BG113517A - Пан-хемокинови антагонисти за използване при превенция и намаляване на ракови метастази - Google Patents
Пан-хемокинови антагонисти за използване при превенция и намаляване на ракови метастази Download PDFInfo
- Publication number
- BG113517A BG113517A BG113517A BG11351722A BG113517A BG 113517 A BG113517 A BG 113517A BG 113517 A BG113517 A BG 113517A BG 11351722 A BG11351722 A BG 11351722A BG 113517 A BG113517 A BG 113517A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- cancer
- ccr7
- chemokine
- compound
- prevention
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title abstract description 25
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 title 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 73
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 101710149858 C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000000614 rib Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002559 chemokine receptor antagonist Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102100022718 Atypical chemokine receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 101000678892 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101000716070 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 9 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 5
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims abstract description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims abstract 2
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 125000004527 pyrimidin-4-yl group Chemical group N1=CN=C(C=C1)* 0.000 claims description 16
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 3
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 claims 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 10
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract description 8
- -1 2-({6-phenylthieno[2,3-d]pyrimidin-4-yl}oxy)benzamide Chemical compound 0.000 abstract description 5
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 abstract description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 abstract 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 abstract 1
- 206010044002 Tonsil cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 208000006842 Tonsillar Neoplasms Diseases 0.000 abstract 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 abstract 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 230000001971 thyroidal effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 47
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 46
- BDEDPKFUFGCVCJ-UHFFFAOYSA-N 3,6-dihydroxy-8,8-dimethyl-1-oxo-3,4,7,9-tetrahydrocyclopenta[h]isochromene-5-carbaldehyde Chemical compound O=C1OC(O)CC(C(C=O)=C2O)=C1C1=C2CC(C)(C)C1 BDEDPKFUFGCVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 27
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 26
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 22
- 102000000072 beta-Arrestins Human genes 0.000 description 18
- 108010080367 beta-Arrestins Proteins 0.000 description 18
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 15
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 15
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 15
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 15
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 238000003041 virtual screening Methods 0.000 description 11
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 10
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 10
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 9
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 9
- 230000001275 ca(2+)-mobilization Effects 0.000 description 9
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 230000008856 allosteric binding Effects 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 3
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 description 3
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 description 3
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 3
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 3
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N pentaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCO JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- VQNLJXWZGVRLBA-MRXNPFEDSA-N (2r)-3-acetyl-1-(4-chloro-2-fluorophenyl)-2-cyclohexyl-4-hydroxy-2h-pyrrol-5-one Chemical compound C1([C@H]2N(C(=O)C(O)=C2C(=O)C)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)F)CCCCC1 VQNLJXWZGVRLBA-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 2
- 102000007471 Adenosine A2A receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010085277 Adenosine A2A receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100036842 C-C motif chemokine 19 Human genes 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 2
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 2
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N γS-GTP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- NUJWKQSEJDYCDB-GNRVTEMESA-N (3s)-1-[(1s,2r,4r)-4-[methyl(propan-2-yl)amino]-2-propylcyclohexyl]-3-[[6-(trifluoromethyl)quinazolin-4-yl]amino]pyrrolidin-2-one Chemical compound CCC[C@@H]1C[C@H](N(C)C(C)C)CC[C@@H]1N1C(=O)[C@@H](NC=2C3=CC(=CC=C3N=CN=2)C(F)(F)F)CC1 NUJWKQSEJDYCDB-GNRVTEMESA-N 0.000 description 1
- 230000035495 ADMET Effects 0.000 description 1
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 1
- 206010063746 Accidental death Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 description 1
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 description 1
- 102100037853 C-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100036305 C-C chemokine receptor type 8 Human genes 0.000 description 1
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108700013048 CCL2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004274 CCR5 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017088 CCR5 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000000018 Chemokine CCL2 Human genes 0.000 description 1
- 229940122444 Chemokine receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940125633 GPCR agonist Drugs 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 101000716063 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108091058560 IL8 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102100033461 Interleukin-17A Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101100225046 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ecl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102100028886 Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710083167 Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010535 acyclic diene metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008849 allosteric communication Effects 0.000 description 1
- 229940125516 allosteric modulator Drugs 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 229940124411 anti-hiv antiviral agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003067 chemokine receptor CCR5 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003073 chemokine receptor CCR9 antagonist Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000013501 data transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229940125425 inverse agonist Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- GSNHKUDZZFZSJB-QYOOZWMWSA-N maraviroc Chemical compound CC(C)C1=NN=C(C)N1[C@@H]1C[C@H](N2CC[C@H](NC(=O)C3CCC(F)(F)CC3)C=3C=CC=CC=3)CC[C@H]2C1 GSNHKUDZZFZSJB-QYOOZWMWSA-N 0.000 description 1
- 229960004710 maraviroc Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000005400 testing for adjacent nuclei with gyration operator Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- YEZNLOUZAIOMLT-UHFFFAOYSA-N tolfenamic acid Chemical compound CC1=C(Cl)C=CC=C1NC1=CC=CC=C1C(O)=O YEZNLOUZAIOMLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002905 tolfenamic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Настоящото изобретение разкрива химичното съединение 2-({6-фенилтиено[2,3-d]пиримидин-4-ил}окси)бензамид за използване като CCR7 (C-C хемокинов рецептор тип 7) антагонист. То също така е пан-хемокинов антагонист и има антагонистичен ефект към CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR9 и CXCR4 хемокинови рецептори и се използва при предотвратяване на образуване на метастази в белия дроб, черния дроб и ребрата при in vivo миши модел на рак на гърдата. Изобретението също така разкрива химичните съединения 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)-2,5-диметилтиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}бензамид, означен също като MIC5023, и 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)-2-метилтиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}бензамид, означен също като MIC5024, като панхемокинови антагонисти и по-специално антагонисти на CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR7 и CXCR4 хемокинови рецептори. Посочените по-горе съединения са за използване при превенция или лечение на заболявания, свързани с хемокинови рецептори, които са по-специално метастазите в белите дробове, черния дроб, ребрата и лимфните възли и прогресията на много различни злокачествени заболявания като например рак на гърдата, на стомаха, на кожата (меланом), на главата и шията, на белия дроб, на хранопровода, на черния дроб, на маточната шийка, на щитовидната жлеза, на сливиците, на дебелото черво и на простатата и други подобни. Също така, те са за използване при превенция или лечение на вирусни инфекциозни заболявания, свързани с хемокинови рецептори, като HIV-1, HIV-2, SARS-CoV-2 (COVID-19) и други подобни. Също така, те са за използване при заболявания, свързани с имунитета, като псориазис, артрит и атопичен дерматит.
Description
Пан-хемокинови антагонисти за използване при превенция и намаляване на метастази при рак
ТЕХНИЧЕСКА ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящото изобретение се отнася до съединения, които имат антагонистична активност към хемокинови рецептори. Едно от съединенията е за използване при превенцията на образуването на метастази в белия дроб, черния дроб и ребрата в in vivo миши модел на рак на гърдата.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
CCR7 (С-С хемокинов рецептор тип 7) е GPCR мембранен протеин, който принадлежи към хемокините от клас CCR. Той свързва хемокини CCL19 и CCL21, които са важни за тъканната хомеостаза, наблюдението на имунитета и туморогенезиса [1]. CCR7 е включен в много заболявания като например рак, където той е критичен за разпространението на раковите клетки чрез метастази в лимфните възли, псориазис и също артрит. Свръхекспресията на CCR7 е основно свързана с метастази в лимфните възли. Тя също играе важна роля в прогресията на много различни злокачествени заболявания като например рак на гърдата, на стомаха, на кожата (меланом), на главата и шията, на белия дроб, на хранопровода, на черния дроб, на маточната шийка, на щитовидната жлеза, на сливиците, на дебелото черво и на простатата. При повечето от тези видове рак, по-големият размер на тумора и по-дълбоката инвазия беше свързана с експресията на CCR7. Хемокините също са много важни за имунния отговор и могат да се използват като цел за лечение на няколко сериозни вирусни инфекции. Например, CCR5 рецепторът е гостоприемник, чрез който HIV влиза в човешките клетки и по този начин е един атрактивен анти-HIV лекарствен таргет. CCR5 антагонистът Маравирок, беше одобрен от FDA през 2007 в САЩ. Той показа обещаващи резултати, но за съжаление може да причини сериозни, животозастрашаващи странични ефекти. По-специално, последните доклади разкриха, че С-С хемокините също са важни за имунния отговор към вируса SARS-CoV-2 (Covid19) и антагонистите, които едновременно модулират CCR1, CCR5, CCR7 и CCR8, могат да бъдат от голяма помощ. Това беше очакван резултат, тъй като по-рано също беше демонстрирана важността на CD4+ и CD8+ клетките при инфекции с Covid-19.
Въпреки че CCR7 е атрактивен лекарствен таргет, се съобщава за много ограничен набор от молекули, които могат да се свържат с този хемокин. Наскоро беше извършен масивен високопроизводителен скрининг и бяха експериментално тествани повече от 150 000 молекули за CCR7 активност. Бяха открити четиринадесет антагонисти, главно малки фрагменти, както и някои подобни на естествените молекули, включително анти-HIV агентът Cosaline чрез анализ, свързан с β-арестин. Потентността на всички тези антагонисти беше около ΙΟμΜ, с изключение на Cosaline (ICso=O.2pM) [2]. Други видове анализи и изследвания на селективността не бяха извършени. Известен е също патент US7691856B2, който разкрива един клас от високо потентни антагонисти, но в научните доклади никога не са публикувани подробности относно процеса на откриване, зависимостите структура-активност (SAR), селективност и др. От университета в Брадфорт беше използвана друга молекула (ICT5888) като начална точка при разработването на новото съединение (ICT13069), но данните все още не са публични. Обаче, наскоро публикувана докторска дисертация разкри пътя на откриването на ICT13069, която съдържа масивен проект с SAR и синтезиране на повече от 100 съединения [3]. Активността на този антагонист, измерена чрез анализ на Са2+ мобилизация беше 0.1 μΜ. Така, CCR7 е атрактивна таргетна област както за академичните среди, така и за големите фармацевтични компании.
Рентгенова структура на CCR7 в комплекс с най-активния лиганд, сшр2105, от споменатите по-долу (US7691856B2) серии и изследвания на свързване бяха публикувани от изследователската група на Roche [4]. Това изследване предоставя ценна структурна информация и може да се използва както за валидиране на вече получени теоретични модели, така и за допълнителни изследвания. Всъщност то може да се използва и за кампании за виртуален скрининг и оптимизация на водещи структури.
Целта на настоящото изобретение е да осигури съединения имащи антагонистична активност към хемокинови рецептори, т.е. да осигури нов СС7 антагонист.
ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящото изобретение разкрива 2-({6-фенилтиено[2,3-б]пиримидин-4ил}окси)бензамид, означен също като Hit 1, MIC5022 за използване като нов CCR7 активен антагонист, който се оказа също пан-хемокинов антагонист. По-нататък изобретението разкрива някои изследвания на зависимостта структура-активност (SAR), изследвания на селективността и няколко in vitro анализа, в опит да се идентифицира пътят на действие, както и теоретични изследвания на начина на свързване на идентифицирания лиганд. Изобретението също разкрива in vivo данни на миши модел на рак на гърдата 4T-1-Luc, който ясно показва ефикасността на 2({6-фенилтиено[2,3-с1]пиримидин-4-ил}окси)бензамид (Hit 1, MIC5022) за използване при превенцията и намаляването на метастази в белия дроб, черния дроб и ребрата, което показва потенциалът за лечение на това съединение.
В друг аспект, настоящото изобретение разкрива химичната формула, пътят за синтез и in vitro биологичните данни за две нови съединения, които са панхемокинови антагонисти: 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофрнил)-2,5-диметилтиено[2,3б]пиримидин-4-ил]окси}бензамид, означен също като MIC5023, и 3-хлоро-2-{[6-(2хлорофенил)-2-метилтиено[2,3-0]пиримидин-4-ил]окси}бензамид, означен също като MIC5024.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
За да се улесни разбирането на това изобретение, по-долу са дефинирани редица термини, които имат значения, както обикновено се разбират от специалист в областта, свързана с настоящото изобретение.
Както се използва тук терминът „лечение“ означава използването или прилагането на терапавтичен агент описан тук, или идентифициран чрез описан тук метод, върху пациент, или използването, или прилагането на терапавтичен агент на изолирана тъкан или клетъчна линия от пациент, който е със заболяване, симптом на заболяване, с предразположение към заболяване, с цел лечение, оздравяване, облекчаване, успокояване, променяне, излекуване, оправяне, подобряване или повлияване на заболяването, симптомите на заболяването или предразположението към заболяване.
Виртуален скрининг (VS)
Процедурите на виртуален скрининг вече са описани от изобретателите в последните им изследвания относно АК.Т1 и GlyT2 инхибитори. Накратко, тази процедура комбинира структурно базиран фармакофорен модел и докинг скриниране последвано от Докинг с индуциране прилагане (IFD). За този тип подходи също е необходима структура с високо качество. Въпреки това, в настоящото изобретение, този протокол е допълнително оптимизиран чрез извършване на екстензивна молекулярна динамика (MD) след IFD за получаване на холоподобни структури за най-добрите хитове и след това съединенията бяха подложени на повторен докинг. Трябва да се подчертае, че по време на научноизследователската и развойната дейност и последващите изследователски дейности, не е била налична експериментална структура на CCR7 (тя е публикувана в PDB през септември 2019, PDB код 6QZH) и изобретателите трябваше да конструират базирана на хомоложен модел структура, която беше усъвършенствана чрез много MD симулации и крайната изходна структура беше използвана за VS кампанията.
Поради високата гъвкавост на свързващите джобове на GPCR, броят на MD, използвани за получаване на първоначалната апо структура, беше увеличен. За CCR7, изобретателите използваха над 10 MD симулации с дължина между 500ns и Ips. Също така беше извършен набор от ускорени (aMD) симулации. Въз основа на получените данни, апо структурата на CCR7 беше извлечена чрез клъстерен анализ, което беше основата за настоящия структурно-базиран фармакофорен модел. Фармакофорните точки бяха получени след докинг на около 600 малки фрагменти в ортостеричното свързващо място на CCR7. За този модел не бяха използвани настройките по подразбиране, които са внедрени в софтуера Schrodinger, но вместо това бяха създадени 6 фармакофорни точки и беше поискано всички те да бъдат съпоставени. В допълнение към автоматично генерираните фармакофори, са включени всички важни точки, както от MD данните, така и от скорошни проучвания на биохимични мутации, като някои от тези точки бяха добавяни и модифицирани ръчно. Изискването всички фармакофорни точки да съвпадат е много рестриктивен подход и намалява броя на хитовете, но съвпадението на всички точки има значителни предимства и намалява броя на фалшиво положителни лиганди.
Любопитно е, че подобен фармакофорен модел е валиден и може да се използва до известна степен и за алостеричното място. Всъщност формите и размерите на алостеричното свързващо място са различни от тези на ортостеричното място и то е по-малко, така че само малки по размер лиганди (M.W от около 350 Da) могат да се поберат в двете места на свързване, но това е интересна стратегия за намиране на потенциално кооперативно свързващи молекули. Тази характеристика е уникална в семейството на CCR и присъства само в CCR7. Първоначалната и основна цел на изобретението беше да се намерят ортостерични свързващи съединения, за това VS скрининга беше започнат от това място за свързване. Въпреки това, намерените хитове потенциално можеше да се свързват също към алостерично свързващо място. Въз основа на ортостеричен фармакофорен модел, над 4 милиона съединения бяха скринирани от базата данни на ZINC (lead-like set, версия 2017), които бяха налични по време на първоначалната фаза на това проучване, както и от набора Enamine hts (версия 2020_2). В резултат на това само 1300 молекули съответстваха на тези шест ключови взаимодействия (фармакофорни точки) и лигандите бяха допълнително подложени на докинг и повторно отчетени от софтуера Glide SP на Schrodinger. Найобещаващите топ 100 хитове от всеки набор бяха визуално проверени и след това повторно подложени на докинг чрез процедурата на докинг с индуцирано прилягане, която взема предвид също така гъвкавостта на остатъците на свързващите джобове. След това изходните лиганд-протеинни комплекси бяха внимателно изследвани и бяха избрани над 20 лиганда за изследвания на MD и свободна енергия (MM/PBSA). Преди това такава процедура не беше изпълнена, но CCR7 джобът е много гъвкав и за намиране на някаква холоподобна структура той трябваше да бъде прецизиран чрез интензивни MD симулации, напр. с лиганд в свързващия джоб.
По време на изследванията на MM/PBSA изобретението също използва като референтни данните за свободната енергия на наскоро открити малки молекули, както и тези от предишни проучвания, за които са налични както MD симулации с Charm силово поле (FF), така и експериментални данни. Това беше необходимо, тъй като Charm36m FF беше използвано за MD и софтуера AmberTools за MM/PBSA, но тази комбинация не беше много тествана, дори изобщо не беше тествана. Например, ако някой използва Amber 14SB FF в комбинация с AmberTools, ще получи една стойност от изчисленията на MM/PBSA, която ще бъде значително различна, ако се използва Charm FF. По този начин, за да се получи някаква информация за това в какъв диапазон на свободна енергия можем да очакваме активни лиганди, всички предишни данни бяха използвани като референция и стойност от -20 kcal/mol беше зададена като праг за потенциално активни хитове. В резултат на това се наблюдава, че според изчисленията на MM/PBSA повечето от лигандите с добър докинг резултат не бяха CCR7 свързващи съединения, а някои от тях дори бяха напуснали свързващия джоб по време на MD симулациите, които бяха с дължина от 300-ns всяка. Тези симулации показаха правилното направление и най-вероятната холо CCR7 структура беше получена въз основа на най-активния, напр. с най-ниска стойност на MM/PBSA лиганд и клъстерен анализ. По-нататък беше извършен нов докинг, последван от нови изследвания на MD и MM/PBSA. Същите 1300 молекули бяха скринирани и за способността им да се свързват с алостеричното място. Изненадващо, един от лигандите, наречен тук като Hit 1, UP АС наименование: 2-({6фенилтиено[2,3-с!]пиримидин-4-ил}окси)бензамид, (означен също като MIC5022), ZINC9862573 беше намерен между първите 10 класирани съединения както за алостеричните, така и за ортостеричните места. Накрая, въз основа на цялата тази изчислителна работа и комбиниране на резултатите от VS кампанията с апо и холо структури, беше избран крайният набор от 16 лиганди, които да бъдат изпратени за биологични оценки.
Биологични in vitro данни
Избраните съединения първоначално бяха изпратени за анализи както за антагонист, така и за агонист на TANGO β-арестин тестове. Сред тези лиганди Hit 1, UP АС наименование: 2-( {6-фенилтиено[2,3-б]пиримидин-4-ил} окси)бензамид, (означен също като MIC5022), ZINC9862573 (също наречен тук Съединение 1, G1 (Таблица 1 и Фигура 1А) показа обещаваща антагонистична активност, IC50 стойност от 9.1 μΜ и никаква агонистична активност. По нататък, това съединение беше тествано чрез анализ за Са2+мобилизиране и беше получена разлика от 10 пъти (IC 50=92 μΜ, Фигура IB). Това беше силна индикация, че съединение 1 е повлияно от β-арестин. Въпреки това, по-нататъшни експерименти в независима лаборатория показаха IC50 в диапазон от 25-30 μΜ в подобен анализ за Са2+мобилизация, така че точната степен на влияние трябва да се взема с повишено внимание (данните не са показани). Тъй като за това малко съединение (MW=347 Da) дори малките промени (метил, замествания) могат да увеличат значително неговата потентност, беше решено да се извърши прост анализ на зависимостта структура-активност (SAR), като се използват някои търговско достъпни производни. Замяната само на амидната група с CN доведе до силно намаляване на активността при анализа на β-арестин: само 31% активност при около 30 μΜ и подобна при 100 μΜ (Таблица 1). Още пет производни със заменена амидна група също бяха тествани успоредно чрез анализ на Са2+ мобилизация и всички те не бяха активни до тестваната концентрация от 100 μΜ.
Таблица 1. Анализи на зависимостта структура-активност (SAR) на производни на Hit 1 (MIC5022).
Съединение R Анализ на β-арестин Анализ на Са2+ (100μΜ)α (ΙΟΟμΜ)6
N/A < 20
I o a,b Процент на инхибиране при концентрация от ΙΟΟμΜ в извършени анализи на β-арестин и Са2+; Ν/Α- Не е налично
Ако приемем, че разликата между тези анализи (биаса) е около 10х, това означава, че тези съединения ще имат активност от не по-малко от 10 μΜ в анализа на βарестин.
След това бяха проведени серии от анализи за селективност. По-специално, hit 1 не беше CCR7 селективен, а по-скоро пан-CCR хемокинов антагонист (Фигури 2A-D). Той беше дори по-активен в анализите на β-арестин за CCR2, CCR3 и CCR5 с IC50 от 2.6, 4.4 и 1.9 μΜ, съответно, и по-малко активен към CCR1 (ICso=l3.6 μΜ). Това е очакван резултат за съединение, извлечено като хит от VS и този резултат беше счетен за положителен, тъй като Hit 1 може да бъде относително лесно трансформиран, като например чрез FEP+ насочена оптимизация на водещи структури, в потентни и селективни съединения, свързани с много терапевтични области. Още повече, въз основа на най-новите данни, изглежда, че такива панантагонисти могат да бъдат полезни за лечението на Covid-19 инфекция и поспециално на цитокиновата буря. В крайна сметка, не е ясно дали един панантагонист на няколко известни и важни за развитието на рак и разпространението на метастази хемокини, няма да осигури адитивен положителен ефект при лечението. Въз основа на тези литературни данни се смята, че разработването на панантагонист към няколко CCR би имало много повече ползи от селективен такъв.
Анализ на Са2+ мобилизация също беше извършен за други CCR и беше изчислена IC50 от 55μΜ за CCR5, така за тези хемокинови рецептори биаса спрямо β-арестин беше даже по-високо. От този анализ стана ясно също, че Hit 1 е CCR9 антагонист с IC50 стойност от 58μΜ. Беше извършен също сАМР анализ за CCR5 и беше получена подобна стойност (1С5о=5ОрМ, данните не са показани). КЬ стойностите бяха също изведени. За CCR7 и CCR9 бяха получени КЬ стойности от 2.8 и 5.2μΜ, но за CCR5 стойността беше 10.5μΜ. И накрая, за да се направи по-ясен вторичния път на действие на Hit 1 и да се потвърди естеството на влиянието на β-арестин , също бяха извършени GTPyS и ERK анализи. Докато съединението започна да инхибира CCR7 само при най-високата концентрация от 100 μΜ в GTPyS анализ (16% антагонистична активност), то беше ясен ERK антагонист с ICso=l8.1 μΜ. Вземайки под внимание, че ERK е пряко свързан с пътя на β-арестин и се свързва директно с арестина, беше заключено, че това съединение е повлияно от β-арестин (Таблица 1 и Фигури ЗА и ЗВ). И накрая, бяха идентифицирани няколко други потенциални хитове, но активностите бяха в диапазона от 25-35% при концентрация от 100 μΜ и те отпаднаха от това разкритие.
In vitro доказателство на концепция, базирана на общи възпалителни процеси
Беше потърсено допълнително in vitro доказателство на концепцията (РоС) на наблюдаваната хемокинова активност на Hit 1. За тази цел беше използван модел за инхибиране на освобождаването на CCL2 от IL-4, IL-13, IL-22 и ΙΕΝγ-стимулирани първични човешки кератиноцити (екзематозно възпаление), а също и анализ за инхибиране на освобождаването на IL-8 от IL-17A и TNFa (псориатично възпаление). Тези модели са подобни на панелите за анализ на SARS-CoV-2 възпаления, които станаха достъпни по-късно и също така представляват добра РоС за метастатичните процеси. В резултат на това Hit 1 действа като инхибитор на възпалението и има ефект върху освобождаването на CCL2, IL8 и IL17. Стойностите на измерените ефективни концентрации ECso бяха съответно 411 пМ, 733 пМ и 3780 пМ. Така, изглежда също, че Hit 1 има адитивен механизъм на действие, базиран на неговата пан-антагонистична природа. Това не е неочакван резултат, защото, както беше показано по-горе, Hit 1 е CCR пан-антагонист и по-специално модулатор на CCR2 и най-вероятно на активността на CCR4, което наистина ще антагонизира освобождаването на CCL2. Много други хемокини също са включени в споменатите след това възпалителни процеси. Известно инхибиране на клетъчната жизнеспособност беше също наблюдавано, но инхибирането на освобождаване на цитокини често е придружено от известно намаляване на клетъчната жизнеспособност, особено ако молекулата е с потентност с ECso около микромоларния диапазон. Накрая беше извършен миграционен анализ чрез клетъчна линия МВ231. Добавянето на 100 nM CCL19/CCL21 увеличи процента на мигриращите клетки от 100% (контрола) на 200%, но Hit 1 премахна този ефект 10 пъти (наблюдавани бяха само 20% мигриращи клетки).
In vivo доказателства на концепция, базирана на миши модел на рак на гърдата 4T-1-Luc+
Дизайн на in vivo изследването: В изследването на 4T-1-Luc бяха използвани общо 44 женски мишки BALB/c (12 мишки за изследване на максимална толерантна доза (MTD); 32 мишки за изследване на ефикасност). В началото на изследването животните бяха без специфични патогени и на възраст приблизително 4-5 седмици. Клетки от миши карцином на гърдата 4Т-1-1ис клетки, използвани в това изследване, бяха култивирани в инкубатор при 37 °C, съдържащ 5% СО2 с 10% FBS и 2 pg/mL пуромицин в среда RPMI1640. Клетките бяха субкултивирани в 10 пасажа, преди да се инокулират в мишките. 2*105 4Т-1-1ис клетки, суспендирани в 20 uL PBS, бяха инжектирани ортотопично в 4-тата мастна подложка от дясната страна на всяка мишка. Преди инокулацията, мишките бяха предварително анестезирани с 30 mg/kg Zoletil, смесен с 10 mg/kg Xylazine и държани анестезирани с 3-4% изофлуран. Като болкоуспокояващо беше инжектиран подкожно 20 mg/kg Tolfedine веднъж дневно в продължение на 3 дни. Денят на клетъчната инокулация беше отбелязан като Ден 0. На Ден 3,16 мишки с тумор бяха рандомизирани в 4 групи (4 мишки на група) според телесното си тегло и BLI сигнала.
Информацията за приготвянето на разтвор за дозиране на Hit 1 е както следва:
За приготвянето на доза от 5 mg/kg 2-({6-фенилтиено[2,3-б]пиримидин-4ил}окси)бензамид (Hitl, MIC5022): претеглени 2.5 mg Hitl, добавени в 0.50 ml етанол, вихрово или магнитно разбъркване, достатъчно, за да се смесят добре (цялото разтворено съединение ще бъде по-добре), добавени 2.00 ml PEG400, вихрово или магнитно разбъркване до получаване на бистър разтвор (може да е необходима не повече от 60°С водна основа, подложена на ултразвук), добавени 2.50 ml вода, за да се получи бистър разтвор. Концентрацията беше 0.5 mg/ml, условията на съхранение бяха при температура 4°С и честотата на приготвяне беше на всеки 5 дни.
За приготвянето на доза от 30 mg/kg 2-({6-фенилтиено[2,3-б]пиримидин-4ил}окси)бензамид (Hitl, MIC5022): претеглени 15 mg Hit 1, добавени в 0.50ml етанол, вихрово или магнитно разбъркване, достатъчно, за да се смесят добре (цялото разтворено съединение ще бъде по-добре), добавени се в 2.00ml PEG400, вихрово или магнитно разбъркване до получаване на бистър разтвор (може да е необходима не повече от 60°С водна основа, подложена на ултразвук), добавени 2.50ml вода, за да се получи бистър разтвор. Концентрацията беше 0.3 mg/ml, условията на съхранение бяха при температура 4°С и честотата на приготвяне беше на всеки 5 дни.
За приготвянето на доза от 150 mg/kg 2-({6-фенилтиено[2,3-б]пиримидин-4ил}окси)бензамид (Hitl, MIC5022: претеглени 75 mg Hit 1, добавени в 0.50ml етанол, вихрово или магнитно разбъркване достатъчно, за да се смесят добре (цялото разтворено съединение ще бъде по-добре), добавени 2.00ml PEG400, вихрово или магнитно разбъркване до получаване на бистър разтвор (може да е необходима не повече от 60°С водна основа, подложена на ултразвук), добавени 2.50ml вода, за да се получи бистър разтвор. Концентрацията беше 15 mg/ml, условията на съхранение бяха при температура 4°С и честотата на приготвяне беше на всеки 5 дни.
Всяка мишка беше наблюдавана за промени в общия външен вид и поведение всеки ден в продължение на 4 седмици след групирането. Бяха записани аномалните явления.
Телесно тегло: Мишките бяха претеглени и записвани два пъти седмично след групирането и по време на периода на дозиране. Животните също бяха претеглени при случайна смърт или евтаназия близо до смъртта. Туморен обем: Туморният обем (V) беше изчислен, както следва: V = (дължина х ширина2) / 2. Туморният обем беше измерен два пъти седмично. Инхибиране на туморния растеж (TGI), TGI= (1(Т/С)х100%; Т и С като средни туморни обеми на лекуваната и контролната групи в деня на измерване.
Индивидуалният относителен туморен обем (RTV) беше изчислен, както следва: RTV=Vt/V0, където Vt беше обемът всеки ден, a V0 беше обемът в началото на лечението. IVIS изобразяване: Използвахме IVIS® In Vivo Системи за изобразяване (PerkinElmer, Waltham, МА), които позволяват високо чувствително и с висока разделителна способност in vivo BLI и флуоресцентно изобразяване (FLI) в широк диапазон от дължини на вълните. Животните бяха изобразени до пет наведнъж под газова анестезия от 3-4% изофлуран. Всяка мишка беше инжектирана с D-Luciferin и изобразена 10-15 минути след инжектирането. Сигналът BLI беше количествено определен в региони от интерес (ROI), начертани около тумори или тъкани ex vivo и сигналът беше изразен като фотони в секунда, представляващи потока, излъчващ във всички посоки от дефинирания от потребителя регион веднъж седмично след групирането (Ден 3, Ден 10 , Ден 14, Ден 17, Ден 21, Ден 24, Ден 28 и Ден 31).
Резултати от in vivo изследване:
MTD изследвания: Първоначално, 10 BALB/c мишки бяха използвани за определяне на проучването за отговор на максималната толерантна доза (MTD). Мишките бяха рандомизирани въз основа на телесно тегло и бяха третирани с Hit 1 съединение с дневни (QD) орални дози от 30 mg/kg и 150 mg/kg. Телесното тегло беше измервано ежедневно. Животните не показаха необичайно поведение по време на експеримента и не бяха наблюдавани сериозни странични ефекти. Не беше наблюдавана значителна загуба на тегло (>20%).
Телесно тегло и състояние на животните: В експеримента за изследване на рак, телесното тегло на G2, G3 и G4 няма значителна разлика с телесното тегло на G1 (р>0.05) (Фигура 4). В допълнение, при животните нямаше значителна загуба на тегло по време на експеримента (р>0.05), и теглото на животните в експеримента показва общо увеличение. Животните не показаха необичайно поведение по време на експеримента.
Животински туморен обем (TV), относителен обем на тумора (RTV) и тегло на тумора (TW): Туморният обем (TV) на животните прогресивно се увеличава по време на експеримента. Нямаше значителни разлики в TV в G2, G3 и G4 в сравнение с G1 (р>0.05). TV на G1 на Ден 10 след инокулация беше 90.70 ± 5.57 mm3, и на Ден 31 след инокулация беше 515.73 ± 72.98 mm3. Теглото на тумора (TW) на G1 беше 0.97 ± 0.12 g. TV резултатът на G1 показва, че беше успешно установен 4Т-1-1ис ортотопичен модел при BALB/c мишки. TV на G2 Hit 1 5 mg/kg дозирана група животни на Ден 10 след инокулация беше 86.53 ± 6.03 mm3, и на Ден 31 след инокулация беше 515.90 ±53.18 mm3. Относителният туморен обем (RTV) на G2 на Ден 31 след инокулация беше 5.99 ± 0.61 mm3. TW на G2 беше 0.76 ± 0.23 g. TV на
G3 TA 30mg/kg животни на Ден 10 след инокулация беше 90.30 ± 7.67 mm3 и на Ден 31 след инокулация беше 489.69 ± 85.03 mm3. RTV на G3 на Ден 31 след инокулация беше 5.33 ± 0.64 mm3. TW на G3 беше 0.95 ± 0.16 g. TV на G4 ТА 150 mg/kg животни на Ден 10 след инокулация беше 85.22 ± 10.26 mm3, и на Ден 31 след инокулация беше 515.66 ± 98.37 mm3. RTV на G4 на Ден 31 след инокулация беше 5.92 ± 0.63 mm3. TW на G4 беше 1.05 ± 0.19 g. TV, RTV и TW на G2, G3 и G4 нямат значителни разлики в сравнение с G1 в експеримента (р>0.05), но в групата G3 наблюдавахме ясно намаляване на RTVслед ден 24 (Фигура 4). Така, на базата на тези данни можем да заключим, че Hitl предизвиква подобно намаляване на размера на туморите и може да бъде комбиниран с някои известни лекарства за по-нататъшно постигане на управление на туморите.
Биолуминесцентно изобразяване на животни и метастази в органи: В експеримента, животните бяха подложени на биолуминесцентно изобразяване на Ден 3, Ден 10, Ден 15, Ден 17, Ден 21, Ден 28 и Ден 31 след инокулация, за да се открие растежа на туморните клетки. Интензитетът на биолуминесценция на G1 продължи да се увеличава (Фигури 4 (горе вляво) и 5А). Интензитетът на биолуминесценция на контролната група (G1) на Ден 3 след инокулация беше 0.23*108 ± 0.081 * 108 p/s и на Ден 31 след инокулация беше 31,31*108 ± 18,39*108 p/s (Таблица 2).
Интензитетът на биолуминесценция на лечение G2 (5 mg/kg) на Ден 3 след инокулация беше 0.21*107 ± 0.056*108 p/s и на Ден 31 след инокулация беше 5.01*108 ± 2.67*108 p/s.
Интензитетът на биолуминесценция на G3 група (30 mg/kg) на Ден 3 след инокулация беше 0.23*107 ± 0.075*108 p/s и на Ден 31 след инокулация беше 3.26*108 ± 0.89*108 p/s.
Интензитетът на биолуминесценция на G4 група (150 mg/kg) на Ден 3 след инокулация беше 0.21 * 107 ± 0.054* 108 p/s и на Ден 31 след инокулация беше 5.08*108 ± 2.16* 108 p/s.
Тези резултати показваха, че разпространението на тумора е значително намалено с 610 пъти. За резултата от биолуминесцентно изобразяване на белия дроб (Фигури 5В и 6), обработено на Ден 32 след инокулация, интензитетът на биолуминесценция на контролната G1 група беше най-висок (6.48*106 ± 4.91*106), докато за 5, 30 и 150 mg /kg групи на лечение само 1.07Е+06, 1.66Е+06 и 1.56Е+06, съответно, т.е. развитието на метастази беше намалено около пет пъти. Въз основа на ex-vivo изследванията, метастазите в органи на контролната G1 група (Таблица 3) се образуваха най-много в белите дробове и са открити метастази във всички идентифицирани органи на G1 (бял дроб, черен дроб и ребра).
Метастазите в белия дроб са 3/4, метастазите в черния дроб са 2/4 и метастазите в ребрата са 2/4. Метастазите в органите на G2, G3 и G4 се случиха само в белия дроб.
Метастазите в белия дроб за групите на лечение G2 и G3 са 2/4, а за G4 са съответно 1/4 (Фигура 6 и Таблица 3). Общият брой на метастазите, открити от ex-vivo изследванията в контролната група, беше 10, докато в лекуваните групи с дози от 5, 30 и 150 mg/kg от съединение Hit 1 бяха съответно само 3, 2 и 5.
Въз основа на тези данни може да се заключи, че се наблюдава значително намаляване както на метастазите, така и на разпространението на тумора. Разпространението на туморите беше намалено в пъти според in vivo биолуминесцентните изображения (Фигура 4) и също така силно намалено в белите дробове, както се вижда от ex-vivo биолуминесцентните изображения (Фигура 6). Метастазите в черния дроб и ребрата бяха напълно елиминирани. Това се виждаше ясно на всички изображения. Ръчното ех vivo преброяване потвърди това.
Заключения от in vivo изследването: Ортотопичният модел 4Т-1-1ис беше успешно установен при BALB/c мишки и туморният обем (TV) на G1 продължава да се увеличава по време на експеримента. TV на Ден 31 след инокулация беше 515.73 ± 72.98 mm\ По време на експеримента нямаше смърт на мишки или аномалия в поведението на мишки. Освен това, в сравнение с началото на експеримента, Таблица 2. Интензитет на биолуминесцентно изобразяване на животните (108 p/s)
| Ден | G1 Носител р.о. QD | G2 Hitl 5mg/kg р.о. QD | G3 Hitl 30mg/kg р.о. QD | Q4 Hitl 150mg/kg р.о. QD | ||||
| Средно | SEM | Средно | SEM | Средно | SEM | Средно | SEM | |
| 3 | 2.28Е+07 | 8.12Е+06 | 2.07Е+07 | 5.57Е+06 | 2.31Е+07 | 7.53Е+06 | 2.07E+07 | 5.39E+06 |
| 10 | 3.54Е+08 | 3.21Е+08 | 1.56Е+08 | 8.29Е+07 | 2.71Е+08 | 7.62Е+07 | 4.97E+07 | 1.06E+07 |
| 15 | 3.44Е+08 | 2.83Е+08 | 1.69Е+08 | 6.11Е+07 | 1.09Е+08 | 3.10Е+07 | 1.33E+08 | 7.42E+07 |
| 17 | 4.94Е+08 | 3.00Е+08 | 3.39Е+08 | 1.10Е+08 | 1.32Е+08 | 3.70Е+07 | 2.43E+08 | 1.13E+08 |
| 21 | 5.35Е+08 | 2.44Е+08 | 4.78Е+08 | 2.35Е+08 | 1.30Е+08 | 1.59Е+07 | 2.94E+08 | 1.54E+08 |
| 24 | 7.62Е+08 | 5.19Е+08 | 3.52Е+08 | 1.07Е+08 | 2.08Е+08 | 5.07Е+07 | 3.20E+08 | 9.58E+07 |
| 28 | 2.84Е+09 | 1 98Е+09 | 4.34Е+08 | 1.28Е+08 | 4.49Е+08 | 2.19Е+08 | 5.27E+08 | 1.77E+08 |
| 31 | 3.13Е+09 | 1.84Е+09 | 5.01Е+08 | 2.67Е+08 | 3.26Е+08 | 8.94Е+0/ | 5.08E+08 | 2.16E+08 |
Таблица 3. Метастази в органи
| Метастази в органи | Метастази в бял дроб | Метастази в черен дроб | Метастази в ребра |
| G1 (контрола) | (3/4 мишка) общо 10 | (2/4 мишка) общо 3 | (2/4 мишка) общо 2 |
| G2 (5mg/kg) | (2/4 мишка) общо 3 | (0/4 мишка) общо 0 | (0/4 мишка) общо 0 |
| G3 (30mg/kg) | (2/4 мишка) общо 2 | (0/4 мишка) общо 0 | (0/4 мишка) общо 0 |
| G4 (150mg/kg) | (1/4 мишка) общо 5 | (0/4 мишка) общо 0 | (0/4 мишка) общо 0 |
телесното тегло на мишките се е увеличило в края. Може да се счита, че Hit 1 е относително биологично безопасен. TV, RTV, TW и резултатите от биолуминесцентното изобразяване на 4-тата мастна подложка и белия дроб на G2 Hit 1 5mg/kg имат непрекъснато увеличение и нямат значителни разлики в сравнение с G1 в експеримента. Може да се счита, че Hit 1 с концентрация 5 mg/kg има по-слаб ефект върху инхибиране на растежа на тумора. Въпреки това, резултатът от метастази върху органи показва, че тестовото съединение е ефективно при инхибиране на метастази, особено метастази в черния дроб и ребрата. По същия начин, TV, RTV, TW и резултатите от биолуминесцентното изобразяване на 4-тия мастен слой и белия дроб на G3 Hit 1 30mg/kg имат непрекъснато увеличение и нямат значителни разлики в сравнение с G1 в експеримента. Следователно може да се счита, че тестовото съединение с концентрация от 30 mg/kg има по-малък ефект върху инхибиране на растежа на тумора. Въпреки това, резултатът от метастази върху органи показва, че Hit 1 с концентрация от 30 mg/kg е ефективен при инхибиране на метастази, особено метастази в черния дроб и ребрата.
TV, RTV, TW и резултатите от биолуминесцентното изобразяване на 4-тата мастна подложка и белия дроб на G4 Hit 1 150mg/kg имат непрекъснато увеличение и нямат значителни разлики в сравнение с G1 в експеримента. Може да се счита, че тестовото съединение с концентрация от 150 mg/kg има по-малък ефект върху инхибиране на растежа на тумора. Резултатът от метастази върху органи показва, че тестовото съединение с концентрация от 150 mg/kg е относително ефективно при инхибиране на метастази, особено метастази в черния дроб и ребрата, като инхибирането е подобро от концентрация от 30 mg/kg и концентрация от 5 mg/kg.
Схема 1: Път на синтезиране на MIC5023 (2g_p)
MIC5023 (IUPAC наименование: 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)-2,5диметилтиено[2,3-(1]пиримидин-4-ил]окси}бензамид) и MIC5024 (IUPAC наименование: 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)-2-метилтиено[2,3-(1]пиримидин-4ил]окси}бензамид) са нови пан-хемокинови антагонисти
В друг аспект на изобретението след идентифициране на местата на свързване (виж по-долу) и теоретични изчисления на пертурбации на свободна енергия (FEP) бяха генерирани нови пан-хемокинови антагонисти, които бяха допълнително химически синтезирани и биологично оценени. Целта на изобретението беше допълнително да идентифицира и потвърди начина на свързване на съединенията, както и някои ADMET профили, като по този начин този набор може да се счита като предварителен набор от съединения, които могат да бъдат използвани в понататъшния процес на оптимизация на водещи структури. Между тези аналози съединенията 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)-2,5-диметилтиено[2,3-б]пиримидин-4ил]окси}бензамид, означен също като MIC5023, и 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)-2метилтиено[2,3-(1]пиримидин-4-ил]окси}бензамид, означен също като MIC5024, бяха синтезирани и изпратени за биологични оценки.
MIC5023. Пътят на синтез на MIC5023 е показан на Схема 1. Той се състои от 5 химични трансформации, за да се получи крайният продукт. Два хлорни атома бяха добавени към ароматните пръстени на MIC5022, както и една метилова група, което прави MIC5023 близко производно на MIC5022. В резултат на това MIC5023 показа активност към няколко хемокина. Активността към CCR5, измерена чрез β-арестин беше подобна на тази на MIC5022 и беше получена IC50 от 2.1 μΜ (Фигура 7). Въпреки това, активността към CCR2 беше силно намалена до IC50 от 31.5 μΜ. Активността към CCR1 беше практически премахната (IC50 >30 μΜ), но за CCR3 беше само леко намалена (IC50 >9.5 μΜ). Анализите за Са2+ мобилизация извличат стойност на IC50 от около 30μΜ и подобна за CXCR4; т.е. по-малко от наблюдаваните за Hit 1 (MIC5022).
MIC5024. Пътят на синтез на MIC5024 е показан на Схема 2. Той се състои от 4 химични трансформации, за да се получи крайният продукт. Разликата между MIC5023 и MIC5024 е само една метилова група, въведена в централния петчленен ароматен пръстен, но намалява активността на β-арестин на MIC5024 към CCR1, CCR2 и CCR3 под 30 μΜ. Активността към CCR5 също беше намалена до IC50 стойност от 7.2 μΜ (Фигура 8). Въпреки това, активността към CCR3 (IC50 =7.2 μΜ) е подобна на Hit 1 (MIC5022) и MIC5023. Анализите за Са2+ мобилизация показват стойности на 1С50>50 μΜ за CCR7 и CXCR4. Така стана ясно, че това метилово заместване е по-малко чувствително само към CCR3 и CCR5. Това ясно разкри както потенциалния начин на свързване на тези съединения, така и идеята за понататъшните стъпки на оптимизация.
Схема 2. Път на синтез на съединение MIC5024 (2dl А)
Тест за потенциални взаимодействия и анализ на наблюдаваните коефициенти на Hill
Кривата доза-отговор на CCR7 (Таблица 1, Фигури 1А и 1В) беше много стръмна, което обикновено е „червен флаг“ за артефакт. Една често срещана индикация за артефакт сред хитовете е стръмната крива доза-отговор, често обозначена с висок коефициент на Hill. За такива съединения инхибирането нараства много по-бързо с концентрацията, отколкото може да се очаква. Три механизма могат да бъдат разгледани, които обясняват високите коефициенти на Hill. Първо, няколко молекули могат да се свържат към един рецептор; тук наклонът на кривата дозаотговор ще се повиши с броя на инхибиторните места. Второ, инхибиторът може да претърпи физически фазов преход, като колоидна агрегация, тъй като концентрацията му е повишена. Образуването на колоиди има рязка зависимост от концентрацията и ако този преход се съчетае с инхибиране, ще се получи стръмна крива доза-отговор. И накрая, стръмни криви доза-отговор ще се появят във всяка двойка ензим-инхибитор, когато концентрацията на ензима значително надвишава стойността Ка на инхибитора, което очевидно не е случаят в това изследване.
В настоящия антагонистичен анализ на CCR7^-apecTHH беше получен коефициент на Hill от 15.1, без каквато и да е трансформация на данните. Вместо това за CCR1, CCR2, CCR3 и CCR5 бяха изчислени коефициенти, много по-близки до единица, съответно 2.3, 3.1, 2.6 и 1.9. Освен това повишаването на активността за CCR3 и CCR5 беше над 50 пъти за концентрации, при които активността се повишава. Изчисленията за CCR7, използващи същите данни, но трансформирани в логаритмични единици, нормализирани и посредством софтуер GraphPad 6, дадоха ICso=9.2pM и наклон на Hill от 11.2 (Фигура 1А). Освен това, антагонистичния анализ на ССЕ7-Р~арестин беше повторен и даде почти идентични резултати. От анализа за Са2+ мобилизация беше получен наклон на Hill от 2.6 от данните за CCR7, което показва, че наблюдаваната висока стойност на коефициента на Hill е свързана главно с антагонистичния анализ на β-арестин.
За да се изследва възможността за колоидна агрегация, беше извършен анализ на ензимна активност на β-лактамаза, който е общоприетият инструмент за откриване на такива свойства на съединенията. Резултатите ясно показваха липса на активност върху β-лактамаза (-18% при 50 μΜ концентрация). Също така, предварителните данни с 0.01% реагент Triton Х-100, за който е известно, че нарушава колоидни образувания, добавен в анализа за Са2+ мобилизация, допълнително показват, че няма промяна в активността в CCR7 експресираните клетки, което потвърждава, че агрегацията не е причина и подходящо обяснение за наблюдаваните стръмни криви доза-отговор и както и за коефициента на Hill.
Настоящите данни предоставят също няколко допълнителни експериментални доказателства, които са срещу зависимостта от колоидна агрегационна активност: - Наблюдавани са почти идентични стръмни криви доза-отговор за естествените агонисти CCL19 и CCL21. По този начин изглежда, че това не е уникално за случая с Hit 1.
- Коефициент на Hill от 1.5 в ERK експериментите и без стръмен наклон (Фигура ЗА). Освен това, кривата доза-отговор на ERK изглежда като типичен единичен антагонистичен лиганд.
- При същите условия като в ERK анализа съединението не беше поспециалноактивно в GTPyS анализа до 100 μΜ (Фигура ЗВ). Като се има предвид, че колоидното инхибиране присъства при концентрации, подобни на точката на агрегатиране, това е силен аргумент срещу такъв тип свързване на Hit 1.
- Същото като по-горе е валидно за Са2+ анализи върху CCR5 и CCR9 и Hillнаклоните бяха малки, съответно 1.2 и 0.8. Освен това, наблюдаваната Са2+ активност е много по-ниска и би било трудно да присъства точка на концентрация на агрегиране в толкова широк диапазон; напр. в диапазона от 1 до 100 μΜ. Например, добре е известно, че критичната концентрация на агрегиране (САС, или CMC) за агрегатори е специфична за съединението (напр., някои съединения могат да се агрегират при 5 μΜ, докато други могат да агрегират само при концентрации на съединение от 50 μΜ). Също така е добре известно, че след достигане на САС повърхностното напрежение остава относително постоянно.
- SAR проучванията не показаха същото поведение за много подобни съединения, които имат дори по-висок LogP, което е един от основните предиктори за агрегация. Въз основа на посочените по-горе аргументи може да се заключи, че наблюдаваната в β-арестиновия анализ активност на Hit 1 към CCR7 не се дължи на колоидна агрегация и се отнася до други механизми. Коефициентите на Hill обикновено също се считат за доказателство за свързване на множество лиганди. Големите вариации на докладваните коефициенти на Hill най-вероятно съответстват на множествено свързване. Общоприетата хипотеза за такива наблюдения е, че някои лиганди могат да имат положителна кооперативност на свързване. По този начин експериментите допълнително се концентрират да обяснят наблюдаваните експериментални данни, базирани на механизма на множествено свързване. Такъв механизъм на действие не е уникален в семейството на хемокините. Например, кристалната структура на CCR2 показва, че е възможно два различни лиганда да се свържат едновременно в две напълно различни места на свързване - единия в алостеричното и другия в ортостеричното място. Структурата предполага интересен симетричен механизъм за едновременното антагонистично действие на двете съединения. BMS-681 пречи директно на свързването на хемокин и индиректно на свързването на G-протеин, като стабилизира неактивна, вероятно несъвместима с G-протеин, конформация на рецептора. Обратно, CCR2-RA-[R] директно предотвратява свързването на Gпротеин/р-арестин и алостерично инхибира свързването на CCL2 хемокина, който, подобно на повечето GPCR агонисти, изисква активен, G-протеин-свързан рецептор за свързване с висок афинитет. Двупосочната алостерична комуникация между екстра- и вътреклетъчните страни на рецептора напомня тази, наблюдавана преди в аденозин A2A рецептор (AA2AR) и P2AR, използвайки алостерични обратни агонистични антитела/нанотела, които са насочени към същия епитоп като CCR2RA-[R], Подобно на тези антитела, по-рано беше показано, че CCR2-RA-[R] повишава алостерично и се усилва алостерично чрез свързване на ортостерични антагонисти, демонстрирайки положителна кооперативност на свързване.
Режим на уникално свързване на Hit 1 в CCR7
Въз основа на посочените по-късно експериментални данни за Hit 1, както и подобни докинг резултати за ортостеричните и алостеричните места в CCR7, изобретението изясни механизма на свързване на съединението в този хемокин. Това също е първоначална и важна стъпка за по-нататъшния процес на FEP+ насочена оптимизация на водещите структури. Бяха проведени множество редовни MD симулации и метадинамика в случай, когато лигандът присъства или в орто, или в алостеричните места, и беше изследвано свързването на лиганда, когато и двете от тези места бяха едновременно заети от съединението. Първоначално рецепторните остатъци, които взаимодействат с Hit 1 в орто и алостеричните места, бяха идентифицирани въз основа на предишни MD холо структури, получени по време на VS. Това даде представа както за начина на свързване на лиганда, така и за ключовите рецепторни остатъци, които са значими за свързването. Например, Lysl37, Туг136, Туг279 и ТугЗО8 (тирозинова тирада) бяха определящи за свързването в орто мястото, осигуряващо Н-връзки към амидната група и π-π подреждане с ароматни части на съединението. Повечето от тези остатъци са уникални в семейството на CCR (Фигура 9А). Също така, MD симулациите показаха, че консервираният Trpl 14, който не е значим за селективността, също е важен за стабилното свързване на лиганда. В алостеричното място съединението образува Н-връзки с по-консервирани остатъци Thr93 и Asp94, и също и Lys332 (Фигура 9В). Ароматният скелет беше стабилизиран главно чрез Val79, Leu98, РЬеЗЗЗ и Туг326.
Освен това, съединението беше прикрепено към наскоро получената рентгенова структура на CCR7 (PDB: 6QZH). Hit 1 съответства добре на алостеричното място и имаше идентични взаимодействия лиганд-рецептор, но в тази структура ортостеричното място беше затворено, противоположно на модела за хомология на MD, който беше използван за VS. По този начин, за орто мястото бяха проведени 2x800ns MD симулации и и в двете от тях лигандът бавно се премести и се стабилизира в предвидената по време на VS свързваща конформация. По време на този път Hit 1 първоначално беше стабилизиран главно чрез Gln286 и Asn306 и след това беше преместен към вече идентифицираното орто място, където доминираха взаимодействията с Lysl37, Tyrl36, Tyr279, Tyr308, Gln286 и Asn3O5.
Основните разлики в наблюдаваните взаимодействия в гореспоменатата холоструктура бяха процентът на Н-връзките, образувани с отделни членове на тирозиновата тирада и включването на Gln286 в образуването на стабилна водородна връзка. Също така, амидната група не беше стабилна и аминогрупата промени ориентацията си по време на симулациите в посока както към извънклетъчното, така и към вътреклетъчното пространство; напр. около 20-30% от времената на симулация беше стабилизирана от Gln286 и Asn306, а не от тирозинова тирада. Чрез прост MM-PBSA подход беше изчислена енергия на свързване без лиганд от -24 kcal/mol. Тези данни показват, че Hit 1 може да се свърже с орто CCR7 свързващото място.
Същата процедура беше повторена за алостеричното място и бяха изпълнени 2x500ns симулации. Лигандът се движеше успоредно на спиралите 3, 6 и 7, а амидната група беше в междуклетъчно направление. При всички изпълнени беше наблюдавано MD значително отклонение в RMSD на лиганда. Първоначално той беше стабилизиран чрез Thr93, Asp94 и Lys332, но амидната група беше много гъвкава. Освен това, Asp92 и Lys332 могат да образуват също стабилна водородна връзка и лигандът беше в състояние да образува Н-връзки с всички споменати след това остатъци. Също, лигандът също беше в състояние да образува водородна връзка с Argll4 и взаимодейства с няколко други остатъка. Според изчисленията на MM/PBSA свободната енергия на свързване беше по-висока и равна на -21 kcal/mol. Бяха изпълнени и допълнителни 2x500ns MD симулации, наречени тук MD3 и MD4, с лиганд, присъстващ както в орто, така и в алостеричните места на свързване. Също така бяха извършени метадинамични изчисления с дължина 300 ns, използващи RMSD промените на Hit 1 в двете места като колективна променлива. Симулацията MD3 показа, че в присъствието на лиганд в алостеричния свързващ джоб, съединението в орто джоба беше много по-стабилизирано, отколкото в случай, когато само единичен лиганд е свързан към орто джоба. По време на симулацията MD4 след около 80 ns беше наблюдавано много бързо развързване на лиганда в алостеричното място. Първоначално амидната група на лиганда се завъртя и взаимодейства с Arg 144, нарушавайки важните за комуникацията контакти на остатъка на орто-сайт Argl44-cπиpaлa 6, както беше показано от симулациите на апо рецептора (данните не са показани).
Освен това Hit 1 се транслира над Arg 144 и след това напълно се освобождава във вътреклетъчното пространство. Съединението в орто мястото също промени своята конформация. Амидната група се завъртя и образува Н-връзка с ELC2 остатъци Ser211 и Туг308, като по този начин свърза бримката със спирала 7. След това, лигандът в орто мястото промени конформацията си повече и взаимодейства главно с ECL2 и остатъци от спиралаб/7, което всъщност доведе до пълно освобождаване на съединението в алостеричното място. Простият RMSD анализ показа, че конфронтационните промени на лиганда в алостеричния джоб пряко корелират с тези в орто джоба. Така това е сериозна индикация, че процесите в тези места са свързани.
Резултатите от редовното изпълнение на MD4 също бяха подкрепени от добре темперирана метадинамична симулация, въпреки че амидната група беше понестабилна в орто мястото и лигандът в алостеричния джоб показа две основни конформации. Разликата в свободната енергия между тези конформации беше само около 1 kcal/mol, което означава, че всички те са вероятни. Стана също така очевидно, че когато два лиганда са свързани към CCR7 местата, тогава съединението в орто мястото може да се премести в различни позиции, които бяха открити от изпълнени редовни MD и по някакъв начин описаха пътя на свързване, вече описан от тези симулации. Също така, тази метадинамична симулация беше подобна на MD4, тъй като амидната група на лиганда в алостеричното място беше близо и взаимодейства с Arg 154. От своя страна лигандът в орто мястото беше понестабилен. Разликата в свободната енергия между конформацията на амидната група към Gln286 и Asn305 и тирозиновата тирада беше само 0.2 kcal/mol. Бяха изпълнени също шест независими метадинамични симулации, като се използва само RMSD на лиганда в алостеричния джоб като колективна променлива и резултатите бяха сходни. Съединението винаги променя конформацията си чрез RMSD от около 1,5А-2,5А с втори енергийни минимуми, които са по-близо до първоначалната му позиция.
Въз основа на всички тези данни и тези от експерименталните изследвания може да се заключи, че в CCR7 Hit 1 има уникален механизъм на свързване. Изобретението предполага, че кооперативното свързване изглежда е отговорно за наблюдаваните стръмни криви доза-отговор и че лигандът може да се свърже както с орто, така и с алостерични места наистина с различна вероятност и честота. Съединението може първоначално да се свърже с орто мястото и след достигане на известна концентрация, също за по-кратко време към алостеричния джоб, стабилизирайки лиганда в орто джоба. След това Hit 1 напуска алостеричното място, като по този начин лигандът в този джоб действа като алостеричен модулатор. Възможно е също така втори лиганд да бъде приет към орто мястото, след като съединението напусне алостеричния джоб. Това може да е резултат от конформационните промени в ортостеричното свързващо място поради свързването на лиганда в алостеричния джоб, което изглежда значително. Такова кооперативно свързване не е рядкост в орто местата на GPCR, но алостеричният джоб обикновено е близо до орто джоба В случая на CCR7, алостеричното място е на голямо разстояние от орто джоба и лигандите са приблизително разделени на разстояние 31 А. По този начин изглежда, че Hit 1 има уникален механизъм на действие не само между хемокините, но и във всички известни GPCR. Известно е също, че CCR7 прави олигомери, което допълнително увеличава броя на общия брой съединения, свързани към системата.
Режим на свързване на Hitl в други хемокини
В друг аспект изобретението изследва също така и начина на свързване на Hit 1 в другите хемокини. Въз основа както на докинг, така и на изпълнени MD, стана ясно, че съединението действа като алостерични антагонисти в тези хемокини. Лигандът не е в състояние да се приспособи към ортостеричните места просто защото остатъците, включени във взаимодействията и описани в случая на CCR7 по-горе, са мутирали и не могат да осигурят никакъв разумен механизъм на свързване. От друга страна, взаимодействията в алостерични места, където остатъците между всички CCR са предимно консервирани, бяха стабилни и могат да обяснят наблюдаваните активности в CCR1, CCR2, CCR3 и CCR5. Например, Lys56, Thr64 и Asp66 изглежда играят значителна роля в свързването на Hit 1 в CCR5. Asp66 е мутирал в CCR1 и CCR3 съответно до Ser и Asn, което може да обясни намалената активност, особено в CCR1. Освен това, в CCR2 Ser63 е мутирал до Cys, което може също да повлияе на взаимодействията лиганд-рецептор в тази част на свързващия джоб. Въпреки това, в CCR7 и CCR9 тези остатъци са идентични с тези в CCR5, с изключение на Lys59, който е мутирал към Arg, но значително намаляване на активността се наблюдава само в CCR7. Накрая, идентифицираният като значим за свързващия остатък Lys332 в CCR7 е мутиран до Glu в CCR5 и Arg в CCR1 и CCR9. Така, тези промени показват различен начин на свързване на Hit 1 към семейството на хемокините. Също така е вероятно Glu303 в CCR5 (Lys302 в CCR7) да участва във взаимодействията на амидната група с рецептора по различен начин от тези в CCR7, което води до наблюдавано повишаване на активността. В обобщение, докато този мутационен анализ може поне частично да обясни наблюдаваната селективност в CCR1, 2, 3, 5 и 9, той не може да даде разумно обяснение на намалената активност в CCR7 в сравнение с CCR5. Това означава, че откритият лиганд има уникални свързващи свойства; той е пан-хемокинов антагонист, но действа чрез различни механизми в отделните членове на CCR и по-специално CCR7.
Съединенията съгласно изобретението имат антагонистична активност на хемокиновите рецептори и по този начин са ефективни за използване при превенция или лечение на заболявания, свързани с хемокиновите рецептори, които са поспециално метастази на белите дробове, черния дроб, ребрата и лимфните възли и прогресията на много различни злокачествени заболявания като като рак на гърдата, на стомаха, на кожата (меланом), на главата и шията, на белия дроб, на хранопровода, на черния дроб, на маточната шийка, на щитовидната жлеза, на сливиците, на дебелото черво и на простатата и други подобни. Тук изобретението разкрива М1С5022 за използване при превенция на образуване и развитие на метастази в белия дроб, черния дроб и ребрата при in vivo мишки модел на рак на гърдата. MIC5022 има антагонистична активност към CCR7 главно поради наличието на амидна химична група в структурата си; той засяга повече пътищата на β-арестин и втория месинджър на ERK, когато се свързва с CCR7, отколкото нивата на концентрации на Са2+ и сАМР; напр. е повлиян от β-арестин. Съединението също така е за използване при превенция или лечение на вирусни инфекциозни заболявания, свързани с хемокинови рецептори като HIV-1, HIV-2, SARS-CoV-2 (COVID-19) и други подобни. Също така се използва при заболявания, свързани с имунитета, като псориазис, артрит и атопичен дерматит.
Claims (10)
1. Съединение с IUPAC наименование: 2-({6-фенилтиено[2,3с!]пиримидин-4-ил}окси)бензамид и негова фармацевтично приемлива сол за използване като CCR7 (С-С хемокинов рецептор тип 7) рецепторен антагонист.
2. Съединение, съгласно претенция 1 за използване като пан-хемокинов антагонист с антагонистичен ефект към хемокинови рецептори CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR9 и CXCR4.
3. Съедининие, съгласно претенция 1 или 2 за използване при превенция или лечение на метастази на рак, образувани в белия дроб, черния дроб, ребрата и лимфните възли.
4. Съедининие съгласно претенция 1 или 2 за използване при намаляване прогресията на различни злокачествени заболявания като например рак на гърдата, на стомаха, на кожата (меланом), на главата и шията, на белия дроб, на хранопровода, на черния дроб, на маточната шийка, на щитовидната жлеза, на сливиците, на дебелото черво, на простатата и други подобни.
5. Съединение съгласно претенция 1 или 2 за използване при превенция или лечение на вирусни инфекциозни заболявания, свързани с хемокинови рецептори като HIV-1, HIV-2, SARS-CoV-2 (COVID-19) и други подобни.
6. Съединение съгласно претенция 1 или 2 за използване при превенция или лечение на свързани с имунитета заболявания като псориазис, артрит и атопичен дерматит.
7. Съединение с IUPAC наименование: 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)2,5-диметилтиено[2,3-б]пиримидин-4-ил]окси}бензамид (MIC5023) и негови фармацевтично приемливи соли.
8. Използване на съединение съгласно претенция 7 като пан-хемокинов антагонист с антагонистичен ефект към хемокинови рецептори CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR7 и CXCR4.
9. Съединение с ШРАС наименование: 3-хлоро-2-{[6-(2-хлорофенил)-2метилтиено[2,3-<1]пиримидин-4-ил]окси}бензамид (MIC5024) и негови фармацевтично приемливи соли.
10. Използване на съединение съгласно претенция 9 като пан-хемокинов антагонист с антагонистичен ефект към хемокинови рецептори CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR7 и CXCR4.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113517A BG113517A (bg) | 2022-04-04 | 2022-04-04 | Пан-хемокинови антагонисти за използване при превенция и намаляване на ракови метастази |
| PCT/BG2023/000011 WO2023193070A1 (en) | 2022-04-04 | 2023-03-30 | Pan-chemokine antagonists for use in treating cancer and immune disorders |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113517A BG113517A (bg) | 2022-04-04 | 2022-04-04 | Пан-хемокинови антагонисти за използване при превенция и намаляване на ракови метастази |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG113517A true BG113517A (bg) | 2023-10-16 |
Family
ID=86142746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG113517A BG113517A (bg) | 2022-04-04 | 2022-04-04 | Пан-хемокинови антагонисти за използване при превенция и намаляване на ракови метастази |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG113517A (bg) |
| WO (1) | WO2023193070A1 (bg) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60326080D1 (en) | 2002-10-09 | 2009-03-19 | Schering Corp | Thiadiazoldioxide und thiadiazoloxide als cxc- und cc-chemokinrezeptor liganden |
| TW200508224A (en) * | 2003-02-12 | 2005-03-01 | Bristol Myers Squibb Co | Cyclic derivatives as modulators of chemokine receptor activity |
-
2022
- 2022-04-04 BG BG113517A patent/BG113517A/bg unknown
-
2023
- 2023-03-30 WO PCT/BG2023/000011 patent/WO2023193070A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023193070A1 (en) | 2023-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6399660B2 (ja) | 癌治療用組成物および方法 | |
| JP7085635B2 (ja) | Ｂｃｌ－２阻害剤又はＢｃｌ－２／Ｂｃｌ－ｘＬ二重阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の組合せ製品並びに疾患の予防及び／又は治療におけるその使用 | |
| TWI752335B (zh) | Bcl-2抑制劑與MDM2抑制劑的組合產品及其在預防及/或治療疾病中的用途 | |
| Zheng et al. | A novel STAT3 inhibitor W2014-S regresses human non-small cell lung cancer xenografts and sensitizes EGFR-TKI acquired resistance | |
| Chang et al. | Design, synthesis, and biological evaluation of quinazolin-4 (3H)-one derivatives co-targeting poly (ADP-ribose) polymerase-1 and bromodomain containing protein 4 for breast cancer therapy | |
| WO2019149183A1 (zh) | 一种联芳基衍生物、其制备方法和在药学上的应用 | |
| TW200811185A (en) | Fused pyrimidones and thiopyrimidones, and uses thereof | |
| JP2015521603A (ja) | 脳癌の新規治療薬 | |
| KR20070115879A (ko) | 의학 장애의 치료용 ｃｘｃｒ4 길항제 | |
| US11040038B2 (en) | Methods for treating diseases associated with abnormal ACVR1 expression and ACVR1 inhibitors for use in the same | |
| CN106946812A (zh) | 作为个性化抗癌药的胱天蛋白酶原活化化合物的设计、合成和评价 | |
| Tan et al. | Design, synthesis, and biological evaluation of heterocyclic-fused pyrimidine chemotypes guided by X-ray crystal structure with potential antitumor and anti-multidrug resistance efficacy targeting the colchicine binding site | |
| WO2016054642A1 (en) | Inhibitors of grb2-associated binding protein 1 (gab1) and methods of treating cancer using the same | |
| Yang et al. | Novel benzo five-membered heterocycle derivatives as P-glycoprotein inhibitors: design, synthesis, molecular docking, and anti-multidrug resistance activity | |
| BG113517A (bg) | Пан-хемокинови антагонисти за използване при превенция и намаляване на ракови метастази | |
| Fang et al. | Design, synthesis and evaluation of the Brigatinib analogues as potent inhibitors against tertiary EGFR mutants (EGFRdel19/T790M/C797S and EGFRL858R/T790M/C797S) | |
| Chen et al. | Design, synthesis and anticancer evaluation of 6, 7-disubstituted-4-phenoxyquinoline derivatives bearing 1, 8-naphthyridine-3-carboxamide moiety as novel multi-target TKIs | |
| WO2019217933A1 (en) | Inhibitors of the ras oncoprotein, methods of making and methods of use thereof | |
| Zuo et al. | Design, synthesis and antitumor activity of 4-arylamine substituted pyrimidine derivatives as noncovalent EGFR inhibitors overcoming C797S mutation | |
| Gao et al. | Design, synthesis and biological evaluation of biphenylurea derivatives as VEGFR-2 kinase inhibitors (II) | |
| WO2023105008A1 (en) | Small-molecule inhibitors of the frs2-fgfr interaction | |
| JP2015533834A (ja) | Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介疾患を処置するための化合物 | |
| US20240173316A1 (en) | Methods and Compositions for Treating Cancer | |
| CN101137379B (zh) | 用于治疗医学病症的cxcr4拮抗剂 | |
| Buzrieda | Discovery of highly potent and selective phosphatidylinositol 3-kinase-δ inhibitors for the treatment of blood cancers and autoimmune diseases |