BG62168B1

BG62168B1 - Щам aspergillus terreus, продуцент на хипохолестеролимиченпродукт

Info

Publication number: BG62168B1
Application number: BG100447A
Authority: BG
Inventors: Надежда М. Иванова; Димитра Ц. Тодорова; Радка Х. Иванова
Original assignee: "Антибиотик" АД
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1999-04-30
Also published as: BG100447A

Description

Изобретението се отнася до щам Aspergillus terreus, продуцент на хипохолестеролимичен продукт, който намира приложение във фармацевтичната промишленост.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че хипохолестеролимичните продукти от групата на А Лактоните, се използват в хуманната медицина като средство за регулиране съдържанието на холестерин в кръвта. Ефектът на действието им се постига чрез конкурентна инхибиция на 3-хидрокси3-метилглутарил коензим А-редуксидаза, ключов ензим в холестеролния биосинтез. Такива са продуктите ловастатин, дихидроловастатин и др.

Известни са щамове, продуценти на хипохолестеролимични продукти, от вида Aspergillus terreus, Penicillium citrinum, Monascus ruber /Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1980, (77) 7, 39573961; US 4 231 938; US 4 376 863; J. Am. Chem. Soc., 1985 (107), 12, 3694-3701/.

Известен е щам продуцент Aspergillus terreus НБПМКК N3319, който при дълбочинно култивиране в аеробни условия продуцира хипохолестеролимичните продукти ловастатин и дихидроловастатин /US 4 376 863/.

Недостатък на известните щамове е, че при култивирането им желаният хипохолестеролимичен продукт ловастатин се получава като минорен компонент във ферментационната среда, което ги прави нискоефективни за промишлено използване.

Техническа същност на изобретението

Задачата на изобретението е да се създаде щам Aspergillus terreus, с повишена про дукция на хипохолестеролимичен продукт ловастатин в културалната течност.

Задачата се решава чрез създаване на щам Aspergillus terreus, продуцент на хипохолестеролимичен продукт, регистриран в НБПМКК под N3318, при селекция на изходен щам Aspergillus terreus НБПМКК N3319 чрез мутагенно третиране с ултравиолетова светлина с дължина на вълната 254 nm за 60-180 s, подбор на определен вариант на щама, след разсев естествен отбор и следващо обработване с Н-метил-Н’-нитро-Н-нитрозогуанидин от 250 до 500 |Ag/l за 45 до 60 min.

За охарактеризиране на изходния родителски щам Aspergillus terreus НБПМКК N3319 и получения от него мутант Aspergillus terreus НБПМКК N3318 са използвани следните хранителни среди:

1. Малцов агар, със състав в тегл.%: малцов екстракт 3,0, соев пептон 0,3, агар 1,5 при pH 5,6 ± 0,1.

2. Малцово-царевичен агар със състав в тегл.%: малцов екстракт 2,0, царевичен екстракт 1,0, агар 1,5 при pH 6,5 ± 0,2.

3. Сабуро-малтозен агар със състав в тегл.%: месен пептон 0,5, казеин 0,5, малтоза 2,0, агар 1,5 при pH 5,6 ±0,1.

4. Комбиниран агар със състав в тегл.%: малцов екстракт 1,5, пептон 0,075, малтоза 1,3, декстрин 0,3, глицерол 0,25, монокалиев фосфат 0,1, амониев хлорид 0,1, агар 1,5 при pH 4,8 ± 0,2.

5. Малцово-глюкозо-пептонен агар (MGP) със състав в тегл.%: малцов екстракт 2,0, глюкоза 2,0, пептон 0,1, агар 1,5 при pH 5,6 ± 0,1.

Морфолого-културалните характеристики на двата щама, направени на 14-ия ден от развитието им, са отразени в таблица 1:

Таблица 1

Сравнителна морфологична характеристика на щамове Aspergillus terreus

НБПМКК N N 3319 и 3318

Хранителна среда	Родителски щам A. terreus 3319, НБПМКК	Мутантен щам A. terreus 3318, НБПМКК
Малцов агар	колонии с размер 5 до 30 mm, пухкав въздушен мицел, ненабраздени с обилна спорулация; цвят на въздушния мицел жълтовато серен вЗ	колонии с размер 5 до 20 mm, пухкав въздушен мицел, ненабраздени с обилна спорулация; цвят на въздушния мицел жълтоват к1 до бледопясъчен кЗ
Малцово-царевичен агар	колонии с размер над 40 mm, ненабраздени, пухкав въздушен мицел и обилна спорулация; цвят на въздушния мицел светъл шамуа г5	колонии с размер 20-40 mm, ненабраздени, пухкав въздушег мицел, нормална спорулация; цвят на въздушния мицел пясъчен л7
Сабуро-малтозен екстракт	колонии с размер 30-40 mm, ненабраздени, обилна спорулация; цвят на въздушния мицел бледо пясъчен кЗ до червеникаво кафяв з5	колонии с размер 20-25 mm, ненабраздени, пухкав въздушег мицел, обилна спорулация; цвят на въздушния мицел тъмнопясъчен зб до тъмнодимен м1 хомогенна популация
Комбиниран агар	колонии с размер 10-40 mm, радиално ненабраздени с пухкав въздушен мицел и обилна спорулация; цвят на въздушния мицел бледоохра 65+дЗ	колонии с размер 7-30 mm, радиално набраздени с пухкав въздушен мицел и нормална спорулация; цвят на въздушни? мицел серно жълт и1 до янтарно жълт ~ к1
Малцово-глюкозопептонен агар	колонии с размер 25-35 mm, набраздени радиално, обилна спорулация; цвят на въздушния мицел зЗ охра до пясъчен л7	колонии с размер 18-20 mm, плоски ненабраздени, обилна спорулация цвят на въздушни? мицел тъмнопясъчен зб до гранатов к5 висока хомогенност

Цветът на въздушния мицел е определен по цветната скала на Бондарцев /Бондарцев, А.С., Шкала цветов, Изд. на АН СССР, 1954/.

Данни за усвояване на различни въгле хидрати от родителския щам Asp. terreus НБПМКК N3319 и мутантния щам Asp. terreus НБПМКК N3318 са отразени в таблица 2:

Таблица 2

Сравнителни характеристики на щамове Asp. terreus НБПМКК N N 3319 и 3318

Субстрат	Родителски щам A. terreus N 3319	Мутантен щам A. terreus N 3318
1	2	3
Глюкоза	+++	-Н-+
Фруктоза	-н-	+
Малтоза	+++	+++
Захароза	++	++
Галактоза	++	+
Глицерол	+	++
Нишесте	++	++
Декстрин	++	+
Ксилоза	+++	+++
Манит	++	+
Контрола	+	+

Означенията в таблицата: “+” - положителен ръст; “±“ - вероятен ръст

Захарите, използвани за изготвяне на сравнителна характеристика, се приготвят, като 10%-ни разтвори и се подават стерилно при температура 60°С към контрола, съдържаща соли и единичен източник на въглерод в концентрация 1%, със следния състав в g/Ι: амониев сулфат 2,64, монокалиев фосфат безводен 2,38, дикалиев фосфат трихидрат 5,65, магнезиев сулфат 1, агар 15, солев разтвор 1 ml/1 при pH 6,8 - 7,0. Солевият разтвор, използван за изготвяне на контрола, съдържа в g: CuSO₄0,63, FeSO₄ 0.11. MnCl₂ 0,79, ZnSO₄ 0,15 и до 100 ml дестилирана вода.

Стабилизирането на получения мутантен щам и запазване на полезните му свойства се постига чрез последователни разсеви естествен отбор за хомогенизиране на популацията. След петия разсев върху малцово-глюкозо-пептонен агар се постига висока хомогенност на колониите както по отношение на физико-морфологичните характеристики, така и по продуктивност.

Щамът се съхранява върху скосен агар при температура +4°С за не повече от 6 месеца 45 или чрез лиофилизация върху обезмаслено мляко или друга защитна среда.

Ферментацията се провежда двустепенно при използване на следните хранителни среди: инокулационна среда със състав в 50 тегл.%: царевичен екстракт 2, царевично брашно 0,1, глюкоза 0,1 и разтвор от микроелементи 10 ml, с pH 5,6; ферментационна среда със състав в тегл.%: глюкоза 2,5, лактоза 2,5, царевичен екстракт 2,5, соево брашно 1,5, монокалиев фосфат 0,1, амониев сулфат 0,1, магнезиев сулфат 0,1, калциев карбонат 0,6 с pH 7,0. Култивирането се извършва при температура 26-28°С, в аеробни условия за 140 до 168 h.

Разтворът от микроелементи в състава на инокулационната среда съдържа в mg: FeSO₄.7H₂O 1000, MnSO₄.4H₂O 1000, CuCl₂.2H₂O 25, СаС1₂ 100, H₃BO₃ 56, (NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 19, ZnSO₄.7H₂O 200 и дестилирана вода до 1 1.

Описание на приложената фигура

Продукцията на хипохолестеролимичен продукт в културалната течност на родителския и мутантния щам е представена сравнително графично на фиг. 1, където крива 1 изобразява диференциалната скорост на натрупване на хипохолестеролимичен продукт в културалната течност в процеса на ферментация на родителския, а крива 2- на получения щам - мутант.

Предимствата на щама съгласно изобретението, се изобразяват в по-големите му продуктивни възможности на хипохолестеролимичен продукт ловастатин.

Изобретението се пояснява със следните примерни изпълнения:

Пример 1. Щам Aspergillus terreus НБПМКК N3319 се развива върху епруветка с полегата агарова среда MGP, съдържаща в g: малцов екстракт “Дифко” 20,0, глюкоза 20,0, пептон 1,0, агар 20,0 и дестилирана вода до 1 1, pH 5,6 ± 0,1, за 10-14 дни. Спорите се смиват с 10 ml физиологичен разтвор и 9,5 ml от суспензията се подлага на облъчване с ултравиолетова светлина с дължина на вълната 254 nm за 60-180 s при непрекъснато разбъркване. С 0,5 ml от изходната суспензия се изготвя контролен разсев. От облъчената суспензия се правят серийни разреждания, от които се посяват петрита с MGP агар. Култивирането се извършва при 26-28°С за 10-14 дни. Преживелите облъчването колонии се изолират върху епруветки полегат агар MGP, както и тези от контролата и продуктивността им се проверява чрез дълбочинно култивиране в двустепенна ферментация. В края на ферментационния процес се определя натрупването на хипохолестеролимичен продукт в културалната течност чрез HPLC метод.

Провежда се разсев естествен отбор, изолира се определен вариант на щама. Така определената култура се смива от епруветка полегат агар с 10 ml дестилирана вода. С по 0,5 ml от суспензията се инокулират няколко Ерленмайлерови колби от 300 ml, съдържащи 50 ml среда MY със следния състав в %: малцов екстракт 2, дрождев екстракт 0,4, агар 0,1, pH се коригира с NaOH до 5,5 ±0,1. Колбите се култивират 24-36 h при 26-28°С на кръгова клатачка с 200-250 об./мин. и 5 cm отклонение, след което по 1 ml от най-хомогенно развитата колба се прехвърля в няколко Ерленмайлерови колби от 300 ml със същата хранителна среда и отново се култивират до среднологаритмична фаза на ръст.

Съдържанието на една колба се центрофугира стерилно, промива се с физиологичен разтвор двукратно, след което мицелът се ресуспендира отново в 50 ml MY среда и се култивира 4 h при 32°С на кръгова клатачка с 220-250 об./мин. и 5 cm отклонение. След това pH се коригира с NaOH до 8,5 и се прибавя от 250 до 500 mg/1 N-Memn-N’-HHTpo-N-HHTpoзогуанидин. След 45-60 min се взема 1 ml за преброяване на колонииформиращите единици. Останалата част се центрофугира и се промива с MY среда. Суспендира се в 50 ml MY среда и се култивира една нощ при 26-28°С на клатачка. От тази култура се изготвят серийни разреждания, които се разсяват върху петри с MY среда, съдържаща 2% агар.

Прорасналите колонии от контролната и обработваната популация се изолира върху полегат агар MGP, култивират се и се проверяват ферментативно за образуване на хипохолестеролимичен продукт.

Пример 2. За ферментационна проверка на колонии, изолирани от разсеви естествен отбор, а Ерленмайлерова колба от 500 ml, съдържаща 100 ml хранителна среда със състав в тегл.%: малцов екстракт 0,2, дрождев ек стракт 0,4, arap “Дифко” 0,05, pH 5,6 се посява едно реутаново ухо спори от добре спорулирала култура на щам Aspergillus terreus. Култивирането се извършва при 26-28оС за 24-26 h на кръгова клатачка с 200-250 об. в мин. С 510% от добре развитият посевен материал се инокулира една еднолитрова Ерленмайлерова колба, съдържаща 200 ml от същата хранителна среда, която се култивира при същите условия. Добре развитият посевен материал трябва да има pH в границите 5,5 - 5,7, биомаса 20-25%, възраст 24-36 h, микроскопска картина-хифи с добра базофилия и да бъде стерилен.

5-10 об.% от така приготвения посевен материал се прехвърлят в 500 ml Ерленмайлерова колба върху 100 ml ферментационна хранителна среда, съдържаща следните съставки в тегл.%: глюкоза 4,0, малтоза 2,0, монокалиев фосфат 0,2, дикалиев фосфат 0,7, натриев цитрат 0,05, амониев сулфат 0,1, магнезиев сулфат 0,1, казеинов пептон 1,0 с pH 5,5 ± 0,1. Ферментационният процес се провежда при температура 26-28°С, за 140 до 168 h на кръгова клатачка с 200-250 об./мин. и 5 cm отклонение.

В края на ферментационния процес се определя натрупването на хипохолестеролимичен продукт в културалната течност под формата на киселина чрез HPLC метод на етилацетатни екстракти от клетките. Анализът се извършва на стандартна хроматографска колона RP 18, еквилибрирана с метанол и 0,1 %-ен разтвор на фосфорна киселина в съотношение 70:30, скорост на потока 1,5 ml/min, дължина на вълната 238 nm, спрямо USP стандарт също в киселинна форма. Времето на задържане на киселинната форма на хипохолестеролимичния продукт ловастатин е около 20 min.

В резултат на извършената фермента тивна проверка и анализ на пордуктивността на отделните колонии се подбират високо продуктивни варианти за следващи стъпала на селекция или за работа в производствени условия.

Пример 3. Добре спорулирала култура на щам Aspergillus terreus НБПМКК N 3318 върху полегат arap MGP се посява в 500 ml Ерленмайлерова колба, върху 100 ml хранителна среда със състав в тегл.%: царевичен екстракт 2, глюкоза 1,5, царевично брашно 1 и разтвор от минерални соли 10 ml, pH 6,8, стерилизирана 30 min при температура 120°С. 5-10% от добре развитият посевен материал се инокулира в еднолитрова Ерленмайлерова колба, съдържаща 200 ml от същата хранителна среда, култивирана при същите условия. С 200-400 ml от така подготвения посевен материал се инокулира в 50 1 ферментатор, съдържащ 35 1 хранителна среда в тегл. %: глюкоза 2,5, лактоза 2,5, царевичен екстракт 2,5, соево брашно 1,5, монокалиев фосфат 0,1, амониев сулфат 0,1, магнезиев сулфат 0,1 и калциев карбонат 0,6 с pH 7,0. Култивирането се провежда при температура 26-28°С, непрекъснато разбъркване с бъркалка с 200 об./мин., аериране с въздух в съотношение спрямо ферментационната среда 0,3:1 до 24 h, а до края на ферментационния процес 0,6:1 и налягане 0,5 atm за 140 до 160 h. Активност на културална течност 1300 MME* (1 MME - 1 g/ml) по метода HPLC.

Claims

Патентни претенции

1. Щам Aspergillus terreus, регистриран в НБПМКК под N 3318, продуцент на хипохолестеролимичен продукт.