BG63614B1

BG63614B1 - Method for the production of probiotics

Info

Publication number: BG63614B1
Application number: BG103668A
Authority: BG
Inventors: Иван МУРГОВ; Запряна ДЕНКОВА
Original assignee: Иван МУРГОВ; Запряна ДЕНКОВА
Priority date: 1999-08-18
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2002-07-31
Also published as: BG103668A

Abstract

The method shall be applied for the prevention and treatment of diarrhoeas, gastrointestinal infections and dysbacteriosis in humans and animals, as well as for the cholesterol level regulation and for reinforcing the immune system. The freeze-dry and standardized products are administered as preparations for direct application and as yeasts for the preparation of fermented lactic acid products of probiotic effect. By the method probiotics are produced having high titre of live active cells of mixed and symbiotic cultures of selected strains of LAB 8 lactobacilli and streptococci, registered in NBIMCC under No. 2416, Lactobacillus LBC 7, registered in NBIMCC under No, 3599, Lactobacillus LBG-MZ, registered in NBIMCC under No. 3600, Lactobacillus bulgaricus LB 51-157, registered in NBIMCC under No. 3598, Streptococcus thermophilus 35, registered in NBIMCC under no. 3597 and Bifidobacterium bifidum BB 87, registered in NBIMCC under No. 3601. 1 claim

Description

Изобретението се отнася до метод за получаване на пробиотични препарати за профилактика и лечение на диарии, стомашно-чревни инфекции и дисбактериози при хора и животни.The invention relates to a method for the preparation of probiotic preparations for the prevention and treatment of diarrhea, gastrointestinal infections and dysbacteriosis in humans and animals.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Известни са методи за получаване на пробиотици, в състава на които са включени представители на лактобацили, лактококи, гъби и други микроорганизми, развиващи се аеробно или анаеробно в мляко, млечни и растителни субстрати и среди, съдържащи въглехидрати, източници на азот и фосфор, минерални елементи и растежни фактори /1, 2, 3, 7, 10/. Характерна особеност на пробиотиците е, че съдържат живи активни клетки, които чрез своите метаболити и жизнено действие спомагат за регулиране на стомашно-чревната микрофлора.Methods for preparing probiotics are known, which include representatives of lactobacilli, lactococci, fungi and other microorganisms that develop aerobically or anaerobically in milk, milk and plant substrates, and media containing carbohydrates, nitrogen sources and phosphorous elements and growth factors / 1, 2, 3, 7, 10 /. A characteristic feature of probiotics is that they contain living active cells that, through their metabolites and vital activity, help to regulate the gastrointestinal microflora.

Известно е диетичното и лечебно действие на българския йогурт, ацидофилното и бифидното мляко, в които влизат различни представители на лактобацили и лактококи, способни да се развиват в стомашночревния канал и да продуцират млечна киселина и бактериоцини, чрез които потискат патогенните и гнилостните бактериипричинители на чревни инфекции, диарии и други нежелани за организма процеси, като дисбактериози при хора и животни, понижават нивото на холестерола и укрепват имунната система /3, 4, 7, 8, 9, 10/.Dietary and therapeutic effects of Bulgarian yoghurt, acidophilus and bifid milk are known, which include various lactobacilli and lactococci, capable of developing in the gastrointestinal canal and producing lactic acid and bacteriocins, which suppress pathogenic bacteria and gastric infectious bacteria , diarrhea and other undesirable processes such as dysbacteriosis in humans and animals, lower cholesterol levels and strengthen the immune system / 3, 4, 7, 8, 9, 10 /.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

Същността на изобретението е метод за получаване на пробиотици с висок титър на жизнеспособни активни клетки, в състава на които са включени хибридните щамове на лактобацили Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBC 7 и Lactobacillus LBG-MZ. Последните са получени по метода на генетичната рекомбинация чрез фузия на протопласти /3/ и имат висока размножителна способност, натрупват висок титър клетки и имат висока инхибиторна активност спрямо ентеропатогенни бактерии. Рекомбинантните щамове се развиват еднакво добре като монокултури и в симбиотични култури с други лактобацили и лактококи и се използват за получаване на пробиотици и ферментирали млечни продукти с високо съдържание на жизнеспособни клетки, имащи пробиотично действие.The essence of the invention is a method for producing high-titre probiotics of viable active cells, comprising hybrid strains of Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBC 7 and Lactobacillus LBG-MZ. The latter were obtained by the method of genetic recombination by fusion of protoplasts (3) and have high reproductive capacity, accumulate high titer cells and have high inhibitory activity against enteropathogenic bacteria. Recombinant strains develop equally well as monocultures and in symbiotic cultures with other lactobacilli and lactococci and are used to produce probiotics and fermented dairy products with a high content of viable cells having probiotic activity.

В метода за получаване на пробиотици се използват като продуценти: Lactobacillus LAB 8, регистриран в НБПМКК под № 2416 и получен чрез фузия на протопласти на клетки на Lactobacillus acidophilus 12 и Lactobacillus bulgaricus 10; Lactobacillus LBC 7, регистриран в НБПМКК под № 3599 и получен чрез фузия на протопласти на Lactobacillus bulgaricus 144 и Lactobacillus casei-C; Lactobacillus LBG - MZ, регистриран в НБПМКК под № 3600 и получен чрез фузия на протопласти на L. bulgaricus-Z и L. bulgaricus-M.In the probiotic production method, the following are used as producers: Lactobacillus LAB 8, registered in NBPCC under No. 2416 and obtained by fusion of protoplasts of cells of Lactobacillus acidophilus 12 and Lactobacillus bulgaricus 10; Lactobacillus LBC 7, registered in NBPMCC under No. 3599 and obtained by fusion of protoplasts of Lactobacillus bulgaricus 144 and Lactobacillus casei-C; Lactobacillus LBG - MZ, registered in NBPMCC under No. 3600 and obtained by fusion of protoplasts of L. bulgaricus-Z and L. bulgaricus-M.

Щамовете Lactobacillus bulgaricus LB51157, регистриран в НБПМКК под № 3598, Bifidobacterium bifidum ВВ 87, регистриран в НБПМКК под № 3601, и Streptococcus thermophilus 35, регистриран в НБПМКК под № 3597, са получени чрез индуцирана мутагенеза с нитрозометилгуанидин върху съответните родителски култури.The strains of Lactobacillus bulgaricus LB51157 registered in NBPMCC under No. 3598, Bifidobacterium bifidum BB 87 registered in NBPMCC under No. 3601, and Streptococcus thermophilus 35 registered in NBPMCC under No. 3597 were obtained by mutagenetin-induced mutagenetin.

Според Donald и Brown /6/, за да изпълняват ролята на пробиотици, препаратите трябва да съдържат в 1 g продукт над 1 билион жизнеспособни клетки, което се счита като норма за човешкия организъм при балансиране на стомашно-чревната микрофлора.According to Donald and Brown (6), in order to serve as probiotics, preparations must contain in 1 g of product over 1 billion viable cells, which is considered to be the norm for the human body in balancing the gastrointestinal microflora.

Задачата на изобретението е получаването на пробиотични препарати с висок титър на жизнеспособни клетки на смесени или симбиотично развиващи се култури на посочените щамове лактобацили и лактококи в мляко, млечни, соеви и други среди на растителна основа.It is an object of the invention to provide high titer probiotic preparations of viable cells of mixed or symbiotic developing cultures of said strains of lactobacilli and lactococci in milk, milk, soybean and other plant-based media.

Висока активност на пробиотиците се постига за сметка на използване на селекционираните щамове, имащи съответните свойства от една страна и за сметка на високата размножителна способност и натрупването на клетки с висок титър в средата и тяхното концентриране чрез микрофилтрация или сепариране, от друга страна /1, 3/.High probiotic activity is achieved by using the selected strains having the corresponding properties on the one hand and at the expense of the high reproduction capacity and the accumulation of high titer cells in the medium and their concentration by microfiltration or separation on the other hand / 1, 3 /.

В получаваните концентрати титърът на лактобацилите и на лактококите надхвърля 10¹³ cfu/g, които след лиофилизацията практически съхраняват своята жизненост и активност.In the concentrates obtained, the titre of lactobacilli and lactococci exceeds 10 ¹³ cfu / g, which after lyophilization virtually retain their vitality and activity.

Изобретението се отнася до получаването на пробиотични препарати с високо съдържание на активни клетки на смесени и симбиотично развиващите се щамове лактобацили и лактококи: Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBC 7, Lactobacillus LBG-MZ, Lactobacillus bulgaricus LB 51-157, Streptococcus thermophilus 35 и Bifidobacterium bifidum BB 87.The invention relates to the production of probiotic preparations with high content of active cells of mixed and symbiotic developing strains of lactobacilli and lactococci: Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBC 7, Lactobacillus LBG-MZ, Lactobacillus bulgaricif Streptobacterium Streptobacterium Streptococcus Lactobacillus, Streptococcus lactocobacterium Streptococcus LB bifidum BB 87.

Настоящият метод включва култивиране на посочените селекционирани щамове на лактобацилите и лактококите в млечна или соева среда, последващо концентриране и лиофилизация. Препаратите, получени в среди на основа соеви субстрати, позволяват прилагането им за профилактика и лечение на диарии, стомашно-чревни инфекции и дисбактериози при хора, страдащи от лактазна недостатъчност /5/.The present method involves the cultivation of said selected strains of lactobacilli and lactococci in milk or soy medium, subsequent concentration and lyophilization. The preparations obtained in soy substrate-based media allow their use for the prevention and treatment of diarrhea, gastrointestinal infections and dysbacteriosis in humans suffering from lactase deficiency / 5 /.

Изобретението може да се илюстрира със следните примери.The invention can be illustrated by the following examples.

Пример 1. Стерилно обезмаслено и охладено до 37-40°С мляко се засява с 1% 24часова култура на развити симбиотично Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBC 7 и Streptococcus thermophilus 35. Култивира се при 37°С за 10 h. Млякото се изважда от термостата, охлажда се до 4-6°С и се центрофугира. Полученият концентрат се замразява и се суши под вакуум (лиофилизира). Сухият продукт представлява концентрат с висок титър жизнеспособни клетки, превишаващи 10¹² cfu/g.Example 1. Sterilized skimmed and cooled to 37-40 ° C milk was seeded with a 1% 24 hour culture of developed symbiotic Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBC 7 and Streptococcus thermophilus 35. Cultivated at 37 ° C for 10 h. The milk was removed from the thermostat, cooled to 4-6 ° C and centrifuged. The resulting concentrate was frozen and vacuum dried (lyophilized). The dry product is a concentrate with a high titre of viable cells exceeding 10 ¹² cfu / g.

Пример 2. Приготвя се соев екстракт със съдържание на сухи вещества 3%, към който се прибавят 3,5% глюкоза или захароза. Така приготвената среда се стерилизира при 121 °C за 15 min. Охлажда се до 3740°С и се посява самостоятелно с 1 % 24часова култура на Lactobacillus bulgaricus LB 51-157 и Lactobacillus LAB 8. Култивира се при 40-42°С 12-14 h, след което се внасят в количество 2-5% във ферментационната среда, която съдържа соево брашно, глюкоза или захароза. Процесът се води при посочената температура в течение на 18-24 h. Клетките се отделят и се сушат чрез лиофилизация. Сухият концентрат съдържа над 10² cfu/g жизнеспособни клетки.Example 2 A soybean extract with a solids content of 3% was prepared, to which 3.5% glucose or sucrose was added. The medium thus prepared is sterilized at 121 ° C for 15 min. It is cooled to 3740 ° C and seeded alone with a 1% 24 hour culture of Lactobacillus bulgaricus LB 51-157 and Lactobacillus LAB 8. Cultivated at 40-42 ° C for 12-14 h, after which they are introduced in 2-5% in a fermentation medium containing soya flour, glucose or sucrose. The process was run at the indicated temperature for 18-24 h. The cells were separated and dried by lyophilization. The dry concentrate contains more than 10 ² cfu / g viable cells.

Пример 3. Стерилна ферментационна среда (обезмаслено мляко или соева среда), както е описано в примери I и 2, се посява с 1 % 24-часова симбиотична култура на Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBG-MZ и Streptococcus thermophilus 35. Култивира се 7-8 h при 40-42°. След това ферментационната среда се охлажда до 4-6°С, концентрира се и се подлага на лиофилизация. Сухият лиофилизиран продукт съдържа над 10² cfu/g.Example 3. Sterile fermentation medium (skim milk or soy medium) as described in Examples I and 2 was inoculated with a 1% 24-hour symbiotic culture of Lactobacillus LAB 8, Lactobacillus LBG-MZ and Streptococcus thermophilus 35. Cultivated 7 -8 h at 40-42 °. The fermentation medium was then cooled to 4-6 ° C, concentrated and lyophilized. The dried lyophilized product contains more than 10 ² cfu / g.

Пример 4. Стерилно обезмаслено мляко, към което са добавени 1 % дрождев екстракт и 0,5% цистеин. HCL, се посява с 1% симбиотичноразвита култура на Lactobacillus LAB 8 и Bifidobacterium bifidum BB 87. Култивира се при 37°С за 12-16 h. Културалната среда се охлажда до 4-6°С, сепарира се и се подлага на лиофилно сушене.Example 4. Sterile skimmed milk to which 1% yeast extract and 0.5% cysteine were added. HCL, was seeded with 1% symbiotic culture of Lactobacillus LAB 8 and Bifidobacterium bifidum BB 87. Cultivated at 37 ° C for 12-16 h. The culture medium was cooled to 4-6 ° C, separated and subjected to freeze-drying.

Пример 5. Лиофилизираният препарат се стандартизира и със съдържание на живи активни клетки над 10‘° cfu/g се капсулира или таблетира по 250, 400 и 500 mg. Дава се профилактично или лечебно по 2-6 броя на ден в течение на 3-10 дни в зависимост от потребностите на пациента.EXAMPLE 5 The lyophilized preparation was standardized and the capsules or tablets of 250, 400 and 500 mg were encapsulated or tableted with live active cells above 10 µCfu / g. It is given prophylactically or curatively for 2-6 units a day for 3-10 days depending on the patient's needs.

Пример 6. Лиофилизиран пробиотик със съдържание на активни живи клетки над 10‘° cfu/g след разтваряне в преварено мляко или вода се дава на бозайници непосредствено след раждане за профилактика на колиентерити и едемна болест, а също така лечебно при диарии, стомашно-чревни инфекции или дисбактериози в зависимост от потребностите на отделните пациенти.Example 6. A lyophilized probiotic containing active living cells above 10 'cfu / g after dissolution in digested milk or water is given to mammals immediately after birth for the prevention of collienteritis and edema, and also for treatment in diarrhea, gastrointestinal infections or dysbacteriosis depending on the needs of individual patients.

Claims

A method for the preparation of probiotics comprising the cultivation of mixed or symbiotic cultures of strains of the genera Lactobacillus and Streptococcus in nutrient media containing milk and soybean substrates, carbohydrates, mineral elements and growth factors with subsequent concentration, lyophilization and lyophilization that the producers used are Lactobacillus LAB 8, registered with NBPMC under No. 2416, Lactobacillus LBC 7, registered with NBPMC, under No. 3599, Lactobacillus LBG-MZ, registered,