por exemplo, em uma composição agriculturalmente aceitável.

O termo “atividade biológica” diz respeito a uma função ou um grupo de funções executado por uma molécula em um contexto biológico (isto é, em um organismo ou substituto in vitro ou algum outro modelo similar). Para uma δ-endotoxina, a atividade biológica é caracterizada pela sua atividade citotóxica aos receptores presentes no intestino médio do inseto-praga alvo, ocasionando à morte do mesmo.

Como usado aqui, o termo “impactando insetos-praga” refere-se ao efeito de mudar nos insetos a alimentação, crescimento, e/ou comportamento em qualquer estágio do desenvolvimento, incluindo, mas não limitado a: matar o inseto; retardar o crescimento; impedir capacidade reprodutiva; atividade anti-alimentação; e outros semelhantes.

Os termos “atividade pesticida” e “atividade inseticida” são utilizados sinonimamente para referir-se a atividade de um organismo ou uma substância (p.ex: 15 uma proteína) que pode ser medida por, mas não estando limitada a mortalidade da praga, perda de peso da praga, repelência à pragas, e outros comportamentos e mudanças físicas de uma praga depois da alimentação e exposição por um apropriado período de tempo. Dessa forma, o impacto da atividade pesticida deve ter pelo menos um parâmetro mensurável de aptidão da praga. Por exemplo, “proteínas pesticidas e/ou 20 inseticidas” são proteínas que desencadeiam a atividade pesticida por elas mesmas ou em combinação com outras proteínas, δ-endotoxinas são proteínas pesticidas. Outros exemplos de proteínas pesticidas incluem, por exemplo, jaburetox, inibidores de alfaamilase, dentre outros.

O termo “quantidade efetiva de pesticida” diz respeito a uma quantidade de uma 25 substância ou organismo que tem atividade pesticida quando presente no ambiente da praga. Para cada substância ou organismo, a quantidade efetiva de pesticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. Similarmente o termo “quantidade efetiva de pesticida” pode ser usado para referir a uma “quantidade efetiva de pesticida” quando uma praga é um inseto-praga. O termo 30 “composição pesticida biodegradável” é caracterizado por ser produtos ou substâncias liberadas no solo para ação em ambiente de praga, podendo ser degradados por ação de microorganismos, fotólise, oxidação, entre outros, em um período curto de tempo. As composições biodegradáveis envolvem substâncias classificadas como organofosforados, carbamatos, triazinas, anilinas, podem ser colocadas na forma de estacas que podem ser introduzidas no solo sem danos permanentes. Os produtos geralmente compreendem um aglutinante polimérico sólido, hidrófilo, solúvel em água, 5 a um pesticida sistêmico. Ainda, o pesticida biodegradável se caracterizada pelo fato de que um veículo carreador aceitável pode ser um agente superfície-ativo, um veículo carreador inerte, um preservativo, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificador, um corante, um protetor uv (ultra-violeta), um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante, doadores de 10 micronutriente, ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta. A composição pesticida biodegradável é caracterizada pelo fato de o veículo carreador aceitável ser um microorganismo transformado. Na presente invenção a composição pesticida biodegradável é caracterizada pelo fato de o polipeptídeo da presente invenção ou análogo mutante ser usado em combinação outras proteínas inseticidas.

O termo “recombinantemente engenheirado” ou “engenheirado” diz respeito a

utilização da tecnologia do ADN recombinante para gerar (engenheirar) uma mudança na estrutura da proteína baseando-se no entendimento do mecanismo de ação da mesma, podendo os aminoácidos serem introduzidos, deletados ou substituídos.

O termo “Embaralhamento de ADN” é utilizado para descrever um método 20 empregado em evolução molecular dirigida in vitro para gerar variantes de uma única seqüência gênica, ou duas ou mais seqüências gênicas homólogas por meio de recombinações de fragmentos gerados randomicamente, com recuperação de seqüências modificadas e com conseqüente modificação de resíduos de aminoácidos na proteína codificada pelo análogo mutante.

O termo “apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage

display’ diz respeito a um sistema de expressão e de interações de proteínas fusionadas a bacteriófagos que permitem uma varredura em células, tecidos ou órgãos a procura de pares receptor-ligantes, sendo esses ligantes, proteínas que se ligam aos receptores presentes no alvo em estudo.

Como usado aqui, o termo “seqüência de nucleotídeo mutada” ou “mutação” ou

“seqüência de nucleotídeo mutageneizada” diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo que tem sido mutada ou alterada para conter um ou mais resíduos de nucleotídeos (p.ex.: pares de base) que não está presente no tipo selvagem ou na seqüência nãomutada. Tal mutagênese ou alteração consiste de uma ou mais adições, deleções, ou substituições ou realocamento de resíduos de ácidos nucleicos.

Como usado aqui, o termo “melhora da atividade inseticida” ou “melhora da 5 atividade pesticida” caracteriza um polipeptídeo ou uma δ-endotoxina da invenção que possui a atividade pesticida contra lepidópteras melhorada em relação às δ-endotoxinas originais que não sejam efetivos contra insetos. Para medir a melhora da atividade pesticida ou inseticida deve-se requerer uma demonstração de alteração do desenvolvimento (tamanho e peso) das larvas do inseto-específico ou da mortalidade 10 das larvas após o contato com a δ-endotoxina da invenção..

Um especialista no assunto tem conhecimento dos avanços no campo da biologia molecular tais como uma mutagênese sítio-específica ou ao acaso, metodologia da reação de polimerase em cadeia (PCR), e técnicas da engenharia protéica provém uma extensiva coleção de ferramentas e protocolos viáveis para o uso para alterar ou 15 engenheirar ambas as seqüências de aminoácido e seqüências genéticas disfarçadas de proteínas de interesse agrícola. Então, as proteínas pesticidas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras, incluindo substituição de aminoácido, deleções, truncações, e inserções. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma seqüência de aminoácido variante da proteína 20 pesticida da presente invenção pode ser preparada pela introdução de mutações dentro de um ácido nucleico sintético (p.ex.: molécula de ADN). Métodos para mutagênese e alterações em ácidos nucleicos são bem descritos no estado da técnica.

Entende-se que os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos tanto pela expressão de um ácido nucleico descrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular.

Descreve-se que um método para o controle de uma praga pode ser caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente;

b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou produzida como uma composição da presente invenção.

Sabe-se que proteínas pesticidas podem ser oligoméricas e variam em peso

molecular, número de resíduos, componentes peptídicos, atividades contra pragas particulares, e outras características. No entanto, pelos métodos descritos aqui, proteínas ativas contra uma variedade de pragas podem ser isoladas e caracterizadas. As proteínas pesticidas da invenção podem ser usadas em combinação ou outras proteínas inseticidas para aumentar a ação no inseto alvo. Além do mais, o uso de proteínas pesticidas da presente invenção em combinação com outros princípios inseticidas de uma natureza 5 diferente podem ter uma utilidade particular para prevenção e/ou manejo da resistência à inseto. Outros princípios inseticidas incluem, mas não estão limitados a outros tipos de inibidores de protease (ambos serina e cisteína), lectinas, e peroxidases.

A invenção também diz respeito a plantas transformadas com pelo menos um ácido nucleico da presente invenção, com um gene quimérico compreendendo o ácido 10 nucleico, ou com um vetor binário compreendendo o gene quimérico. Preferencialmente, o microrganismo é um que se multiplica em plantas. Mais preferencialmente, o microrganismo é uma bactéria colonizadora de raiz. Uma concretização da presente invenção diz respeito a uma proteína pesticida encapsulada, que compreende um microrganismo transformado compreendendo pelo menos uma 15 proteína pesticida da invenção.

A invenção também provê um método de aumentar o alcance do inseto alvo através do uso de proteínas pesticidas da invenção em combinação com pelo menos uma segunda proteína pesticida que seja diferente da proteína pesticida da invenção. Qualquer proteína pesticida conhecida no estado da técnica pode ser utilizada no 20 método da presente invenção. Tais proteínas pesticidas incluem, mas não estão limitadas a δ-endotoxinas de Bt, inibidores de protease, lectinas, alfa amilases, hidrolases acil lipídicas, e peroxidases.

A invenção também compreende plantas transgênicas ou transformadas compreendendo pelo menos uma seqüência nucleotídica da invenção. 25 Preferencialmente, a planta é estavelmente transformada com um gene quimérico. compreendendo pelo menos uma seqüência nucleotídica da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão em células vegetais. Como usado aqui, o termo “plantas transgênicas” ou “plantas transformadas” refere-se a uma planta que compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o 30 polinucleotídeo heterólogo é integrado ao genoma de uma planta transgênica, de forma estável para que o polinucleotídeo seja passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado dentro do genoma sozinho ou como parte de um vetor recombinante.

Como usado aqui, o termo “transgênico” inclui qualquer célula, linhagem celular, calos, tecidos, parte da planta, ou genótipo da planta que tem sido alterado pela presença do ácido nucleico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados bem como aqueles criados por cruzamento sexual ou propagação sexual do transgênico sexual.

O termo “plantas” refere-se a organismos fotossintéticos, ambos eucariotos e procariotos, onde o termo “plantas desenvolvidas” refere-se a plantas eucariotas. O 10 termo refere-se a plantas inteiras, órgãos vegetais (p.ex.: folhas, caules, raízes, flores, entre outros), sementes, células vegetais, e progênies dos mesmos. Partes das plantas transgênicas também estão incluídas dentro do escopo da invenção compreendendo, por exemplo, células vegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, óvulos, caules, frutos, folhas, raízes originados de plantas transgênicas ou sua progênie 15 previamente transformada com uma molécula de ADN da invenção e, portanto, consistindo de pelo menos parte das células transgênicas, são também objeto da presente invenção. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser utilizados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Então, a invenção possui uso sobre várias espécies de plantas, incluindo espécies dos gêneros Anona, Arachis, Artocarpus, 20 Asparagus, Aíropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carlhamus, Cocos, Cqffea, Cucumis, Cucurbiía, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Ilordeum, Hyoseyamus, Lacíuca, Linum, Lolium, Lupinns, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Panneselum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, 25 Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triíicum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. Particularmente, a presente invenção diz respeito a plantas de cana-de-açúcar transformadas com as seqüências nucleotídicas da presente invenção bem como fragmentos e derivados das mesmas.

Protocolos de transformação bem como protocolos para introduzir seqüências de nucleotídeos dentro de plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula vegetal, por exemplo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, alvos da transformação. Métodos viáveis de introduzir seqüências nucleotídicas em células vegetais e a subseqüente inserção dentro do genoma vegetal são bem descritos no estado da técnica e podem ser, mas não estão limitados a técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas, ou a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com ADN.

Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., Liu, G., Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol., 101, 433- 448, 1983) (como mencionado no pedido de patente US4743548). A introdução de construções gênicas utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. (Paszkowski, J., Shillito, R. D., Saul, M., Mandák, V., Hohn, T. Hohn, B., Potrykus, I., Direct gene transfer to plants. Embo J. 3: 2717-2722, 1984) (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em Fromm et al (Fromm, M. E., Taylor, L. P. Walbot, V., Expression of genes electroporated into monocot and dicot plant cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985) (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. (Klein, T. M., Wolf,. E. D., Wu, R., Sanford, J. C., High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327:70-73, 1987) (como mencionado no pedido de patente US20020152501).

Alternativamente, as construções gênicas podem ser combinadas com regiões flanqueadoras de T-ADN apropriadas e introduzidas em um vetor convencional, o hospedeiro Agrobacterium tumefaciens. A função de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador 25 adjacente dentro do ADN da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch, R. B., Fraley, R. T., Rogers, S. G., Sanders, P. R., Lloyd, A., Hoffmann, N. Inheritance of functional foreign 30 genes in plants. Science 233:496-498, 1984; e Fraley, R. T., Rogers, S. G., Horsch, R. B., Sanders, P. R., Flick, J. S., Adams, S. P., Bittner, M. L., Brand, L. A., Fink, C. L., Fry, J. S., Galluppi, G. R., Goldberg, S. B., Hoffmann, N. L., Woo, S. C. Expression of baeterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983).

Células de plantas transformadas derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira 5 que possua o genótipo transformado e então o fenótipo desejado, tal como resistência a insetos. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a seqüência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é 10 descrita em Evans et al (Evans, D. E., and Bravo, J. E., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, vol. 1, 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983); e Binding 1985 (Binding, H., Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985) (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de 15 calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al (Klee, H., Horsch, R., Rogers, S., Agrobacteriummediated plant transformation and its further applications to plant biology. Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).

Um gene codificando uma proteína pesticida da invenção pode ser introduzido por

meio de um vetor viável dentro de um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro pode ser inserido em plantas ou em animais. O termo “introduzido” no contexto de inserir um ácido nucleico dentro de uma célula significa “transfecção” ou “transformação” ou “transdução” e inclui a incorporação de um ácido nucleico dentro de uma célula 25 procariótica ou eucariótica onde o ácido nucleico pode ser incorporado dentro do genoma da célula (p.ex.: cromossomo, plasmídeo, plastídeo, ou ADN mitocondrial), convertido dentro de um replicon autônomo, ou expresso transientemente (p.ex.: ARNm transfectado).

O termo “microorganismo” é definido aqui como sendo micróbios que possuem organelas funcionais no interior de suas cápsulas ou células como bactérias, protozoários, fungos unicelulares e algas unicelulares. Existem vários métodos viáveis para introduzir um gene expressando a proteína pesticida dentro de um microrganismo hospedeiro sob condições que permitam a manutenção e a expressão estável do gene. Por exemplo, vetores de expressão podem ser construídos contendo a seqüência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada 5 a sinais regulatórios de transcrição e tradução para expressão da seqüência de nucleotídeo. Quando uma seqüência de nucleotídeo homóloga interna do organismo se encontra com a seqüência no vetor binário, poderá haver uma recombinação entre elas e o gene que codifica a proteína pesticida se integrará no genoma do organismo hospedeiro de forma estável.

Células hospedeiras viáveis, onde as células contendo a proteína inseticida serão

tratadas para prolongar a atividade da proteína inseticida na célula quando a célula tratada for aplicada no meio ambiente da praga alvo, pode incluir procariotos ou eucariotos, normalmente sendo limitadas àquelas células que não produzem substâncias tóxicas em organismos superiores. No entanto, organismos que produzem substâncias 15 tóxicas em organismos superiores podem ser usados, onde a toxina for instável ou o nível de aplicação suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de toxicidade a hospedeiros mamíferos. Particularmente os hospedeiros são procariotas e eucariotas menos desenvolvidos como os fungos. Exemplos de procariotos, ambos gram negativos e gram positivos, incluem, mas não estão limitados a Enterobacteriaceae, tais 20 como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, e Proleus; Bacillaceae; Rhizobiceaet tais como Rhizobium; Spirillaceae, tais como Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tais como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraeeae e Nitrobacteraceae. Entre os eucariotos podem ser exemplificados os fungos, tais como Phycomycetes e 25 Ascomycetes, os quais incluem leveduras, tais como Saccharomyces e Schizosaeeharomyces; e Basidiomycetes, tais como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, e semelhantes.

Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para o propósito de produzir a proteína inseticida incluem a facilidade de introdução do gene da proteína inseticida dentro do sistema de expressão, eficiência de expressão, estabilidade da proteína no hospedeiro, e a presença de capacidades genéticas auxiliares. Organismos hospedeiros de particular interesse incluem leveduras, tais como Rhodolorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp., e Sporobolomyces spp., Piehia pastoris, Saccharomyees eerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escheriehia coli, Bacillus sublilis, e outros semelhantes.

As concretizações da presente invenção podem ser efetivas contra uma variedade

de pragas. Para os propósitos da presente invenção, as pragas incluem, mas não estão limitadas a, insetos, fungos, bactérias, nematóides, ácaros, patógenos protozoários, parasitas animais, e semelhantes. Pragas de particular interesse são insetos-praga, particularmente insetos-praga que causam danos significativos para plantas agrícolas. 10 Entende-se como “insetos-praga” insetos e outras pragas similares tais como, por exemplo, os insetos das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente, Lepidoptera especialmente broca gigante da cana-de-açúcar, Telehin licus licus. Insetos-praga da presente invenção da 15 maioria das cultivares incluem, mas não estão limitadas a Milho: Ostrinia nubilalis, Agrolis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Dialraea saccharalis, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi, Diabrolica undecimpunctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japonica, Chaetocnema 20 puliearia, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leueopterus leucopterus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinipes, Hylemya plalura, Agromyza parvicornis, Anaphothrips obscrurus, Solenopsis milesla, Tetranychus urticae; Sorgo: Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Elasmopalpus lignosellus, Feltia sublerranea, Phyllophaga crinita, Eleodes, 25 Conoderus, e Aeolus spp., Oulema melanopus, Chaetocnema puliearia, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha fiava, Blissus leucopterus leucopterus, Contarinia sorghicola, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae', Trigo: Pseudaletia unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Elasmopalpus lignosellus, Oulema melanopus, Hypera punctata, 30 Diabrotica undecimpunctata howardi, Schizaphis graminum, Macrosiphum avenae, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differenlialis, Melanoplus sanguinipes, Mayeliola deslructor, Sitodiplosis mosellana, Meromyza americana, Hylemya coarctata, Frankliniella fusca, Cephus cinctus, Aceria tulipae; Girassol: Cylindrocupturus adspersus, Smicronyx fulus, Smicronyx sordidus, Suleima helianthana, Homoeosoma electellum, Zygogramma exclamationis, Bothyrus gibbosus, Neolasioptera murtfeldliana', Algodão: Heliothis virescens, lagarta-das-maçãs;

Helicoverpa zea, lagarta da espiga do milho; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho; Peclinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, bicudo-do-algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão-do-algodoeiro; Pseudatomoscelis serialus, pulga saltadora do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca Bemisia tabaci; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto; Thrips tabaci, tripes-do10 fumo; Franklinkiella fusca, tripes; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro-rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Colaspis brunnea, Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophilus oryzae, Nephotettix nigropictus, Blissus leucopterus leucopterus, Acrosternum hilare; Soja: Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Ostrinia nubilalis, 15 Agrotis ipsilon, Spodoplera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Epilachna variveslis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Hylemya platura, Sericothrips variabilis, Thrips tabaci, Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae', Cevada: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus leucopterus', Acrosternum 20 hilare, Euschislus servus, Jylemya platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Canola: Vrevicoryne brassicae, Phyllolreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Phyllotreta nemorum, Meligethes aeneus, Meligethes ruflmanus, Meligethes nigreseens, Meligethes canadianus, e Meligethes viridescens; Batata, Leptinolarsa decemlineata e Feijão: Zabrotes subfasciatus', Calossobruchus spp., Acanthoscelides obtectus.

Os exemplos abaixo são colocados de forma a ilustrar e elucidar melhor a

invenção e não podem ser tidos como forma de limitar a presente invenção.

EXEMPLOS

Técnicas usuais de biologia molecular (p.ex.: transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos) estão descritas por meio de termos comumente empregados. Detalhes da prática de tais técnicas são descritos em Sambrook et al (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).

Exemplo 1 - Geração de genes mutantes, análogos ao gene cryIIa 12 nativo, altamente eficazes no controle de T. I. licus pela técnica de embaralhamento do DNA.

A construção de biblioteca de genes recombinantes análogos ao gene cryllal2 é

uma importante estratégia biotecnológica, contribuindo de modo importante em programas de melhoramento de plantas, via transformação genética para geração de transgênicos. Esta tecnologia disponibiliza uma variedade de novas moléculas com potencial uso na transformação de plantas visando o controle do inseto-alvo, bem como 10 a melhoria da atividade inseticida de novas proteínas codificadas pelos genes recombinantes.

Em estudos prévios (Grossi-de-Sá, MF, Magalhães, MQ, Silva, MS, Silva, SMB, Dias, SC, Nakasu, EYT, Brunetta, PSF, Oliveira, GR, Oliveira Neto, OB, Oliveira, RS, Soares, LHB, Ayub, MAS, Siqueira, HAA, Figueira, ELZ (2007) Susceptibility of 15 Anthonomus grandis (Cotton Boll Weevil) and Spodoptera frugiperda (Fali Armyworm) to a Crylla-type Toxin from a Brazilian Bacillus thuringiensis Strain. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (5), 773-782; Craveiro, KIC, Gomes Júnior, JE, Silva, MCM, Macedo, LLP, Lucena, WA, Silva, MS, AntoninoSouza Júnior, JD, Oliveira, GR, Magalhães, MTQ, Santiago, AD, Grossi-de-Sá, MF 20 (2010) Variant CrylI toxinsgeneratedby DNA shuffling are active against sugar cane giant borer. Journal of Biotechnology. 145, 215-221), foi demonstrado que a toxina Cryllal2 apresenta atividade moderada contra insetos lepidópteros e, com o objetivo de obter, in vitro, novos genes, análogos ao gene cryllal2, altamente eficazes contra T. I. licus, foi realizada a técnica de DNA shuffling.

Para isso, o gene selvagem cryIIal2 (SEQ ID NO 1) foi reamplificado por PCR

com oligonucleotídeos específicos para seqüência gênica em questão, os quais contêm o sítio para a enzima de restrição Sfi I

(CrylIaShuffFOR_SfiExtr_AP:5'GAGGCCCAGGCGGCCAGTAGTGGCGTGTCAG GATCCTGTTTGAAAATGTCTGAG3' e CrylIaShuffREV_SfiExtr_AP:5' CGAGGCCGGCCTGGCCCAACATGTAGCCGCATGCGCGTTCTACCGGAACAA ATTCAATTC3'). Estes oligonucleotídeos foram então utilizados em uma reação de PCR com volume final de 50 μΐ,, contendo 150 nM de cada oligonucleotídeo específico, 400 μΜ de dNTPs, 3 mM de MgCb, IX do tampão para a enzima Taq DNA Polimerase (Cenbiot®), 1,5 U de TaqONA polimerase (Cenbiot®) e 200 ng de DNA cryIlal2. A amplificação foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf®) sob 5 as seguintes condições: 95°C por 2 minutos; 35 ciclos: 45 segundos a 95 0C (desnaturação), 45 segundos a 60°C (anelamento dos oligonucleotídeos) e 2 minutos a 72 0C (extensão da DNA polimerase) e uma extensão final de 5 minutos a 72 °C. Uma alíquota dos produtos da PCR (um produto de aproximadamente 2000 pb) foi analisada em gel de agarose 1% e o restante foi purificado utilizando o QIAquick® PCR 10 Purification Kit (QIAGEN). Seguindo o protocolo da técnica de DNA shuffling (Stemmer, WPC (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature. 370, 389-391; Zhao, H & Arnold, FH (1997) Optimization of DNA shuffling for high fidelity recombination. Nucleic Acids Research. 25, 1307-1308), vinte microgramas do gene cryllal2 com os sítios para a enzima de restrição Sfi I foram liofilizados,

solubilizados em tampão de DNAse I e digeridos com 30 U de DNAse I a 15°C por 20 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 5 μι de EDTA 0,5 M. Uma alíquota do produto da digestão foi analisada em gel de agarose 2,5%. O restante do produto da digestão foi purificado utilizando colunas Microcon® YM-100 (Millipore), seguindo as instruções do fabricante visando a recuperação de fragmentos de até 125 pb. Os 20 fragmentos do gene cryl Ial 2 purificados foram utilizados em uma reação de PCR com volume final de 25 μι, sem a adição de oligonucleotídeos iniciadores, 400 μΜ de dNTPs, 1 mM de MgS04, 5X do tampão para a enzima Ta^Platinum DNA Polimerase High Fidelity (Invitrogen®), 2,5 U de Taq Platinum DNA Polimerase High Fidelity (Invitrogen®) e 1,5 μg de DNA de fragmentos do gene cryIIal2. A reação foi realizada 25 em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf®) sob as seguintes condições: 95°C por 2 minutos; 44 ciclos: 95°C por 1 minuto (desnaturação), 42°C por 1 minuto (anelamento) e 72°C por 1 minuto (com um acréscimo de 5 segundos no tempo de extensão a cada ciclo) e uma extensão final de 7 minutos a 72°C. Esta primeira reação da técnica de embaralhamento de DNA gerou um montante de fragmentos de tamanhos 30 variados. Este novo produto foi então utilizado na segunda reação de PCR (50 μι) como molde, nas seguintes condições: um microlitro e meio do produto da primeira reação, IX do Tampão Taq Platinum DNA Polimerase High Fidelity IX, 0,2 mM dNTPs, 0,8 μΜ dos oligonucleotídeos específicos Shuff2FOR_SfíExtr_AP (5' CG AGGCCC AGGCGGCCAGTAGTGGCGTGTCAGGATCC 3') e

Shuff2REV_SfíExtr_AP (5’

CGAGGCCGGCCTGGCCCAACATGTAGCCGCATGCGCG 3'), 2mM MgSO4 e 10 U na mistura de 1:1 Taq Plalinum DNA Polimerase High Fidelity (Invitrogen®)/7aí/ DNA Polimerase (Cenbiot®). A reação de amplificação foi realizada em termociclador (MastercyclerGradient - Eppendorf) sob as seguintes condições: 95°C por 2 minutos, ciclos: 95°C por 30 segundos (desnaturação); 42°C por 1 minuto (anelamento dos fragmentos) e 72°C por 1 minuto (extensão da DNA polimerase), 14 ciclos: 95°C por 1 minuto, 42°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto (com um acréscimo de 20 segundos por ciclo), com uma extensão final a 72°C por 10 minutos. Dessa forma, o gene cryIIal2 selvagem submetido à técnica de embaralhamento de DNA, gerou uma população de genes variantes, seja pela introdução, deleção ou substituição de nucleotídeos (Figura I). Esse produto foi analisado em gel de agarose 1% e o amplicon de aproximadamente 2000 pb, correspondendo à população de genes cryIIal2 variantes, foi excisado e purificado com o QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN). O vetor fagomídeo pCOMB3X (Andris-Widhopf, J, Rader, C, Steinberger, P, Fuller, R, Barbas III, CF

(2000) Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181) foi submetido à digestão com a enzima de restrição Sfi I. Foram utilizados 2 μg de DNA do vetor, tampão NEB2 IX, BSA 1 mg/mL e 40 U Sfi I (New England Biolabs®), para um volume final de reação de 40 μι, ocorrendo a 50°C por 2 horas. As mesmas condições foram obedecidas para as digestões dos genes cryllal2 selvagem e variantes. Os produtos das digestões foram analisados em gel de agarose 0,8% e as bandas correspondentes ao vetor fagomídeo pCOMB3X linearizado (aproximadamente 3000 pb) e aos genes cryllal2 selvagem e variantes (aproximadamente 2000 pb) foram excisadas e purificadas com o QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN). Os novos genes reconstruídos, análogos ao gene cryllal2 selvagem, foram clonados no vetor com auxílio da enzima T4 DNA Ligase® (Invitrogen). Adicionou-se o vetor e os genes cry foram misturados na proporção de 4:1 (vetor:inserto), com a adição do tampão da enzima T4 DNA Ligase IX, enzima T4 DNA Ligase IU e ATP 20 mM, num volume final de 25 μί, a 15°C por

16 horas. O produto da ligação (pCOMB3X + cryIlal2) foi utilizado para transformar células E. coli XL-I Blue, via eletroporação. Os transformantes foram crescidos em meio LB contendo ampicilina 100 mg/mL e indicaram um título de IO6 células para a biblioteca combinatória de genes cryllal2 variantes. Uma parte dessas colônias foi analisada por PCRs de colônia e os DNAs das colônias apresentando o transgene foram 5 preparados e as seqüências determinadas utilizando os oligonucleotídeos iniciadores MMB4 (5' GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT 3'), MMB5 (5’ CGTCCATTGCATTCTTTTAAT 3’).

Exemplo 2 - Seleção das toxinas Cryllal2 variantes, análogas à toxina Cryllal2 selvagem, pela técnica de Phage display.

A biblioteca de genes análogos ao cryIIal 2 gerada por embaralhamento do

DNA e fusionados a proteína III do capsídeo do fago fílamentoso Ml3 (fagos de fusão) foi então selecionada pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display (Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK, Silverman, GJ

(2001) Selection from antibody libraries. In: Phage display - A Laboratory Manual USA: Cold Spring Laboratory, 10.1 - 10.20) utilizando como ligantes BBMVs de T. I. licus (Francis, BR, Maaty, WSA, Bulla Jr., LA (1998) Effects of Midgut-ProteinPreparative and Ligand Binding Procedures on the Toxin Binding Characteristics of BT-Rl, a Common High-Affinity Receptor in Manduca sexta for CrylA Bacillus thuringiensis Toxins. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6): 2158-2165). No procedimento de seleção por afinidade de ligação, os fagos fusionados às toxinas Cryl Ial 2 foram depositados em poços de uma placa de microtitulação previamente sensibilizadas com BBMVs (100 μg/μL), extraídas da membrana do intestino de larvas da broca gigante da cana-de-açúcar. A cada ciclo de seleção, os poços são lavados com solução PBS-Tween (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 12 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4 e 0,05% Tween 20®) e, os fagos específicos, eluídos em pll baixo, são usados para transfectar novas células de E. coli. As partículas de fagos amplificadas são utilizadas no sucessivo ciclo de seleção. O procedimento envolveu cinco ciclos de lavagem, eluição e amplificação. A titulação das colônias coletadas em cada ciclo é feito pelo plaqueamento de colônias em diluições seriais em meio SBagar contendo carbenicilina 100 μg/mL. As colônias isoladas do montante de fagos específicos eluídos no quarto ciclo de seleção (indicados como o ciclo de enriquecimento de fagos específicos) foram amplificadas com oligonucleotídeos específicos para as extremidades do vetor fagomídeo pCOMB3X, nas quais estão ligados os genes cryllal2. Cinco colônias mostrando amplificação em PCR e contendo aproximadamente 2000 pb (tamanho do gene original) foram selecionadas para a expressão em E. coli.

Exemplo 3 - Expressão dos genes selvagem e variantes em E. coli XL-I Blue.

Os genes cryllal2 selvagem e variantes selecionados por Phage display e com o tamanho esperado do inserto (aproximadamente 2000 pb), indicado pelas PCRs de colônia, foram utilizados para expressão em E. coli após indução por IPTG (Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK, Silverman, GJ (2001) Analysis of Antibody Fragment10 expressing Clones in ELISA. In: Phage display - A Laboratory Manual - USA: Cold Spring Laboratory, 11.9 - 11.12). As colônias selecionadas foram inoculadas em meio SB contendo carbenicilina [100 mg/mL] e incubadas a 37°C, sob agitação de 200 rpm até atingir a de DOôoonm = 0,5. A expressão foi induzida pela adição de IPTG (concentração final de 2 mM) utilizando agitação de 300 rpm por 16 horas a 37°C. Para 15 obter as toxinas Cry, a partir do lisado celular, as culturas induzidas foram centrifugadas a 2000 x g por 10 minutos. Os sedimentos foram solubilizados em TBS (2% do volume), e transferidos para tubos de microcentrífugas. As células foram lisadas por congelamento em nitrogênio líquido por 5 minutos seguido por descongelamento em banho-maria a 37°C por 3 minutos, repetindo-se esse procedimento por três vezes. Os 20 restos celulares foram separados por centrifugação a 15000 x g por 15 minutos e o sobrenadante contendo as toxinas Cry expressas, armazenados para utilização nos ensaios de atividade.

Exemplo 4 - Bioensaios seletivos contra broca gigante da cana-de-açúcar para determinação da atividade entomotóxica das δ-endotoxina Cryl Ial 2 análogas.

Fêmeas adultas de T. I. licus foram coletadas em campo e acondicionadas em

gaiolas com o fundo telado, de modo a permitir a separação dos ovos depositados. Após

24 horas, os ovos foram coletados e mantidos em câmara insetária (tipo B.O.D.) a 28 ±10C e 70±10% de umidade relativa. Ovos com oito dias foram individualizados em placas de 96 poços, permitindo assim, a eclosão das larvas em reservatórios separados. As larvas, depois de eclodidas, foram mantidas sobre um substrato esponjoso, o qual foi umedecido com uma dieta líquida, modificada a partir da dieta já estabelecida por HENSLEY E HAMMOND (1968) para a criação de Diatraea saccharalis. As larvas que conseguiram se alimentar da dieta mudaram de coloração e foram então transferidas para uma nova placa, contendo nova dieta, permanecendo nesta até sua utilização nos 5 bioensaios, por um período máximo de 7 dias. Devido à característica de canibalismo das larvas de T. I. licus. Foram utilizadas placas de microtitulação de 96 poços, para que as larvas ficassem individualizadas. Cada poço do experimento continha uma esponja (80% de viscose, 20% de pohéster) com, aproximadamente 1 cm , previamente embebida em suspensão de dieta liquida, com 3,5 μg/mL das toxinas CrylIal2 original 10 (SEQ ID NO 7) e variantes I, II, III, IV e V (SEQ ID NOs 8-12) expressas em bactéria. O tratamento-testemunha foi realizado com dieta sem nenhuma bactéria. Os experimentos foram realizados em triplicata em que cada unidade experimental consistia de 12 larvas de I0 instar, individualizadas em cada poço contendo os diferentes tratamentos.

As placas foram mantidas em câmara climatizada a 28±1°C, UR 70±10% e

fotoperíodo de 12 horas. Após cinco dias, o experimento foi interrompido para a avaliação de mortalidade larval dos diferentes tratamentos. Os valores de mortalidade foram comparados utilizando-se de análise de variância pelo teste de Tukey, ao nível de significância de 5% (Figura 2).

Exemplo 5 - Determinação da seqüência primária das toxinas análogas Cryl Ial2.

Os genes análogos cryIIal 2 selecionados por PCRs de colônia foram submetidos a reações de sequenciamento nas seguintes condições: 500 ng de DNA plasmidial contendo os análogos e 3 μΜ de oligonucleotídeos específicos (VarPhaDispJnt FOR (5' CTTTAGCATTATTGTGTTCC 3'), VarPhaDisp Int REV 25 (5’ CGCATACCCGTACGACGTTCC 3'), VarPhaDisp_Int_FOR_2 (5' G AAATCGT AAT AAC AC AAGGG 3') e VarPhaDisp_Int_REV_2 (5' CCAGCACCATCACCATCACC 3')), em um seqüenciador automático modelo ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Ao final, foram selecionadas cinco seqüências análogas ao gene cryIIa 12 (variantes I, II, III, IV e V - SEQ ID NO 2-6, respectivamente). As novas moléculas geradas pela recombinação do gene cryIIal2 apresentaram diferenças de 0,15 a 1,24% de resíduos de aminoácidos modificados. Para a análise das seqüências e classificação das mesmas como análogas do gene cryIIa 12 selvagem, estas moléculas foram agrupadas por similaridade de seqüências nucleotídicas. Mesmo havendo mutações nucleotídicas nas seqüências geradas, poucas significaram modificações de resíduos de 5 aminoácidos (até 1,08%) (Tabela I). Duas novas moléculas Cryllal2, variante II (SEQ ID NO 8) e variante V (SEQ ID NO 11), se mostraram aproximadamente 3 vezes mais ativas que a molécula selvagem (Cryllal2 - SEQ ID NO 1) exibindo uma mortalidade de 55,5 e 75%> das larvas neonatas alimentadas com dieta contendo 3 μg de proteína por mililitro de dieta líquida. Os modelos de Cryllal2 e de seus análogos mostraram o 10 mesmo arcabouço estrutural, sendo diferenças observadas apenas nas cadeias laterais dos aminoácidos substituídos no análogo. As estruturas selvagem e análoga CrylIal2 apresentam os três domínios funcionais conservados (I, II, e III), típicos das toxinas Cry.

Tabela 1. Mutações encontradas nas toxinas Cryllal2 variantes.

Variantes CrylIal2 Mutações Domínio I (SEQ ID NO 8) S84G I R159K I G380R II II (SEQ ID NO 9) S84G I R159K I L212del I S213del I D233N I Q413S II P414T II P419L II III (SEQ ID NO 10) S84G I IV (SEQ ID NO 11) S84G I R159K I G380R II K426_F427insK II V (SEQ ID NO 12)

D233N

Claims

1.Moléculas isoladas de ácido nucleico caracterizadas por compreender: a) seqüências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6; b) complementos das seqüências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6; c) complementos reversos das seqüências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6; d) seqüências reversas das seqüências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6.

2.Construção gênica caracterizada por compreender a molécula isolada da reivindicação 1.

3.Construção gênica caracterizada por compreender: a) um promotor opcionalmente ligado a uma seqüência líder e operacionalmente ligado a b) uma seqüência codificadora selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6.

4. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato do promotor ser selecionado do grupo consistindo de constitutivos, induzíveis e tecido-específicos.

5. Construção gênica de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo fato do promotor tecido-específico ser selecionado entre promotores UbiI, Ubi 9 e Actl.

6. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato do promotor conter elementos enhancers.

7. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato do promotor poder ser expresso em plantas, animais, bactérias, fungos ou insetos.

8. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato da seqüência líder ser obtida do mesmo gene que o promotor utilizado para dirigir a transcrição da molécula isolada de ácido nucleico.

9. Vetor binário caracterizado por conter uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-8.

10. Vetor binário caracterizado por compreender: a. um promotor opcionalmente ligado a uma seqüência líder e operacionalmente ligado a b. uma seqüência codificadora selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6 operacionalmente ligada a c. um sinal de terminação; d. uma origem de replicação; e. um marcador seletivo; e f. um sítio de clonagem.

11. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do promotor ser selecionado do grupo consistindo de constitutivos, induzíveis e tecido-específicos.

12. Vetor binário de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato do promotor constitutivo ser selecionado entre promotores Ubi 1, Ubi9 e Actl.

13. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do promotor conter elementos enhancers.

14. Vetor binário de acordo coma reivindicação 10 caracterizado pelo fato da seqüência líder ser obtida do mesmo gene que o promotor utilizado para dirigir a transcrição da molécula isolada de ácido nucleico.

15. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do promotor poder ser expresso em plantas, animais, bactérias, fungos ou insetos.

16. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do sinal de terminação ser selecionado do grupo sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.

17. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do marcador seletivo ser selecionado entre seqüências que conferem resistência a antibióticos ou marcadores visuais.

18. Vetor binário de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato marcador seletivo ser selecionado entre as seqüências codificadoras dos genes canamicina, neomicina, ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, higromicina, geneticina, fosfinotricina, glifosato, glufosinato de amônio, AHAS, BAR e GUS.

19. Polipeptídeos isolados, caracterizados por compreender seqüências substancialmente similares a qualquer uma das seqüências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 8-12.

20. Polipeptídeos de acordo com a reivindicação 19, caracterizados por exibir atividade inseticida, quando administrado oralmente, a larvas de insetos susceptíveis.

21. Polipeptídeos de acordo com a reivindicação 19, caracterizados por exibir atividade inseticida, quando fornecido em uma dieta administrada oralmente a uma larva de inseto lepdóptero.

22. Polipeptídeos de acordo com a reivindicação 21, caracterizados pelo fato de a larva de inseto ser uma larva de broca gigante da cana-de-açúcar.

23. Polipeptídeos isolados de acordo com as reivindicações 19 a 22, caracterizados por ser uma δ-endotoxina.

24. Célula transformada caracterizada pelo fato de conter uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.

25. Célula transformada caracterizada pelo fato de conter um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18.

26. Célula transformada caracterizada pelo fato de conter um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23.

27. Célula transformada de acordo com as reivindicações 24-26 caracterizada pelo fato da célula ser oriunda de qualquer um dos grupos consistindo de bactérias, fungos, insetos, mamíferos e vegetais.

28. Planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progênie da mesma caracterizada por compreender uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.

29. Planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progênie da mesma caracterizada por compreender um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18.

30. Planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progênie da mesma caracterizada pelo fato de possuir um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23.

31. Microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.

32. Microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18.

33. Microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23.

34. Método para produzir um organismo geneticamente modificado caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8 ou um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18; b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b); d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo a construção gênica ou vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 18.

35. Método para produção de proteína recombinante caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18; b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b); d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18; e. Fazer a extração da proteína recombinante produzida nos organismos selecionados na etapa (d).

36. Proteína recombinante obtida através do método descrito na reivindicação 35.

37. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 36 caracterizada pelo fato da proteína ter atividade δ-endotoxina.

38. Composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender uma concentração eficaz do polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23 ou análogo mutante, em um veículo carreador agronomicamente aceitável.

39. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de o veículo carreador aceitável ser um microorganismo transformado.

40. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que um veículo carreador aceitável pode ser um agente superfície-ativo, um veículo carreador inerte, um preservativo, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificador, um corante, um protetor uv (ultra-violeta), um tampão, um agente de lluxo ou fertilizante, doadores de micronutriente, ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta.

41. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de o polipeptídeo uma das reivindicações de 19 a 23 ou análogo mutante ser usado em combinação com outras proteínas inseticidas.

42. Método para o controle de uma praga caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente; b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou com uma composição da invenção, em que a referida proteína consiste das seqüências selecionadas do grupo de seqüências de aminoácidos descritas em SEQ ID N0. 8-12.

43. Método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8 ou um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18; b) regenerar linhagens transgênicas contendo a referida construção estavelmente integrada em seus genomas; c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de expressão da δendotoxina da invenção.