BG111169A - Високочувствителни имунохроматографски системи с магнитни наночастици и флуоресцентни маркери - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до имунохроматографска система за определяне на концентрацията на различни компоненти в течни среди, която е предназначена за анализ на един или няколко компонента (антигени) в една и съща проба от храни, биологични течности, води, екстракти от почви и др. Антигенът от пробата се свързва с излишък от специфично антитяло, което предварително е имобилизирано върху модифицирани магнитни наночастици. Имунохроматографската тест лента се потапя в сместа, образуваните конюгати се придвижват по хроматографски механизъм и достигат до адсорбираните конюгати антигени-флуоресцентни багрила на конюгатната подложка. Последните се свързват с незаетите активни центрове на антитялото, получените конюгати продължават да се движат по модифицираната мембрана и в края на мембраната се задържат от постоянен магнит. Задържаните конюгати на тестовата линия се възбуждат с лъчение от лазерни или LED източници със съответна възбуждаща дължина на вълната, отговаряща на възбуждащата честота на използваните флуоресцентни багрила, свързани с конюгатите. Емитираната светлина се обработва оптически и се филтрира от интерферентни тънкослойни ивични филтри. Филтрираният монохроматичен светлинен поток попада върху чувствителен фотодиод или друг тип високочувствителен фотоприемен елемент. Сигналът се преобразува и подава в компютърна система за изразяване на концентрацията на наличния в пробата антиген. Имунореакцията при антигени с малка молекулна маса (антибиотици) протича на конкурентен принцип и отговорът е обратно пропорционален на концентрацията на анализирания компонент (т.е. при присъствие на повече антиген сигналът е по-нисък, отсъствието на антиген дава висок сигнал). 1 претенция, 5 фигури

Description

Наименование^йа изобретението

Високочуствителни имунохроматографски системи с магнитни наночастици и флуоресцентни маркери

Област на техниката

Производство на уреди и апарати за измерване, изпитание и навигация № 26.51 от Класификацията на икономическите дейности в Република България.

Предишно състояние на техниката

Разработени са редица цветни имунохроматографските тестове на база визуално и абсорбционно измерване, но те осигуряват слаба чуствителност и точност. Известно е, че флуоресцентното измерване подобрява чувствителността с 1-2 порядъка в сравнение с измерването на цвят. При флуоресцентното измерване границата на откриваемост зависи от броя на генерираните флуоресцентни фотони, вместо промяната на цвета на наночастици както е при абсорбционни тест ленти.

Едни от най-важните елементи на една имунохроматографска система са маркерите. Маркерите са цветни или флуоресцентни наночастички с размер 15-800 nm, позволяващи безпрепятствено преминаване през мембранния носител. Цветните наночастиците са колоидно злато или оцветен латекс, по-рядко се използват, въглерод или липозоми [1,2]. Ензимите също намират приложение като маркери, но е необходимо допълнително да се добави хромоген [3]. Прилагат се и флуоресцентни багрила директно свързани към антитяло [4] или латексови частици импрегнирани с флуоресцентни багрила [4]. В литературата няма данни за използването едновременно на магнитни наночастици и флуорофор при получаването на имунохроматографски тестове. Предварителното модифициране на магнитните наночастици с подходящ полимер ( хитозан, полиетиленимин) ще доведе до въвеждане на активни групи на повърхността на частиците, необходими за провеждане на имобилизацията на антитялото върху тях. Прилагането на магнитни наночастици ще осигури идеално сепариране и пречистване на маркираните антитела с помощта на магнитно поле, висок имобилизационен добив на антитялото върху голямата специфична С повърхност на наночастиците и съответно до подобрена чувствителност на теста. Добавянето на флуоресцентното багрило като маркер ще доведе до прецизно количествено измерване и подобрена чувствителност на анализа.

Мембранният носител също е важен елемент на имунохроматографските тестове. Те се изработват от нитроцелулоза, полиамид, полисулфон и полиетилен [1,2]. Хидрофилността и размера на порите на мембранната подложка влияят съществено върху движението на потока. За тази цел в редица публикации мембраните С се обработват предварително с повърхностно активни вещества или други химични реагенти [1,2]. Подобряването на тези два параметъра може да се осъществи чрез две нови модификации. Модификацията с плазма увеличава хидрофилността и запазва порестата структура на мембраната. Получаването на наноструктурирана мембрана посредством нанасяне на втори полимерен слой, осигурява контролиран размер на порите, добра хидрофилност и значително количество активни групи водещи до висока степен на имобилизация на биоагенти. Тези две модификации ще доведат до намаляване на времето за протичане на анализа вследствие увеличаване скоростта на движение на потока, намаляване на неспецифичната адсорбция на повърхността на мембраната и подобряване на имобилизационния добив на реагентите на тестовата и контролна линия на имунохроматографските системи, както и подобряване на чувствителността на анализа.

Имунохроматографските тест ленти имат универсален характер и само с промяната на антитялото или рецептора те могат да се прилагат за анализ на различни компоненти в биологични течности, в храни, води и други. Определянето на ниски концентрации от антибиотици в мляко е много важен въпрос. Антибиотиците са ниско молекулни съединения и за тях е подходящ конкурентния w имунологичен метод. Известни са редица експресни имунохроматографски тестове за определя концентрацията на антибиотици в мляко с маркирани антитела или рецептори. Тестовете с рецептори са по-бавни и изискват инкубиране при 50°С [5,6]. Всички посочени имунохроматографски тестове използват като маркери колоидни златни частици или оцветени латексови частици [5-7]. Освен това тези тестове се предлагат само с визуална и полуколичествена детекция чрез ССД камера. Много малко са имунохроматографските тестове за мултианализ. За определяне едновременно на три вида антибиотици (беталактами, сулфонамиди и тетрациклини) в една и съща проба е известна имунохроматографска система β-S.T.A.R, от USB Bioproducts, Belgium описана в www.wikipatents.com/US-Patent- 5434053, [6] базираща се на реакцията на специфични антисеруми и рецептори, конюгирани със златни частици и съответните антибиотици. Остатъка от несвързаните антитела и рецептори се придвижват по мембраната и след това се задържат на тестовата линия от конюгата антиген-протеин. За по добро визуализиране близо до тестовата линия има и контролна линия, съдържаща протеин- златни частици. Основният недостатък на всички публикувани имунохроматографски системи е невъзможността да осигурят количествени измервания, тъй като детекцията е визуална. Освен това всички имунохроматографски тестове имат тестова и контролна линия. При предлаганият от нас вариант с магнитните наночастици и флуоресцентно багрило не е необходимо да има тестова и контролна линии със реагенти и това значително поевтинява теста.

Целта на настоящия патент е разработване на нови високочувствителни наноимунохроматографски системи с прецизна количествена детекция чрез използването на магнитни наночастици и флоресцентни маркери, модифицирана полимерна мембрана и чувствителен флуоресцентен модул.

Техническа същност на изобретението

Задачата е решена чрез създаването на метод в чиято основа лежи имобилизацията на няколко - N на брой (в случая за яснота на изложението три) вида антитела или рецептори (1), (2) и (3) съгласно фигура 1, върху повърхността (4) на модифицирани магнитни наночастици (5) с полимерен филм съдържащ активни групи необходими за имобилизацията на антителата или рецепторите. Количеството на сухите магнитните наночастици с имобилизираните антитела или рецептори в кюветата (9) от фигура 1 са определени така, че да са повече от очакваната максимална концентрация на изследваните компоненти във фиксирания обем на пробата (7) на фигура 2. Следва смесване на магнитните наночастици с имобилизираните антитела или рецептори и течната проба (8), която ще се анализира. Последните се свързват със съответните изследвани компоненти (10), (11) и (12), наречени антигени в пробата. Смесването става в кювета (9). Имунохроматографската система е изградена от няколко компоненти, включващи подложка за проба (13), подложка за конюгат (14), пластмасов държател (16), мембрана (17), която съдържа улавящи реагенти и адсорбираща подложка (18), (фиг.З). Подложката (14) съдържа лиофилизирани конюгати от идентични три антигена свързани с три различни флуоресцентни багрила, намиращи се в поле (15). Тестът се потапя в кювета (9) и образуваните конюгати (25) в кюветата се предвижват към втората подложка съдържаща трите конюгати (антиген-флуоресцентно багрило), (15). (фиг.4). Последните се свързват към свободните активни центрове на антителата и се придвижват по модифицираната мембрана (26, 27, 28). В края на мембраната постоянен магнит (29) задържа магнитните конюгати (30) и се осветяват с три различни лазерни или LED източници със съответните възбуждащи дължини (31, 32, 33), отговарящи на възбуждащите дължини на вълните на трите различни флуоресцентни багрила, свързани с конюгатитемагнитни наночастици. Последните започват да фосфоресцират с дължини на вълните съответстващи на свързаните конюгати-багрила към магнитните наночастици. Колкото количеството на антигена в пробата е по-голямо, по-малко количество конюгат антигенфлуоресцентно багрило се свързва с имобилизирания рецептор или антитяло и светлинната емисия е по слаба. Излъченото от фосфоресценцията лъчение се филтрира и фокусира от специална оптична система (34) върху три отделни фотодиода (35) или друг тип високочуствителни фотоприемни елементи за съответните три дължини на вълните. Аналоговите сигнали се преобразуват в цифрови и постъпват в компютърна система за интерпретация чрез специализиран софтуер.

Предимствата на изобретението са:

1. Идеална сепарация на образуваните конюгати модифицирани магнитни наночастици-антитяло или модифицирани магнитни наночастици-рецептор благодарение на магнитните наночастици и приложеното магнитно поле.

........

2. Избягване ползването на тестова и контролна линии, съдържащи скъпи реагенти, поради опростеното задържане на магнитните конюгати с постоянен магнит.

3. Висока чувствителност на имунохроматографския тест благодарение на голямата специфична повърхност на магнитните наночастици, водеща до висок имобилизационен добив на антитялото (рецептора).

4. Ниска граница на откриваемост и висока чувствителност на имунохроматографските системи, доминираща над всички останали тестове, поради използването на маркери С флуоресцентни багрила.

5. Бърз анализ, благодарение на високата скорост на потока през модифицираната мембрана и бързата кинетична реакция поради добрата контактна повърхност между магнитните наночастички с имобилизирано антитяло или рецептор и антигена.

6. Намаляване на неспецифичната адсорбция вследствие на приложената нова модификация на мембраната.

7. Прецизна количествена детекция гарантирана от q разработения чувствителен флуоресцентен модул.

8. Проста манипулация, при което не са необходими измиващи процедури.

9. Провеждане на мултианализ благодарение на едновременно използване на няколко различни антитела или рецептори и различни флуоресцентни маркери.

10. Имунохроматографският тест и портативния, компактен флуоресцентен детектор могат да се използва в полеви условия и да се проведе анализ в реално място и реално време.

11. Предлаганата имунохроматографската система има универсален характер и може да се използва за анализ на антибиотици, микробни клетки, хормони, токсини и други компоненти в проби от мляко, млечни продукти, храни, биологични течности, води и др.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 - Показана е структурата на магнитните наночастици с имобилизираните антитела или рецептори.

Фигура 2 - Показано е взаимодействието и свързването на имобилизираните антитела или рецептори върху магнитните наночастици и антигените в анализираната течна проба.

Фигура 3 - Представени са отделните елементи на имунохроматографския тест.

Фигура 4 - Показано е потапянето на теста в кюветата, движението на частично свързаните конюгати от кюветата по теста, свързването на конюгатите антигени-флуоресцентните багрила със свободните активни центрове на антителата и задържане на магнитните конюгати от постоянен магнит.

Фигура 5. Осветяване с три различни лазерни или LED източници със съответните възбуждащи дължини, отговарящи на възбуждащите дължини на вълните на трите различни флуоресцентни багрила, свързани с конюгатите-магнитни наночастици и детектиране на сигналите.

Примери за изпълнение

Съгласно фиг.1 лиофилизираните имобилизирани три вида антитела или рецептори (1), (2) и (3) върху магнитни наночастици (5), покрити с хитозанов слой (4), се поставят в кювета (9). Съгласно фиг. 2 след това към обема на имобилизираните рецептори или антитела се накапва с микропипета (8), или автоматизиран дозатор изследваната проба (7). Антигените (10), (11) и (12), съдържащи се в пробата се свързват селективно към съответните рецептори или антитела, но остават незаети активни центрове в последните. Веднага С след това в кюветата (9) се потапя имунохроматографски тест, състоящ се от подложка за проба (13), подложка за конюгат (14), локация (15) на конюгати флуоресцентни багрила-антигени (19.20,21,22,23, 24), пластмасов държател (16), мембрана (17) и адсорбционна подложка (18). Частично свързаните конюгати се предвижват през подложката (13), достигат до конюгатите антигенифлуоресцентни багрила разположени в (15) и те се свързват със свободните активни центрове на антителата. Получените конюгати се придвижват по мембраната (17) и се задържат от постоянния магнит £ (29) в края на мембраната (30). Лазерни системи (31), (32) и (33) или

LED източници осветяват задържаните конюгати със съответните възбуждащи дължини, отговарящи на възбуждащата светлина на трите различни флуоресцентни багрила. Последните започват да емитират лъчение с дължини на вълните съответстващи на емисиите на флуоресцентните багрила от конюгатите (магнитни наночастицирецептор-антиген-флуоресцентно багрило). Колкото количеството на антигена в пробата е по-голямо, по-малко количество конюгат антигенфлуоресцентно багрило се свързва с имобилизирания рецептор или антитяло и светлинната емисия е по слаба. Емитираната светлина минава през оптичен блок (34), филтрира се и попада на чуствителен

............

фотодиод (35). Полученият флуоресцентен сигнал е обратнопропорционален на концентрацията на антигена в пробата. Сигналите от трите фотодетектора се усилват и след това се преобразуват от аналогово цифрови преобразователи и постъпват на входа на компютърната система.

Claims (1)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   Разработване -на- Ймунохроматографска система за определяне концентрацията на различни компоненти-(остатъци от антибиотици, микробни клетки, хормони, пестициди и други токсините течни среди, характеризираща се с използването на три имобилизирани антитела върху модифицирани магнитни наночастици за провеждане на конкурентна имунореакция с три антигена (анализираните компоненти) в пробата и имобилизираните конюгати антигенифлуоресцентни багрила, придвижване на конюгатите по модифицираната мембрана, задържане на последните с постоянен магнит и с последващо спектрофотометриране на собственото светене на фосфоресциращите маркирани конюгати, в следствие на оптическо възбуждане, в резултат на което се определя концентрацията на изследваните компоненти в пробата. Имунореакцията при антигени с малка молекулна маса (антибиотици) протича на конкурентен принцип и отговорът е обратно пропорционален на концентрацията на анализирания компонент (т.е.

   при присъствие на по-голямо количество антиген сигналът е по-нисък; отсъствието на антиген дава висок сигнал).