BG65654B1

BG65654B1 - Метод за получаване на микрофибриларен водоразтворим колаген за хранителната и фармацевтичната промишленост и козметиката

Info

Publication number: BG65654B1
Application number: BG108293A
Authority: BG
Inventors: Константин СТОЯНОВ; Цветан ЦВЕТКОВ; Светла ДЯНКОВА
Original assignee: Институт По Криобиология И Хранителни Технологии
Priority date: 2003-10-27
Filing date: 2003-10-27
Publication date: 2009-05-29
Also published as: BG108293A

Abstract

Изобретението се отнася до метод за получаване на микрофибриларен водоразтворим колаген, при който суровината (обезмаслени и обезкосмени свински кожи от млади животни, обработени до етап "Опресняване") се подлага предварително на вакуум-сублимационно сушене и последващо (преди ензимната обработка) смилане и развлакняване. Самата ензимна обработка се извършва с комбиниран ензимен препарат - с протеолитична, липолитична и амилолитична активност. За многократно удължаване срока на годност на получения водоразтворим колаген и за използването му по всяко време, същият се лиофилизира и при нужда рехидратира до желаната от потребителя концентрация. Готовият продукт по този метод е предназначен за хранителната и фармацевтичната промишленост и за козметиката.

Description

Област на техниката

Методът по настоящото изобретение позволява да се увеличи добива на пречистен микрофибриларен колаген с подобрена разтворимост във вода. Готовият продукт, получен по този метод може да се използва в хранителната и фармацевтичната промишленост или за влагане в козметични състави за грижа за косата и кожата. При допълнителна обработка същият може да служи като изходна суровина за производство на хемостатични продукти за медицински цели.

Предшестващо състояние на техниката

Колагенът е основен протеин в организма на бозайниците. Той има уникален строеж, чиято основна градивна единица е тропоколагеновата молекула. По-голямата част от нейната структура слабо се различава при отделните видове бозайници, което е и причина за слабата алергенност и имуногенност на колагеновите продукти. Пречистеният колаген с напълно или частично запазена нативна структура, намира приложение в различни области на медицината (хемостатични продукти, превръзки за рани и имплантати), козметиката (подхранващи и регенериращи състави) и хранителната промишленост (като сгъстител стабилизатор, хидратиращ агент, хранителна добавка и др.). В индустриални условия пречистен колаген в различни форми се получава от кожи, сухожилия, хрущяли и други субпродукти от редица селскостопански животни по различни методи.

Известно е използването на колагенови филми като естествена обвивка за пълнене на колбаси, шунка или кренвирши (ЕР 1270672, US 5,736,180, US 5,885, 634). Колагенови продукти (фибри и гелове) се използват като хранителни добавки (US 4,295,894) или се включват в рецептури за пайове, пудинги, желирани бонбони, сладоледи, майонезени сосове, снаксове и др. (US 3,691,281).

JP 2001245614 описва метод за получаване на диетична храна на основата на колагеново желе с добавени ароматизиращи и коригиращи съставки. Предложено е и получаването на хранителна добавка на основата на колаген и микроелементи (GN1312019).

Колаген и колагенови хидролизата се влагат в различни козметични състави: кремове емулсионни системи тип В/М и М/В, лосиони, лакове за коса, шампоани, пени за баня и др. (US 4,131,650, US 3,691,281). Колагеновите продукти притежават някои ценни качества - не са токсични, не причиняват алергии, влияят положително върху кожата и нейната еластичност като подобряват функционалното и състояние и оказват положително влияние върху белтъчния и аминокиселинния обмен (Георгиев и кол., 1990).

Известно е използването на колагенови продукти като превързочни материали за рани с абсорбиращо и стимулиращо епителизацията действие (US 4,148,664; US 4,294,241; Хилькин и кол., 1976) или за осъществяване на локална хемостаза при капилярни и паренхиматозни кръвотечения (US 4,320,201; US 4,331,766; US 4,412,947).

Известни са методи за получаване на разтворим колаген (от телешки, свински и овчи кожи и от телешки, свински и говежди сухожилия) чрез ензимна обработка с протеолитични ензими и последваща киселинна или алкална обработка (WO 8704078, US 4,294,241, US 4,140,537, US 4,148,664, US 4,837,258). Аналитичният добив може да бъде увеличен чрез прецизно механично развлакняване на предварително обработения с ензими колаген (Хилькин и кол., 1976). Описани са и много методи за получаване на кисел водоразтворим колаген чрез продължителна алкална и киселинна обработка на суровината и последващо ензимно третиране, очист2

65654 Bl ване от баластни вещества и довеждане, чрез добавяне или отнемане на вода, до необходимата концентрация (US 4,320,201).

US 4,295,894 представя метод за получаване на разтворими колагенови фибрили, които могат да бъдат използвани за текстуриране на месо, като влагозадържащи агенти и хранителна добавка или за прилагане в козметични препарати. В предлаганата технология, сурови животински кожи се обработват с воден разтвор на алкален хидроксид и дехидратиращи агенти за отстраняване на космите и мазнините, стабилизират се с воден разтвор на алкален сулфат и полученият продукт се неутрализира и разтваря в разредена киселина. pH на разтвора се коригира до изоелектричната точка, за да се утаят колагеновите фибри, които впоследствие се изсушават и консервират. Този метод обаче не осигурява очистване в достатъчна степен на колагеновия продукт от мазнините, глобуларните белтъци и телопептидите.

Известен е и метод за производство на микрокристален колаген (US 3,691,281), при който сурова или изсушена говежда кожа се третира с разреден разтвор на киселина и впоследствие се смила до размери на частиците под микрон и се суши при условия, препятстващи денатурацията. Така полученият микрокристален колаген се диспергира колоидно при смесване с вода и подобрява стабилността на суспендираните ингредиенти в течностите и теловете. Предлаганата технология се основава на колоидното смилане на обработените с киселина кожи, така че около 80-85 % от частиците да са със субмикронни размери, което обаче изисква специална апаратурна обезпеченост. Методът не изяснява въпроса за физичната стабилност на получените колагенови суспензии и гели, особено при продължително съхранение.

Не са известни методи за получаване на кисел водоразтворим колаген, при които:

1. Суровината (кожи или сухожилия), след като се обработи механично или химично за отстраняване на съпътстващите тъкани, се подлага на вакуум-сублимационно сушене. По този начин се постига:

а) по-лесно (при стайна температура) и попродължително (2 и повече години) съхранение на изходната суровина;

б) смилане и развлакняване на суровина та до размери по-малки от 1 mm, което е необходимо за по-пълното извличане на колагена;

в) при последващата ензимна обработка се получава по-бързо проникване на ензимния разтвор в лиофилизираните частици.

2. Ензимната обработка на суровината се провежда с ензимен комплекс, съдържащ поне три ензима и притежаващ протеолитична, липолитична и амилолитична активност, което спомага за по-пълно очистване на изходния материал и за повишаване добива на водноразтворим колаген.

3. Като изходна суровина се използват обезмаслени и обезкосмени свински кожи на етап “Опресняване” само от млади животни.

4. Извършва се допълнително вакуум-сублимационно сушене на готовия продукт, което увеличава значително неговото време на съхранение при стайна температура и дава възможност да се използва по предназначение след рехидратиране.

Техническа същност на изобретението

Същността на изобретението е в това, че чрез промяна в основни производствени параметри на известни технологии за получаване на колаген е създаден метод за получаване на биологичен продукт на базата на колаген, който има различни области на приложение в хранителновкусовата промишленост, във фармацевтичната промишленост и в козметиката.

Като изходна суровина за получаване на колаген се използват обезмаслени и обезкосмени кожи от млади животни (за предпочитане свински), обработени до етап опресняване, добре очистени от съпътстваща тъкан и други артефакти и промити с дестилирана вода. Същите се нарязват на парчета с размери от 250 до 500 cm² и се прехвърлят в нискотемперазурна камера при темперазура от -30 до -50°С за не по-малко от 24 h. След приключване на замразяването кожите се прехвърлят в сушилната камера на вакуум-сублимационна инсталация и се подлагат на лиофилизация при температурен режим от (-40°С) до +25°С и времетраене на процеса от 24 до 32 h.

Остатъчната влажност на лиофилизираните кожи не трябва да бъде по-висока от 8 %.

Така подготвената изходна суровина се нарязва на парчета с размери 5-8 cm² и се опакова във водо- и въздухо-непропускливи опаковки (за

65654 Bl предпочитане дву- или трислойно алуминиево фолио). Предимствата на вакуум-сублимационната обработка на суровината са следните: пълно запазване на нативната структура на колагена в кожите; възможност за съхранение продължително време на стайна температура (повече от 2 години); възможност за бързо използване на суровината по всяко време; увеличена дифузия на реакционните смеси при ензимната и киселинната обработка на суровината, което подпомага/ усилва извличането на колагена от кожите и съответно разтварянето му във вода; предпазване от допълнителна бактериална контаминация през периода на съхранение.

Определено количество от лиофилизираните кожи се смила на ножова мелница със сито с диаметър на отворите от 0,5 до 1,5 mm. Смляната суровина се подлага на ензимна обработка. За целта тя се прехвърля в стъклен реактор с кожух и бъркалка, добавят се последователно комбиниран ензимен продукт с протеолитична, липолитична и амилолитична активност (за предпочитане панкреатин) в количество от 0,5 до 1,0% т/т спрямо смлените кожи; 0,5-1,0 % т/об нейоногенно ПАВ (за предпочитане полисорбат 80) и дестилирана вода в съотношение спрямо суровината от 1:20 до 1:40 (за предпочитане 1:30). Включва се бъркалката за 1-2 min, след което pH на реакционната смес се довежда до 7,0-7,5 чрез добавяне на 5%-ен разтвор на натриев хидроксид или лимонена киселина. Разбъркването продължава за 20-40 min при 300-500 rpm. През целия процес температурата в реакционната смес се поддържа в границите от 30 до 32°С. Изключва се бъркалката и реакционната смес се оставя в покой в продължение на 1,5-2 h, след което надутаечната течност се отдекантира на дълбочина

5-10 cm (около 5-61) за отстраняване на отделените липиди, глобуларни белтъци, телопептиди, аминокиселини, мукополизахариди и други артефакти в кожите. Долива се дестилирана вода в адекватно на отдекантираната реакционна смес количество. Отново се включва бъркалката и се добавя още 0,5% (спрямо първоначалното количество суровина) от ензимния продукт. Процедурата се повтаря трикратно без допълнително добавяне на ензим.

Обработката с комбиниран ензимен продукт осигурява по-пълно очистване на колагена от съпътстващите вещества. Под действие на ен зимния комплекс едновременно се разграждат глобуларните белтъци и липидите и се освобождават телопептидите, които свързват край с край молекулите на тропоколагена. Известно е, че телопептидите са основно отговорни за имуногенността и алергенността и трябва да се отстранят при пречистването на колагеновите продукти (US 4,412,947; US 4,404,134). Обработката на неразтворимия колаген с амилаза отделя киселите глюкозоаминогликани (мукополизахариди) и довежда до дезорганизация и дезинтеграция на структурните елементи на колагена, разхлабва или разрушава междумолекулните връзки и дава възможност за пълно разтваряне на колагена в слабокисел разтвор (Хилькин и кол., 1976).

След приключване на ензимната обработка сместа се прехвърля в метален реактор, в който предварително е добавена дестилирана вода, подкиселена със слаба киселина (оцетна, винена, лимонена) до pH 3,0-4,0 (за предпочитане рН-стойност 3,5). Съотношението на изходната суровина към количеството на водата е от 1:120 до 1:150. Сместа се хомогенизира и се оставя да престои 72-96 h при температура 1518°С. Полученият разреден колоиден разтвор на кисел колаген се центрофугира за отделяне на неразтворените частици и други онечиствания.

Киселият разреден разтвор на колаген се подлага на реконструкция чрез добавяне на разтвор на натриев хидроксид до достигане на изоелектричната точка (pH 4,6-5,6), при което настъпва спонтанно фибрилообразуване. Колагеновата дисперсия се концентрира чрез центрофугиране или филтруване до необходимата концентрация (1-2%).

Полученият продукт е със следните показатели: pH-стойност от 4,6 до 5,6; специфична температура на денатурация от 38 до 41°С; вискозитет от 85 до 90 mPa.s (D = 64,6 s'¹); съдържание на сухо вещество от 1 до 2%; съдържание на общ белтък от 0,800 до 0,950 g/g сухо вещество; съдържание на липиди под 0,030 g/g сухо вещество; пепелен остатък под 0,040 g/g сухо вещество; съдържание на тежки метали под 1 microg/g продукт; съдържание на хидроксипролин от 110 до 140 mg/g сухо вещество; общ брой жизнеспособни микроорганизми под 1.10³KOE/g продукт; общ брой плесени и дрожди под 1.10² KOE/g продукт; патогенни микроорганизми - не се откриват.

65654 Bl

В зависимост от предназначението на продукта, същият може да се доведе до pH 4,04,5 с прибавяне на лимонена киселина, да се добави консервант, разрешен за употреба в храни (за предпочитане нипагин и нипазол) и да се опакова в стъклени или пластмасови банки. Така полученият кисел колагенов гел може да се съхранява в хладилна камера (от 0 до 4°С) за срок от 3 месеца или да се подложи на вакуум-сублимационно сушене. Срокът на съхранение на лиофилизирания продукт се удължава многократно (3 години) и при нужда той се разтваря във вода до необходимата концентрация и се използва по предназначение.

Продуктът по настоящото изобретение може да се използва и за получаване на порьозни колагенови гъбки, предназначени за локална хемостаза или като абсорбиращи превръзки за рани. За целта колагеновата микрофибриларна дисперсия се омрежва частично с разреден разтвор на формалдехид, глутаралдехид или глиоксал (за предпочитане глутаралдехид) в количество от 0,04 до 0,06 % об/об, замразява се и се суши във вакуумсублимационна инсталация. Лиофилизираният продукт се стерилизира с гама-лъчи и остава стабилен при стайна температура в продължение на две години.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1.

800 g лиофилизирани свински кожи от млади животни се смилат на мелница Frisch през сито с диаметър на отворите 1 mm. Смлените кожи се прехвърлят в стъклен реактор с бъркалка. Добавят се последователно 20 g панкреатин (Merck), 8 g Polysorbate 80 и 301 дестилирана вода, затоплена до 30-32°С. pH на разтвора се коригира до 7,0-7,5 с добавяне на капки на 40% т/об разтвор на натриев хидроксид или 20% т/об разтвор на лимонена киселина. В кожуха на реактора се подава топла вода, осигуряваща температура 30-32°С. Включва се бъркалката с 350 rpm за 30 min. След това сместа се оставя в покой за 90 min, отдекантира се горният слой на дълбочина 5-10 cm и се изхвърля. Добавя се дестилирана вода в количество, адекватно на отделената смес. Тази процедура се извършва трикратно.

След приключване на ензимната обработка, сместа се прехвърля в метален реактор с бъркалка с вместимост 1801, в който предварително са отмерени 120-1301 дестилирана вода и 120-140 g лимонена киселина. Довежда се pH на разтвора до 3,0-3,5 и ако е нужно, се добавя дестилирана вода до общ обем на разтвора 1601. Включва се бъркалката на 500 rpm, за 30 min, след което се изключва и разтворът се оставя да престои 72 h при температура 16-18°С, през което време се осъществява частична киселинна хидролиза на колагена. Полученият разреден колоиден разтвор на кисел колаген се центрофугира на проточна ултрацентрофуга “Сера” при 16 950 rpm за 20 min. Между реактора и центрофугата разтворът преминава през водна помпа с регулируем поток, която се регулира така, че 1601 от разтвора да премине през нея за 20-30 min. Центрофугатьт се прехвърля в реактор с вместимост 3001. В кожуха на реактора се подава вода, осигуряваща температура на сместа 18-20°С. Включва се бъркалката на 3 50 rpm и при непрекъснато разбъркване в продължение на 20 min, pH се довежда до 4,6-5,6 чрез прибавяне на малки порции 40% разтвор на натриев хидроксид. След всяко прибавяне на порция натриев хидроксид се отчита pH. При достигане на изоелектричната точка настъпва самопроизволно възстановяване (реконструкция) на фибриларната структура на колагена. Така получената колагенова суспензия се оставя да престои 2-3 h и след това се концентрира чрез центрофугиране при 2500 rpm за 30 min. Центрофугатът се изхвърля, а утаената колагенова суспензия се анализира за съдържание на сухо вещество. Довежда се до необходимата крайна концентрация чрез добавяне на дестилирана вода. Към 10 kg от сместа като консерванти се добавят 15 g нипагин и 5 g нипазол.

Аналитичният добив при посочените условия е около 35-40 kg 1% колагенова суспензия.

Пример 2.

В стъклен реактор се прехвърлят 20 kg реконструиран микрофибриларен колаген с концентрация 1 % и към тях се добавят от 20 до 50 g лимонена киселина до pH на разтвора 4,0. Включва се бъркалката на 500 rpm и хомогенизирането продължава 20-30 min до получаването на еднороден колагенов гел. Полученият кисел водноразтворим колаген се разлива в тави и

65654 Bl се подлага на лиофилизация. Вакуум-сублимационното сушене се извършва в лиофилизатор TG 16.50. Включва се охлаждането на лиофилизатора, докато температурата в камерата достигне (-40°С). Тавичките с колагеновия разтвор се прехвърлят в камерата на лиофилизатора и се оставят да престоят при тази температура 2 h. Понататък вакуум-сублимационното сушене се извършва при автоматичен режим до крайна температура на продукта +25°С, в продължение на 24-26 h. Сухият колагенов продукт с остатъчна влажност под 8% се пакетира във въздухо- и водонепроницаеми опаковки и може да се рехидратира и използва при нужда. Той запазва качествата си непроменени при съхранение на стайна температура в продължение на 3 години.

Пример 3.

Получената съгласно пример 1 колагенова суспензия, след реконструкцията и преди концентрирането, се довежда до pH 5,5-6,0. Извършва се допълнително омрежване и стабилизиране на колагеновите микрофибрили чрез добавяне към сместа на 15 cm³ 50% разтвор на глутаралдехид, при непрекъснато разбъркване в продължение на 15-20 min. Колагеновата суспензия се оставя да престои 2-3 h и след това се концентрира чрез центрофугиране при 2500 rpm за 30 min до крайна концентрация на колагена 2%. Към получения колагенов концентрат могат да се добавят биологично активни вещества с хемостатично, антисептично и стимулиращо епителизацията действие, в зависимост от предназначението на крайния продукт (за локална хемостаза при капилярни и паренхиматозни кръвотечения, за лечение на рани от изгаряния, разкъсни, контузии и проблемни рани и др.). Така приготвената колагенова смес се разлива в тавички от оборудването на вакуум-сублимационната инсталация при дебелина на слоя 1 cm. Продуктът се подлага на лиофилизация при описаните в пример 2 условия. Получените колагенови гъби се нарязват до желаните размери, опаковат се и се стерилизират с гама-лъчи при мощност на дозата 25 kGy.

Пример 4.

Колагеновата суспензия приготвена при описаните в пример 1 технологични условия се сгъстява чрез центрофугиране до концентрация

4% и се подкиселява с лимонена киселина до рН-стойност 4,60. Получава се еднороден слабоопалесциращ гел, който показва пластичен тип течене. При температура 20,5°С неговият вискозитет е 9120,0 mPs (ротационен вискозиметър Rheomat 108,7,61 s¹). Друга характерна особеност на този гел е слабо изразената тиксотропия. Гелът няма склонност към синерезис и не показва значими изменения във вискозитета при съхранение, което позволява да се използва като сгъстител и влагозадържащ агент в хранителната промишленост.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване на микрофибриларен водоразтворим колаген при използване на обезмаслени и обезкосмени свински кожи от млади животни, който включва смилане, развлакняване, ензимна и киселинна обработка, центрофугиране за отделяне на неразтворените частици, реконструкция и концентриране, характеризиращ се с това, че обезмаслените и обезкосмени свински кожи предварително се подлагат на вакуум-сублимационно сушене.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че при ензимната обработка на суровината се използва ензимен продукт с комбинирано действие - с протеолитична, липолитична и амилолитична активност.

3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че водноразтворимият микрофибриларен колаген се подкиселява до pH 4,04,5 и се подлага на вакуум-сублимационно сушене.

4. Метод съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че водноразтворимият микрофибриларен колаген след реконструкция се довежда до pH 5,5-6,0 и допълнително се омрежва с глутаров алдехид.