BG113103A - Nmda-рецепторен антагонист с антимикробна активност - Google Patents
Nmda-рецепторен антагонист с антимикробна активност Download PDFInfo
- Publication number
- BG113103A BG113103A BG113103A BG11310320A BG113103A BG 113103 A BG113103 A BG 113103A BG 113103 A BG113103 A BG 113103A BG 11310320 A BG11310320 A BG 11310320A BG 113103 A BG113103 A BG 113103A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- amino
- acid
- amide
- butoxycarbonyl
- dimethyladamantane
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретението се отнася до съединение с обща формула (I), до метод за неговото получаване и до приложението му като NMDA-рецепторен антагонист за профилактика и лечение на болестта на Алцхаймер, както и като средство за профилактика и лечение на заболявания, причинени от клинично значими, условно патогенни бактериални видове и гъби.
Description
NMDA- РЕЦЕПТОРЕН АНТАГОНИСТ С АНТИМИКРОБНА АКТИВНОСТ
Област на изобретението
Изобретението се отнася до антагонист на М-метил-О-аспартат (NMDA) рецепторите с антимикробна активност, приложимо при пациенти с болестта на Алцхаймер с бактериална и гьбична инфекции, причинени от клинично значими, условно патогенни бактериални видове и гъби.
Предшестващо състояние
Много невродегенеративни заболявания са резултат от прогресивна загуба на структура или функция на невроните, включително умъртвяване на неврони. Това са трудно лечими заболявания, които водят до прогресираща дегенерация и/или загуба на нервни клетки. Понастоящем се счита, че прогресивното влошаване на когнитивните възможности, обозначено като болест на Алцхаймер, е нелечимо, дегенеративно и терминално заболяване. Лечението обикновено е симптоматично- използват се антидепресанти, анксиолитици, невролептици, инхибитори на холинестеразата и други симптоматици. Доколкото, обаче, заболяването е резултат от нарушено изпращане на сигнали в мозъка, важна роля в което играят така наречените М-метил-О-аспартат (NMDA)- рецептори, напоследък се използват средства за свързване на NMDA рецепторите върху клетките на мозъка и блокиране активността на невротрансмитера глутамат. Такова средство е мемантинът, което е единственото одобрено от Американската Агенция по Храните и Лекарствата (FDA) лекарство за лечение на болестта на Алцхаймер (БА) [1]. Това е основание, съгласно заявка за патент US2019336509 А1, за включването на мемантина като NMDA- рецепторен антагонист заедно с хистамин-3 рецепторен инверсен агонист и ацетилхолинестеразен инхибитор в състав за лечение на когнитивни нарушения.
Независимо от доказаното терапевтично действие при средни и остри състояния на БА и деменция, обаче, мемантинът манифестира някои негативни прояви, които лимитират употребата му, а именно - твърде висока степен на разтворимост във вода, което представлява предизвикателство за получаване на лекарствените форми, както и някои неблагоприятни странични ефекти при използването му като объркване, виене на свят, сънливост, главоболие, безсъние, гадене и халюцинации.
От друга страна, според Pisa, D. и сътр. (2017) [2], инфекции от различен тип могат да стоят в основата на невродегенеративното заболяване БА, а проучване на Yu, J. Y. и сътр. 2015 [3], предназначено да идентифицира неизвестни антимикробни свойства на известни лекарства, показва за първи път, че мемантинът може ефективно да блокира бактериемия и менингит, причинен от Е. coli при модел на мишки. Резултатите от изследванията установяват, че мемантинът притежава потенциал за лечение на менингококова инфекция, но той е насочен по- скоро към гостоприемника, отколкото към бактериалния патоген, защото in vitro не показва антимикробната активност.
Задача на изобретението е да предложи съединение, представляващо антагонист на Nметил-О-аспартат (NMDA) рецепторите и метод за неговото получаване, приложимо както като средство за превенция и лечение на хроничното невродегенеративно заболяване болест на Алцхаймер, така и като средство срещу клинично значими, условно патогенни бактериални видове и гъби.
Същност на изобретението
Изобретението се отнася до съединение с обща формула (I), zR NH
(I) където R представлява аминокиселина или пептидомиметик, избрани от групата, включваща: аминоетанова киселина, 2-амино-З-метилбутанова киселина, 2-аминопропанова киселина, 3аминопропанова киселина, 2-амино-З-фенилпропанова киселина, 2-амино-3-(4хидроксифенил)пропанова киселина, 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропанова киселина, 2(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбоксилна киселина и 2-(аминометил)-1',3'-тиазолил-4’-2-(1,3тиазол)-4-карбоксилна киселина.
Химичното съединение с обща формула (I) се получава в следната последователност от операции:
Изходното съединение, включващо защитено със защитната група М-(трет-бутоксикарбонил) (ВОС) аминокиселина или пептидомиметик, избрани от групата, включваща Ν-(τρβτбутоксикарбонил)-аминоетанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3метилбутанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-2-аминопропанова киселина, Ν-(τρβτбутоксикарбонил)-3-аминопропанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3-(4флуорофенил)пропанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3-фенилпропанова киселина, N-(τpeτ-бyτoκcиκapбoнил)-2-aминo-3-(4-xидpoκcиφeнил)πpoπaнoвa киселина, Ν(трет-бутоксикарбонил)-2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбоксилна киселина и Ν-(τρβτбутоксикарбонил)-2-(аминометил)-1 ’,3’-тиазолил-4’-2-(1,3-тиазол)-4-карбоксилна киселина), се разтваря в диметилформамид, като при непрекъснато разбъркване се добавят триетиламин (TEA) и дициклохексилкарбодиимид (ДСС) [4].
Мемантин хидрохлорид се разтваря в диметилформамид и се прибавя след двадесет минути. Ходът на реакцията се следи посредством тънкослойна хроматография (TLC). След приключването на реакцията се извършва двукратно промиване с разтвор на 5% №НСОз, разтвор на 5% NaHSCU и еднократно промиване с вода. Органичният слой се суши с безводен Na2SO«. След изпаряване на разтворителя се получава междинно съединение, което в съответствие с изходното съединение, представлява (М-(трет-бутоксикарбонил)-аминоетанМ-(3,5-диметиладамантан)-амид; М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3-метилбутан-М-(3,5диметиладамантан)-амид; М-(трет-бутоксикарбонил)-2-аминопропан-М-(3,5диметиладамантан)-амид; М-(трет-бутоксикарбонил)-3-аминопропан-М-(3,5диметиладамантан)-амид; N-(τpeτ-бyτoκcиκapбoнил)-2-aминo-3-(4-φлyopoφeнил)πpoπaн-N(3,5-диметиладамантан)-амид; М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3-фенилпропан-М-(3,5диметиладамантан)-амид; М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3-(4-хидроксифенил)пропан-М(3,5-диметиладамантан)-амид; М-(трет-бутоксикарбонил)-2-(аминометил)-1,3-тиазол-4карбокси-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид и Н-(трет-бутоксикарбонил)-2-(аминометил)-1 ',3тиазолил-4’-2-(1,3-тиазол)-4-карбокси-М-(3,5”-диметиладамантан)-амид) под формата на масло.
Към междинното съединение, охладено до 0°С и разтворено в дихлорметан, се прибавя еквивалентен обем трифлуороцетна киселина (TFA) на капки за деблокиране на защитната ВОС група. Разтворът се разбърква при 0°С и процесът се следи хроматографски до деблокиране на ВОС групата.
След изпаряването на разтворителите се добавя неколкократно диетилов етер, който съответно се изпарява. Към полученият маслообразен продукт, в зависимост от разтворимостта, се добавят смеси на етилацетат/хексан или метанол/диетилов етер, в резултат на което се получават кристали от трифлуорацетати на химични съединения, които в съответствие с изходните съединения, представляват производни на мемантина както следва:
1. аминоетан-М-(3,5-диметиладамантан)-амид
2. 2-амино-3-метилбутан-М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид
3. 2-амино-пропан- М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид
4. 3-амино-пропан- М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид
5. 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5-диметиладамантан)-амид
6. 2-амино-3-фенилпропан-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид
7. 2-амино-3-(4-хидроксифенил)пропан-М-(3”,5”-диметиладамантан)-амид
8. 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбокси-М-(3',5’-диметиладамантан)-амид
9. 2-(аминометил)-1 ',3’-тиазолил-4'-2-(1,3-тиазол)-4-карбокси-М-(3,5”-диметиладамантан)амид.)
Разтворителите се изпаряват и към кристалите се добавя вода, метанол и/или ацетонитрил и pH на разтвора се довежда до 7.5- 8.0 посредством 25%-ен разтвор на амоняк. Следва двукратна екстракция с етилацетат, изпаряване на разтворителя и хроматографско пречистване на получените кристали.
Добивът на различните мемантинови производни варира в границите от 28% до 45%.
1. аминоетан-Н-(3,5-диметиладамантан)-амид 1Н (DMSO-d6) δ (ppm): 0.82 (s, 6H, 2xCH3), 1.12 (m, 2Н), 1.26 (d, 2Н, J=12.6 Hz), 1.32 (dd, 2H, J=2.8 Hz, J=12.5 Hz), 1.55 (d, 2H, J=11.9 Hz), 1.60 (d, 2H, J=11.6 Hz), 1.77 (d, 2H, J=2Hz) 2.09 (m, 1H), 3.45 (s, 2H), 7.9 (brs, 1H, NH-amide), 7.95 (brs, 2H, NH2-amine). 13C (DMSO-d6) δ (ppm): 29.9 (CH), 30.5 (CH3), 32.3 (Cquat), 39.81 (CH2), 40.8 (CH2), 44.6 (CH2), 47.4 (CH2), 50.5 (CH2), 53.3 (Cquat), 165.2 (CO). ESI-MS: m/z: 237, [M+HJ+
2. 2-амино-3-метилбутан-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид 1H (DMSO-d6) δ (ppm): 0.82 (s, 6H, 2xCH3), 0.91 (d, 3H, J=6.9 Hz, CH3), 0.92 (d, 3H, J=6.9 Hz, CH3), 1.12 (m, 2H), 1.26 (d, 2H, J=12.6 Hz), 1.32 (dd. 2H, J=2.8 Hz, J=12.5 Hz), 1.55 (d, 2H, J=11.9 Hz), 1.62 (d, 2H, J=11.6 Hz), 1.78 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 2.09 (m, 1H), 3.48 (d, 1H, J=6 Hz), 7.91 (brs, 1H, NH-amide), 8.02 (brs, 2H, NH2-amine). 13C (DMSO-d6) δ (ppm): 18.1 (CH3), 18.8 (CH3), 29.9 (CH), 30.3 (CH), 30.4 (CH3), 32.3 (Cquat), 39.7 (CH2), 42.6 (CH2), 47.3 (CH2), 47.3 (CH2), 50.5 (CH2), 53.2 (Cquat), 58.0 (CH), 167.3 (CO).ESI-MS: m/z: 279, [M+H]+
3. 2-амино-пропан- М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид 1H (DMSO-d6) δ (ppm): 0.82 (s, 6H, 2xCH3), 0.91 (d, 3H, J=6.9 Hz, CH3), 0.92 (d, 3H, J=6.9 Hz, CH3), 1.12 (m, 2H), 1.26 (d, 2H, J=12.6 Hz), 1.32 (dd, 2H, J=2.8 Hz, J=12.5 Hz), 1.55 (d, 2H, J=11.9 Hz), 1.62 (d, 2H, J=11.6 Hz), 1.78 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 2.09 (m, 1H), 3.48 (d, 1H, J=6 Hz), 7.91 (brs, 1H, NH-amide), 8.02 (brs, 2H, NH2amine).
13C (DMSO-d6) δ (ppm): 18.1 (CH3), 29.9 (CH), 30.5 (CH3), 32.3 (Cquat), 39.7 (CH2), 42.6 (CH2), 47.3 (CH2), 47.3 (CH2), 48.8 (CH), 50.5 (CH2), 53.2 (Cquat), 169.0 (CO). ESI-MS: m/z: 251, [M+H]+
4. 3-амино-пропан- М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид 1H (DMSO-d6) δ (ppm): 0.81 (s, 6H, 2xCH3), 1.10 (m, 2H), 1.25 (d, 2H, J=12.6 Hz), 1.30 (d, 2H, J=12.5 Hz), 1.58 (m, 4H). 1.75 (d, 2H, J=2.8 Hz), 2.07 (m, 1H), 2.39 (t, 2H, J=7.0 Hz), 2.92 (t, 2H, J=7.0 Hz), 7.64 (brs, 1H, NH- amide), 7.73 (brs, 2H, NH2-amine). 13C (DMSO-d6) δ (ppm): 29.9 (CH), 30.5 (CH3), 32.3 (Cquat), 32.8 (CH2), 35.8 (CH2), 39.9 (CH2), 42.7 (CH2), 47.4 (CH2), 50.6 (CH2), 52.9 (CH2), 52.9 (Cquat), 169.3 (CO). ESI-MS: m/z: 251, [M+H]+.
5. 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5”-диметиладамантан)-амид 1H (DMSO-d6) δ (ppm): 0.80 (s, 6H, 2xCH3), 1.07 (d, 2H, J=12.5 Hz), 1.10 (d, 2H, J=12.5 Hz), 1.24 (d, 2H, J=12.4
Hz), 1.28 (d, 2H, J=12.5 Hz), 1.44 (m, 2H). 1.5 (d, 2H, J=12.0 Hz), 1.68 (m, 2H), 2.06 (m, 1H), 2.95 (d, 2H, J=7.0 Hz), 3.88 (m, 1H), 7.16, (br, 2H, Ar), 7.26 (m, 2H, Ar), 7.82 (brs, 1H, NH-amide), 8.14 (brs, 2H, NH2-amine). 13C (DMSO-d6) δ (ppm): 29.8 (CH), 30.4 (CH3), 32.3 (Cquat), 36.9 (CH2), 39.6 (CH2), 42.6 (CH2), 47.2 (CH2), 50.5 (CH2), 53.3 (Cquat), 54.0 (CH), 115.6 (CHAr, 3JCF=22.0 Hz), 131.6 (Cquat-Ar), 132.0 (CH-Ar, 4JCF=8.3 Hz), 162.8 (Cquat, 1JCF=243 Hz), 167.1 (CO). ESIMS: m/z: 345, [M+H]+
6. 2-амино-3-фенилпропан-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид 1H (DMSO-d6) δ (ppm): 0.78(br, 3H, H-2‘), 1.33 (m, 3H, H-2a), 1.41 (m, 3H, H-2b), 1.426 (s, 9H, tBu), 1.560 (m, 3H, H-4b), 1.66 (m, 3H, H-4a), 2.99 (dd, 1H, 3J=9.6, 2J=13.5, CH2, PheAla), 3.11 (dd, 1H, 3J=6.2, 2J=13.8, CH2, PheAla), 3.59 (m, 1H, H-3’), 4.24 (br q, 1H, CH, PheAla), 5.20 (br, 1H, NH), 5.41 (br, 1H, NH), 7.23 (m, 3H), 7.30 (t, 2H). 13C (DMSO-d6) δ (ppm): 14.2 (CH3, C-2'), 28.2 (Mem C-3), 36.9 (CH2, C-4), 38.1 (CH2, C-2), 38.2 (Mem-CH2, C-2), 38.2 (PheAla-CH2), 53.0 (CH, C-l'), 56.2 (Mem-CH), 126.9 (Ph), 128.7 (Ph), 129.4 (Ph), 170.2 (CO). ESI-MS: m/z: 326, [M+H]+
7. 2-амино-3-(4-хидроксифенил)пропан-И-(3”,5”-диметиладамантан)-амид 1H-NMR: (DMSO-d6) δ (ppm): 0.75. (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’, D2), 0.93 (d, J=6.7 Hz, 3H, H-2’), 1,49 (3H, H-4b), 1,57 (3H, H-4a’), 1.84 (br, 3H, H-3, D1), 2.87 (m, 2H, CH2, D1+D2), 3.44 (D1+D2) 3.93 (m, 1H, CH, D2), 6.69 (m, 2H, Ar, D1), 6.70 (m, 2H, Ar), 7.04 (m, 2H, Ar), 7.01 (m, 2H, Ar), 7.78 (d, 1H, J=9.4 Hz, NH - amide), 7.89 (d, 2H, J=9.4 Hz, NH - amide), 8.12 (br., 1H, NH2); 13C-NMR: (DMSO-d6) δ (ppm): 13.6 (CH3, D2), 13.9 (CH3), 27.5 (CH) 27.6 (CH), 37.5 (C-4), 37.6 (C-4), 37.5 (C-2), 37.6 (C-2), 52.7 (CH), 53.6 (CH), 53.5 (CH), 115 (CH-Ar), 130.4 (CH-Ar) 130.2 (CH-Ar), 156.5 (Cquat), 167.1 (CO); ESI-MS: m/z: 343, [M+HJ+
8. 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбокси-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид 1H-NMR (CDCI3) δ (ppm): 1.12 (m, 2H), 1.26 (d, 2H, J = 12.6 Hz), 1.32 (dd, 2H, J = 2.8 Hz, J = 12.5 Hz), 1.55 (d, 2H, J = 11.9 Hz), 1.60 (d, 2H, J = 11.6 Hz), 1.77 (d, 2H, J = 2 Hz) 2.09 (m, 1H), 3.45 (s, 2H), 4.39 (d, 2H, CH2), 7.25 (s, 1H, NH), 8.04 (br t, 1H, NH), 8.95 (s, 1H, CHThz). 13C (DMSO-d6) d (ppm): 171.9 (COamide), 156.2 (C-Thz), 150.6 (C-Thz), 123.6 (CH-Thz), 79.9 (C), 50.6 (CH2), 47.4 (CH2), 42.7 (CH2), 42.4 (CH2), 29.6 (CH), 35.7 (CH2), 38.1 (CH2), 29.6 (CH). ESI-MS: m/z: 320, [Μ+Η]+
9. 2-(аминометил)-Г,3’-тиазолил-4’-2-(1,3-тиазол)-4-карбокси-М-(3”,5”-диметиладамантан)-амид 1H-NMR (CDCI3) δ (ppm): 0.79 (s, 6H, CH3), 1.18 (m, 2H), 1.31 (d, 2H, J = 13.2 Hz), 1.39 (d, 2H, J = 12.9 Hz), 1.81 (m, d, 2H, J = 12.2 Hz), 1.71 (m, d, 2H, J = 10.6 Hz), 1.99 (m, 2H), 2.16 (m, 1H), 4.26 (t, 1H, J = 6.5 Hz), 4.42 (d, 2H, J = 6.2 Hz), 4.53 (d, 2H. J = 6.7 Hz), 7.34 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.72 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.91 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 8.26 (s, 1H), 8.37 (s, 1H). 13C NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 15.2 (CH3, C-2', D1), 15.4 (CH3, C-2', D2), 28.4 (Mem C-3, D2), 28.6 (Mem C-3, D1), 28.1 (C(CH3)3, D2), D1), 37.1 (CH2, C-4, D2), 37.9 (CH2,
C-4, D1), 38.1 (СН2, D2), 38.2 (Mem-CH2, С-2, D1), 53.3 (CH, С-1', D1), 53.5 (CH, С-1', D2), 56.4 (Mem-CH, D2+D1), 132.5 (С5 Thz), 147.9 (С4 Thz), 163.1 (С2 Thz). ESI-MS: m/z: 366, [M+HJ+
Етапите на синтеза на съединението с формула (I), съгласно изобретението, са обобщени на Схема I по- долу:
i) DCCTE A: и) TFA
Схема I
Където:
ВОС е М-(трет-бутоксикарбонил);
R е изходното съединение, избрано от групата, посочена по- горе и представляващо амино киселина или пептидо миметик;
ВОС- R е Вос- защитена аминокиселина или пептидомиметик
Постигнатата по този начин химична модификация на съществуващото лекарствено средство за борба с болестта на Алцхаймер мемантин с природните аминокиселини аминоетанова киселина, 2-амино-З-метилбутанова киселина, 2-аминопропанова киселина, 3аминопропанова киселина, 2-амино-З-фенилпропанова киселина, 2-амино-3-(4хидроксифенил)пропанова киселина, неприродната аминокиселина 2-амино-3-(4флуорофенил)пропанова киселина и пептидомиметиците 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4карбоксилна киселина и 2-(аминометил)-1’,3'-тиазолил-4'-2-(1,3-тиазол)-4-карбоксилна киселина, води до получаването на ново съединение, което в условията на организма се хидролизира и се разделя на двете участващи компоненти: компонент 1 - мемантин и компонент 2 - съответната аминокиселина или пептидомиметик. По този начин в организма се създават условия новосинтезираното съединение да действа както като NMDA-рецепторен антагонист, така и като транспортна молекула, улесняваща преминаването на мемантина през клетъчната мембрана, когато втората компонента е аминокиселина или антимикробен агент, както и когато втората компонента е модифицирана аминокиселина или пептидомиметик. Така съединението, съгласно настоящото изобретение, е едновременно ефективно както за преодоляване на развиваща се инфекция, причинена от клинично значими, условно патогенни бактериални видове и гъби, така и при лечение на Болестта на Алцхаймер.
Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения без да ограничават неговият обхват.
Пример 1. Получаване на 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5’’-диметиладамантан)амид, съгласно изобретението.
За получаване на съединение 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5”диметиладамантан)-амид, 10 mmol М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3-(4флуорофенил)пропанова киселина се разтварят в 3 mL диметилформамид при стайна температура и непрекъснато разбъркване. Към този разтвор се добавят 10 mmol триетиламин (TEA) и 14 mmol от свързващия реагент дициклохексилкарбодиимид (ДСС). В отделен съд 11 mmol мемантин хидрохлорид се разтварят в 2 mL диметилформамид и след двадесет минути след приготвянето на първия разтвор, разтворите се смесват. Ходът на реакцията се следи хроматографски. Продължителността на реакцията е около 7 часа. След приключването й се извършва двукратно промиване с разтвор на 5% №НСОз, разтвор на 5% NaHSCU и еднократна промивка с вода. Органичният слой се суши с безводен МагвОд, след което се филтрува, а разтворителя се изпарява. Продуктът (Н-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино-3-(4флуорофенил)пропан-М-(3”,5-диметиладамантан)-амид) се изолира.
Към получения и изолиран N-(τpeτ-бyτoκcиκapбoнил)-2-aминo-3-(4-φлyopoφeнил)πpoπaн-N(3”,5”-диметиладамантан)-амид, охладен до 0°С, се прибавя на капки трифлуороцетна киселина. Разтворът се разбърква при 0 °C до пълното премахване на защитната (третбутоксикарбонил) група. Процесът се следи хроматографски. Разтворителите се изпаряват, след което се добавят трикратно 30 mL диетилов етер с последващо изпаряване. Към полученият маслообразен продукт се добавят няколко капки етилацетат и около 10-20 mL диетилов етер. В резултат на обработката се получават кристали трифлуорацетатна сол на 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3’’,5”-диметиладамантан)-амида. Разтворителите се изпаряват и към кристалите се добавя 3 mL вода, 1 mL метанол и 1 mL ацетонитрил. Към получения разтвор се добавя 25%-ен амоняк до достигане на pH 7.5-8. Следва неколкократна екстракция с етилацетат, сушене на органичния слой с безводен ИагЗОд, филтруване и изпаряване на разтворителя. Получените кристали се пречистват чрез колонна хроматография.
Полученият продукт е 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3,5”-диметиладамантан)-амид - свободна база. Добив 2002,5 mg (45%).
Полученото съединение е с наименование по IUPAC: 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-Н(3,5-диметиладамантан)-амид.
1Н (DMSO-d6) δ (ppm): 0.80 (s, 6H, 2xCH3), 1.07 (d, 2Н, J=12.5 Hz), 1.10 (d, 2H, J=12.5 Hz), 1.24 (d, 2H, J=12.4 Hz), 1.28 (d, 2H, J=12.5 Hz), 1.44 (m, 2H). 1.5 (d, 2H, J=12.0 Hz), 1.68 (m,2H), 2.06 (m, 1H), 2.95 (d, 2H, J=7.0 Hz), 3.88 (m, 1H), 7.16, (br, 2H, Ar), 7.26 (m, 2H, Ar), 7.82 (brs, 1H, NHamide), 8.14 (brs, 2H, NH2-amine). 13C (DMS0-d6) δ (ppm): 29.8 (CH), 30.4 (CH3), 32.3 (Cquat), 36.9 (CH2), 39.6 (CH2), 42.6 (CH2), 47.2 (CH2), 50.5 (CH2), 53.3 (Cquat), 54.0 (CH), 115.6 (CHAr, 3JCF=22.0 Hz), 131.6 (Cquat-Ar), 132.0 (CH-Ar, 4JCF=8.3 Hz), 162.8 (Cquat, 1JCF=243 Hz), 167.1 (CO). ESI-MS: m/z: 345, [M+H]+
Пример 2: Невропротективно действие на мемантинови производни, съгласно изобретението
Биологични изследвания in vitro
Резултатите от in vitro изследванията показват, че изследваните производни имат благоприятен невропротективен ефект. Те подържат жизнеспособността на невроналните клетки, въпреки цитотоксичността, индуцирана от бета амилоида. В сравнение с контролната група клетки, третирани с мемантин, 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5”диметиладамантан)-амид демонстрира сравнително еквивалентен невропротективен ефект при наномолни концентрации, докато 2-амино-3-фенилпропан-Н-(3,5-диметиладамантан)амид и 2-амино-3-(4-хидроксифенил)пропан-М-(3’’,5”-диметиладамантан)-амид показват много по-добър невропротективен ефект. От Таблица 1 по- долу е видно, че сред тестваните съединения, ароматните аминокиселинни аналози притежават еквивалентен, а в някои случаи дори по-добър невропротективен ефект спрямо контролните, в сравнение с тези на алифатните аминокиселини.
Таблица 1: Невропротективен ефект на мемантинови производни
| Съединения | Cu2*-ECso (μΜ) | CoCh-ECso (μΜ) | LPS(TNF-a) -ICso (μΜ) | LPS(IL-6) -IC50 (μΜ) |
| Мемантин | 8.34x10 3± 0.51 х10'3 | 0.1141 ± 0.047 | 0.0804 ±0.017 | 0.1436 ± 0.0117 |
| аминоетан-М-(3,5диметиладамантан)-амид | 22.87 ± 1.89 | 0.7434 ±0.1288 | 21.75 ±3.88 | 26.10 ±0.68 |
| 2-амино-З-метилбутан-М(3’,5'-диметиладамантан)амид | 44.87± 9.30 | 0.2308 ± 0.068 | 53.23± 3.18 | 58.77± 0.66 |
| 2-амино-пропан- Ν-(3',5'диметиладамантан)-амид | 41.09 ±3.19 | 58.92 ± 7.44 | 32.17 ±2.96 | 39.22 ±5.19 |
| 3-амино-пропан- Ν-(3',5'диметиладамантан)-амид | 33.17 ± 9.54 | 0.1192 ±0.047 | 40.12 ± 1.29 | 42.39 ± 4.82 |
| 2-амино-3-(4флуорофенил)пропан-М(3”,5-диметиладамантан)амид | 1.26х10'2± 0.86x10’2 | 0.4141 ± 0.055 | 0.0234 ± 0.016 | 0.2570 ± 0.0274 |
| 2-амино-З-фенилпропанМ-(3',5’-иметиладамантан) -амид | 4.28x10-± 1,24*10- | 0.6546 ± 0.0465 | 0.0594 ± 0.0131 | 0.1878 ±0.0153 |
| 2-амино-3-(4- хидроксифенил)пропан-М(3,5-диметиладамантан)амид | 2.18*10-± 1,29*10- | 0.5604 ±0.0189 | 0.0916 ±0.0144 | 0.9708 ±0.0150 |
Си2’-ЕСИ обозначава ефективната концентрация на изследваното съединение при индуцирана от бета амилоид (Αβ) цитотоксичност, стимулирана от медни йони.
СоСЬ-ЕСю обозначава ефективната концентрация на изследваното съединение при индуцирана от бета амилоид (Αβ) цитотоксичност, стимулирана от кобалтов дихлорид..
LPS(TNF-a)-IC5o обозначава инхибиращата концентрация на изследваното съединение при индуцирана от туморнекротизиращ фактор алфа (TNF-α) цитотоксичност, стимулирана от липозахариди.
LPS(IL-6)-IC5o обозначава инхибиращата концентрация на изследваното съединение при индуцирана от интерлевкин6 (IL-6) цитотоксичност, стимулирана от липозахариди.
Пример 3: In vitro тестване за антимикробна активност на мемантинови производни
На изследване са подложени следните мемантинови производни, номерирани както следва:
1. аминоетан-М-(3,5-диметиладамантан)-амид;
2. 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5-диметиладамантан)-амид ;
3. 2-амино-3-метилбутан-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид;
4. 3-амино-пропан- М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид;
5. 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбокси-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид
Тест култури.
Моделните тест култури са от НБПМКК и колекция на Биологически факултет при СУ „Св. Климент Охридски“.
• Бактерии: За експериментите са използвани Грам положителни и Грам отрицателни клинично значими условно патогенни бактерии Escherichia coli НБПМКК 3397, Salmonella enterica НБПМКК 8691, Staphylococcus aureus НБПМКК 6538 и Bacillus megaterium БФ 145. Тест културите са изготвяни чрез посев в хранителна среда месо-пептонен бульон (МПБ) със състав (g/L): 5 пептон, 3 говежди екстракт, 5. NaCI, pH 7.0 и култивирани за 16 часа при Т = 37°С. Използвани са култури с плътност ODses = 0.5 McF (стандарт за оптична плътност по Макферланд).
• Дрождеви микроорганизми: Тест културите Rhodotorula sp. БФ 16-25 и Candida lusitniae БФ 744 са изготвяни чрез посев в течна хранителна среда YPD със състав (g/L): 20 глюкоза, 10 пептон, 5 дрождев екстракт и култивиране на клатачен апарат при 220 rpm за 16 h, при Т = 28°С. Използвани са работни култури с плътност ODses = 0.8 McF.
Методи: Качествен анализ на антимикробна активност - метод на дифузия в агар
Бактериалните и дрождеви тест култури се изготвят, както е описано по-горе.
Бактериалните култури се инокулират дълбочинно, а дрождевите- повърхностно в съответните агаризирани хранителни среди при концентрация 1 ml тест култура за бактериите и 0.1 ml за дрождите към 15 ml подходяща хранителна среда. След посев, в хранителните среди се правят ямки с диаметър 9 mm, в които се поставят по 50 μΙ от изследваните проби. След инкубиране за 1.5 час на 4'С за дифундиране на пробата се провежда култивиране за 24 - 48 h при 28/37‘С.
Ефективността на изследваните съединения в концентрации от 10 mM се определя чрез измерване на зоната на инхибиране (в mm) и сравнява с тази на контролите DMSO, мемантин и търговски препарати тетрациклин и нистатин (30 pg/disk) и немдатин (мемантин-HCI, 10 mg/tablet).
Количествен анализ на антимикробна активност: определяне на минималната инхибираща концентрация (МИК)
Тест културите са приготвени, както е описано по-горе. От 10 mM мемантинови конюгати са приготвени поредица разтвори с двукратно намаляващи концентрации. Аликвоти (20 μΙ) от тези разтвори се накапват върху петриеви панички с тест култури и инкубират 24/48 часа на оптимална за микробния вид температура. Отчитат се зоните на инхибиране и се определя МИК.
Влияние на клетъчната плътност на бактериалните култури върху инхибиторния ефект на изследваните МЕМ-конюгати
Тест култури се приготвят, както е описано по-горе с начална концентрация 0.1,0.3 и 0.5 McF. Към всяка култура се добавя по 0.5 ml 1 mM разтвор на тестваните конюгати. Пробите се инкубират на 37°С. Измервания на ODses се извършват на 2, 3, 4, 5, 6 и 7 час от инкубирането.
Резултатите от изпитването, съгласно настоящия пример са представени на Таблици 2, 3 и 4 по- долу. От всички изследвани субстанции, вещества № 1 - 5 проявяват инхибиторен ефект към отделни тест-микроорганизми. Вещество № 3 оказва по-голяма ефективност към Грамотрицателните бактерии, а към Грам-положителните, повлиява растежа само на В. megaterium БФ 145. Съединение № 4 оказва ефект единствено по отношение растежа на S. enterica НБПМКК 8691, а № 5 има по-добър инхибиторен ефект срещу Грам-положителните бактерии. Наблюдава се видова специфичност по отношение на ефекта на различните производни на мемантина, с изключение на конюгат № 2, който е ефективен към всички изследвани щамове. Инхибиторният му ефект е съизмерим стози на положителните контроли търговски препарати тетрациклин и нистатин.
Оценката на ефекта на клетъчната плътност на моделните бактериални култури върху инхибиторния ефект на изследваните МЕМ-конюгати дава възможност да се изведе модел на преживяемостта на щамовете, представен на Таблица 3. Физиологичният показател преживяемост нараства право пропорционално с повишаване на начална концентрация на бактериалния инокулум. За период от 5 часа, когато нетретираната култура навлиза в стационарна фаза, в пробите се наблюдава потискане на растежа в различен обхват. Той е специфичен както по отношение на изпитваните вещества, така и по отношение на видовата принадлежност на тест културите. Най-чувствителна е S. enterica НБПМКК 8691 към вещество № 2, при която се регистрират най-ниски стойности на преживяемост на културата.
Таблица 2: Антимикробна активност на мемантинови производни
| Г рам-отрицателни бактерии | Грам- положителни бактерии | Дрождеви микроорганими | ||||
| Съединение* Ns (10 тМ) | S. enterica НБПМКК 8691 | Е. coli НБПМКК 3397 li | St aureus НБПМКК 6538 | В. megaterium БФ 145 | Rhodotorula sp. БФ 16-25 | Candida lustiniae БФ 74-4 |
| 1 | не | не | не | не | не | не |
| 2 | 20 | 22 | 21 | 22 | 26 | 23 |
| 3 | 11 | 11 | не | 16 | не | не |
| 4 | 16 | не | не | не | не | не |
| 5 | не | 13 | 10 | 16 | не | не |
| MEM-HCI | не | не | не | не | не | не |
| МЕМ | не | не | не | не | не | не |
| 2-амино-3-(4флуорофенил)пр опанова киселина | не | не | не | не | не | не |
| DMSO | не | не | не | не | не | не |
| Тетрациклин | 26 | 26 | 28 | 34 | - | - |
| Нистатин | - | - | - | - | 26 | 24 |
*На съединенията, номерирани от 1 до 5 съответстват:
1. аминоетан-М-(3,5-диметиладамантан)-амид;
2. 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5-диметиладамантан)-амид;
3. 2-амино-3-метилбутан-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид;
4. 3-амино-пропан- М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид;
5. 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбокси-М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид.
Зоните на инхибиране на растежа на тест микроорганизмите са представени в mm и включват ямката за нанасяне на пробата; „не”- не се наблюдава зона на инхибиране.
Таблица 3: Минимална инхибираща концентрация (МИК) на мемантинови производни
| Г рам-отрицателни бактерии | Г рам-положителни бактерии | Дрождеви микроорганими | ||||
| Съед. № (тМ) | S. enterica НБПМКК 8691 | Е. coli НБПМКК 3397 П | St aureus НБПМКК 6538 | В. megaterium БФ 145 | Rhodotorula sp. БФ 16-25 | Candida lustiniae БФ 74-4 |
| 1 | 1.25 | 0 | 0 | 1.25 | 0 | 0.3125 |
| 2 | 0.156 | 1.25 | 1.25 | 0.625 | 0.078 | 0.078 |
| 3 | 1.25 | 5 | 10 | 2.5 | 0 | 0.3125 |
| 4 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0.078 |
| 5 | 5 | 5 | 10 | 10 | 1.25 | 0.3125 |
- няма зона на инхибиране;
МИК на съединенията е представена в тМ.
Таблица 4: Модел на преживяемостта на условно патогенни бактерии спрямо изследваните вещества; култивиране - 5 ч.
| Съедин. ODsss | Преживяемост (%) | ||||
| Е. coli НБПМКК 3397 | S. enterica НБПМКК 8691 | St aureus НБПМКК 6538 | В. megaterium БФ 145 | ||
| 1 | 0.1 0.3 0.5 | 5.88 | 19.05 | 38.46 | 16.67 |
| 1.67 | 17.65 | 86.36 | 20.00 | ||
| 25 | 25 | 85 | 0 | ||
| 2 | 0.1 0.3 0.5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 0 | 5 | 0 | ||
| 3 | 0.1 0.3 0.5 | 5.26 | 0 | 15.38 | 16.67 |
| 26.67 | 11.76 | 31.82 | 0 | ||
| 53.33 | 6.25 | 40 | 0 | ||
| 4 | 0.1 0.3 0.5 | 21.05 | 9.52 | 19.23 | 0 |
| 20 | 11.76 | 54.55 | 33.33 | ||
| 40 | 31.25 | 25 | 0 | ||
| 5 | 0.1 0.3 0.5 | 21.05 | 0 | 15.38 | 16.67 |
| 33.33 | 5.88 | 36.36 | 0 | ||
| 46.67 | 6.25 | 35 | 80 |
Пример 4. In vitro тестване антимикробна активност на 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М(3”,5”-диметиладамантан)-амид
Тест култури.
Моделните бактериални и дрождеви тест култури и тяхното изготвяне са както в Пример 3. Тест култури от филаментозните гъби Fusarium graminearum - НБПМКК 2294 и Penicillium claviforme БТ 136 са изготвяни чрез посев върху хранителна среда картофено - глюкозен агар (КГА) със състав (g/L): 200 картофи, 10 глюкоза, 15 агар и култивиране за 5 дни при Т = 28°С.
Методи:
Качественият анализ за антибактериална и антидрождева активност на 2-амино-3-(4флуорофенил)пропан-М-(3,5”-диметиладамантан)-амид в концентрации от 0,1 тМ, 1 тМ и 10 тМ е проведен, както е описано в Пример 3. За качествена оценка на активността срещу филаментозни гъби се изготвят спорови суспензии от пет дневни култури върху ΚΓΑ в концентрация 1 х 105 spores/ml, определени чрез броителна камера на Бюргер. Антигъбният ефект се оценява чрез инокулиране на свежа хранителна среда ΚΓΑ (15 ml) в патриева паничка с 3 μΙ от съответната спорова суспензия и култивиране за 5 дни при 28°С. Инхибирането на радиалната скорост на растеж (Кг) на гъбните култури, измерена като увеличение на диаметъра на гъбната колония (mm) за единица време (h), се изчислява като процент от тази на нетретирана контрола. Положителна контрола е търговският фунгициден препарат топсин.
Определяне на минимална бактерицидна концентрация (МБК)
Минималната бактерицидна концентрация е оценена по следната схема: в МПБ, съдържащ различни концентрации на 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3,5'’-диметиладамантан)амид (10 гпМ, 1 тМ, 0.5 тМ, 0.1 тМ, 0.01 тМ) се инокулират 10 μΙ от изследваната тест култура с OD585 = 0.5 McF. Пробите се инкубирани за 24 часа при оптимална за микробния вид температура. След инкубацията, епруветките са прегледани за наличие на растеж. От последната епруветка без видим растеж се изготвят разреждания 1:1 и 1:10, 1:100 и 1:1000. Последните са инкубирани при същите условия за 24 часа. След това 10 μΙ от всяка епруветка се посява върху МПА, инкубира се за 24 часа и проверява за наличие/липса на растеж за определяне на минимална бактерицидна концентрация.
„Time-kill“ тест за оценка на бактериостатичен/бактерициден ефект.
Тест културите се приготвят, както е описано в Пример 3 с начална концентрация 0.1,0.3 и 0.5 McF. Към всяка култура се добавя по 0.5 ml 1 тМ разтвор на 2-амино-3-(4флуорофенил)пропан-М-(3”,5-диметиладамантан)-амид. Пробите се инкубират на 37°С. Измервания на ODsas се извършват на 2, 3, 4, 5, 6 и 7 час от инкубирането. В пробите се определят CFU/ml (xi) и се сравняват с данните за контрола (без инхибитор) от същия час (хк). Резултатите се интирпретират по следната схема: при xi > хк - съединението стимулира растежа на микроорганизмите; при xi = хк - съединението няма ефект; при xi = CFU/ml преди инкубирането - ефектът на съединението е бактериостатичен; при xi < хк - ефектът на съединението е бактерициден.
Резултатите от изпитването, съгласно настоящия пример, са представени на Таблици 5 и 6 по-долу и се илюстрират с приложената Фигура 1, представяща динамиката на растеж на S. enterica НБПМКК 8691 в присъствие на 1 тМ 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5”диметиладамантан)-амид. При 0.1 тМ 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3,5”диметиладамантан)-амид, инхибиторен ефект върху бактериалния растеж не се наблюдава, при 1 тМ такъв се регистрира срещу St. aureus НБПМКК 6538 и В. megaterium БФ 145, а при 10тМ се потиска растежа на всички изследвани бактериални видове. Определянето на МИК в Пример 3 показва, че най-чувствителен е видът S. enterica НБПМКК 8691 (МИК = 0.156 тМ), следван от В. megaterium БФ 145 (МИК = 0.625 тМ). За S. enterica НБПМКК 8691 МБК = 0.3 тМ.
„Time-kill тестът на 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5”-диметиладамантан)-амид, проведен с най-чувствителния бактериален вид- Salmonella enterica НБПМКК 8691 показва бактерициден ефект и 100 % инхибиране на бактериалния растеж след 7 часа култивиране в присъствие на изследваното веществото. За същия период контролата достига клетъчна плътност над 6 х 108 CFU/ml.
Таблица 5: Антимикробна активност на 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5”диметиладамантан)-амид
| Г рам-отрицателни бактерии | Грам-положителни бактерии | Дрождеви микроорганими | ||||
| фенилаланил(4-Р)-М-(3,5ди метил -адамантан)-амид (mM) | S. enterica НБПМКК 8691 | Е. coli НБПМКК 3397 Н | St. aureus НБПМКК 6538 | в. megaterium БФ 145 | Rhodotor ula sp. БФ 16-25 | Candida lustiniae БФ74-4 |
| 0.1 | не | не | не | не | не | не |
| 1 | не | не | 5 | 12 | не | не |
| 10 | 20 | 22 | 21 | 22 | 26 | 23 |
| MEM-HCI | не | не | не | не | не | не |
| МЕМ | не | не | не | не | не | не |
| 2-амино-3-(4флуорофенил) пропанова киселина | не | не | не | не | не | не |
| DMSO | не | не | не | не | не | не |
Зоните на инхибиране на растежа на тест микроорганизмите са представени в mm и включват ямката за нанасяне на пробата; „не”- означава, че не се наблюдава зона на инхибиране.
На Таблица 6 по- долу е показан силно изразен инхибиторен ефект на 2-амино-3-(4флуорофенил)пропан-М-(3”,5”-диметиладамантан)-амид върху растежа на филаментозните фунги. Той е в обхват 9.5% при Penicillium chaviforme БТ136 и 39.4% при Fusarium graminearum НБПМКК 2294.
Таблица 6: Инхибиране радиалната скорост на растеж на филаментозни гъби от 2-амино-З(4-флуорофенил)пропан-М-(3,5”-диметиладамантан)-амид
| Час (h) | Penicillium chaviforme d (mm) | Fusarium graminearum d (mm) | ||||||
| K | Топсин | DMSO | N2 | K | Топсин | DMSO | N2 | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 24 | 5,5 | 0/0 | 8,5 | 6,5 | 8,5 | 15,0 | 21,0 | 7,0 |
| 48 | 11,5 | 0/0 | 13,5 | 10,5 | 26,0 | 39,0 | 39,0 | 35,0 |
| 72 | 16,0 | 0/0 | 13,5 | 14,5 | 50,5 | 44,0 | 66,0 | 46,0 |
| 96 | 21,0 | 0/0 | 23,0 | 19,5 | 70,0 | 47,0 | 82,5 | 48.0 |
| 120 | 25,0 | 0/0 | 27,0 | 23,0 | 85,0 | 50,0 | 85,0 | 52,0 |
| Кг (mm/h) | 0,21 | 0 | 0,22 | 0,19 | 0,71 | 0,42 | 0,71 | 0,43 |
Физико-химични характеристики
Рентгеноструктурен анализ
Понастоящем, рентгеноструктурен анализ е водещият метод, даващ еднозначна информация за структурата на веществата в твърдо състояние. Методът изисква източник на монохроматично лъчение, монокристал или поликрустал (прах), гониометрична система и детектор на рентгенови лъчи. Лъчението се насочва към кристалите, като по този начин се получават снопове отразени лъчи който се регистрират от детектора. Комбинацията от дифракционен интензитет и положението му (рефлекс) генерира набор от рефлекси които са специфични за всеки кристален материал. Рентгеноструктурният анализ използван за доказване на кристалната структура на веществата беше проведен на апарат Supernovadual, Oxford diffraction или D2Phasr Bruker, при стайна температура на образците с Мо или Си лъчение.
Диференциален термичен анализ (ДТА, DTA)
ДТА се използва се за измерване на ендотермични или екзотермични ефекти свързани с преходи (фазови и др.) във функция от температурата. Преходите включват кристализация, аморфизация, десорбция, топене и сублимация. Експериментът се провежда в контролирана атмосфера (въздух). Базира се на отчитане на разликата между температурата на изследваното вещество и тази на еталон. Чрез ДТА може да се определя температура на топене на органични молекули.
Термогравиметричен анализ (ТГА, TGA)
ТГА измерва промяната на теглото на веществата като функция от температурата и/или времето. Най-често този метод се употребява за определяне на тегловни промени свързани с разлагане, окисление или абсорбиране на влага и т.н.. Диференциалния термичен анализ (ДТА) и термогравиметричния анализ (ТГ) бяха проведени на апарат STA (Simultaneous thermal analyzer) Stanton Redcroft 1500. Условия на експеримента: нагряване от стайна температура до 250 °C, със скорост на покачване на температурата - 5 °C.min-1; продухващ газ - въздух.
ДТА кривата на 3-амино-пропан-М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид, представена на Фиг. 2а, показва два ефекта при 160°С и в областта 200-250°С. Тези ендо ефекти отговарят съответно на стапяне (фазов преход) на кристалната структура и последваща деструкция. При ТГА се наблюдава се рязък спад в теглото на пробата (-80%), започващ от около 215 °C. При охлаждането не се регистрират ефекти свързани с кристализация. ДТА и ТГА кривите на 2aминo-3-(4-φлyopoφeнил)πpoπaн-N-(3”,5”-димeτилaдaмaнτaн)-aмид, представени на Фиг. 2Ь, отново показват два ендо ефекта, свързани със стапяне (—150 °) и деструкция (~210 °C) съпроводена с тегловни загуби.
Праховият рентгеноструктурен анализ анализ на веществата, представен на Фиг. За и ЗЬ, показва еднозначно наличие на една фаза при 3-амино-пропан-М-(3',5’-диметиладамантан)амид, и 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3,5”-диметиладамантан)-амид. При разтваряне и последващо изпарение на разтворителя, кристалната фаза се запазва като степентта на кристалност нараства, докато аморфното хало на практика изчезва.
Данните от термичния и праховия рентгенофазов анализ ракриват стабилността на веществата, липса на фазови преходи във функция от температурата (термична стабилност) и липса на фазови преходи след разтваряне (липса на полимоорфизъм).
Решени са и кристалните структури на 3-амино-пропан-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид и 2амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3’’,5-диметиладамантан)-амид. Таблица 7 по-долу представя основните данни за кристална структура на мемантиновите аналози. Докато съединението 3-амино-пропан-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид кристализира в центросиметрична пространствена група (P2Fc, No 14), то 2-амино-3-(4флуорофенил)пропан-Н-(3,5-диметиладамантан)-амид кристализира в нецентросиметрична пространсвена група (P2i2i2i, No 19). Именно с наличието на рацемична смес и липсата на такава могат да се обяснят разликите в наблюдаваните антимикробни активности.
Таблица 7: Данни за кристалната структура на мемантиновите производни
| Вещество | 3-амино-пропан-Н-(3’,5’диметиладамантан)-амид | 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-Л(3”,5-диметиладамантан)-амид |
| Температура/К | 290(2) | 290(2) |
| Кристана система | monoclinic | orthorhombic |
| Пространствена група | P2,/C | P2,2,2i |
| а/А | 15.6374(10) | 6.9402(6) |
| Ь/А | 11.9090(8) | 10.4856(7) |
| с/А | 10.9889(8) | 35.454(3) |
| а/° | 90 | 90 |
| β/° | 110.208(8) | 90 |
| у/ | 90 | 90 |
| Обем/А3 | 1920.4(2) | 2580.0(4) |
| Ζ | 4 | 4 |
| Pcacg/cm3 | 1.260 | 1.227 |
| μ/mm-1 | 0.105 | 0.102 |
| F(000) | 776.0 | 1008.0 |
| Размер на кристала/mm3 | 0.3 x 0.15 x 0.15 | 0.3 x 0.2 x 0.15 |
| Лъчение | ΜοΚα (λ = 0.71073) | ΜοΚα (A = 0.71073) |
| 2Θ range for data collection/“ | 6.522 to 50.046 | 5.982 to 57.36 |
| Събрани рефлекси | 9411 | 9244 |
| Независими рефлекси | 3370 [R,„, = 0.0634] | 5265 [Rw = 0.0588] |
| Data/restraints/parameters | 3370/0/229 | 5265/37/331 |
| Goodness-of-fit on F2 | 1.039 | 0.957 |
| Final R indexes [/>=2σ (1)] | R, = 0.0893, wR2 = 0.2410 | Ri = 0.0855, wR2 = 0.2062 |
| Final R indexes [all data] | Ri = 0.1688, wR2 = 0.2960 | R, = 0.2168, wR2 = 0.2762 |
| Largest diff, peak/hole / e A-3 | 0.32/-0.30 | 0.79/-0.19 |
Данните от изследванията по- горе показват, че съединението, съгласно настоящото изобретение е стабилно в условията на стомашно-чревния тракт (pH 1.0 и pH 7.4), като найдобра антибактериална ефективност както към Грам-отрицателните, така и към Грамположителните бактерии проявява съединение 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3,5диметиладамантан)-амид. Инхибиторният му ефект е съизмерим с този на положителната контрола търговски препарат тетрациклин. Антибактериалната активност на съединения 2амино-3-метилбутан-М-(3',5’-диметиладамантан)-амид и 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4карбокси-М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид е съизмерима, но по-ниска и варира между 10 и 16 mm зона на инхибиране. Съединението 3-амино-пропан- М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид демонстрира ефект само срещу S. enterica НБПМКК 8691, а при съединение 2-(аминометил)1 ',3'-тиазолил-4’-2-(1,3-τиaзoл)-4-κapбoκcи-N-(3”,5”-димeτилaдaмaнτaн)-aмид инхибиторен ефект не се наблюдава. Всички изследвани вещества са разтворени в DM SO. Този разтворител, 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропанова киселина, мемантин и мемантин хидрохлорид (MEM-HCI) са заложени като контроли на експеримента.
Сравнителният анализ на антимикробната активност по отношение на Грам-статуса на тестбактериите показва, че веществото 2-амино-3-метилбутан-М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид оказва по-голяма ефективност към Грам-отрицателните бактерии, а към Грам-положителните, повлиява растежа на Bacillus megaterium БФ 145. Съединение 3-амино-пропан- N-(3’,5'диметиладамантан)-амид оказва ефект по отношение растежа на S. enterica НБПМКК 8691, а 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбокси-М-(3’,5’-диметиладамантан)-амид има по-добър инхибиторен ефект срещу Грам-положителните бактерии. Наблюдава се видова специфичност по отношение на ефекта на различните производни на мемантина, с изключение на конюгат 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5”-диметиладамантан)амид, който е ефективен към всички изследвани щамове.
При изследване на 1 тМ концентрация от мемантиновите конюгати, инхибиторен ефект на бактериалния растеж проявява вещество 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-Н-(3”,5диметиладамантан)-амид срещу Грам-положителните St. aureus НБПМКК 6538 и В. megaterium БФ 145.
Антигъбен ефект проявява съединение 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3”,5диметиладамантан)-амид. Количествено, той е съизмерим с този на положителната контролатърговски препарат нистатин.
Експерименталните данни показват, че мемантиновите производни: аминоетан-М-(3,5диметиладамантан)-амид, 2-амино-3-метилбутан-М-(3’,5'-диметиладамантан)-амид, 3-аминопропан- N-(3’, 5’-диметиладамантан)-амид, 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропан-М-(3,5”диметиладамантан)-амид и 2-(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбокси-М-(3’,5' диметиладамантан)-амид проявяват определен антимикробен ефект както срещу моделните прокариотни видове, така и срещу изследваните еукариотни култури.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Aracava, Y., Pereira, Е. Е, Maelicke, A., & Albuquerque, Е. X. (2005). Memantine blocks а7* nicotinic acetylcholine receptors more potently than N-methyl-D-aspartate receptors in rat hippocampal neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 312(3), 1195-1205. DOI: httos://doi. oro/10.1124/ioet. 104.077172.
2. Pisa, D., Alonso, R., Fernandez-Fernandez, A. M., Rabano, A., & Carrasco, L. (2017). Polymicrobial infections in brain tissue from Alzheimer’s disease patients. Scientific reports, 7(1), 1-14.DOI: https://doi.org/10.103B/S41598-017-05903У-
3. Yu, J. Y., Zhang, B., Peng, L, Wu, C. H., Cao, H., Zhong, J. F. et al. (2015). Repositioning of memantine as a potential novel therapeutic agent against meningitic E. Coli-induced pathogenicities through disease-associated Alpha7 cholinergic pathway and RNA sequencing-based transcriptome analysis of host inflammatory responses. PloS one, 10(5). DOI: 10.1371/joumal.pone.0121911
4. Knorr, R., Trzeciak, A., Bannwarth, W., & Gillessen, D. (1989). New coupling reagents in peptide chemistry. Tetrahedron Letters. 30(15), 1927-1930. DOI: httos://doi.oro/10,1016/30040-4039(00)99616-3
5. US2019336509 A1
6. Заявка за патент BG112806
Claims (4)
1. Съединение с обща формула (I), zR NH
(I) където R представлява аминокиселина или пептидомиметик, избрани от групата, включваща аминоетанова киселина, 2-амино-З-метилбутанова киселина, 2-аминопропанова киселина, 3аминопропанова киселина, 2-амино-З-фенилпропанова киселина, 2-амино-3-(4хидроксифенил)пропанова киселина, 2-амино-3-(4-флуорофенил)пропанова киселина, 2(аминометил)-1,3-тиазол-4-карбоксилна киселина и 2-(аминометил)-Г,3’-тиазолил-4’-2-(1,3тиазол)-4-карбоксилна киселина.
2. Метод за получаване на съединение с формула (I) съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че защитено със защитната група М-(трет-бутоксикарбонил) изходно съединение, избрано от групата, включваща М-(трет-бутоксикарбонил)-аминоетанова киселина, Ν-(τρβτбутоксикарбонил)-2-амино-3-метилбутанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-2аминопропанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-3-аминопропанова киселина, Ν-(τρβτбутоксикарбонил)-2-амино-3-(4-флуорофенил)пропанова киселина, Ν-(τρβτ- бутоксикарбонил)-2-амино-3-фенилпропанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-2-амино3-(4-хидроксифенил)пропанова киселина, М-(трет-бутоксикарбонил)-2-(аминометил)-1,3тиазол-4-карбоксилна киселина и М-(трет-бутоксикарбонил)-2-(аминометил)-1’,3’-тиазолил-4'2-(1,3-тиазол)-4-карбоксилна киселина), се разтваря в диметилформамид, като при непрекъснато разбъркване се добавят триетиламин и дициклохексилкарбодиимид с последващо добавяне на предварително разтворен в дихлорметан на ултразвук мемантин хидрохлорид и триетиламин и след приключването на реакцията се извършва промиване с 5%-ен разтвор на МаНСОз, 5%-ен разтвор на NaHSO4 и вода; органичният слой се суши с безводен NazSOi, разтворителят се изпарява и към полученото междинно съединение, охладено до 0°С и разтворено в дихлорметан, се прибавя еквивалентен обем трифлуороцетна киселина на капки, разтворът се разбърква при 0°С до деблокиране на N(трет-бутоксикарбонил) групата и след изпаряване на разтворителя се добавя неколкократно диетилов етер, който съответно се изпарява, а към полученият маслообразен продукт се добавя смес на етилацетат/хексан или метанол/диетилов етер, pH на разтвора се довежда до 7.5- 8.0 и се провежда двукратна екстракция с етилацетат, изпаряване на разтворителя и хроматографско пречистване на получените кристали.
3. Съединение съгласно претенции 1 и 2, приложимо като NMDA-рецепторен антагонист за профилактика и лечение на болестта на Алцхаймер.
4. Съединение съгласно претенции 1-3, приложимо като средство за профилактика и лечение на заболявания, причинени от клинично значими, условно патогенни бактериални видове и гъби.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113103A BG67555B1 (bg) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Nmda-рецепторен антагонист с антимикробна активност |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG113103A BG67555B1 (bg) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Nmda-рецепторен антагонист с антимикробна активност |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG113103A true BG113103A (bg) | 2021-09-30 |
| BG67555B1 BG67555B1 (bg) | 2023-07-17 |
Family
ID=80735357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG113103A BG67555B1 (bg) | 2020-03-17 | 2020-03-17 | Nmda-рецепторен антагонист с антимикробна активност |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG67555B1 (bg) |
-
2020
- 2020-03-17 BG BG113103A patent/BG67555B1/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG67555B1 (bg) | 2023-07-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6178777B2 (ja) | ネクロトーシスの小分子阻害剤 | |
| US20220281814A1 (en) | Hdac6 inhibitors and uses thereof | |
| Khan et al. | Syntheses of a library of molecules on the marine natural product ianthelliformisamines platform and their biological evaluation | |
| CN114456160B (zh) | 一种具有抗耐药菌活性的含噁二唑-吡啶季铵盐侧链截短侧耳素衍生物及其制备方法与应用 | |
| US20230331679A1 (en) | Naphthalene monoimide compounds and methods thereof | |
| CN111170884B (zh) | 一类水杨酰胺类化合物、其制备方法和用途 | |
| Li et al. | Synthesis and bioactivities of new N-terminal dipeptide mimetics with aromatic amide moiety: Broad-spectrum antibacterial activity and high antineoplastic activity | |
| CN109265362A (zh) | 一类2,5-二羟基对苯二甲酰胺类化合物、其制备方法和用途 | |
| KR20120098745A (ko) | 치환된 피라졸로피리미딘의 결정질 형태 | |
| BG113103A (bg) | Nmda-рецепторен антагонист с антимикробна активност | |
| Pańczyk et al. | Synthesis and anticonvulsant activity of phenoxyacetyl derivatives of amines, including aminoalkanols and amino acids | |
| CN110698445B (zh) | 一类3-胺烷基苯酞类化合物、其制备方法和用途 | |
| CN113956233B (zh) | 一种酰胺类化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用 | |
| CN105646439A (zh) | 一类抗真菌药物增效剂及其制备与应用 | |
| CN113372296A (zh) | 用于抑制多重耐药的金黄色葡萄球菌的硒啉类化合物及用途 | |
| WO2011063615A1 (zh) | 大环酰胺化合物、其药物组合物、其制备方法与应用 | |
| CN110003034A (zh) | 一类羟基氟比洛芬曼尼希碱类化合物、其制备方法和用途 | |
| Chaudhary et al. | Synthesis and investigation of anthelmintic, antibacterial and antifungal activity of 3, 3-diphenyl propanamide derivatives | |
| Sharma et al. | Synthesis and antibacterial evaluation of novel fluoroquinolone derivatives | |
| CN117105810B (zh) | 一种具有广谱抗菌活性的化合物及其抗菌组合物 | |
| WO2024024961A1 (ja) | ２（１ｈ）－ピリジンイミン誘導体 | |
| CN115160213B (zh) | 一种大黄酸吡啶季铵盐类化合物及其合成方法和应用 | |
| Dahiya et al. | Synthesis and antimicrobial screening of some novel halogenated phenoxyacetyl amino acid and peptide analogs | |
| Akbaş et al. | A novel approach to determine anti-proliferative, anti-migratory and anti-microbial properties of 2-phenylethylammonium carboxylate molecular salts | |
| Jilariya | SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF NOVEL SULFONAMIDES DERIVATIVES OF 4-(4-AMINOPHENYL) MORPHOLIN-3-ONE AND ITS ANTIMICROBIAL ACTIVITY |