BR102012017234A2 - Composições farmacêuticas compreendendo peptídeos catiônicos incluídos e/ou associados à ciclodextrinas e usos - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO PEPTÍDEOS CATIÔNICOS INCLUÍDOS E/OU ASSOCIADOS À CICLODEXTRINAS E USOS. A presente invenção apresenta composições farmacêuticas, com atividade antomicrobana e antiproliferativa, de peptídeos catiônicos incluídos e/ou associados à ciclodextrinas. Mais particularmente, as composições compreende os peptídeos catiônicos LL37f, KR12 ou LyeTxl isolados ou misturados, associados ou incluídos em ciclodextrina, para o tratamento da doença periodontal.

Description

“COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO PEPTIDEOS CATIÔNICOS INCLUÍDOS E/OU ASSOCIADOS À CICLODEXTR1NAS E

USOS”

A presente invenção apresenta composições farmacêuticas, com 5 atividade antimicrobiana e antiproliferativa, de peptídeos catiônicos incluídos e/ou associados à ciclodextrinas. Mais particularmente, as composições compreendem os peptídeos catiônicos LL37f, KR12 ou LyeTxI isolados ou misturados, associados ou incluídos em ciclodextrina, para o tratamento da doença periodontal.

A doença periodontal é uma patologia complexa que envolve interações

entre os microrganismos na cavidade oral e fatores do hospedeiro, como as respostas imunológicas e diferenças genéticas, o que causa alteração da homeostase do tecido conectivo e manifestações clínicas (Tatakis DN. et al. Etiology and pathogenesis of periodontal diseases. Dent Clin North Am 15 2005;49:491-516, Offenbacher S. et al. Periodontal disease at the biofilm- gingival interface. J Periodontol 2007;78:1911-1925). As diferenças genéticas entre os indivíduos parecem ter um impacto elevado no risco de doença periodontal, principalmente pela alteração das respostas do hospedeiro o que modifica a gravidade clínica da doença (Kornman KS et al. The interleukin-1 20 genotype as a severity factor in adult periodontal disease. J Clin Periodontol 1997;24:72-77).

A fase inicial da doença periodontal, denominada gengivite, é definida como a inflamação da gengiva, com ausência de perda de inserção clínica (CAL) (Parameter on plaque-induced gingivitis. American Academy of 25 Periodontology. J Periodontol 2000; 71:851-852.). A gengivite se caracteriza clinicamente por vermelhidão da gengiva, hemorragia e aumento do fluxo do fluído crevicular gengival (GCF) (The pathogenesis of periodontal diseases. J Periodontol 1999; 70:457-470).

A lesão inicial da gengivite aparece como uma resposta inflamatória aguda com infiltrado de neutrófilos, alterações vasculares, alterações de células epiteliais e degradação do colágeno. A quimiotaxia dos neutrófilos e a vasodilatação são devidas aos componentes bacterianos, bem como à ativação de sistemas do hospedeiro, tais como o complemento, a cinina e vias do ácido araquidônico (Kornman KS. Mapping the Pathogenesis of Periodontitis: A New Look. J Periodontol 2008;79:1560-1568, Kinane DF et al. Clinicai, pathological and immunological aspects of periodontal disease. Acta Odontol Scand 5 2001;59:154-160).

Na evolução da doença observam-se lesões com infiltrado linfóide com predomínio de linfócitos T e extensa perda de colágeno. No entanto, na lesão estabelecida predominam os linfócitos B e células plasmáticas. O infiltrado inflamatório crônico, bem como a proliferação do epitélio juncional e a 10 destruição do colágeno, são resultantes da ativação dos fagócitos mononucleares e fibroblastos por produtos bacterianos com recrutamento e ativação do sistema imune local e vias de citocinas (Kinane DF et al. Clinicai, pathological and immunological aspects of periodontal disease. Acta Odontol Scand 2001;59:154-160, Kornman KS. Mapping the Pathogenesis of 15 Periodontitis: A New Look. J Periodontol 2008; 79:1560-1568).

A cavidade oral pode ser colonizada por mais de 700 espécies de bactérias, sendo maior a contagem microbiológica nas bolsas período ntais mais profundas (Lindhe et al. Clinicai periodontology and implant dentistry. Blackwell Munksgaard; 2008). As diferentes condições clínicas do periodonto 20 estão associadas com a presença de diversos microrganismos. São considerados compatíveis com a saúde periodontal microrganismos como Streptococcus sanguis, S. mitis, Veionella parvula, A. naeslundi e A. viscosus, dentre outros (Dibart S et al. Identification of bacterial species on or in crevicular epithelial cells from healthy and periodontally diseased patients using 25 DNA-DNA hybridization. Oral Microbiol Immunol 1998;13:30-35). Nas gengivites, são mais frequentemente encontradas espécies de Aetinomyees, Streptoeoeeus, VeioneUa, Fusobacterium e Prevotella intermedia (Lindhe et al. Clinicai periodontology and implant dentistry: Blackwell Munksgaard; 2008). Por sua vez, são mais freqüentes em doença periodontal Porphyromonas 30 gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola e Aggregatibacter aetinomycetemcomitans (Chalabi M et al. Periodontopathie bactéria and herpesviruses in chronic periodontitis. Mol Oral Mierobiol 2010;25:236-240). Devido a essas associações entre doença periodontal e determinados grupos de microrganismos, Socransky et al. (1998) sugeriram que uma melhor compreensão da doença periodontal deve incluir os microrganismos como consórcios e não de forma isolada. Isto tornou-se evidente após a análise de 5 mais de 13.000 amostras de placa bacteriana de 185 indivíduos, usando-se a técnica de hibridização de DNA - DNA e uma complexa análise estatística. Como resultado destes estudos definiu-se que o complexo mais patogênico é composto por P. gingivalis, T. forsythia e Treponema denticola (complexo vermelho), que depende da colonização inicial da bolsa de microrganismos 10 menos patogênicos agrupados em outros complexos microbianos (Socransky SS, et al. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol. 1998;25: 134-144).

Diferenças demográficas na composição da microbiota subgengival foram demonstradas. Amos tras d e micro biota su bgengival de pacien tes d e diversas nacionalidades tais como, Chile, Colômbia e Espanha foram estudadas por Herrera et al. Os resultados deste estudo mostraram diferenças na frequência de detecção e proporções de importantes patógenos periodontais, especialmente microrganismos do complexo vermelho, P. gingivalis e T. forsythia, e bactérias entéricas. A prevalência de P. gingivalis foi alta (>50%) na Colômbia, Espanha e Chile. A frequência de T. forsythia foi menor no Chile do que na Colômbia e Espanha. Os microrganismos mais frequentemente detectados em chilenos foram P. gingivalis, Fusobacterium spp., E. corrodens, P. micra e, com a mesma frequência, P. intermédia/nigrescens e A. actinomycetemcomitans. Por outro lado, as bactérias mais prevalentes nos indivíduos colombianos examinados foram Fusobacterium spp., P. intermédia/nigrescens, P. gingivalis, T forsythia e bactérias entéricas gram-negativas, e com menos frequência, P. micra. Em indivíduos da Espanha, Fusobacterium spp., P. intermédia/ nigrescens, P. gingivalis, P. micra e T. forsythia foram os mais comumente isolados. Em contraste, bactérias entéricas gram-negativas estiveram ausentes nos indivíduos espanhóis. A. actinomycetemcomitans foi detectado em baixas proporções e frequência nas três populações (Herrera D et al. Subgingival microbial profiles in chronic periodontitis patients from Chile, Colombia and Spain. J ofClin Periodontol 2008; 35: 106-113).

Estudos microbiológicos no Brasil mostraram também a relação entre o microrganismo colonizador e o estado periodontal. Cortelli et al. examinaram 5 203 indivíduos; 25 com periodontite agressiva e 178 com periodontite crônica. Neste estudo, P. gingivalis foi a bactéria mais prevalente nas duas condições clínicas, 80% e 68%, respectivamente. Nos casos de periodontite agressiva, A. actinomycetemcomitans (72%) e C. rectus (48%) foram mais prevalentes (Cortelli JR et al. Prevalence of periodontal pathogens in Brazilians with 10 aggressive or chronic periodontitis. J Clin Periodontol 2005;32:860-866).

A carga microbiana na doença periodontal é muito importante devido à alta virulência das bactérias presentes no biofilme. Um exemplo é P. gingivalis a qual é altamente patogênica devido a múltiplos fatores de virulência que facilitam sua aderência, colonização e o subsequente estabelecimento da 15 infecção no periodonto dos indivíduos. As fímbrias bacterianas são um dos fatores de virulência que agem primeiramente no momento da colonização e facilitam a adesão do microrganismo à película adquirida na superfície dental (Nakano K. et al. Distribution of P. gingivalis fimA genotypes in cardiovascular specimens from Japanese patients. Oral Microbiol Immunol 2008;23:170-172). 20 As fímbrias, também são capazes de produzir uma alta resposta inflamatória através de seus lipopolissacarídeos que são reconhecidos por receptores Toll- Iike (TLR), estimulando a produção de citocinas pró-inflamatórias por células da resposta imune (Pathirana RD et al. Host immune responses to Porphyromonas gingivalis antigens. Periodontol 2000 2010;52:218-237). Verificou-se que a 25 resposta imune pode ser suprimida através de outros fatores de virulência como cápsula, proteases de imunoglobulina, cisteíno-protease (gingipain) e ácidos graxos de cadeia curta (Holt SC et al. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol 2000 1999;20:168-238).

Por outro lado, a doença periodontal (entendida como um estado de infecção e inflamação crônicas) tem se correlacionado com múltiplas doenças sistêmicas como diabetes, síndrome metabólica, artrite reumatoide, osteoporose, pré-eclâmpsia, baixo peso ao nascer e doenças cardiovasculares, como infarto agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral (Nakano K et al. Distribution of Porphyromonas gingivalis fimA genotypes in cardiovascular specimens from Japanese patients. Oral Microbiol Immunol 2008;23:170-172, Perez-Chaparro PJ. Et al. Genotypic characterization of Porphyromonas 5 gingivalis isolated from subgingival plaque and blood sample in positive bacteremia subjects with periodontitis. J Ciin Periodontol 2008;35:748-753. Epub 2008 JuI 2025, Contreras A. Compelling evidence reveals that oral chronic infection and oral inflammation generate systemic consequences. Colomb Med 2011;42:416-417). A relação da doença periodontal com as 10 doenças sistêmicas é apoiada pela evidência experimental que associa os fatores de virulência dos microrganismos periodontais, como a capacidade de induzir agregação das plaquetas e formação de células espumosas no desenvolvimento do ateroma (Lalla E1 et al. Oral infection with a periodontal pathogen accelerates early atherosclerosis in apolipoprotein E-null mice. 15 Arterioscler Thromb Vasc Bioi 2003;23:1405-1411). Além disso, microrganismos periodontais têm sido encontrados em placas ateromatosas de pacientes com doença periodontal. Marcelino et al. estudou 28 indivíduos brasileiros com periodontite crônica e encontrou em 19 deles (67,9%) DNA de microrganismos periodontais, sendo P. gingivalis a bactéria mais freqüente (n= 20 14 - 50%), seguida de P. intermedia (n= 5,17 - 9%); E. fecalis e P. nigresces (n= 4,14 - 3%); A. actinomycetemcomitans, C. rectus e T. forsythia (n= 2,7 - 1%) e, por último, P. endodontalis e T. denticola (n= 1,3 - 6%) (Marcelino SL, et al. Presence of periodontopathic bactéria in coronary arteries from patients with chronic periodontitis. Anaerobe 2010;16:629-632).

O desequilíbrio entre o biofilme polimicrobiano e a resposta inflamatória

produzida pelo hospedeiro para eliminá-lo são as causas da doença periodontal, tornando importante sua eliminação para tratar a periodontite, a qual ajudaria a reduzir a carga inflamatória local e sistêmica da doença.

O tratamento convencional da doença periodontal é a raspagem e o aiisamento radicular (SRP), o qual tem como objetivo a desorganização mecânica do biofilme e a eliminação dos cálculos dentais, causando a diminuição dos patógenos periodontais e o aumento da microbiota compatível com a saúde bucal (Haffajee AD, et al. The effect of SRP on the clinicai and microbiological parameters of periodontal diseases. J Clin Periodontol 1997;24:324-334, Cugini MA, et al. The effect of scaling and root planing on the clinicai and microbiological parameters of periodontal diseases: 12-month 5 results. J Clin Periodontol 2000;27:30-36). Porém, o SRP traz consigo efeitos adversos na cicatrização dos tecidos periodontais. Após o tratamento periodontal por SRP, a cicatrização do tecido está acompanhada de migração apical do epitélio (epitélio juncional longo) o que não permite a formação eficiente de osso e a fixação do tecido conjuntivo, impedindo assim a 10 regeneração e o restabelecimento dos niveis de inserção periodontal perdidos com a doença (Graber HG, et al. Role of interactions between integrins and extracellular matrix components in healthy epithelial tissue and establishment of a Iong junctional epithelium during periodontal wound healing: A review. J Periodontol 1999;70:1511-1522). Em estados não patogênicos, o epitélio 15 juncional longo continua com o epitélio oral e fornece a ligação entre o dente e a gengiva, além disso este epitélio pode se desenvolver a partir do epitélio oral (Lindhe et al. Clinicai periodontology and implant dentistry: Blackwell Munksgaard; 2008).

Alem disso, a terapia mecânica é incapaz de erradicar a totalidade de algumas das espécies patogênicas (Cugini MA, et al. The effect of scaling and root planing on the clinicai and microbiological parameters of periodontal diseases: 12-month results. J Clin Periodontol 2000;27:30-36). A persistência dos periodontopatógenos na cavidade oral após o SRP, está relacionado à capacidade destes de residir em tecidos moles, túbulos dentinários, ou em irregularidades da superfície radicular (Adriaens PA, et al. Bacterial invasion in root cementum and radicular dentin of periodontally diseased teeth in humans - a reservoir of periodontopathic bactéria. J Periodontol 1988;59:222-230). Estes sítios podem atuar como reservatórios para a recolonização dos tecidos periodontais e, assim contribuir para a falha do tratamento (Sbordone L, et al. Recolonization of the subgingival microflora after scaling and root planing in human periodontitis. J Periodontol 1990;61:579-584). Nos últimos anos, tem se utilizado a terapia mecânica em combinação com antibióticos como estratégia para combater a recolonização da cavidade oral por patógenos periodontais após o SRP1 o qual tem mostrado, além da diminuição da carga microbiana, um maior ganho de inserção clínica e redução 5 da profundidade à sondagem (PD) (Mombelli A. Antimicrobial profiles of periodontal pathogens and systemic antimicrobial therapy. J Clin Periodontol 2005;32:891-892). Contudo, os microrganismos tem mostrado capacidade de se adaptar à condições adversas do ambiente e desenvolvido fatores de resistência aos antibióticos. Gomes et al. investigaram a susceptibilidade a 10 amoxicillina, amoxicillina + clavulanato, benzilpeniciílina, clindamicina, eritromicina, e metronidazol de microrganismos orais, por um período de nove anos. Neste estudo, os pesquisadores concluíram que a amoxicilina e amoxicilina+clavulanato foram eficazes contra todas as espécies, nos diferentes períodos de estudo, com exceção de F. nucleatum. No entanto, o 15 aumento na resistência dos microrganismos anaeróbicos à benzilpenicilina e clindamicina foi observada, principalmente para os isolados de F. nucleatum; para P intermedia/nigrescens, nesses casos não houve mudanças nos perfis de sensibilidade nos nove anos de estudo. As cepas de P. oralis mostraram uma tendência à resistência ao longo do tempo. A efetividade da eritromicina 20 contra F. nucleatum diminuiu entre os anos 2003 - 2005 e 2007 - 2008. Os valores da concentração inibitória mínima (MIC, Inhibitory Minimal Concentration) determinados neste estudo mostraram uma ampla variedade, especialmente para a eritromicina e metronidazol, o que demonstra uma elevada variabilidade no perfil de susceptibilidade das cepas a estes fármacos 25 (Gomes BPFA, et al. Analysis of the Antimicrobial Susceptibility of Anaerobic Bactéria Isoíated from Endodontic Infections in Brazil during a Period of Nine Years. J Endod 2011 ;37:1058-1062).

A complexidade do biofilme periodontal faz com que a susceptibilidade dos microrganismos no interior deste seja menor que a susceptibilidade dos microrganismos planctônicos. Larsen testou a susceptibilidade de P. gingivalis contra amoxicilina, doxiciclina e metronidazol no estado planctônico e no interior do biofilme, e encontrou que a MIC das células do biofilme era maior que a MiC das células planctônicas, especialmente para o metronidazol (Larsen T. Susceptibility of Porphyromonas gingivalis in biofilms to amoxicillin, doxycycline and metronidazole. Oral Microbiol Immunol 2002; 17:267-271). Este fato foi também provado por Eick et al. em um modelo de biofilme in vitro. Uma 5 concentração de clindamicina 100 vezes maior à MIC para células planctônicas não apresentou nenhum efeito na eliminação dos biofilmes de S. constellatus e A. actinomycetemcomitans, enquanto no número de células viáveis do biofilme de P. gingivalis, houve uma redução dependente da concentração do antibiótico. Porém, apenas uma concentração 50 vezes maior que a MIC para 10 clindamicina e doxiciclina foi capaz de eliminar totalmente o biofilme depois de 48 horas de exposição. Concentrações desde 10 e 50 vezes maiores que a MIC para bactérias planctônicas foram necessárias para a erradicação do biofilme de A. actinomycetemcomitans, depois de 48 e 24 horas de exposição, respectivamente. No caso de metronidazol uma concentração 100 vezes maior 15 que o MIC foi capaz de eliminar o biofilme de P. gingivalis (Eick S, et al. Efficacy of antibiotics to strains of periodontopathogenic bactéria within a single species biofilm - an in vitro study. J Clin Periodontot 2004;31:376-383).

Novos compostos antimicrobianos têm sido propostos com capacidade de atuar em múltiplas espécies responsáveis pela doença periodontal, 20 principalmente aquelas mais patogênicas, já que são as que produzem maior injúria tecidual e maior grau de inflamação local e sistêmica. Por outro lado, estes compostos devem ser ativos no interior do biofilme, pois como relatado anteriormente, a resistência das bactérias no biofilme é maior que as bactérias planctônicas.

Com o advento dos peptídeos antimicrobianos (AMPs), com atividade

sobre bactérias gram-negativas, gram-positivas e fungos (Giacometti A, et al. Antimicrobial activity of polycationic peptides. Peptides 1999;20:1265-1273) é promissor estudar as possíveis ações destes AMPs sobre as bactérias orais, buscando-se novas alternativas de tratamento que superem a resistência 30 destes microrganismos aos medicamentos convencionais. Os AMPs, em geral, não são sensíveis aos mecanismos de resistência antibiótica já desenvolvidos pelas bactérias, porque as bactérias não tem demonstrado resistência à ação dos mesmos (Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002;415:389-395). Além disso, o alvo dos AMPs é a membrana bacteriana e não uma proteína específica como a maioria dos antibióticos disponíveis atualmente, o que torna menos provável a geração de resistência 5 bacteriana por uma mutação genética (Peschel A1 et al. The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial resistance. Nat Rev Microbiol 2006; 4:529-536).

Os AMPs são importantes moléculas de defesa dos organismos eucariotas, sendo encontrados em plantas, insetos e vertebrados (Zasloff M. 10 Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002;415:389-395). Estes são peptídeos curtos, carregados positivamente e anfipáticos que tem uma ampla ação antimicrobiana e uma importante função na resposta imune inata (Bachrach G, et ai. Resistance of Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 to direct killing by antimicrobial peptides is protease independent. Antimicrob 15 Agents Chemother 2008;52:638-642). O modelo de ação que tem sido proposto para a interação de peptídeos com a membrana é o deslocamento de lipídeos de membrana, alterando a estrutura da mesma, formando poros e, em alguns casos, permitindo a entrada destes peptídeos na célula-alvo (Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002;415:389-395).

Atualmente, na base de dados de peptídeos antimicrobianos do

Departamento de patologia da Universidade de Nebraska, estão reportados quase 1500 AMPs de diferentes origens (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Um dos peptídeos antimicrobianos de origem eucariótica amplamente estudado é o peptídeo LL37, o qual faz parte da família das catelicidinas. As catelicidinas 25 foram descobertas inicialmente em mamíferos, no entanto, recentemente foram também e ncontradas em três esp écies di ferentes de peixes. Emh umanos apenas uma catelicidina foi identificada do cDNA da medula óssea e isolada dos neutrófílos (Okumura K. Cathelicidins—Therapeutic antimicrobial and antitumor host defense peptides for oral diseases. Jap Dent Sci Rev 30 2011;47:67-81). O LL37 estimula, nos queratinócitos humanos, a produção do perfil citoquinas Th1, IL-6, IL-8, TNF-α, o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e IL-1 (Daffre S1 et al. Bioactive natural peptides. Stud Nat Prod Chem 2008;35:597-691). Sua concentração aumenta em infecções e feridas cutâneas tendo um papel protetor contra infecções de bactérias invasoras como P. aeruginosa, S. aureus, e espécies dos Streptococcus spp. (Steinstraesser L, et al. Host defense peptides and their antimicrobial-immunomodulatory duality. Immunobiology 2011;216:322-333). Kim et al. testaram a atividade antimicrobiana do peptídeo expressado e secretado por uma variedade transgênica da levedura Piehia pastoris contra, S. aureus, Microecoeus Iuteusi e Salmonella gastroentertis, encontrando uma atividade antimicrobiana máxima após 72 horas de incubação. O estudo anterior além de evidenciar a atividade antimicrobiana do peptídeo recombinante, também mostra a utilidade da expressão de peptídeos antimicrobianos em sistemas de expressão de leveduras o que poderia ser de grande ajuda para aplicações industriais e farmacêuticas dos mesmos (Kim SJ, et al. Antibacterial activity of recombinant hCAP18/LL37 protein secreted from Pichia pastoris. J Mierobiol 2009;47:358-362).

A atividade do peptídeo LL37 não se re stringe som ente à atividade antimicrobiana. O peptídeo LL37 tem se mostrado um potente agente imunomodulador por inibir a estimulação de macrófagos por componentes bacterianos tais como LPS, ácido lipoteicóico e Iipoarabinomannan (Scott MG, 20 et al. The human antimicrobial peptide LL-37 is a multifunctional modulator of innate immune responses. J Immunol 2002;169:3883-3891).

A deficiência de LL37 em humanos está correlacionada ao desenvolvimento de doença p eriodontal s evera. Pütse p e t al. estudaram 6 pacientes com Sindrome de Kostmann (neutropenia congênita grave), 25 determinaram os níveis do peptídeo LL37 no sangue e na saliva e estes níveis foram correlacionados com o grau de doença periodontal. O peptídeo não foi detectado em nenhuma das amostras de pacientes com neutropenia congênita e todos eles tinham doença periodontal severa. Os peptídeos antibacterianos são parte da primeira linha da defesa imune antibacteriana e sua deficiência 30 nos pacientes com Síndrome de Kostmann está diretamente correlacionada com uma maior incidência de doença periodontal severa (Putsep K, et al. Deficiency of antibacterial peptides in patients with morbus Kostmann: an observation study. Lancet 2002;360:1144-1149).

Murakami M. et al., demonstraram que, após a secreção na superfície da pele, o peptídeo LL37 é processado por uma serino-protease em três novos peptídeos antimicrobianos distintos, o peptídeo RK-31 (RKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES), KS-30

(KSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES) e KR-20 - denominado neste pedido de patente LL37f (KRIVQRIKDFLRNLVPRTES). A clivagem proteolítica do peptídeo LL37, a peptídeos mais curtos diminuiu a atividade hemolítica e a 10 capacidade de estimular a secreção de IL-8 pelos queratinócitos assim como o aumento da atividade antimicrobiana, evidenciada pela diminuição das MIC para S. aureus e C. albicans e na sua capacidade de inibir o crescimento de um tipo selvagem de S. aureus, o qual tem desenvolvido resistência a peptídeos catiônicos tais como defensinas e LL37 por modificação da carga 15 superficial (Murakami M, et al. Postsecretory processing generates multiple cathelicidins for enhanced topica! antimicrobial defense. J Immunol 2004;172:3070-3077). A menor seqüência de LL37 que conserva a atividade antimicrobiana foi identificada por Wang G., o peptídeo KR12 (KRIVQRIKDFLR), que corresponde aos resíduos 18-29 de LL37. O peptídeo 20 KR12 apresentou um efeito seletivo contra as bactérias, ao não ser citotóxico em células humanas até 100 pg/mL (Wang G. Structures of Human Host Defense Cathelicidin LL37 and Its Smallest Antimicrobial Peptide KR-12 in Lipid Micelles. J Biol Chem 2008;283:32637-32643).

Os AMPs de invertebrados podem ser encontrados em diferentes 25 artrópodes como mosquitos, escorpiões e aranhas, entre outros. Animais peçonhentos, incluindo os aracnídeos, têm diversas substâncias ativas compondo seus venenos. Dentre estas substâncias destacam-se os peptídeos de baixo peso molecular com ação neurotóxica, que atuam principalmente em canais iônicos (De Lima ME, et al. Peptides of arachnid venoms with 30 insecticidal activity targeting sodium channels. Comp Biochem and Physiol 2007;146:264-279; Rates B et al. From the stretcher to the pharmacy's shelf: drug Ieads from medically important brazilian venomous arachnid species. Inflamm Allergy Drug Targets 2011;10:411-9). No veneno das aranhas também são isolados peptídeos com atividade antimicrobiana, como, por exemplo, em Cupiennius salei (Haeberli S, et al. Characterisation of antibacterial activity of peptide isolated from the venom of the spider Cupiennius salei (Araneae : 5 Ctenidae). Toxicon 2000;38:373-380) e Lycosa erythrognatha (Santos DM, et al. LyeTx I, a potent antimicrobial peptide from the venom of the spider Lycosa erythrognatha. Amino Acids 2010;39:135-144).

Variados peptídeos antimicrobianos têm sido isolados do gênero Lyeosa spp. como a Licotoxina I e Il do veneno da aranha Lyeosa earolinensis. Estas toxinas são peptídeos catiônicos que contêm 25 e 27 aminoácidos, respectivamente, com uma homologia na seqüência de 52% e uma estrutura secundária anfipática, catiônica e com conformação α-hélice. As Iicotoxinas mostraram uma potente atividade antimicrobiana. A Licotoxina Il foi mais ativa contra E. eoli, mostrando a atividade inibitória em concentrações baixas, como 40 μΜ, em comparação com 80-150 μΜ para Licotoxina I. A espécie mais sensível à Licotoxina I foi a bactéria gram-positiva, B. thuringiensis israelensis, com um MIC de 5 μΜ. Finalmente, Licotoxinas I e Il inibiram o crescimento da levedura C. albieans (MIC 40 μΜ) (Yans LZ, et al. Lycotoxins, antimicrobial peptides from venom of the wolf spider Lycosa earolinensis. J Biol Chem 1998;273:2059-2066). O veneno da espécie L. singoriensis é outra fonte de peptídeos antimicrobianos. Os AMPs isolados desta espécie, chamados Licocitinas 1, 2 e 3, podem inibir o crescimento de bactérias gram-positivas, gram-negativas e fungos em concentrações micromolares (Liu ZH, et al. Biochemical and pharmacological study of venom of the wolf spider Lycosa singoriensis. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis 2009;15:79-92).

Na espécie Lyeosa erythrognata, um peptídeo com atividade antimicrobiana, LyeTxI, foi isolado, sequenciado e obtido por síntese química em fase sólida no Laboratório de Venenos e Toxinas Animais do Departamento de Bioquímica e Imunologia da UFMG. O LyeTxI nativo e sintético 30 apresentaram a tividade anti microbiana c ontra Escheriehia e oli, S. aure us e fungos, como Candida krusei e Cryptoeoceus neoformans, dentre outros, com valores de MIC semelhantes aos valores relatados na literatura com peptídeos semelhantes ou a antibióticos convencionais. O mecanismo de ação do LyeTxI parece estar relacionado à formação de poros na membrana, como evidenciados por estudos com Iipossomas (Santos DM, et al. LyeTx I, a potent antimicrobial peptide from the venom of the spider Lycosa erythrognatha.

Amino Acids 2010;39:135-144). Porém, até a presente data não foi estudada sua efetividade contra bactérias anaeróbicas periodontais.

Algumas espécies bacterianas são resistentes aos AMPs por múltiplos mecanismos (Brogden KA. Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bactéria? Nat Rev Microbiol 2005;3:238-250). S. aureus, por exemplo, altera sua carga superficial ao introduzir grupos amino-básicos, em sua parede de ácido lipoteicóico (Peschel A, et al. Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor MprF is based on modification of membrane Iipids with L-lysine. J Exp Med 2001; 193:1067-1076); as espécies capsuladas de K. pneumoniae são mais resistentes aos AMPs, já que a cápsula limita a interação do peptídeo com seu alvo, a membrana celular (Campos MA, et al. Capsule polysaccharide mediates bacterial resistance to antimicrobial peptides. Infect Immun 2004;72:7107-7114). Por último, algumas bactérias podem produzir enzimas proteolíticas com a capacidade de inativar os AMPs (Sieprawska-Lupa M, et al. Degradation of human antimicrobial peptide LL-37 by Staphylococcus aureus- derived proteinases. Antimierob Agents Chemother 2004;48:4673-4679).

O uso dos peptídeos antimicrobianos como agentes terapêuticos nas infecções bacterianas apresentam grandes vantagens como seu amplo espetro de ação, a limitada toxicidade e pouca resistência bacteriana, embora, algumas 25 bactérias tem desenvolvido resistência. Porém, seu uso prático é limitado devido à alta qua ntidade de peptídeo necessário p ara exercer sua função microbicida, o que faz a produção de formulações farmacêuticas um processo muito oneroso. Além disso o uso terapêutico de proteínas e peptídeos é restrito devido à limitada solubilidade e estabilidade destes. A formação de compostos 30 de inclusão entre as CDs e os peptídeos tem mostrado uma melhoria na solubilidade e estabilidade e uma diminuição na sua agregação e precipitação, o que poderia ser o resultado da estabilização da forma funcional nativa das proteínas em solução.

As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos não higroscópicos solúveis em água. As CDs naturais são denominadas aCD, pCD e yCD, 5 segundo o numero de unidades de glicopiranose; sendo que a aCD é composta por seis unidades, a βϋϋ por sete e yCD por oito (Loftsson T, et al. Self-association of cyclodextrins and cyclodextrin complexes. J Pharm Sci 2004;93:1091-1099). A descrição da estrutura das CDs é comparada com um cone truncado, caracterizado por um exterior hidrofílico e uma cavidade 10 hidrofóbica que permite a formação de complexos supramoleculares com a molécula hóspede, estabilizados por interações não-covalentes, tais como forças de van der Waals e ligações de hidrogênio (Loftsson T, et al. Self- association of cyclodextrins and cyclodextrin complexes. J Pharm Sci 2004;93:1091-1099). A cavidade hidrofóbica das CDs proporciona proteção 15 temporária para as partes hidrofóbicas. Assim propriedades físico-quimicas, como a solubilidade e/ou a estabilidade são alteradas em solução (Davis ME1 et al. Cyclodextrin-based pharmaceutics: Past1 present and future. Nat Rev Drug Diseov 2004;3:1023-1035).

As ciclodextrinas cumprem com os requisitos básicos de dispositivos de liberação controlada, que têm como princípio a liberação lenta de certa da quantidade de um princípio ativo, com alvo especifico por determinado intervalo de tempo, de forma eficiente e precisa. Relatos prévios mostraram que a inclusão de antimicrobianos em ciclodextrinas é útil como um sistema liberação controlada do antimicrobiano (Denadai AML, et al. Supramolecular self- assembly of beta-cyciodextrin: an effective carrier of the antimicrobial agent chlorhexidine. Carbohydrate Research. 2007;342:2286-96, Domingues ZR, et al.Bioactive glass as a drug delivery system of tetracycline and tetracycline assoeiated with beta-cyclodextrin. Biomaterials. 2004;25:327-33, Pataro, et al., Surface effects and desorption of tetracycline supramolecular complex on bovine dentíne. Biomaterials (Guildford). , v.24, p.1075 - 1080, 2003).

A interação dos peptídeos com as ciclodextrinas acontece pelos aminoácidos hidrofóbicos e anéis aromáticos (Horsky J, et al. Inclusion complexes of proteins - iníeraction of cyclodextrins with peptides containing aromatic-amino-acids studied by competitive spectrophotometry. J Incl Phen Molec Ree Chem 1994;18:291-300, Qin XR, et al. NMR and CD studies on the interaction of Alzheimer beta-amyloid peptide (12-28) with beta-cyclodextrin.

5 Bioehem Biophys Res Commun 2002;297:1011-1015, Kahle C, et al. NMR spectroscopic and molecular modelling studies on cyclodextrin-dipeptide inclusion complexes. European J Org Chem 2005:1578-1589). As CDs parecem reduzir a degradação dos peptídeos em solução. A redução da degradação do glutationo (GSH) e seus compostos de inclusão com aCD pela 10 enzima γ-glutamiltranspeptidase foi demonstrada. 50% do peptídeo livre foi degradado após duas horas de incubação, no entanto, a taxa de degradação foi reduzida a 40% no caso do composto de inclusão aCD/GSH 8:1, e 27% para o composto aCD/GSH 32:1. A redução acentuada da hidrólise enzimática dependente da concentração de aCD é atribuída à formação de um complexo 15 peptídeo/aCD que protege a molécula do ataque enzimático (Garcia-Fuentes M, et al. Protection of the peptide glutathione by complex formation with alpha- cyclodextrin: NMR spectroscopic analysis and stability study. European J Phar Bioph 2006;64:146-153).

A atividade de peptídeos antimicrobianos tem sido relatada no estado da 20 técnica. Lehrer et al. (US2005272645, Lehrer et al.), reivindicam o uso de peptídeos de retrociclina como agentes antimicrobianos. Lee et al. (US20060135748A1, Lee et al.) relatam o isolamento de um peptídeo antimicrobiano do corpo fluido de Haloeynthia aurantium, este peptídeo apresenta uma alta atividade antimicrobiana em ambientes ácidos e básicos, 25 assim como contra bactérias resistentes a antibióticos convencionais. 0'Neil (AU2011235933A1, 0'Neil) relata o uso dos AMPs na forma de sal para infecções fúngicas, porém os peptídeos aqui reivindicados não são catiônicos, mas sim hidrofóbicos, além disso o tamanho do peptídeo é de até 200 resíduos de aminoácidos o que faz o processo de produção deste muito oneroso.

Na patente de Waugh (MX2010000916, Waugh) reivindica-se uma formulação antimicrobiana ativa contra P. aenes, S. aureus, P. aeruginoas, E. eoli, C. albieans, A. nigere o Vírus H erpes simplex, o u d oenças n as quais estes microrganismos estejam envolvidos. Nesta formulação farmacêutica, o principio ativo é um peptídeo de até 50 aminoácidos com uma seqüência N-terminal VIH-TAT e C-terminal VIH-TAT inversa.

Upton et aí. (W02011073663-A1, Upton et al.) reivindicam o uso de 5 peptídeos antimicrobianos contra bactérias formadoras de biofilmes como as espécies de Staphylococcus spp., esta invenção também inclui os ácidos nucléicos que codificam para estes peptídeos. Os peptídeos reivindicados apresentam ação bactericida contra estas bactérias e inibem a formação de biofilmes. Por outro lado, os inventores propõem o uso desta formulação como 10 revestimento de dispositivos médicos ou curativos assim como em géis para o tratamento de infecções orais por S. mutans. Porém, não é reivindicada a utilização destes peptídeos contra outro tipo de bactérias formadoras de biofilmes, como são os microrganismos anaeróbios associados à doença periodontal.

Outros usos dos peptídeos antimicrobianos também têm sido descritos.

Shathle-Backdahl et al. (US2007149448A1, Shathle-Backdahl et al.) desenvolveram uma formulação farmacêutica baseada no peptídeo LL37 e seus derivados, a qual estimula a proliferação epitelial e de células estromais e, desse modo, a cicatrização de feridas.

Na literatura científica também encontra-se evidência do potencial uso

dos AMPs contra infecções orais. Um exemplo disso é o peptídeo LL37. Altman et al. concluíram em uma série de testes, que as espécies de F. nucleatum eram as mais sensíveis das bactérias orais ao peptídeo LL37, em contraste com P. gingivalis, que não apresentou suscetibilidade em concentrações ^ 200 25 pg/mL (Altman H, et al. In vitro assessment of antimicrobial peptides as potential agents against several oral bactéria. J Antim Chem 2006;58:198-201). Outras espécies de bactérias como: A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, Prevotella intermédia, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, 30 Streptococcus mitis e Lactobacillus casei foram susceptíveis ao peptídeo LL37 com diferenças nos valores das MIC entre as diferentes cepas e espécies sendo F. nucleatum a espécie mais susceptível com MIC de 12,5 mg/L, em comparação com outras espécies como A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e P. intermédia, com MIC de até 200 mg/L (Ouhara K, et al. Susceptibilities of periodontopathogenic and cariogenic bactéria to antibacterial peptides, beta-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antim Chem 2005;55:888-896).

Algumas bactérias periodontais apresentam sensibilidade aos AMPs, sendo esta sensibilidade limitada, e a concentração de peptídeo necessária para exercer um efeito inibitório é muito alta, fazendo com que a utilização destes na prática farmacológica não seja viável devido aos altos custos de 10 produção. E como já citado, o uso terapêutico de proteínas e peptídeos é restrito devido à limitada solubilidade e estabilidade destes. A formação de compostos de inclusão entre as CDs e os peptídeos tem mostrado uma melhoria na solubilidade e estabilidade e uma diminuição na sua agregação e precipitação, o que poderia ser o resultado da estabilização da forma funcional 15 nativa das proteínas em solução.

Assim, na presente invenção foram desenvolvidas composições contendo os AMPs, LyeTxI, LL37f e/ou KR12, incluídos ou associados à ciclodextrinas, com potente atividade antimicrobiana contra F. nucleatum, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitants, em baixas concentrações, quando 20 comparado com os AMPs livres. Além disso, as composições apresentaram baixos níveis de hemólise e de citotoxicidade em células eucarióticas da cavidade bucal, neste caso os osteoblastos. Essa característica é de grande importância, uma vez que a baixa citotoxicidade celular é indispensável no desenvolvimento de fármacos.

Portanto, as composições da presente invenção apresentam uma nova

alternativa de tratamento para as manifestações locais e sistêmicas da doença periodontal com potencial uso contra os organismos resistentes aos medicamentos convencionais.

Uma das maiores vantagens da presente invenção está relacionada ao potencial uso de peptídeos antimicrobianos, os quais apresentam baixos níveis de resistência bacteriana, em infecções bacterianas causadas por biofilmes como é o caso da doença periodontal. Embora existam descritos no estado da técnica outros tipos de peptídeos antimicrobianos, não se conhece outra composição destes associados ou incluídos às ciclodextrinas para o tratamento da doença periodontal com efeito antimicrobiano e antiproliferativo em células epiteliais. Além do uso como antimicrobianos na periodontite, a invenção 5 também fornece o uso dos peptídeos LyeTxI1 LL37f e KR12, incluídos ou associados às ciclodextrinas, como agentes antitumorais, evidenciado nos testes de citotoxicidade em células epiteliais de cólon, Caco-2. Os compostos AMPs/3CD impedem a proliferação das células epiteliais testadas a doses não citotóxicas para os osteoblastos. Eliminar a carga microbiana da periodontite e 10 previnir a proliferação de células epiteliais da bolsa periodontal no sentido apical, após o tratamento por SRP é de grande importância, uma vez que essa proliferação não permite a formação eficiente de osso e a fixação do tecido conjuntivo, impedindo assim a regeneração e restabelecimento dos níveis de inserção periodontal perdidos pela doença.

Breve descrição das figuras

Figura 1. Porcentagens de viabilidade do modelo de biofilme in vitro, composto por Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 29522), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586) exposto a concentrações crescentes dos peptídeos e seus compostos 20 de inclusão com PCD (250; 125 e 62,5 pg/mL). O controle corresponde a um biofilme na mesma idade do biofilme teste exposto incubado somente com o meio de cultura.

Figura 2. Determinação do efeito dos peptídeos antimicrobianos e seus compostos de inclusão sobre a carga superficial de Fusobacterium nucleatum 25 (ATCC 25586) pela medição do potencial Zeta pela técnica "Laser Dopple Velocimetry” no equipamento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). (A) Titulação de LyeTxI vs. LyeTxI^CD. (B) Titulação de LL37f vs. LL37f/pCD. (C) Titulação de KR12 vs. KR12/pCD. (D) Titulação de pCD.

Figura 3. Avaliação da rugosidade superficial da parede celular de A. actinomycetemcomitans por Microscopia de Força Atômica após 1 hora de exposição (A) e três horas (B) ao peptídeo LyeTxI à concentração de 30,38 pg/mL

Figura 4. Avaliação da rugosidade da superfície de A. actinomycetemcomitans por Microscopia de Força Atômica após três horas de exposição com os AMPs e seus compostos de inclusão. (A) pCD; (B) LyeTxI;

(C) LyeTxΙ/βΟD; (D) KR12; (E) KR/pCD.

Figura 5. Porcentagem de hemólise de eritrócitos de coelho gerado por concentrações crescentes (0 - 50 pg/mL) dos peptídeos LyeTxI1 LL37f KR 12 e seus compostos de inclusão com a PCD.

Figura 6. Fotografia de placa de 96 poços da hemólise de eritrócitos de

coelho gerada por LyeTxI e LyeTxl/pCD em concentrações crescentes (0-100 pg/mL).

Figura 7. Teste de citotoxicidade em osteoblastos de concentrações crescentes (0 - 100 pg/mL) dos AMPs e seus compostos de inclusão com a pCD. (A) LyeTxI e LyeTxI^CD; (B) LL37f e LL37f/pCD; (C) KR12 e KR12/pCD;

(D) ÇCD.

Figura 8. Teste de citotoxicidade em células Caco-2 de concentrações crescentes (0-100 Mg/mL) dos AMPs e seus compostos de inclusão com a pCD. (A) LyeTxl e LyeTxl/pCD; (B) LL37f e LL37f/pCD; (C) KR12 e KR12/pCD; (D) PCD.

Descrição detalhada da tecnologia

Na presente invenção foram desenvolvidas composições contendo os AMPs, LyeTxl1 LL37f e/ou KR12, incluídos ou associados à ciclodextrinas, com potente atividade antimicrobiana contra F. nucleatum, P. gingivalis, A. 25 actinomycetemcomitants, em baixas concentrações, quando comparado com os AMPs livres. Ainda, essas composições poderão estar associadas a bases poliméricas, como polímeros mucoadesivos ou bases sólidas compostas por carbonato de cálcio, biocerâmicas ou matrizes de hidroxiapatita, para a obtenção de dispositivos de liberação controlada ou de dispositivos de implante 30 que permitam a liberação lenta do principio ativo. Os peptídeos LyeTxI (Seq. ID 1), LL37f (Seq. ID 2) e/ou KR12 (Seq. ID 3) são apresentados na tabela 1

Tabela 1. Seqüência de aminoácidos p elo código de uma Ietr a dos peptídeos LyeTxI, LL37f e KR12

Seq. ID 1 IWLTALKFLGKNLGKHLAKQQLAKL Seq. ID 2 KRIVQRIKDFLRNLVPRTES Seq. ID 3 KRIVQRIKDFLR A invenção poderá ser melhor compreendida, de forma não Iimitante, através dos seguintes exemplos:

Exemplo 1- Preparação de compostos dos peptídeos antimicrobianos

A preparação dos compostos de AMPs/pCD na razão molar 1:1 foi feita pelo método de liofilização como descrito anteriormente por De Souza et al. na preparação de um composto de inclusão peptídeo^CD (De Sousa FB, et al. Structural and physical-chemical evaluation of Bradykinin Potentiating Peptide and its high soluble supramolecular complex. J Incl Phenom Macrocycl Chem 2010;67:407-422). Inicialmente, soluções aquosas de cada peptídeo e de PCD foram preparadas separadamente. Em seguida, as duas soluções foram misturadas, na concentração adequada para obter a razão molar 1:1 AMP/pCD e mantidas sob agitação durante um período aproximadamente de 8 horas. Posteriormente a solução foi congelada em nitrogênio liquido e submetida ao processo de liofilização por 24 horas no equipamento Savant Modulo D-Freeze Dryer da Thermo-Electron Corporation®.

Exemplo 2- Determinação da sensibilidade das bactérias associadas à doença periodontal, F. nucleatum, P. gingivalis, A, actinomycetemcomitants aos AMPs, LyeTxI, LL37f e/ou KR12 e seus compostos incluídos ou associados à ciclodextrina, LyeTxl/pCD, LL37f/pCD ou KR12/pCD.

A sensibilidade das bactérias periodontais aos AMPs foi verificada pela determinação da Concentração Mínima lnibitória (MIC) pelo método de diluição em c aldo modificado para a de terminação da s ensibilidade bacteriana a os peptídeos antimicrobianos (Ouhara K, et al. Susceptibilities of periodontopathogenic and cariogenic bactéria to antibacterial peptides, beta- defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antim Chem 5 2005;55:888-896, Wiegand I. et al., Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols 2008;3:163-175), recomendado pelo “R.E.W. Hancock Laboratory” do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de British Columbia (Wiegand I, et al. Agar and broth dilution 10 methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Prot 2008;3:163-175, Minimal Inhibitory Concentration (MIC) Determination for Cationic Antimicrobial Peptides by Modified Microtitre Broth Dilution Method (http://cmdr.ubc.ca/bobh/methods/MODIFIEDMIC.html)). Este método é baseado na microdiluição em caldo recomendado pelo “Clinicai and 15 Laboratory Standards Institute” (CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First InformationaISuppIement. CLSl document M100-S21. Wayne, Clinicai and Laboratory Standards Institute, 2011). As modificações do método foram primeiramente introduzidas pela Intrabiotics Inc. na conferência sobre agentes antimicrobianos e quimioterapia de 1996 (ICAAC 20 do inglês, Interseience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy) e depois recomendado para seu uso geral pelo Bob Hancock na primeira conferência Gordon sobre peptídeos antimicrobianos.

A. actinomycetemcomitants (ATCC 29522), F. nucleatum (ATCC 25586) e P. gingivalis (ATCC 33277), foram crescidas em caldo BHI (Caldo Infusão 25 Cérebro - Coração. HIMEDIA Laboratories Pvt. Ltd. India) suplementado com hemina, 5 Mg/mL, (Sigma-Aldrich Co. EUA.) e menadiona, 1 pg/mL (Sigma- Aldrich Co. EUA). A. actinomycetemcomitants foi incubado 24 horas a 37°C e 5% CO2. F. nucleatum e P. gingivalis foram incubadas 24 - 48 horas a 37°C em anaerobiose (90% N2 - 10% CO2).

Diluições seriadas do s peptídeos e dos compostos ΑΜΡ:β CD assim

como, um branco de pCD, diluídos em caldo de cultura em placas de polipropileno de 96 poços (Costar® # 3879, Corning USA), em triplicata em concentrações de 0,122-250pg/mL. Seguidamente, a cultura bacteriana primaria foi diluída até 1 x 107 UFC/mL e 50 pL foram acrescentadas aos poços contendo as diluições do composto a testar, obtendo uma concentração final de inóculo por poço de 5 x 105 UFC/mL Cada teste incluiu uma triplicata de 5 controle de esterilidade dos meios e de controle de crescimento da bactéria testada. Posterior à adição do inóculo bacteriano, as placas foram incubadas por 24 horas a 37°C, para A. actinomycetemcomitants, e 5% de CO2 e para F. nucleatum e P. gingivalis em anaerobiose (90% N2 - 10% CO2). A MIC foi definida como a menor concentração do composto que inibe o crescimento 10 bacteriano visível determinado pela leitura da absorbância a 600 nm no espectrofotômetro.

Após a determinação da MIC, a Concentração Bactericida Mínima (MBC) foi determinada pelo plaqueio dos poços correspondentes ao MIC e os poços sem crescimento bacteriano visível em Agar BHI suplementado com 15 hemina (5 pg/mL) e menadiona (1 pg/mL), seguidamente, as placas foram incubadas por 24 horas nas condições correspondentes para cada espécie bacteriana. A MBC foi definida como a menor concentração do composto que não permitiu o crescimento bacteriano visível na superfície do ágar.

Os resultados dos testes de sensibilidade são mostrados na Tabela 2. A inclusão do peptídeo LyeTxI em βΟϋ aumentou significativamente a atividade antimicrobiana do mesmo contra A. actinomycetemcomitants (30,38 vs. <0,03 pg/mL) e P. gingivalis (30,38 vs 15,20 pg/mL). A atividade contra F. nucleatum não apresentou nenhuma mudança.

Tabela 2. Suscetibilidade de bactérias periodontopatogênicas aos AMPs e seus compostos incluídos ou associados em pCD. Valores expressos em pg/mL.

Aa Fn Pg uompQSio MIC MBC MIC MBC MIC MBC LyeTx I 30,38 60,75 30,38 30,38 30,38 30,38 LyeTx I/&CD 1:1 <0,03 60,75 30,38 30,38 15,20 60,75 LL37f >250 >250 250 >250 250 >250 LL37f /βΟΟ 1:1 31,25 >250 62,5 125 7,81 62,5 KR-12 >250 >250 125 125 >250 >250 KR-12/pCD 1:1 15,63 31,25 7,81 7,81 62,5 250 Aa: Aggregatibacter actinomycetemcomitans Fn: Fusobacterium nucleatum Pg: Porphyromonas gingivalis MIC: Concentração Inibitória Mínima MBC: Concentração Bactericida Mínima

0 peptídeo LL37f não mostrou atividade antimicrobiana em concentrações menores de 250 pg/mL. O peptídeo associado ou incluído na 3CD apresenta um aumento na atividade antimicrobiana com uma diminuição do MIC a 31,25; 62,5 e 7,81 pg/mL para A. actinomycetemcomitants, F.

nucleatum e P. gingivalis, respectivamente. LL37f/pCD apresenta maior atividade contra P.gingivalis, a qual geralmente é a bactéria periodontopática que exibe maior grau de resistência contra os AMPs.

A bactéria que apresentou maior sensibilidade ao peptídeo KR-12 é F. nucleatum com o MIC de 125 pg/mL. Não se observou atividade antimicrobiana

do mesmo contra A. actinomycetemcomitants e P.gingivalis a concentrações menores de 250 pg/mL. Ao realizar a inclusão ou associação de KR-12 em PCD, a atividade antimicrobiana aumentou significativamente para as três espécies testadas; 15,63; 7,81 e 62,5 contra A. actinomycetemcomitants, F. nucleatum e P.gingivalis, respectivamente.

A sensibilidade das bactérias em ordem crescente aos compostos de

inclusão é: LyeTxl, KR-12 e LL37f para A. actinomycetemcomitants1, KR-12, LyeTxI e LL37f para F. nucleatum e LL37f, LyeTxI e KR-12.

Exemplo 3 - Estudo da sensibilidade de um modelo de biofilme periodontal in vitro, desenvolvido com P. gingivalis, A.

actinomycetemcomitans, F. nucleatum e aos peptídeos LL-37f, KR-12 e LyeTxI e seus compostos LyeTxl/pCD, LL37f/pCD ou KR12/pCD.

O desenvolvimento do modelo de biofilme periodontal in vitro foi feito como previamente descrito (Lemos JA1 et al. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods Mol Biol 2010;666:87-102, Nwaokorie F, et al.

Antimicrobial activities of Garcinia kola on oral Fusobacterium nucleatum and biofilm. Afr J Microbiol Res 2010;4:509-514), brevemente, P. gingivalis (ATCC 33277), A. actinomycetemcomitans (ATCC 29522), F. nucleatum (ATCC 25586) foram crescidas em BHI, suplementado com hemina (5 μ9/ηιΙ_), menadiona (1 Ug/mL) e glicose 1% 37°C, 72 h em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2). A 5 solução de cada bactéria foi ajustada a uma densidade ótica de OD600 "0,5 e, posteriormente, diluídas 1:100 com o mesmo meio utilizado para a cultura. 200 μΐ_ de cada uma das soluções anteriores foram acrescentadas a placas de 24 poços e estas foram incubadas em anaerobiose. Após 48 horas de incubação o meio de cultura de cada poço foi trocado com o objetivo de eliminar as células 10 não aderentes e de repor os nutrientes necessários para o desenvolvimento do biofilme. A troca de meio foi realizada diariamente até o sexto dia de incubação, dia no qu al foi feita a exposiç ão d o bi ofilme aos A MPs e a os compostos AMPs/pCD.

Após 6 dias de incubação o meio de cultura foi descartado e o biofilme 15 formado foi lavado com NaCI 0,86% estéril. A adição do NaCI 0,86% e sua posterior remoção para a lavagem do biofilme foi feita usando uma pipeta estéril desde a parede do poço, absorvendo cuidadosamente o líquido para evitar o desprendimento do biofilme, em seguida a placa foi invertida sobre uma toalha de papel absorvente para a completa remoção da solução de 20 lavagem.

Foram acrescentados a cada poço 500 μ[_ de cada peptídeo e dos compostos AMPs/pCD à concentrações de 250, 125 e 62,5 μg/mL e a placa foi incubada por 6 horas em anaerobiose.

Após o tempo de incubação as placas foram dispostas em banho de 25 ultrassom por 10 minutos para o desprendimento do biofilme. O biofilme desprendido foi recolhido junto a um mililitro de NaCI 0,86% estéril e ressuspendido no poço por pipetagem lenta e, posteriormente, disposto em tubos de microcentrifuga. O biofilme desprendido foi lavado duas vezes com NaCI 0,86% para eliminar o meio de cultura. Cada solução de biofilme foi 30 ajustada até o OD67o ~0,06 e tingido com o reagente LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial/Viability Kit (lnvitrogen™/Moleular Probes®. Oregon - USA), segundo as recomendações do fabricante. 25/35

Com o comprimento de onda de excitação centrada em 485 nm e de emissão em 530 nm (emissão 1) a intensidade de fluorescência foi medida para cada poço. Posteriormente com o mesmo comprimento de onda de excitação, mas com a emissão ajustada a 630 nm (emissão 2) a intensidade de 5 fluorescência foi medida novamente para cada poço, no equipamento Cary Eclipse FL1006M012.

A razão de células vivas e mortas foi calculada pela relação entre a intensidade de fluorescência das suspensões bacterianas coradas com emissão 1 e a intensidade de fluorescência a emissão 2. As porcentagens de viabilidade foram calculadas por interpolação linear (Figura 1) em uma curva de calibração de viabilidade previamente feita.

Para a realização da curva de calibração de viabilidade, culturas frescas das três espécies bacterianas foram lavadas com NaCI 0,86% estéril e ressuspendidas na mesma solução, posteriormente ajustou-se cada solução bacteriana a OD67o ~1,0 e uma mistura destas em iguais proporções foi preparada. A solução contendo as três espécies bacterianas foi centrifugada e o sedimento ressuspendido em 2 ml_ de NaCI 0,86%, 1 mL desta solução foi incubado em 10 mL de NaCI 0,86% (100% viabilidade) e 1 mL em 10 mL de álcool isopropílico 70% (0% de viabilidade) e incubados a 37°C por uma hora. Após o tempo de incubação as soluções foram centrifugadas e o sedimento bacteriano foi ressuspendido em NaCI 0,86% a uma densidade ótica de OD67o ~0,06, diferentes proporções destas soluções misturaram-se para obter soluções bacterianas com 100%, 90%, 50%, 10% e 0% de viabilidade. As soluções anteriores foram coradas com o reagente LIVE/DEAD® e a intensidade de fluorescência foi medida. As razões de células vivas e mortas foi calculada como descrito para o biofilme. Um gráfico contendo as razões das intensidades de fluorescência entre as células vivas e mortas, no eixo X e as percentagens de viabilidade no eixo Y, foi feito e usado como curva de calibração para a determinação da viabilidade celular dos biofilmes expostos aos AMPs e aos compostos AMPs/pCD.

Os resultados da viabilidade do biofilme estão resumidos na Tabela 3. A porcentagem de viabilidade do biofilme controle (sem exposição aos f 26/35

compostos), incubado pelo mesmo tempo contendo somente o meio de cultura, foi de 80,46% ± 13,11. Como pode-se observar a viabilidade do biofilme diminui com o incremento da concentração do AMPs ou os compostos AMPs/pCD. Porém, diferenças estatisticamente significativas não foram encontradas ao 5 comparar os AMPs com os compostos de inclusão contendo a mesma concentração do peptídeo.

Estes resultados são de muita importância porque permitem evidenciar que os peptídeos e seus compostos associados ou incluídos em pCD conservam sua atividade bactericida ainda quando as bactérias se encontram 10 no interior do biofilme. O desenvolvimento de antibióticos para uso oral deve garantir a atividade no interior do biofilme já que é nesse estado no qual se encontram as bactérias causando a doença.

Tabela 3. Porcentagem de viabilidade de um modelo in vitro de biofilme polimicrobiano de 6 dias de idade, composto por Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), A, actinomycetemcomitans (ATCC 29522), F. nucleatum (ATCC 25586) exposto aos AMPs e aos compostos AMPs/pCD por 6 horas.

250 Mg/mL 125 pg/mL 62,5 pg/mL % Viabilidade DP % Viabilidade DP % Viabilidade DP LyeTxI 35,66 6,02 52,81 10,75 82,47 10,49 LyeTxl/3CD 31,72 3,34 36,72 0,88 55,80 3,65 LL37f 26,90 6,45 27,79 10,50 29,28 3,10 LL37f/pCD 32,32 1,02 32,59 5,56 46,90 10,20 KR12 30,50 3,23 32,69 2,27 32,72 2,45 KR12/pCD 24,60 2,54 27,27 17,78 52,73 11,16 α esvio padrão "O Il CL Exemplo 4- Monitoramento do efeito dos AMPs e seus compostos AMPs/pCD sobre a carga superficial da superfície bacteriana pela determinação do potencial Zeta.

A determinação da influência de concentrações crescentes (0 - 500 pg/mL) dos AMPs e dos compostos AMPs/pCD sobre a carga superficial de F. nucleatum foi determinada pela medição do potencial Zeta (PZ) da superfície bacteriana no equipamento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, 27/35

Malvern, UK) pela técnica “Laser Dopple Velocimetry” (Manual. ZNSU. Worcestershire, United Kingdom. Malvern Instruments; 2004, Alves CS, et al. Escherichia coli Cell Surfaee Perturbation and Disruption Indueed by Antimicrobial Peptides BP100 and pepR. J Biol Chem 2010;285:27536-27544, 5 Wilson WW1 et al. Status of methods for assessing bacterial cell surface charge properties based on zeta potential measurements. J Microbiol Methods 2001;43:153-164), com uma cubeta descartável (DPS1060) a um ângulo de dispersão de 90° a 25°C.

Preparou-se 100 pL de solução padrão com AMP1 10 vezes mais concentrado que a concentração a testar, e seu composto de inclusão em tampão fosfato 100 mM pH 7,4. Separadamente, preparou-se uma suspensão bacteriana em concentração de 1,0 x 108 UFC/mL no mesmo tampão a partir de uma cultura em caldo fresco de F. nucleatum. As soluções utilizadas para a preparação das suspensões bacterianas e a diluição dos AMPs e os compostos AMPs/pCD foram filtradas (filtros de 0.22 μιη, Millipore®) antes de usar para retirar qualquer material particulado. Foram acrescentados a 900 pL da suspensão bacteriana, 100 pL de cada solução padrão de peptídeo ou composto AMPs/pCD. A suspensão anterior foi transferida para uma cubeta descartável (DPS1060) e a medição do potencial Zeta foi feita depois de 120 segundos de estabilização no interior do equipamento. As medições foram realizadas em triplicata.

Como observado na Figura 2, F. Nucleatum apresenta uma carga negativa ao redor dos -17 mV no início do experimento a qual é devida ao LPS na superfície celular; com o aumento da concentração dos AMPs e os 25 compostos AMPs/pCD a carga superficial vai aumentando, em alguns casos próximo a zero e em outros tornando-se positiva. Este fato poderia ser explicado pela atividade dos AMPs e compostos AMPs/pCD, os quais atuam sobre a membrana celular desestabilizando-a e deste modo exercendo sua atividade bactericida.

Na titulação de F. nucleatum com soluções dos peptídeos LL37f e KR12

e os compostos LL37f^CD e KR12/pCD (Figura 2B e 2C) é observado o incremento da carga superficial bacteriana até valores próximos a -5 mV, sendo as mudanças mais acentuadas para KR12/pCD. A titulação com o peptídeo LyeTxI e LyeTxl/pCD, alé m d e c ausar um increm ento d a carga superficial bacteriana, leva a uma inversão da mesma passando pelo ponto isoelétrico (0 mV). O ponto isoelétrico das células na titulação com LyeTxl/pCD ocorre em 5 menor concentração do que com o peptídeo puro (Figura 2A), -250 pg/mL e ~350 pg/mL, respectivamente. Por outro lado, a titulação de concentrações crescentes de βΟϋ em F. nucleatum (Figura 2D), não mostra mudança significativa do potencial zeta, sendo este mantido ao redor de -10 mV na concentração de 250 pg/mL de PCD, o qual evidencia que as mudanças 10 eletrostáticas da superfície bacteriana pela exposição aos compostos com βΟϋ não é devida à presença de βΟϋ. Com estes resultados pode-se concluir que a pCD age na interação dos compostos de inclusão com a membrana celular ao se considerar que, em ambos experimentos, a concentração dos AMPs foi a mesma, sendo a única diferença a presença ou ausência de PCD.

O aumento da interação dos compostos AMPs/pCD, em comparação

com os peptídeos, pode ser causado, pela aderência da pCD na superfície bacteriana, devido à sua capacidade de formar ligações de hidrogênio, o que poderia agir sinergicamente com as interações iônicas entre os peptídeos catiônicos e a superfície celular aniôníca.

As diferenças nas interações entre os diferentes AMPs e os compostos

AMPs^CD com as membranas celulares pode-se explicar pelas diferenças nas propriedades dos peptídeos como observado na Tabela 4. O peptídeo LyeTxI tem uma carga mais positiva que os outros peptídeos (+5), e pode ser este o motivo pelo qual este foi o único capaz de inverter o carga superficial de F. 25 nucleatum. Em sistemas biológicos, a neutralização da superfície pode ser amplamente atribuída ao equilíbrio das interações eletrostáticas entre as cargas positivas dos peptídeos (cadeias laterais da Iisina e arginina) com os grupos carregados negativamente (fosfatos e carboxilatos) do LPS (Alves CS, et al. Escherichia coli Cell Surface Perturbation and Disruption Induced by 30 Antimicrobial Peptides BP100 and pepR. J Biol Chem 2010;285:27536-27544).

Tabela 4. Propriedades dos peptídeos LyeTxI. LL37f e KR12

Peptídeo Carga Total Resíduos Hidrofóbicos (%) LL37f +4 35 KR12 +4 41 LyeTxI +5 52 Exemplo 5- Avaliação por microscopia de força atômica (AFM) dos AMPs e dos compostos AMPs/pCD sobre a rugosidade da superfície celular bacteriana.

A. actinomycetemcomitans (ATCC 29522), foi crescida em caldo BHi 5 suplementado com hemina (5 pg/mL) e menadiona (1 pg/mL) a 37°C por 48 h em atmosfera de 5% de CO2. Posterior à incubação, a solução bacteriana foi ajustada à concentração de 1x 108 UFC/mL.

A. actinomycetemcomitans foi exposta a LyeTxI, LyeTxl/pCD, KR12 e KR12/3CD à concentrações do MIC: 31; 0,12; 250 e 16 pg/mL, respectivamente a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por uma e três horas para LyeTxI e por três horas para os outros AMPs e compostos de inclusão.

Após o tempo de exposição a amostra foi lavada três vezes com PBS pH 7,4. O sedimento final foi ressuspendido em 100 pL de PBS e disposto em lamínulas de vidro que tinham sido tratadas previamente com uma solução 15 ácida de HCkHNO3 concentrada 3:1. A amostra foi seca ao ar, protegida da poeira e posteriormente fixada com 2,5% de glutaraldeído em 0,1 M de tampão cacodilato e desidratada em gradiente de álcool.

As imagens das bactérias expostas a cada um dos compostos foram feitas no equipamento Asylum Research (Santa Barbara, CA, EUA) Modelo: 20 MFP-3D-AS usando a sonda Olympus AC240TS. As condições de aquisição da imagem foram as se guintes: Cons tante de m ola (k) (N/m) - 2 (0.5 - 4 .4), frequência de ressonância (kHz) - 70 (50 - 90), Tip radius (nm) - 9 +/- 2. O cálculo da rugosidade da superfície bacteriana após a exposição e o tratamento das imagens foi feito com o programa Gwyddion 2.26.

Na Figura 3 observam-se as imagens da microscopia da AFM de A.

actinomycetemcomitants com uma hora de exposição com (A) LyeTxI e (B) LyeTxl/pCD. Como pode se observar na análise da rugosidade, o aumento do tempo de exposição (1 vs. 3 horas) leva a um aumento na rugosidade celular 38 nm e 61,78 nm, respectivamente. Da mesma forma como observado na Figura 4 (imagens da AFM de A. actinomycetemcomitants com três horas de exposição com os AMPs e os compostos de inclusão à concentrações do MIC) a inclusão dos peptídeos em pCD levam também ao aumento da rugosidade celular, evidenciado mais notoriamente ao comparar a Figura 4D e 4E, (KR12 e 5 KR12/pCD) onde a rugosidade aumenta de 52,28 nm para o peptídeo sem incluir até 99,058 nm para o peptídeo incluído (KR12/3CD), este fato poderia ser explicado pela formação de nanoagregados pelos compostos de inclusão sobre a superfície bacteriana como reportado por Teixeira et al. (Teixeira K. et al. Ultrastructural changes in bacterial membranes induced by nano- 10 assemblies-cyclodextrin chlorhexidine: SEM, AFM, and TEM evaluation. Pharm DevTechnoI 2012;1:1-9;

Exempio 6- Determinação do grau de hemólise gerado pelos peptídeos LL-37f, KR-12 e LyeTxI e seus compostos de inclusão com as ciclodextrinas.

O grau de hemólise gerado p elos p eptídeos an timicrobianos e seu s

compostos de inclusão foi determinado em eritrócitos de coelho, como descrito previamente (Yau YH, et al. High therapeutic index of factor C Sushi peptides: Potent antimicrobials against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents and Chemother 2001;45:2820-2825, Shin SYi et al. Structure-antibacterial, 20 antitumor and hemolytic activity relationships of cecropin A-magainin 2 and cecropin A-melittin hybrid peptides. J Pept Res 1999;53:82-90). Preparou-se uma suspensão de eritrócitos de coelho a 0,8% com PBS. Separadamente, em uma placa de polipropileno de 96 poços, prepararam-se diluições seriadas dos peptídeos e seus compostos de inclusão com volume final de 100 μί (100 - 0,1 25 μ9/ηηί). Seguidamente, acrescentaram-se 100 μί da suspensão de eritrócitos 0,8% a diluições decrescentes do composto a testar e as placas foram incubadas a 37°C por 1 hora. Ao término do tempo de incubação, as placas foram centrifugadas a 100g por 5 minutos a 4°C. Alíquotas de 100 pL do sobrenadante foram transferidas a uma nova placa de 96 poços e a 30 absorbância destas foi medida a 414 nm,usando como branco o PBS. Em cada teste foi incluído um controle negativo composto por uma suspensão de f 31/35

eritrócitos 0,4% em PBS, considerado como o mínimo de Iise normal, ou seja, 0% de Iise e um controle positivo composto por 100 pL de uma solução de eritrócitos 0,4% Iisada com 1% de Triton® X-100 (Lote: 80M011289V. Sigma- AIdrich Co. EUA). A absorbância deste último foi considerada como o 100% de lise.

O percentual de hemólise dos compostos testados foi determinado pela seguinte fórmula:

% hemólise = (Ad-u na solução do peptídeo - Adia em PBS) x 100 (A414 em 1 % Triton-X 100 - A414 em PBS)

Como observa-se na Figura 5, a percentagem de hemólise gerada por

LL37f, KR12 e seus compostos associados à pCD não foi superior a 10% até a concentração de 50 pg/mL. Por sua vez LyeTxI e seu composto de inclusão LyeTxl/pCD geraram quase 90% de hemólise dos eritrócitos na concentração de 50 pg/mL, sendo a EC5O 26,33 e 27,47 pg/mL, respectivamente (Figura 6).

O baixo nível de hemólise gerado pelo LL37f, KR12 e seus compostos

de inclusão permite seu potencial uso como antimicrobiano devido à sua baixa toxicidade, enquanto ao LyeTxl/pCD o EC50 é 26,33 pg/mL, a qual é uma concentração superior à requerida para atingir sua atividade antimicrobiana contra A. actinomycetemcomitants e P.gingivalis (<0,03 e 15,2 pg/mL,

respectivamente) o qual poderia permitir seu potencial uso contra estas duas bactérias.

Exemplo 7- Avaliação da citotoxicidade dos AMPs e os compostos AMPs/pCD em osteoblastos e a avaliação do efeito antiproliferativo destes em células epiteliais de colón, Caco-2.

Os osteoblastos foram isolados a partir da calvária de seis ratos Wistar

de 3 dias de idade pelo método de digestão enzimática. A calvária, depois de ser cortada em pedaços pequenos, foi digerida durante 5 minutos com uma solução 0,25% de tripsina-EDTA e 3 vezes com 2% de colagenase tipo II. O sobrenadante das três últimas lavagens foi centrifugado 1000 xg durante 5 min

e 0 sedimento foi ressuspendido em 5 mL de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle’s Medium. Sigma-Aldrich Co. EUA) suplementado com 10% de SFB (Lote: 2105155K. Gibco® - Invitrogen. EUA), antibiótico (0,1 mg/mL de estreptomicina e 100U/mL de penicilina, Lote: LC4064/10. Cultilab. Brasil) e solução de antimicótico. As células foram colocadas em garrafas de cultura celular e incubadas a 37°C em atmosfera 5% de CO2. Ao alcançar a terceira 5 passagem, as células foram tripsinizadas e dispostas em placas de 96 poços a uma concentração de 9,0 x 104 células/poço.

As células Caco-2 ATCC HTB-37, foram cultivadas em Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) rico em glicose (Sigma-Aldrich Co. EUA) suplementado com 10% de SFB e 1% de uma solução de antibiótico e 10 antimicótico a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. Após a confluência, as células foram tripsinizadas com uma solução de tripsina 0,2% contendo 0,02% de EDTA e cultivadas em placas de 96 poços à concentração de 9,0 x 104 células/poço.

Quando alcançada a confluência para cada um dos tipos celulares, as células foram lavadas com PBS pH 7,4, e concentrações decrescentes dos AMPs e seus compostos de inclusão (100 - 0,0 pg/mL) foram acrescentados em novo meio DMEM e incubadas por 24 horas a 37°C em atmosfera de CO2.

Após o tempo de exposição das células com os compostos testes, a avaliação da viabilidade celular foi feita pelo método MTT segundo o descrito por Mosmann T. 1983, (Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983;65:55-63). Inicialmente, as células foram expostas ao 3-[4,5-dimetiItiazol-2-il]-2,5-difeniItetrazol brometo, 12 mM (Lote. 902952. lnvitrogen™/Moleular Probes®. Oregon - USA) por 4 horas e incubadas a 37°C. Em seguida os cristais de formazan foram dissolvidos com uma solução de SDS - HCI (SDS, Lote. 191209. LGC Biotecnologia. Brasil) por 4-18 horas a 37°C. Após do tempo de incubação, a densidade ótica foi medida a 570 nm no Espectrofotômetro de Iuz UV-visível Multiskan Spectrum - Thermo Scientific e os dados expressos em absorbância foram transformados em percentual de viabilidade para as análises estatísticas. ( 33/35

A avaliação da citotoxicidade celular é indispensável no desenvolvimento de fármacos, uma vez que produtos terapeuticamente efetivos com alta citotoxicidade não são susceptíveis a aplicação clínica.

Na Figura 7A p odem se r obs ervados os r esultados d o M TT p ara o peptídeo LyeTxI e seu composto associado ou incluído na βΟΡ nos osteoblastos. As médias das porcentagens de viabilidade celular nas diferentes concentrações foram comparadas com as do controle, que continha somente o meio de cultura. Diminuição da viabilidade celular com diferenças estatisticamente significativas só foram encontradas para LyeTxl nas concentrações de 50 e 100 ug/mL (p<0,001) onde a viabilidade celular dos osteoblastos foi reduzida a 24,8% ± 2,9 e 3,2% ± 0,15, respectivamente. Por sua vez a citotoxicidade de LyTxl/pCD foi maior que a do peptídeo puro ao conseguir reduzir a viabilidade celular com diferenças estatisticamente significativas até 25 μg/mL (p<0,001). 25, 50 e 100 pg/mL de LyeTxI associado ou incluído na βϋϋ reduziram a viabilidade celular a 59,89% ± 14,88, 27,83% ± 1.33 e 4,66% ± 0,34, respectivamente.

O LL37f e o KR12 (Nas Figura 7B e 7C) não foram citotóxicos para os osteoblastos até 100 pg/mL (p >0,05), porém LL37f/pCD e KR12^CD apresentaram uma citotoxicidade moderada. LL37f^CD diminuiu a viabilidade 20 celular a 57,61% ±6,0 a 100 pg/mL (p<0,01). KR12^CD reduz a viabilidade celular a 78,45% ± 20,44 a 50 Mg/mL (p<0,05) e a 57,61% ± 6,0 a 100 pg/mL (p<0,001).

Os resultados da avaliação da citotoxicidade dos AMPs e os compostos de inclusão em células epiteliais, Caco-2 são mostrados na Figura 8. O 25 peptídeo LyeTxI e seu composto de inclusão LyeTxI^CD inibiram a proliferação das células epiteliais Caco-2 com diferenças estatisticamente significativas, com o controle de células sem expor ao composto, até a concentração de 12,5 (86,9 % ± 7,23) e 6,25 pg/mL (62,4 % ± 7,31), respectivamente. O peptídeo LL37f foi citotóxico para as células Caco-2 a 100 30 e 50 μg/mL com uma diminuição da viabilidade a 48,32% ± 4,22 e 65,9% ±11,9 (p< 0,05). O LL37f/pCD apresentou atividade citotóxica até 25 μg/mL, diminuindo a viabilidade celular a 69,9% ± 0,76 (p< 0,05). Por outro lado KR12 t *

34/35

apresentou uma diminuição da viabilidade celular com diferenças estatisticamente significativas até 25 ug/mL, com a qual pode-se reduzir a viabilidade celular a 77,3% ± 15,7 (p< 0,05). O composto KR 12/pCD tem atividade neste tipo celular até a concentração de 12,5 pg/mL, diminuindo a 5 viabilidade a 87,5% ± 17,1 (p< 0,05). LyeTxl/pCD foi ativo até 12,5 pg/mL concentração com a qual a viabilidade celular diminuiu a 62,8% + 21,4.

Na Tabela 5 estão listadas as concentrações efetivas 50 (EC50) nos osteoblastos e nas células epiteliais, Caco-2 para os AMPs e os compostos AMPs/pCD. A ECsoé definida como a concentração requerida para obter 50% do efeito da droga testada. Como pode se observar todas as EC50 para os osteoblastos são superiores à requeridas para atingir a inibição do crescimento bacteriano nas três espécies testadas. Por outro lado, ao realizar a comparação da diferença estatística entre as EC50, diferenças estatisticamente significativas foram encontradas para KR12, LL37f e seus compostos associados ou incluídos na pCD (p <0,05). Este resultado evidencia a influência da pCD no aumento da citotoxicidade celular destes peptídeos. Os resultados indicam que LyeTxl/pCD, KR12/pCD e LL37f/pCD podem ser utilizados em composições antimicrobianas sem afetar a viabilidade de osteoblastos significativamente até a concentrações inferiores à EC50 a qua! está acima do MIC necessário para inibir 0 crescimento de A. actinomycetemcomitants, P.gingivalis e F. nucleatum.

Tabela 5. Concentrações efetivas-50 (EC50) dos AMPs e compostos AMPs/pCD em Osteoblastos e células Caco-2.

Composto EC50 (pg/mL) Vaior EC50 (pg/mL) Valor Osteoblastos de p Células Caco-2 de p LyeTxl 36,98 >0,05 99,8 <0,05 LyeTxl/3CD 37,16 9,21 KR12 688,0 <0,05 163,1 >0,05 KR12/3CD 168,0 104,5 LL37f 990,2 <0,05 227,2 <0,05 LL37f/3CD 119,5 96,04 Ao fazer a comparação das EC50 dos compostos nos osteoblastos e nas células Caco-2 pode-se observar que as concentrações efetivas nas células epiteliais são inferiores as concentrações citotóxicas nos osteoblastos. Este resultado é de grande importância porque evidencia o potencial uso dos AMPs e de seus compostos de inclusão como agentes antiproliferativos em doses não citotóxicas para as células normais, neste caso representadas pelos osteoblastos.

Por outra lado a avaliação da citotoxicidade da pCD foi feita para os dois

tipos celulares (Figura 7D e 8D), em nenhum dos casos se encontrou diminuição da viabilidade celular estatisticamente significativa quando comparada com o controle sem βΟϋ.

A baixa citotoxicidade dos AMPs as células dos mamíferos quando comparado com a citotoxicidade nas células bacterianas tem sido explicado pelo fato que as membranas bacterianas contêm maior quantidade de fosfolipídeos carregados negativamente, o que permite uma maior interação entre os peptídeos catiônicos e estas membranas (den Hertog AL, et al. Interactions of histatin 5 and histatin 5-derived peptides with Iiposome membranes: surface effects, translocation and permeabilization. Bioch J 2004;379:665-672). Por outro lado, a presença de colesterol nas membranas de mamífero oferece proteção à ação destes peptídeos (Santos DM, et al. LyeTx I, a potent antimicrobial peptide from the venom of the spider Lycosa erythrognatha. Amino Acids 2010;39:135-144), sabe-se que o colesterol está ausente em membranas de bactérias.

Portanto, a presente invenção, baseada na associação dos peptídeos à ciclodextrina, permite diminuir a quantidade de peptídeo efetiva para inibir o crescimento de bactérias associadas à doença periodontal, o qual tem um grande impacto na aplicação industrial dos peptídeos catiônicos como agentes 25 antimicrobianos, ao se diminuírem os custos de produção. Além disso, a presente invenção inibe a proliferação de células epiteliais, o que tem um grande impacto no que se refere à recuperação clínica do paciente, já que após o tratamento por SRP, a proliferação de células epiteliais da bolsa periodontal no sentido apícal não permite a formação eficiente de osso e a fixação do 30 tecido conjuntivo, impedindo assim a regeneração e restabelecimento dos níveis de inserção periodontal perdidos pela doença.

Claims (7)

1. Composições farmacêuticas caracterizadas por compreenderem os peptídeos catiônicos LyeTxI (SEQ ÍD N°1), LL37f (SEQ ID N°2), KR12 (SEQ IDN°3), isolados ou misturados, associados ou incluídos à ciclodextrina e excipientes farmacêutica e cosmeticamente aceitáveis.

2. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por estar associada ou não a bases poliméricas, como polímeros mucoadesivos ou bases sólidas compostas por carbonato de cálcio, biocerâmicas ou matrizes de hidroxiapatita, para a obtenção de dispositivos de liberação controlada ou de dispositivos de implante que permitam a liberação lenta do princípio ativo.

3. Composições farmacêuticas de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas por serem administradas por via tópica, intravenosa, intramuscular, intradérmica e ou subcutânea.

4. Composições farmacêuticas de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizadas por serem administradas preferencialmente por via tópica.

5. Uso das composições farmacêuticas de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser na produção de um medicamento para tratamento de infecções bacterianas.

6. Uso das composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo medicamento ser preferencialmente para o tratamento da periodontite ou infecções relacionadas.

7. Uso das composições farmacêuticas de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser na produção de um medicamento para impedir a proliferação de células epiteliais da bolsa periodontal no sentido apical.