BG107168A

BG107168A - Използване на азалидни антибиотични състави за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна инфекция в бозайници

Info

Publication number: BG107168A
Application number: BG107168A
Authority: BG
Inventors: Wayne BOETTNER; Peter CANNING
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2002-10-03
Publication date: 2003-07-31
Also published as: SK14882002A3; HUP0300585A3; GT200100063A; IL152421A0; ZA200208603B; UY26678A1; CN1227258C; US20020019353A1; MXPA02010586A; NO20025134D0; AP2002002652A0; TNSN01063A1; NO20025134L; HUP0300585A2; EA200200995A1; CZ20023409A3; BR0110382A; EP1276747A1; JP2004516233A; CA2407448A1

Abstract

Изобретението се отнася до използване на азалидниантибиотични състави в методи за лечение или предотвратяване на бактериални или протозойни инфекциипри бозайници чрез прилагане на еднократна доза от антибиотичен състав, съдържащ смес от азалидни изомери с формули@@и фармацевтично приемлив пълнител. Изобретението се отнася и до методи за увеличаване на толерантността в акутно или хронично инжекционно място при бозайници чрез прилагане на еднократна доза от антибиотичен състав, съдържащ смес от азалидни изомери и фармацевтично приемлив пълнител, както и до набор, включващ антиобиотичен състав, съдържащ смес от азалидни изомери, фармацевтично приемлив пълнител и предписания за използване в доза за еднократно приложение.

Description

Област на приложение

Това изобретение се отнася до методи за използване на фармацевтичен състав съдържащ смес от изомери на азалидно антибиотично съединение, за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна инфекция в бозайници. Изобретението допълнително се отнася до методи за увеличаване толерантността в акутно или хронично инжекционно място в бозайник, включващ прилагане на смес от изомери на азалиден антибиотик. Изобретението се отнася също до набор, състоящ се от смес от изомери на азалиден антибиотик, фармацевтично приемлив пълнител и предписания за използване в доза за еднократно приложение.

Предшестващо състояние на техниката

Макролидните антибиотични средства, действащи срещу широко множество от бактериални и протозойни инфекции в бозайници, риби и птици, са били докладвани преди (виж, например Международни патентни публикации WO 98/56802 и WO 99/12552). Тези съединения обикновено имат макроциклен лактонен пръстен с 12 до 22 въглеродни атома, към който са свързани един или повече захарни остатъци. Макролидните антибиотици действат на 50S рибозомалната подединица до инхибиране на протеиновия синтез в микроорганизмите. Примери на макролидни антибиотици включват линкомицин, азитромицин, който е производно от еритромицин А, и други азалидни съединения.

Развитието на фармацевтичните състави, съдържащи азалидни съединения като активен ингредиент, се явява значително предизвикателство. Някои азалиди са способни на изомеризация в разтвор. Следователно, производството на възпроизводим антибиотичен състав съдържащ единичен изомер или изомери с постоянно отношение, е било трудно. Второ, състав съдържащ определено количество от отделен азалиден изомер, може да се измени с течение на времето. Трето, лактоновият пръстен и захарите на азалидите са лесно хидролизиращи се даже в среди с умерено киселинно или основно pH, намалявайки активността и срока на годност на един антибиотичен състав.

Предмет на настоящото изобретение е предоставянето На методи за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна. инфекция в бозайници, като се използват антибиотични състави, които преодоляват гореспоменатите недостатъци.

Добитъкът, който е стресиран от промяна в заобикалящата го среда или храна, или от това, че е затворен с нови животни, носещи чужди патогени, е особено податлив на заболяване. Стресът се среща обикновено когато животните са продадени за пръв път и следователно е известно, че тези животни са в риск. Много болести са високо заразни и могат да причинят висока смъртност и висока степен на заболеваемост в едно стадо. Тъй като повечето антибиотици проявяват тенденция да; имат къса продължителност на живот in vivo, често се изискват многочислени дози за предотвратяване на заболяването. В допълнение, болните животни изискват повторение на дозите от тези лекарства.

Съответно предмет на настоящото изобретение е предоставянето на методи за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна инфекция в бозайници, състоящи се в прилагането на еднократна доза от смес от изомери на азалидно антибиотично съединение.

Цитирането на каквато и да е препратка тук няма д? бъде тълкувано като означаващо, че такава препратка е предшестващо състояние на настоящото изобретение.

Кратко описание на изобретението

В първо изпълнение, настоящото изобретение се отнася до метод за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна инфекция в бозайник, състоящ се в прилагане на бозайника, нуждаещ се от такова лечение или предотвратяване, на еднократна доза от ефективно количество от състав, съдържащ: (а) смес от съединение с формула (I):

(II):

или негова фармацевтично приемлива сол, и съединение с формула

или негова фармацевтично приемлива сол, където и двете R групи са идентични и са избрани от групата, състояща се от водород, СгСюалкилова група с права или разклонена верига и С₃>С₇циклоалкилова група; и (Ь) фармацевтично приемлив пълнител.

Във второ изпълнение, настоящото изобретение се отнася до метод за увеличаване толерантността в акутно или хронично инжекционно място в бозайник, състоящ се в прилагане на бозайник, нуждаещ се, от това, на еднократна доза с ефективно количество от състав, съдържащ: (а) смес от съединение с формула (I), или негова фармацевтично приемлива сол, и съединение с формула (II), или негова фармацевтично приемлива сол; и (Ь) фармацевтично приемлив пълнител.

В трето изпълнение, настоящото изобретение се отнася до набор, състоящ се от: (а) (1) смес от съединение с формула (I), или негова фармацевтично приемлива сол и съединение с формула (II),· или негова фармацевтично приемлива сол; и (2) фармацевтично приемлив пълнител; и (Ь) предписания за използване в доза за еднократно приложение.

Настоящото изобретение може да бъде разбрано по-пълно чрез отнасяне към подробното описание и пояснителните примери, които са предназначени да илюстрират неограничаващи изпълнения на изобретението.

Подробно описание на изобретението

Формула I Формула II

Настоящото изобретение се отнася до методи за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна инфекция в бозайници, състоящ се в прилагане на еднократна доза с ефективно количество от фармацевтичен състав, съдържащ смес от съединение с формула (I) или негова фармацевтично приемлива сол, и съединение с формула II, или негова фармацевтично приемлива сол, където R е дефиниран по-горе; и фармацевтично приемлив пълнител. За предпочитане R е н-пропил.

Съединенията с формула I, които са 15-членни азалиди, са изомерни по отношение на съединенията с формула II, които са 13-членни азалиди. Съответно, както е използван тук, терминът “смес от изомери” се отнася до смес от съединение с формула I или негова фармацевтично приемлива сол, и неговия съответен 13-членен азалиден изомер, който е съединение с формула II, или негова фармацевтично приемлива сол. В предпочитано изпълнение сместа от изомери съдържа съединение с формула I и съединение с формула II в съотношение от около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 %, съответно.

Химичното наименование на съединението с формула I,, в която R е н-пропил (Ν-(Η-προπππ) изомера Г), е ¹ (2R,3S,4R,5R,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-13-((2.6^AeoKCH-3-O-MeTHn-

3-О-метил-4-С-((пропиламино)-метил)-а-Ьрибо-хексопиранозил)окси-2етил-3,4,10-трихидрокси-3,5,8,10,12,14-хексаметил-11-((3,4,в-тридеокси-3(диметиламино)-р-0-ксило-хексопиранозил)окси)-1-окса-6азациклопентадекан-15-он.

Химичното наименование на съединението с формула II, в която R е н-пропил (“Ν-(Η-προπκπ) изомера ΙΓ), е (3R,6R,8R,9R,10S.11 S,12R)-11 -<(2,6-дидеокси-3-С-метил-3-О-метил-4С-((пропиламино)метил-а-Ьрибо-хексопиранозил)окси)-2-((1 R,2R)-1,2дихидрокси-1 -метилбутил)-8-хидрокси-3,6,8,10,12-пентаметил-9-((3,4,6тридеокси-3-(диметиламино)-р~0-ксило-хексопиранозил)окси)-1-окса-4азациклотридекан-13-он.

Съединение с формула I може да бъде образувано от реакция на транслактонизация на съединение с формула II. Подобно, съединение с формула II може да бъде образувано от реакция на транслактонизация на съединение с формула I.

Методи за получаване на съединения с формула I, в която R е Н или С_гС₁₀алкил, са описани в Международна публикация № WO 98/56802, включени тук чрез препратка. Методите, разкрити в Международна публикация № WO 98/56802, могат също да бъдат използвани за получаване на съединения с формула I, в която R е Сз-С/циклоалкил, особено чрез избиране на желан С₃-С₇циклоалкиламин вместо С_ГС_1Оалкиламин или амониев еквивалент. Методи за получаване на съединения с формула II са описани тук. Съединенията с формула I и формула II са активни антибиотични средства.

Състав, съдържащ съединение с формула I и съединение с формула II в съотношение от около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 % може да бъде получен бързо като се използват методите разкрити тук, независимо от тяхното изходно отношение. Счита се, че съотношението: около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 % на съединение с формула I или негова фармацевтично приемлива сол, към съединение с формула II или негова фармацевтично приемлива сол, представлява равновесна смес от изомери. Съответно терминът равновесна смес от изомери както е използван тук, се отнася до сместа от изомери, в която съединение с формула I; или негова фармацевтично приемлива сол, и съединение с формула II, или негова фармацевтично приемлива сол, са в отношение от около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 %, съответно. Един антибиотичен състав, съдържащ равновесната смес от изомери, може да бъде получен последователно и С предоставя стандарт за тестване или използване от потребителя. Така състав, съдържащ равновесната смес от изомери е силно желан.

Примери на СгС₁₀алкилови групи с права или разклонена верига включват, но не са ограничени до метил, етил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил,

2-бутил, 2-метил-1-пропил, 2-метил-2-пропил, 1-пентил, 2-пентил, З-пентил, 2-метил-1-бутил, З-метил-1-бутил, 2-метил-З-бутил, 2,2-диметил-1-пропил,

1-хексил, 2-хексил, 3-хексил, 2-метил-1-пентил, З-метил-1-пентил, 4-метил-

1-пентил, 2-метил-2-пентил, З-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 2,2диметил-1-бутил, 3,3-диметил-1-бутил, 2-етил-1-бутил, 1-хептил, 2-хептил,

З-хептил, 2-метил-1-хексил, З-метил-1-хексил, 4-метил-1-хексил, 2-метил-2хексил, З-метил-2-хексил, 4-метил-2-хексил, 2,2-диметил-1-пентил, 3,3

димвтил-1-пентил, 4,4-диметил-1-пентил, 1-октил, 2-октил, 3-окТил, 4-октил,

2-мвтил-1-хептил, З-метил-1-хептил, 4-метил-1-хептил, 2-метил-2-хептил, 2,2-диметил-1-хексил, 2-етил-1-хексил, З-етил-1-хексил, 4-етил^1-хексил, 1нонил, 2-нонил, 3-нонил, 4-нонил, 2-метил-1-октил, З-мвтил-1-октил, 4метил-1-октил, 5-метил-1-октил, 2,2-диметил-1-хептил, 2-етил-1-хептил, 3етил-1-хептил, 4-етил-1-хептил, 1-децил, 2-метил-1-нонил, З-метил-1-нонил,

4-метил-1-нонил, 5-метил-1-нонил, 2,2-диметил-1-октил, 2-етил-1-октил, 3етил-1-октил, 4-етил-1-октил и 5-етил-1-октил.

Примери на С₃-С₇ циклоалкилови групи включват, но не са ограничени до циклопропилови, циклобутилови, циклопентилови, циклохексилови и циклохептилови групи.

Изразът “фармацевтично приемлива сол(и)”, както е използван тук, включва, но не е ограничен до соли на основни аминогрупи, които присъстват в съединенията, използвани в настоящите състави. Съединенията, използвани в методите от настоящото изобретение, които са основни по естеството си, са способни да образуват широко множество соли с разнообразни неорганични и органични киселини. Киселините, които могат да бъдат използвани за получаване на фармацевтично приемливи киселинни присъединителни соли на такива основни съединения са тези, които образуват нетоксични киселинни присъединителни соли, т.е., соли съдържащи фармакологично приемливи аниони, включително, но не ограничено до оцетна киселина, бензенсулфонова киселина, лимонена киселина, бромоводородна киселина, солна киселина, D- и L-млечна киселина, метансулфонова киселина, фосфорна киселина, янтарна киселина, сярна киселина, D- и L-винена киселина, р-толуенсулфонова киселина, адипинова киселина, асларагинова киселина, камфорсулфонова киселина, 1,2-етандисулфонова киселина, лаурилсярна киселина, глюкохептонова киселина, глюконова киселина, З-хидрокси-2-нафтоена киселина, 1-хидрокси-2-нафтоена киселина, 2-хидроксиетансулфонова киселина, ябълчена киселина, лигава киселина, азотна киселина, нафталенсулфонова киселина, палмитинова киселина, D-глюкарова киселина, стеаринова киселина, малеинова киселина, малонова киселина, фумарова киселина, бензоена киселина, холева киселина, етансулфонова киселина, глюкуронова киселина, глутамова киселина, хипурова киселина, лактобионова киселина, лизинова киселина, бадемена киселина, нападизилова киселина, никотинова киселина, полигалактуронова киселина, салицилова киселина, сулфосалицилова киселина, триптофанова киселина, и техни смеси. Неорганични киселини измежду горните, за предпочитане са използвани във формата на техните водни разтвори, почфедпочитано, неорганичните киселини са използвани във формата на техни разредени, напр., <2М, водни разтвори. Органични киселини измежду горните могат да бъдат използвани във формата на разредени водни или органични разтвори, при което органичният разтвор съдържа разтворител, който достатъчно разтваря и органичната киселина, и съединението с формула I.

Съединенията, полезни в методите от настоящото изобретение могат да образуват фармацевтично приемливи соли с разнообразни аминокиселини, в допълнение към киселините, споменати по-горе.

Съединение с формула II може да бъде получено чрез взаимодействие на съединение с формула I с киселина или основа.

Киселини полезни в това отношение включват, но не са ограничени до неорганични киселини, такива като солна, бромоводородна, йодоводородна, флуороводородна, сярна и азотна киселини; и органични киселини, такива като мравчена, оцетна, трифлуорооцетна, метансулфонова, трифлуорометансулфонова, бензенсулфонова и р-толуен-сулфонова киселини. Неорганичните киселини за предпочитане са използвани, във формата на техни водни разтвори; по-предпочитано, неорганичните киселини са използвани във формата на техни разредени, напр., <2М, водни разтвори. Органичните киселини могат да бъдат използвани във формата на разредени водни или органични разтвори, при което органичният разтвор съдържа разтворител, който достатъчно разтваря и органичната киселина, и съединението с формули I и II.

Основите, използвани в тази връзка, включват неорганични основи, такива като хидроксиди на натрия, лития, калия, магнезия или калция; карбонати и бикарбонати на натрия, лития или калия; и карбонати на магнезия или калциев бикарбонат или карбонат. Полезни са също неорганични основи като триетиламин, етилдиизопропиламин, пиридин, 4диметиламинопиридин, колидин, лутидин и техни смеси. За предпочитане, неорганичните основи са използвани във формата на разредени водни разтвори. За предпочитане, органичните основи са използвани във формата на разредени органични разтвори. Неорганичните или органични основи са предпочитани пред неорганичните или органични киселини.

Съединенията с формула I могат да бъдат добавени към киселината или основата, или обратното. И по единия, и по другия начин, взаимодействието на съединенията с формула I с киселината или основата се улеснява чрез нагряване на смес от съединение с формула I и киселина или основа при температура от около стайна температура до около 100 °C, за предпочитане при температура от около стайна температура до около 60 °C, и по-предпочитано при температура от около 30 °C до около 40 °C. Такова нагряване може да стане за период от около 20 min до около 48 h, за предпочитане за период от около 1 h до около 36 h.

Съединение с формула II или негова фармацевтично приемлива сол, може също да бъде получено чрез нагряване на съединение с формула I в присъствието на разтворител.

Такова нагряване се осъществява при температура.от около стайна температура до около 100 °C, за предпочитане при температура от около стайна температура до около 60 °C, и по-предпочитано при температура от около 30 °C до около 40 °C. Нагряването може да стане за период от около 20 min до около 48 h, за предпочитане за период от около 1 h до .около 36 h.

Полезни разтворители са тези, които достатъчно разтварят съединенията с формула I и включват, но не са ограничени до нисши алканоли, диетилов етер, ацетон, ацетонитрил, тетрахидрофуран, етилацетат, бензен, толуен, хлороформ, метиленхлорид, диметилформамид, диметилсулфоксид, N-метилпиролидинон и подобни, и техни смеси.

Все пак, превръщането на съединения с формула I в съединения с формула II става по-бързо в разтворителна система, която съдържа протон разтворител. Полезни протни разтворители включват, но не са ограничени до нисши алканоли, такива като метанол, етанол, н-пропанол, изо-пропанол, н-бутанол, изобутанол и втор.-бутанол; фенолни съединения, като фенол, халофеноли, нафтоли и подобни; вода; и техни смеси. Трябва да бъде отбелязано обаче, че протният разтворител не е карбоксилна киселина.

Когато разтворителната система съдържа протон разтворител, протният разтворител присъства в количество от около 10 % до около 75 % обемни, за предпочитане в количество от около 25 % до около 60 % обемни.

Ще бъде разбрано от специалиста в областта, че протният разтворител ще бъде смесваем в разтворителя, в който съединението с формула I се нагрява, когато се нагрява при температурата на нагряване.

За предпочитане, разтворителната система съдържа ацетонитрил. Попредпочитано, разтворителната система допълнително съдържа нисш алканол или вода. Когато разтворителната система съдържа нисш алканол, нисшият алканол е за предпочитане метанол.

Съединенията с формула II могат да бъдат изолирани или пречистени със стандартни средства, напр., прекристализация; хроматография с използване на колона, препаративна плака или устройство CHROMATOTRON*; или с други средства, известни на специалистите в областта. Когато се използва хроматография за изолиране или пречистване на съединенията с формула II, изобретателите са открили, че една елуентна система, която съдържа въглеводороден разтворител и органичен амин осигурява резултати с повишено разделяне, по отношение на другите елуентни системи. Въглеводородните разтворители полезни в това, отношение включват, но не са ограничени до пентан, хексан или хексани, хептан, петролев етер, бензен, толуен, ксилени и подобни. За предпочитане, въглеводородният разтворител е хексан или хексани. Полезни органични амини включват, но не са ограничени до диетиламин, триетиламин, етилдиизопропиламин, пиридин, 4-диметиламинопиридин, колидин, лутидин и техни смеси. За предпочитане, органичният амин е диетиламин.

Благоприятно, елуентната система, която съдържа въглеводороден разтворител и органичен амин, допълнително съдържа полярен органичен разтворител. Добавянето на полярния органичен разтворител към елуентната система води до по-добро разделяне на съединенията с формула II от други съединения, спрямо елуентна система, която не съдържа полярен органичен разтворител. Полезни полярни органични разтворители включват, но не са ограничени до нисши алканоли, ацетонитрил, диметилформамид, диметилсулфоксид, N-метилпиролидинон,

1,4-диоксан, тетрахидрофуран, диетилов етер, етилацетат и подобни. За предпочитане, полярният органичен разтворител е ацетонитрил. Попредпочитано, елуентната система съдържа хексани, диетиламин и ацетонитрил. '«

Пропорциите на въглеводородния разтворител, органичния амин и по избор полярния органичен разтворител могат да варират, но обикновено съотношението на въглеводородния разтворител към органичния амин ще варира от около 10:1 до около 1:1, за предпочитане около 7:1 до около 2:1. Когато елуентната система включва допълнително полярен органичен разтворител, елуентната система ще съдържа полярния органичен разтворител при между около 1 % до около 15 % обемни, за предпочитане при между около 1.5 % до около 10 % обемни.

Фармацевтичните състави полезни за методите от настоящото изобретение съдържат смес от изомери заедно с подходящо количество от фармацевтично приемлив пълнител така, че да се осигури формата за подходящо прилагане на бозайник.

В специфично изпълнение, терминът “фармацевтично приемлив означава одобрен от регулаторна агенция на Федералното или щатско правителство или изброен в US Фармакопеята или друга общопризната фармакопея, за използване при бозайници. Терминът “пълнител се отнася до разредител, адювант, ексципиент или носител, с който сместа от изомери се прилага. Такива фармацевтични пълнители могат да бъдат течности, като вода и масла, включително тези от петролен, животински, растителен или синтетичен произход като фъстъчено масло, соево масло, минерално масло, сусамово масло и подобни. Фармацевтичните пълнители могат да бъдат физиологичен разтвор, акациева смола, желатин, тесто от нишесте, талк, кератин, колоидален силициев диоксид, урея й подобни. В допълнение могат да бъдат използвани спомагателни, стабилизиращи, сгъстяващи, омазняващи и оцветяващи средства. Когато се прилагат на бозайник, съставите от изобретението и фармацевтично приемливите пълнители са за предпочитане стерилни. Водата е предпочитан пълнител, когато съставите от изобретението се прилагат интравенозно. Физиологични разтвори и водни разтвори на декстроза и глицеролови разтвори също могат да бъдат използвани като течни пълнители, особено за разтвори за инжектиране. Подходящи фармацевтични пълнители включват също ексципиенти като нишесте, глюкоза, лактоза, захар, желатин, малц, ориз, брашно, варовик, силикагел, натриев стеарат, глицерол моностеарат, талк, натриев хлорид, сухо обезмаслено мляхо, глицерол, пропиленгликол, вода, етанол и подобни. Настоящите състави ако се желае,. могЬт също да съдържат по-малки количества от овлажняващи или емулгиращи средства, или средства за буфериране на pH. В предпочитано изпълнение, фармацевтично приемливият пълнител съдържа: (i) вода; (Н) една или повече киселини, присъстващи в обща концентрация от около 0.2 mmol до около 1.0 mmol за mL от сместа; и (iii) един или повече смесващи се с вода съ-разтворители, присъстващи в количество от около 250 до около 750 mg за mL от състава.

Настоящите състави могат да вземат формата на разтвори, суспензии, емулсия, таблетки, хапчета, пилюли, капсули, капсули съдържащи течности, прахове, формулировки със забавено освобождаване, супозитории, емулсии, аерозоли, спрейове, суспензии или всякаква друга форма, подходяща за използване. В едно изпълнение, фармацевтично приемливият пълнител е капсула (виж напр., патент US № 5 698 155). Други примери на подходящи фармацевтични пълнители са описани в “Remington's Pharmaceutical Sciences от E.W. Martin.

Състави съдържащи една равновесна смес от изомери, които са полезни в настоящото изобретение, могат да бъдат получени както следва. Равновесната смес от изомери се получава от разтвор на сместа от изомери. За предпочитане, сместа от изомери, когато се използва за получаване на равновесната смес от изомери, съдържа съединение с формула I, което е съществено чисто. Под “съществено чист както е използван тук, освен ако не е отбелязано друго, се разбира имащ чистота от поне 97 %. Изобщо, една равновесна смес от изомери се създава чрез нагряване на воден разтвор от сместа от изомери в присъствието на една или повече киселини. В предпочитано изпълнение, воден разтвор от сместа от изомери и една или повече киселини се нагряват до температура от между около 50 °C до около 90 °C, за предпочитане около 60 °C до около 80 °C, за около 0.5 до около 24 h, за предпочитане около 1 до около 10 h, при pH от около 5.0 до около 8.0, за предпочитане около 6.0 до около 8.0. Найпредпочитано, разтвор от сместа от изомери се нагрява до температура от между около 65 °C до около 75 °C за около 1 до около 8 h, при pH от около

6.5 до около 7.5, в присъствието на една или повече киселини. Концентрацията на сместа от изомери за постигане на равновесие може да варира от около 50 mg/mL до около 500 mg/mL, по-предпочитано от около

100 mg/mL до около 300 mg/mL, и най-предпочитано от около 225 mg/mL до около 275 mg/mL от разтвора.

Подходящи киселини полезни за получаване на равновесната смес от изомери включват, но не са ограничени до оцетна киселина, бензенсулфонова киселина, лимонена киселина, бромоводородна киселина, солна киселина, D- и L-млечна киселина, метансулфонова киселина, фосфорна киселина, янтарна киселина, сярна киселина, D- и L-винена киселина, ртолуенсулфонова киселина, адипинова киселина, аспарагинова киселина, камфорсулфонова киселина, 1,2-етандисулфонова киселина, лаурилсярна киселина, глюкохептонова киселина, глюконова киселина, З-хидрокси-2нафтоена киселина, 1-хидрокси-2-нафтоена киселина, 2-хидроксиетансулфонова киселина, ябълчена киселина, лигава киселина, азотна киселина, нафталенсулфонова киселина, палмитинова киселина, D-глюкарова киселина, стеаринова киселина, малеинова киселина,, малонова киселина, фумарова киселина, бензоена киселина, холева киселина, етансулфонова киселина, глюкуронова киселина, глутамова киселина, хипурова киселина, лактобионова киселина, лизинова киселина, бадемена киселина, нападизилова киселина, никотинова киселина, полигаЛактуронова киселина, салицилова киселина, сулфосалицилова киселина, триптофанова киселина и техни смеси. За предпочитане, едната или повече киселини са лимонена и солна киселина. Когато присъства, лимонената киселина е в концентрация от около 0.02 mmol до около 0.3 mmol за mL от разтвора. В едно изпълнение се използва киселинна концентрация от около 0.2 mmol до около 1.0 mmol за mL от разтвора. Без обвързване с някоя теория се счита, че солта, образувана от добавянето на една киселина.към разтвор от сместа от изомери, упражнява буфериращ ефект, тъй като азалидните изомери от своя страна действат като основа. Специалистът в областта ще признае, че изискваното количество киселина за желано pH. ще варира съобразно това, коя киселина е използвана, и че за да се поддържа pH в желания диапазон, може да бъде добавена допълнително киселина и/или основа към разтвора от киселина и сместа от изомери. Подходящите основи включват, но не са ограничени до алкалнометални хидроксиди и карбонати, алкалнометални бикарбонати, и алкалоземни хидроксиди и карбонати. Натриевият хидроксид и калиевият хидроксид са предпочитани; Киселините t и основите описани по-горе, удобно се използват във формата на техните водни разтвори.

Състави съдържащи сместа от изомери са полезни за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна инфекция в бозайник. Съставите са ценни също като междинни съединения за получаването на стабилизирани състави и на стабилизирани равновесни състави.

Методите за приготвяне на стабилизирани състави, които са полезни в методите от настоящото изобретение, включват разреждане на сместа от изомери с един или повече смесващи се с вода органични разтворители (съ-разтворител). Методите за приготвяне на стабилизирани равновесни състави, които също са полезни в методите от настоящото изобретение, се състоят в разреждане на равновесната смес от изомери с един или повече съ-разтворители. Съ-разтворителят не влияе значително на отношението на съединението с формула I и съединението с формула II в съставите, и в действителност запазва техния структурен интегритет. “Запазването на структурния интегритет на съединение с формула I или съединение с формула II както е използван тук, включва, но не е ограничено до, запазване тяхната скорост на хидролиза, например на дескладинозен азалид, и запазване тяхната скорост на образуване на страничен продукт, например на формалдехиден и ацеталдехиден инсерционен продукт, дефинирани понататък. Без обвързване с някоя теория се счита, че разреждането със съразтворител подобрява стабилността на сместа от изомери. Нещо повече, чрез присъствието на съ-разтворител всяка болка, изпитвана при инжектиране на стабилизираните състави или стабилизираните равновесни състави може да бъде по-малка от тази, изпитвана от инжекция на състав, не стабилизиран така. Съ-разтворители полезни за стабилизиране на съставите включват, но не са ограничени до алкохоли като етанол и изопропанол; гликолови етери като диетиленгликол монометилов етер, диетиленгликол бутилов етер, диетиленгликол моноетилов етер и диетиленгликол дибутилов етер; полиетиленгликоли като полиетиленгликол-300 и полиетиленгликол-400; гликоли като пропиленгликол и глицерин; пиролидони като 2-пиролидон и N-метил 2-пиролидой; глицеролформал; диметилсулфоксид; дибутилсебацат; полиоксиетилен сорбитанови естери като полисорбат 80; и техни смеси. За предпочитане съ-разтворителите полезни за стабилизиране на съставите в инжекционни разтвори включват, но не са ограничени до етанол, полиетиленгликоли като полиетиленгликол-300 и полиетиленгликол-400, гликоли като пропилен-гликол и глицерин, пиролидони като 2-пиролидон и N-метил 2-пиролидон, глицеролформал, диметилсулфоксид, полиоксиетилен сорбитанови естери като полисорбат 80 и техни смеси, по-предпочитано, глицеролформал, N-метил

2-пиролидон и пропиленгликол, и най-предпочитано пропиленгликол. В едно изпълнение е използван съ-разтворител в количество от около 250 до около 750 mg за mL от фармацевтичните състави, за да ги стабилизира. В предпочитано изпълнение са използвани около 400 до около 600 mg от съразтворителя за mL от фармацевтичните състави.

В най-предпочитано изпълнение са използвани около 450 до около 550 mg от съ-разтворителя за mL от фармацевтичните състави. ₍

В едно изпълнение, един или повече съ-разтворители се добавят към сместа от изомерите преди установяване на равновесието. В този случай, получената смес се нагрява до температура от между около 50 °C до около 90 °C, за предпочитане около 60 °C до около 80 °C, за околр 0.5 до около 24 h, за предпочитане за около 1 до около 10 h, при pH от около 5.0 до около 8.0, за предпочитане при pH от около 6.0 до около 8.0. В предпочитано изпълнение установяването на равновесието в сместа от изомери се провежда в отсъствието на съ-разтворител, който се добавя към равновесните състави след като те са били охладени до около стайна температура.

След добавянето на съ-разтворителя, pH на получения разтвор може да бъде повторно нагласено за допълнително подобряване стабилността на състава. pH се нагласява с методи, известни на специалистите в областта, като например чрез добавяне на едно количество киселина или основа описани по-горе, напр., като 10 % (т/т) изходен разтвор, и измерване pH на получения разтвор като се използва напр. pH-метър. В едно изпълнение, pH на получения разтвор ако е необходимо се нагласява от около 4.5 до около 7.5, за предпочитане около 5.0 до около 6.0, най-предпочитано, около

5.2 до около 5.6.

Фармацевтичните състави съдържащи смес от изомери и фармацевтично приемлив пълнител, са полезни в методите от, настоящото изобретение. За предпочитане, фармацевтичните състави допълнително съдържат вода, една или повече киселини и един или повече смесващи се с вода съ-разтворители. Количеството на сместа от изомери във фармацевтичните състави варира от около 50 mg за mL от фармацевтичния състав до около 200 mg за mL от фармацевтичния състав. За предпочитане, фармацевтичните състави съдържат от около 75 mg до около 150 mg, попредпочитано, от около 90 до около 110 mg от сместа от изомери за mL от фармацевтичния състав.

Фармацевтичните състави могат още да съдържат допълнително един или повече антиоксиданти. Антиоксидантите запазват скоростта на, или спират, окислителното разлагане на фармацевтичните състави. Подходящите антиоксиданти включват, но не са ограничени до натриев бисулфит, натриев сулфит, натриев метабисулфит, натриев, тиосулфат, натриев формалдехид сулфоксилат. Ι-аскорбинова киселина, ериторбинова киселина, ацетилцистеин, цистеин, монотиоглицерол, тиогликолова киселина, тиомлечна киселина, тиоурея, дитиотреитол, дитисеритреитол, глутатион, аскорбилпалмитат, бутилиран хидроксианизол,. бутилиран

хидрокситолуен, нордихидрогвайаретова киселина, α-токоферол и техни смеси. Специалистите в областта ще признаят, че количеството на антиоксиданта ще се изменя в зависимост от това какъв антиоксидант е използван. В предпочитано изпълнение когато присъства антйоксидантът, той е в количество от около 0.01 mg до около 10 mg за mL от фармацевтичния състав. В по-предпочитано изпълнение, антйоксидантът е монотиоглицерол и присъства в количество от около 1 mg до около 8 mg за mL от фармацевтичния състав. В най-предпочитано изпълнение, антйоксидантът е монотиоглицерол и присъства в количество от около 4 mg до около 6 mg за mL от фармацевтичния състав.

Фармацевтичните състави по избор съдържат един или повече консерванти. Консервантите са полезни за забавяне скоростта на, или спиране, разпространението на микроорганизми, особено когато фармацевтичните състави са изложени на въздуха. Полезните консерванти са: ефективни срещу широк спектър микроорганизми; физично, химично и микробиологично стабилни в продължение на времето на живот на фармацевтичните състави; нетоксични; адекватно разтворими; съвместими с други компоненти от състава; и приемливи по отношение на вкуса и мириса. Подходящите консерванти включват, но не са ограничени до бензалкониев хлорид, бензетониев хлорид, бензоена киселина, бензинов алкохол, метилпарабен, етил па рабе н, пропилпарабен, бутилпарабен, натриев бензоат, фенол и техни смеси. В предпочитано изпълнение, тези един или повече консерванти са избрани от групата, състояща се от бензинов алкохол, метилпарабен, пропилпарабен, комбинация от метилпарабен/пропилпарабен и фенол. Когато присъстват, единият или повече консерванти са в количество от около 0.01 до около 10 mg за mL от фармацевтичните състави. За предпочитане, единият йли повече консерванти е фенол и присъства в количество от около 2.0 до около 5.0 mg за mL, по-предпочитано, от около 2.0 до около 3.0 mg за mL, от фармацевтичните състави. Специалист в областта ще признае, че количеството на консерванта за използване в настоящите състави ще зависи от това, какъв консервант е избран, и че някои консерванти могат да бъдат използвани при по-ниски концентрации, дори по-ниски от около 0.01 mg за mL от фармацевтичните състави.

В едно изпълнение, фармацевтичните състави полезни в методите от изобретението имат pH от около 5.0 до около 7.0 и съдържат: (1) смес от изомери, присъстваща в количество от около 50 mg до около 200 mg за mL от фармацевтичния състав; (2) лимонена киселина присъстваща с концентрация от около 0.02 mmol до около 0.3 mmol за mL от фармацевтичния състав, и по избор едно количество от солна киселина, ефективно за постигане на pH-обхвата; (3) пропиленгликол, присъстващ в количество от около 250 до около 750 mg за mL от фармацевтичния състав;

(4) монотиоглицерол, присъстващ в количество от около 1 mg до около 15 mg за mL от фармацевтичния състав; и (5) вода, присъстваща в количество от около 100 до около 750 mg за mL от фармацевтичния състав. В предпочитано изпълнение, сместа от изомери е една равновесна смес от изомери. В по-предпочитано изпълнение, равновесната смес от изомери е такава, в която R е н-пропил.

В предпочитано изпълнение, фармацевтичните състави полезни в ( методите от изобретението имат pH от около 5.0 до около 6.0 и съдържат: (1) смес от изомери присъстваща в количество от около 75 mg до около 150 mg за mL от фармацевтичния състав; (2) лимонена киселина присъстваща в количество от около 0.05 mmol до около 0.15 mmol за mL от фармацевтичния състав, и по избор, едно количество солна киселина, ефективно за постигане на pH-обхвата; (3) пропиленгликол, присъстващ в количество от около 400 до около 600 mg за mL от фармацевтичния състав; (4) монотиоглицерол, присъстващ в количество от около 1 mg до около 8 mg за mL от фармацевтичния състав; и (5) вода, присъстваща в количество от около 250 до около 550 mg за mL от фармацевтичния състав. По-предпочитано, сместа от изомери е една равновесна смес от изомери. В по предпочитано изпълнение, равновесната смес от изомери е такава, в която R е н-пропил.

В по-предпочитано изпълнение, фармацевтичните състави полезни в методите от изобретението имат pH от около 5.2 до около 5.6. и съдържат: (1) смес от изомери присъстваща в количество от около 90 mg до около 110 mg за mL от фармацевтичния състав; (2) лимонена киселина присъстваща в количество от около 0.075 mmol до около 0.125 mmol за mL от фармацевтичния състав, и едно количество солна киселина, ефективно за постигане на pH-обхвата; (3) пропиленгликол, присъстващ в количество от около 450 до около 550 mg за mL от фармацевтичния състав; (4) монотиоглицерол, присъстващ в количество от около 4 mg до около 6 mg за mL от фармацевтичния състав; и (5) вода, присъстваща в количество от около 300 до около 500 mg за mL от фармацевтичния състав. Найпредпочитано, сместа от изомери е една равновесна смес от изомери. В попредпочитано изпълнение, равновесната смес от изомери е такава, в която R е н-пропил.

По избор, фармацевтичните състави полезни в методите от настоящото изобретение могат да бъдат доставени на краен* потребител, напр., лекар или ветеринар, заедно с предписания за използване в доза за еднократно приложение. Съответно, настоящото изобретение предоставя набор, състоящ се от състав от изобретението и предписания за използване в доза за еднократно приложение.

Фармацевтичните състави могат да бъдат получени както следва. Реагентите се добавят в съд снабден с кожух, с покритие от неръждаема стомана или стъкло, по избор в азотна атмосфера. Към реакционния съд се добавя вода за инжекции и започва разбъркване. Всеки допълнителен компонент се добавя докато сместа се разбърква непрекъснато. Прибавя се киселина в концентрация от около 0.02 mmol до около 0.5 mmol за mL вода и се оставя да се разтвори. За нагласявана на pH до желан обхцат, по избор се добавя воден разтвор на киселина, напр., 10 % (т/т) воден разтвор на солна киселина, и разтворът се разбърква. В този момент се прибавя сместа от изомери към водата и киселинната смес бавно и на малки количества, за да се избегне образуването на буци. Тогава може да бъде прибавено съединение с формула I преди прибавянето на съединение с формула II, съединението с формула II може да бъде прибавено преди прибавянето на съединение с формула I, или съединение с формула I и съединение с формула II могат да бъдат прибавени заедно. Сместа от изомери е оставена да се разтвори и pH на получения разтвор се измерва. В едно изпълнение, сместа от изомери е от около 50 mg до около 500 mg за mL, за предпочитане от около 100 до около 300 mg за mL, и найпредпочитано от около 225 до около 275 mg за mL от получения разтвор. Разтворът след това се нагрява до температура от около 70 °C ,± 10 °C и се поддържа при тази температура докато се получи равновесна смес от изомери. Методите за определяне че е била получена една^; равновесна смес от изомери включват гел хроматография, тънкослойна хроматография, и високоефективна течна хроматография. Обикновено като се използват условията описани тук, една равновесна смес от изомери се получава за около 1 до около 8 h. Щом се получи равновесната смес от изомери, полученият разтвор се охлажда до около 25 °C ± 10 °C. Този разтвор може С да бъде използван като фармацевтичен състав. За предпочитане се добавя съ-разтворител в количество от около 250 до около 750 mg за mL от фармацевтичния състав. По избор се добавя антиоксидант в количество от около 0.01 mg до около 10 mg за mL от фармацевтичния състав. Ако присъства, се добавя консервант в количество от около 0.01 до около 10 mg за mL от фармацевтичния състав и pH се нагласява на около 5.0 до около 8.0, за предпочитане на около 5.0 до около 6.0, чрез добавяне киселина и/или основа, например, като 10 % (т/т) воден разтвор или в твърда форма. Получената смес се разрежда до желан обем. В едно изпълнение крайната концентрация на равновесната смес от изомери е около 50 mg до около 200 f*

mg, за предпочитане около 75 mg до около 150 mg, и най-предпочитано около 90 mg до около 110 mg за mL от получения фармацевтичен състав.

Получените състави за предпочитане се стерилизират, например, чрез пропускане на съставите през предварителен филтър, напр. 5-10 микронен филтър и после през 0.2 микронен филтър за последно стерилизиране, който предварително е бил стерилизиран. Стерилизиращият филтър се стерилизира чрез влажностно-топлинно обработване в автоклав за 60 min при 121 °C, и тестване на цялостта му като се използва метод с поддържане на налягане преди стерилизация и след филтруване на продукта. Стерилният разтвор се добавя към подходящи контейнери, напр., стъклени флакони, които са стерилизирани и депирогенирани при 250 °C за 240 min в тунелна сушилня. Контейнерното пространство се продухва с инертен газ, напр., аргон или за предпочитане азот. Контейнерите се запушват с тапи, които са депирогенирани чрез измиване и стерилизиране с влажностно-топлинно автоклавиране за 60 min при 121 °C. След това контейнерите се запечатват изцяло. Специалистите в областта ще признаят, че малки модификации на горното могат да бъдат използвани за приготвяне на стерилни състави.

Настоящото изобретение се отнася до методи за лечение или предотвратяване на бозайник, състоящ се в прилагане Hd бозайника, нуждаещ се от такова лечение, на фармацевтично ефективно количество от фармацевтичен състав. Фармацевтичните състави могат да бъдат използвани за лечение на инфекции от грам-положителни бактерии, грамотрицателни бактерии, протозои и микоплазма, включително, но не ограничено до видовете Actinobacillus pleuropneumonia, Paqteurella multocida, Pasteurella haemolytica, H. parasuis, B. bronchiseptica, S. choleraesuis, S. pilo, Moraxella bovis, H. somnus, M. bovis, Eimeria zuemii, Eimeria bovis, A. marginale, M. hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis и Staphylococcus, Salmonella, Chlamydia, Coccidia, Cryptosporidia, E. coli, Haemophilus, Neospora и Streptococcus.

Терминът “лекуване на инфекция, както е използван тук, освен ако не е отбелязано друго, означава намаляване тежестта на, или изкореняване на бактериална инфекция или протозойна инфекция както е осигурено в методите от настоящото изобретение. Под предотвратяване на инфекция, както е използвано тук, освен ако не е отбелязано друго, * се разбира предотвратяване установяването и вредната пролиферация на една или повече бактерии или протозои в тялото на бозайник.

Както са използвани тук, освен ако не е отбелязано друго, термините бактериална инфекция(и)” и протозойна инфекция(и) включват w бактериални инфекции и протозойни инфекции, които се срещат в бозайници, риби и птици, а така също заболявания, свързани с бактериални инфекции и протозойни инфекции, които могат да бъдат лекувани или предотвратени чрез прилагане на антибиотици като съединенията от настоящото изобретение. Такива бактериални инфекции и протозойни инфекции, и заболявания, свързани с такива инфекции, включват следните: пневмония, отит медия, синузит, бронхит, тонзилит и мастоидит свързани с инфекция от Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, или Peptostreptococcus spp..; фарингит, ревматична треска и гломерулонефрит свързани с инфекция от О Streptococcus pyogenes, Групи С и G стрептококи, Clostridium diptheriae или Actinobacillus haemolyticum; инфекции на респираторния тракт- свързани с инфекция от Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae или Chlamydia pneumoniae; неусложнени кожни инфекции и инфекции на меки тъкани,“ абсцеси и остеомиелит, и следродова треска, свързани с инфекция рт Staphylococcus aureus, коагулаза-положителни стафилококи (напр., S. epidermidis, S. hemolyticus, и т.н.). Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, стрептококови групи C-F (минута-колония стрептококи), зеленеещи стрептококи, Corynebactehum minutissimum, Clostridium spp. или Bartonella henselae; неусложнени остри инфекции на уринарния тракт,, свързани с инфекция от Staphylococcus saprophyticus или Enterococcus spp.; уретрит и цервицит; и болести, предавани по полов път, свързани с инфекция от Chlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidumf Ureaplasma Urealyticum, или Neiserria gonorrheae; токсични заболявания, свързани c инфекция от S. aureus (хранително отравяне и синдром на токсичен шок), или Групи А, В, и С стрептококи; язви, свързани с инфекция от Helicobacter pylori; системни фебрилни синдроми, свързани с инфекция от Borrelia recurrentis; Lyme болест, свързана с инфекция от Borrelia burgdorferi; конюнктивит, кератит и дакриоцистит, свързани с инфекция от Chlamydia w trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H.

influenzae или Listeria spp.; болестта дисеминиран Mycobacterium avium комплекс (MAC), свързана c инфекция от Mycobacterium avium или Mycobacterium intracellulare; гастроентерит свързан c инфекция от Campylobacter jejuni; чревни протозои свързани с инфекция от Cryptosporidium spp.; одонтогенна инфекция свързана с инфекция от зеленеещи стрептококи; постоянна кашлица, свързана с инфекция от Bordetella pertussis; газова гангрена, свързана с инфекция от Clostridium perfringens или Bacteroides spp.; и атеросклероза, свързана с инфекция от Helicobacter pylori или Chlamydia pneumoniae. Бактериални инфекции и С протозойни инфекции и заболявания, свързани с такива инфекции, които могат да бъдат лекувани или предотвратени в бозайници включват следните: респираторна болест при говедата свързана с инфекция от Р. haemolytica, Р. muttocida, Mycoplasma bovis, Н. somnus или Bordetella spp.; ентеритна болест при телетата, свързана с инфекция от Е. coli или протозои (т.е., кокцидии, криптоспоридии и т.н.); мастит при млечни, крави, свързан с инфекция от Staph, aureus, Strep, uberis, Strep, agalaqtiae, Strep, dysgalactiae, Klebsiella spp., Corynebacterium, Enterococcus spp. или E. coli; респираторна болест при свинете свързано с инфекция от A. pleuro., Р. muttocida или Mycoplasma spp.; ентеритна болест при свинете; свързано с инфекция от Е. coli, Lawsonia intracellularis, Salmonella или Serpulina hyodyisinteriae; заразна болест по краката на кравите свързана с инфекция от Fusobacterium spp.; кравешки метрит свързан с инфекция от Е. coir, кравешки космати брадавици, свързани с инфекция от Fusobacterium necrophorum или Bacteroides nodosus; говежди кератоконюнктйвит (розово око) свързан с инфекция от Moraxella bovis; преждевременен аборт при крави, свързан с инфекция от протозои (т.е. неоспора); свински илеит; говежда кокцидиоза; инфекция на уринарния тракт при кучета и котки, свързана с инфекция от Е. coli; кожни инфекции и инфекции на меките тъкани при кучета и котки, свързани с инфекция от Staph, epidermidis, Staph. w intermedius, коагулаза отр. Staph, или P. multocida; инфекции на зъбите и устата при кучета и котки, свързани с инфекция от Alcaligenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp., Enterobacter spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas или Prevotella: пиодермия при котки и кучета; пневмония при котки и кучета; и инфекции на коне,, свързани с Actinobacillus equi, Rodococcus equi, Streptococcus equi и Streptococcus zooepidemicus. Други бактериални инфекции и протозойни инфекции и заболявания, свързани с такива инфекции, които могат да бъДат лекувани или предотвратявани в съответствие с метода от настоящото изобретение са засегнати в J. Р. Sanford et al., “The Sanford Guide To Antimicrobial G Therapy, 26^th Edition, (Antimicrobial Therapy, Inc., 1996).

Антибактериапната и антилротозойна активност на сместа от изомери полезни в методите от настоящото изобретение срещу бактериални и протозойни патогени е демонстрирана чрез способността на смесите да инхибират растежа на дефинирани щамове от патогени на човек или бозайник.

ΐ

Анализ I

Анализ I, описан по-долу, използва обичайна методология и критерии за интерпретиране и е предназначен да предостави посока за химични модификации, които могат да доведат до съединения, с които се избягват дефинирани механизми на макролидна резистентност. В Анализ I е събран панел от бактериални щамове, така че да включват множество целеви патогенни видове, включително представителни за механизмите на макролидна резистентност, които са били характеризирани. Използването на този панел позволява да бъде определена връзката химична структура/активност по отношение на ефикасността, спектъра на активност и структурните елементи или модификации, които могат да бъдат необходими за избягване механизмите на резистентност. Бактериалните патогени, които съдържа скрининг панелът, са показани в таблицата подолу. В много случаи и макролидно-възприемчивият родителски щам, и макролидно-резистентният щам получен от него, са налични за осигуряване на по-точна оценка на способността на съединенията да заобикалят механизмите на резистентност. Щамовете, които съдържат гена с означението егтА/егтВ/егтС, са резистентни на макролидни, линкозамиди и стрептограмин В антибиотици поради модификации (метилиране) на 23S rRNA молекули с една Erm метилаза, като по този начин в повечето случаи се предотвратява свързването на всичките три структурни класа. Били са описани два типа макролидно изтичане; msrA кодира компонент на система за изтичане в стафилококи, която предотвратява влизането на макролиди и стрептограмини, докато mefA/E кодира трансмембранен протеин, който изглежда води до изтичане само на макролиди. Инактивирането на макролидните антибиотици може да настъпи и може да бъде медиирано или чрез фосфорилиране на 2-хидроксила (mph), или чрез разцепване на макроцикличния лактон (естераза). Щамовете могат да бъдат характеризирани като се използва обичайната технология на полимеразна верижна реакция (PCR) и/или чрез секвениране на детерминантата на резистентност. Използването на PCR технологията в тази заявка е описано от J. Sutcliffe et al., “Detection Of Erythromycin-Resistant Determinants By PCR, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40(11), 2562-2566 (1996). Анализът се осъществява в микротитърни табли и се интерпретира съгласно одобрен стандарт Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests 27

Sixth Edition; публикуван от The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) guidelines; за сравняване на щамовете се използва минималната инхибираща концентрация (MIC). Първоначално смес от изомери се разтваря в диметилсулфоксид (DMSO) като 40 mg/ml изходен

разтвор.

Обозначение на щам	Механизъм(и) на макролидна резистентност·
Staphylococcus aureus 1116	Възприемчив родителски щам
Staphylococcus aureus 1117	ЕгтВ
Staphylococcus aureus 0052	Възприемчив родителски щам
Staphylococcus aureus 1120	ЕгтС
Staphylococcus aureus 1032	MsrA, mph, естераза
Staphylococcus hemolyticus 1006	msrA, mph
Streptococcus pyogenes 0203	Възприемчив родителски щам
Streptococcus pyogenes 1079	ЕгтВ
Streptococcus pyogenes 1062	Възприемчив родителски щам
Streptococcus pyogenes 1061	ЕгтВ
Streptococcus pyogenes 1064	ЕгтВ
Streptococcus agalactiae 1024	Възприемчив родителски щам
Streptococcus agalactiae 1023	ЕгтВ
Streptococcus pneumoniae 1016	Възприемчив;
Streptococcus pneumoniae 1046	егтВ
Streptococcus pneumoniae 1095	ЕгтВ
Streptococcus pneumoniae 1175	MefE
Streptococcus pneumoniae 0085	възприемчив
Haemophilus influenzae 0131	възприемчив
Moraxella catarrhalis 0040	възприемчив.

Обозначение на щам	Механизъм(и) на макролидна резистентност
Moraxella catarrhalis 1055	Еритромицинова междинна резистентност
Escherichia coli 0266	възприемчив

Анализ II е използван за изследване на активност срещу Pasteurella multocida и Анализ III е използван за изследване на активност срещу Pasteurella haemolytica.

Анализ II

Този анализ се базира на метод за течно разреждане в микролитров формат. Единична колония от Р. muttocida (щам 59А067) се инокулира в 5 ml мозъчно-сърдечен инфузионен (BHI) бульон. Получава се разтвор чрез солубилизиране на 1 mg от сместа от изомери в 125 μΙ диметилсулфоксид (DMSO). Приготвят се разреждания на сместа от изомери, като се използва неинокулиран BHI бульон. Използваните концентрации на сместа от изомери варират от 200 pg/ml до 0.098 pg/ml чрез двукратни серийни разреждания. Инокулираният с Р. multocida BHI се разрежда с неинокулиран BHI бульон за получаване на 10⁴ клетъчна суспензия за 200 pg. BHI клетъчните суспензии се смесват със съответните серийни разреждания на сместа от изомери и се инкубират при 37°С за 18 h. Минималната инхибираща концентрация (MIC) е равна на концентрацията на сместа, показваща 100 % инхибиране на растежа на Р. multocida, както е определена чрез сравнение с неинокулирана контрола.

Анализ III

Този анализ се базира на метода на агаровото разреждане, използващ Steers репликатор. Две до пет колонии изолирани от агарова плака се инокулират в BHI бульон и се инкубират цяла нощ при 37 °C с разклащане (200 об/мин). На следващата сутрин 300 pl от напълно зрялата

Р. haemolytica предварителна култура се инокулират в 3 ml свеж BHI бульон и се инкубират при 37 °C с разклащане (200 об/мин). Подходящите количества от сместа от изомери се разтварят в етанол и се приготвя серия от двукратни серийни разреждания. Два ml от съответното серийно разреждане се смесват с 18 ml разтопен BHI agar и се втвърдяват. Когато инокулираната Р. haemolytica култура достигне стандартна плътност 0.5 по McFarland, около 5 ml от Р. haemolytica културата се инокулират на BHI агарови плаки, съдържащи различни концентрации от сместа от изомери, като се използва Steers репликатор и се инкубират за 18 h при 37 °C. Началните концентрации от сместа варират от 100-200 pg/ml. MIC е равна на концентрацията на сместа, показваща 100 % инхибиране на растежа на Р. haemolytica, както е определена чрез сравнение с неинокулирана контрола.

Най-предпочитано анализът с микроразреждане се осъществява като се използва катион-регулираният бульон на Mueller-Hinton, съгласно NCCLS ръководство М31-А, Vol. 19, № 11, “Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals”, June 1999 (ISBN 1-56238-377-9), който е включен тук чрез препратка. Този анализ може да бъде използван за определяне на MIC на съединение срещу двете: Р. haemolytica и Р. multocida. Например равновесната смес от изомери бе тествана съгласно този стандарт срещу Р. haemolytica (АТСС 14003) и бе намерено, че има MIC от 1 pg/mL. Когато равновесната смес от изомери бе тествана съгласно този стандарт срещу Р. multocida (АТСС 43137), бе намерено, че MIC е 1 pg/mL.

Анализ IV

In vivo активността на фармацевтичните състави· от настоящото изобретение може да бъде определена чрез обичайни защитни изследвания на животни, добре известни на специалистите в областта, обикновено извършвани върху мишки.

Мишките се разпределят по клетки (10 на клетка) по тяхното пристигане, и се оставят да се аклиматизират за минимум 48 h преди да бъдат използвани. Животните се заразяват с 0.5 ml от 3 х 10³ CFU/ml бактериална суспензия (Р. multocida щам 59А006) интраперитонеално. Всеки експеримент има поне 3 не-лекувани контролни групи, включително една инфектирана с 0.1 X провокационна доза и две инфектирани с 1Х провокационни доза; може също да бъде използвана група с 10Х провокационни данни. Обикновено субстанциите могат да бъдат въведени на всички мишки в дадено изследване в рамките на 30 - 90 min, особено ако се използва автоматична спринцовка (такава като Cornwall® спринцовка) за прилагане на провокационната проба. Тридесет минути след започване на въвеждането се дава първият фармацевтичен състав. Може да бъде необходимо втори човек да започне дозирането на фармацевтичния състав, ако пробите на всички животни не са били въведени до края на 30 min. Начините на прилагане са субкутанни или орални дози. Субкутанните дози се прилагат в свободната кожа на гърба на врата, докато оралните дози се дават посредством игла за хранене. И в двата случая се използва обем от 0.2 ml на мишка. Съставите се прилагат 30 min, 4 h и 24 h след въвеждането. Във всеки тест е включен контролен състав с известна ефикасност, прилаган по същия начин. Животните се наблюдават ежедневно и се записва броят на оцелелите във всяка група. Р. multocida моделът за мониторинг продължава 96 h (четири дни) след въвеждането.

PD50 е изчислената доза, при която изследваният фармацевтичен състав защитава 50 % от група мишки от смърт поради бактериалната инфекция, която би била летална в отсъствие на лечение.

Фармацевтичните състави полезни за методите от настоящото изобретение показват антибактериална активност в един от гореописаните анализи, особено в Анализ IV.

ΐ

Настоящото изобретение се отнася допълнително до методи за увеличаване на толерантността в акутно или хронично място на инжектиране в бозайник, състоящ се в прилагането на бозайника, нуждаещ се от такова лечение, на фармацевтично ефективно количество от състав, съдържащ: (а) смес от изомери и (Ь) фармацевтично приемлив пълнител. Под увеличаване на толерантността в акутно място на инжектиране, както е използван тук, се разбира, че когато състав от изобретението се прилага чрез инжекция, се намалява размера на подуването и/или възпалението в мястото на инжекцията, особено това, което присъства около 24 до 48 h след инжектирането, сравнено с размера на подуването и/или възпалението, присъстващи около 24 до 48 h след инжектирането с антибиотични средства, различни от сместа от изомери, такива като например MICOTIL. Под “увеличаване на толерантността в хронично място на инжектиране, както е използван тук, се разбира намаляването размера на тъканна некроза в мястото на инжектиране, която присъства около 2 седмици след инжектирането, сравнен с размера на тъканната некроза присъстваща 2 седмици след инжектирането с антибиотични агенти, различни от сместа от изомери, такива като например A/IICOTIL. В предпочитано изпълнение сместа от изомери е една равновесна смес от изомери. В друго изпълнение сместа от изомери е тази, в която R е нпропил.

Фармацевтичните състави полезни за методите от изобретението могат да бъдат използвани за лечение на хора, говеда, коне, овце, свине, кози, зайци, котки, кучета и други бозайници, нуждаещи се от такова лечение. По-специално, фармацевтичните състави полезни за методите от изобретението могат да бъдат използвани за лечение inter alia, на респираторна болест при говедата, респираторна болест при свинете, говежди инфекционен кератоконюнктивит, говежда кокцидиоза, свински илеит, говежди мастит, ентеритна болест при говедата, ентеритна болест при свинете, кучешка пиодермия, котешка пиодермия, кучешка пневмония, котешка пневмония, заболяване на меките тъкани при кучета, заболяване на меките тъкани при котки, пастерелоза, анаплазмоза и инфекциозен кератинит. Фармацевтичните състави могат да бъдат прилагани чрез орален, интрамускулен, интравенозен, субкутанен, интраокулярен, парентерален, локален, интравагинален или ректален начини. За прилагане на говеда, свине или други домашни бозайници, фармацевтичните състави могат да бъдат прилагани в храната или орално като лекарствен състав за животни. За предпочитане фармацевтичните състави се инжектират интрамускулно, интравенозно или субкутанно. В предпочитано изпълнение, фармацевтичните състави се прилагат в еднократна доза, варираща от около 0.5 mg от сместа от изомери за kg телесно тегло (mg/kg) до около 20 mg/kg. В по-предпочитано изпълнение, фармацевтичните състави се прилагат в еднократна доза, варираща от около 1.25 mg/kg до около 10 С mg/kg. В най-предпочитано изпълнение, фармацевтичните състави се прилагат в еднократна доза, варираща от около 2.0 mg/kg до около 5.0 mg/kg. Най-предпочитано, фармацевтичните състави се прилагат субкутанно.

Анти-бактериални и/или анти-протозойни лекарства, различни от сместа от изомери, могат също да бъдат прилагани съвместно с, прилагани преди, или прилагани последващо приложението на настоящите състави и множествени дози от тези лекарства могат да бъдат полезни. Обаче, настоящите състави се прилагат само веднъж, т.е. в еднократна доза. Под “еднократна доза както е използван тук се разбира, че единичното С приложение на фармацевтичните състави е способно да лекува или предотврати бактериална или протозойна инфекция. Т.е. докато последваща доза от фармацевтичните състави може да обезпечи допълнителна изгода, това не се изисква в настоящите методи. Нещо повече, когато съставите от изобретението се прилагат в еднократна доза не е необходимо те да съдържат голямо количество от сместа от изомери, която би присъствала, ако се прилагат в множество дози.

Методите от настоящото изобретение се основават частично на изненадващото откритие на заявителите, че сместа от изомери има дълъг полупериод на съществуване (около 28 h) в тъканите и периферната циркулация. Специалистите в областта лесно ще признаят, че могат да се срещат вариации в дозите в зависимост от вида, теглото и състоянието на субекта, подлежащ на лечение, неговият индивидуален отговор на фармацевтичните състави и избрания специфичен път на приложение. В някои случаи нива на дозите под по-ниската граница на гореспоменатите обхвати могат да бъдат терапевтично ефективни, докато в Други случаи могат да бъдат използвани още по-големи дози без да причинят никакви увреждащи ефекти, при условие, че такива по-големи дози са първо разделени на няколко малки дози за прилагане през целия ден.;

Следващите примери допълнително илюстрират методите за получаване на състави, полезни за методите от настоящото изобретение. Ще бъде разбрано, че настоящото изобретение не е ограничено до специфичните детайли на примерите, предоставени по-долу.

Пример 1

Синтез на И-(н-пропил) изомер II. Към ерленмайерова колба от 2 L бе добавен дезметилазитромицин (190.5 g, 259.2 mmol), метилен хлорид (572 mL) и магнезиев сулфат (38 д). Сместа бе разбърквана 10 min след това филтрувана в облодънна колба от 5 L. Добавен бе метилен хлорид (2285 mL) и разтворът бе охладен до 0-5 °C. След това бе прибавен CBZ-CI (58.4 mL) в продължение на 10 min. Реакционната смес бе разбърквана 6 h при ~0 °C, след това при температура на околната среда цяла нощ. HPLC анализ показа присъствието на остатъчен изходен материал, така че реакционната смес бе повторно охладена до ~0 °C и бе добавен i допълнителен CBZ-CI (19.5 mL) на една порция. Реакционната смес бе разбърквана 5.5 h при 0 °C, после 2.5 h при температура на околната среда. TLC показа завършване на реакцията. Реакцията бе прекъсната с наситен воден разтвор на натриев бикарбонат (953 mL) и фазите бяха разделени. Органичната фаза бе изсушена над магнезиев сулфат, след това филтрувана и концентрирана до получаване на съединението с формула (III):

Към облодънна колба от 5 L, съдържаща съединението с формула (III) (225.3 g) в метиленхлорид (901 mL) и DMSO (450 mL) при -65 °C, бе добавен трифлуорооцетен анхидрид (82.4 mL). Температурата бе поддържана при ~-60 °C по време на прибавянето, което бе завършено за 9 min. Реакционната смес бе разбърквана 20 min при -65 до -70 °C. Реакцията бе прекъсната с триетиламин (145 mL), после разбърквана 20 min при -60 °C до -65 °C. Към реакционната смес след това бе прибавена вода (1127 mL) в продължение на 3 min, в който момент температурата бе повишена до -2 °C. Реакционната смес бе разбърквана 10 min и фазите бяха оставени да се разделят. Органичната фаза бе промита с вода (675 mL), след това с наситен воден разтвор на натриев хлорид (675 mL). Органичната фаза бе изсушена над магнезиев сулфат, след това филтрувана и органичните разтворители отстранени чрез дестилация. Прибавен бе МТВЕ и бе дестилиран за отстраняване на всички следи от метиленхлорид и DMSO. Добавен бе допълнителен МТВЕ до общ обем от 3380 mL. Дибензоил-Dвинена киселина монохидрат (87.8 д) в МТВЕ (1126 mL) бе прибавена до образуване на гъст шлам. Сместа бе нагрявана до кипене под обратен хладник и разбърквана цяла нощ. След охлаждане до температура на околната среда, твърдите вещества бяха събрани на Бюхнерова фуния и промити с МТВЕ. Твърдите вещества бяха изсушени в сушилна пещ при 40 °C до получаване на 258.3 д от дибензоил тартаратната сол на съединението с формула (IV):

(IV)

Към облодънна колба от 3 L бе добавен метиленхлорид (800 mL) и дибензоил тартаратната сол на съединението с формула (IV) (188 д). Прибавени бяха вода (400 mL) и калиев карбонат (45.5 д) и сместа бе разбъркана при температура на околната среда за 5 min. Органичната фаза бе сепарирана, после промита с вода (250 mL) и изсушена над магнезиев сулфат. Сушилният агент бе отстранен чрез филтруване и полученият разтвор изпарен в поток от азот до краен обем от 623 mL, до получаване на кетон, свободна база.

Към облодънна колба от 5 L бе добавен THF (623 mL)· и триметилсулфониев бромид (74.7 д). Полученият шлам бе охладен до -10 °C и бе прибавен калиев трет.бутоксид (54.4 д). Реакционната смес бе разбърквана 10 min при -10 °C, после охладена до -70 °C в продължение на 5 min. Разтвор от свободната база кетон бе добавен за 11 min, при поддържане на температурата между -60 и -65 °C. HPLC показа, че реакцията е завършена след 90 min. Реакцията бе прекъсната при -60 °C с използване на разтвор от амониев хлорид (315 д) във вода (1800 mL). Температурата ре повиши до -5 °C по време на прекъсването на реакцията. Реакционната смес бе затоплена до 5-10 °C и фазите бяха разделени. Органичната фаза бе изсушена над натриев сулфат, след това филтрувана и концентрирана до получаване на съединението с формула (V), (117.4 д) като жълта пяна.

HPLC показа чистота от 61.4 % чрез площта на пика.

(V)

Към разтвор от съединението с формула (V) (275 д, 312 mmol) в сух метанол (2.75 L), бе добавен калиев йодид (518 д, 3.12 mol) и н-пропиламин (250 mL, 3.04 mol). Сместа бе разбърквана цяла нощ при 45 °C. TLC показа завършена реакция. Реакционната смес бе концентрирана на въртящ се изпарител и остатъкът разпределен между вода (2.5 L) и метиленхлорид (2.5 L). pH на водната фаза бе нагласено до 6.7, като се използва 3 N водна HCI. Екстракцията бе повторена още един път. Обединените водни фази бяха смесени със свеж метиленхлорид (1.5 L) и pH на водната фаза нагласено до 8.5 с твърд калиев карбонат. Фазите бяха разделени и водната фаза повторно екстрахирана двукратно с допълнителен метиленхлорид. Обединените органични фази бяха изсушени над натриев сулфат, след това филтрувани. Филтратът бе концентриран на въртящ се изпарител до получаване на бежова пяна (230 д). Пречистването на пяната бе осъществено на суспензионно заредена със силикагел колона, при използване на 19/3 (о/о) хексани-диетиламин като подвижна фаза. По този начин от 125 g суров продукт бяха получени 72 g Ν-(Η-προπππ) изомер I като бяла аморфна пяна.

Ν-(Η-προπππ) изомер I бе разтворен в ацетонитрил (0.5 L) при температура на околната среда. След това бе прибавена дейонизирана вода (1 L), което причини утаяване. После бе добавен допълнителен ацетонитрил (0.5 L) до получаване на хомогенен разтвор, който бе разбъркван при температура на околната среда 30 h. HPLC анализът показа образуването на нов компонент, който обхваща 20 % от общата площ на пика.

Органичният разтворител бе отстранен на въртящ се изпарител. Добавен бе калиев карбонат (30 д) към водния остатък, последван от метиленхлорид (0.3 L). Сместа бе разклащана и долната органична фаза отстранена. Осъществени бяха също две допълнителни екстракции (2 х 0.3 L). Обединените органични фази бяха изсушени над натриев сулфат, след това филтрувани и полученият разтвор концентриран до суха пяна (~10 д).

Получената смес от И-(н-пропил) изомер I и И-(н-пропил) изомер II бе разтворена в смес от метиленхлорид и 19/3 (о/о) хексани-диетиламин, и поставена в суспензионно запълнена силикагелна колона, след това елуирана със системата 19/3. Елуентът бе превключен до 19/6 хексанидиетиламин във фракция 56. Фракции 9 - 17 бяха обединени и концентрирани до суха пяна, която съдържаше само нереагирал изходен материал. Фракции 52 - 72 бяха обединени и концентрирани, й съдържаха С Ν-(Η-προπππ) изомер II (79 % чистота с HPLC).

Пример 2

Таблица 1 по-долу показва ефекта от pH, температурата, типа на киселината и концентрацията на И-(н-пропил) изомера I, върху скоростта на равновесната реакция и върху нивата на главните онечиствания следващи равновесието. Повторени експерименти (данните hq са показани) демонстрираха възпроизводимостта на резултатите. Равновесното съотношение на Ν-(Η-προπππ) изомера I и Ν-(Η-προπππ) изомера II (около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 %, съответно) бе в съгласие за всички експерименти. Анализ на данните показа, че pH и температурата имат значителен ефект върху времето, изискващо се за равновесието. Без обвързване с някаква теория, по-ниските равновесни температури или пониски стойности на pH обикновено имат за резултат съществено по-дълги равновесни времена. Равновесното време може също да зависи inter alia, от концентрацията на изходния материал и типа и концентрацията на използваната киселина. Щн-пропил) изомер I при концентрация от до около 300 mg за mL от състава, бе нагрят до температура от около 40 ^ЬС до около 80 °C в присъствието на една или повече киселини при концентрация от около 0.2 mmol до около 1.0 mmol за mL от сместа и с достатъчно количество солна киселина за получаване на pH от около 6.5 до около 7.5 за С до около 20 h, до получаване на равновесна смес от изомери, която е около % - 98 % чиста. Равновесните кинетични параметри и нива на онечистване за равновесието на Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II, бяха определени като функция на pH, равновесната температура, типа на киселината и концентрацията на Щн-пропил) изомера I, и са изброени в Таблица 1. Известни методи, включително високоефективна течна хроматография (“HPLC), ядреномагнитна резонансна спектроскопия (“NMR), газова хроматография (“GC), масспектрометрия (“MS), течна хроматография/масспектрометрия (“LC/MS”), GC/MS и тънкослойна хроматография (“TLC), могат да бъдат използвани за идентифициране на С на онечистванията. “DS се отнася до Ν-(Η-προπππ) изомер I преди равновесието и е включен за сравнение.

Равновесни смеси от изомери бяха получени и анализирани както следва. 40 mL от разтвора бяха приготвени във всеки от експериментите 1А11А и всеки разтвор бе разделен на 1 mL аликвотни части преди нагряването, за да се проследява по-лесно равновесието в различни моменти във времето. 20 mL от разтвора бяха приготвени вЪв всеки от експериментите 12В - 24В и всеки разтвор бе разделен на 0.7 mL аликвотни части преди нагряване. 100 mL от разтвора бяха приготвени във всеки от експериментите 25С - 28С, 200 mL от разтвора бяха приготвени във всеки от експериментите 29С - ЗОС, и равновесието бе проследявано от 0.5 mL аликвотни части взети от разтворите. 60 mL от разтвора бяха приготвени във всеки от експериментите 31D - 33D и 35D - 41D, 170 mL от разтвора бяха приготвени в експеримент 34D, и равновесието бе проследявано от 0.5 mL аликвотни части взети от разтворите. От 7 200 mL до 54 000 mL от разтвора бяха приготвени във всеки от експериментите 42Е - 46Е, и равновесието бе проследявано чрез изваждане от 2 mL до 5 mL аликвотни части от разтворите. От 35 mL до 50 mL от разтвора бяха приготвени във всеки от експериментите 47F - 50G, и всеки разтвор бе разделен на 1 mL аликвотни части преди нагряването. Добавена бе вода към подходящия w контейнер, последвана от типа и количеството киселина, изброени в колона на Таблица 1. Терминът qs предшестващ типа на киселината, се отнася до едно количество от киселината, достатъчно за постигане на.рН, описано в колона 2. Когато бе използвана 0.1 М лимонена или винена киселина, добавяна бе също солна киселина в количество, достатъчно да се получи pH, описано в колона 2. Когато една киселинна концентрация е описана в колона 4 (напр., “0.1 М лимонена), това е концентрацията на киселината в разтвор, имащ равновесна смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II, присъстващи в концентрация от 100 mg/ml. Сместа от вода и киселина бе разбърквана докато всичката киселина бе разтворена (около

С 5 min или по-малко за по-малките обеми, и около 20 min за по-големите обеми). Ν-(Η-προπππ) изомер I бе добавен бавно и на малки порции, за да се избегне образуването на бучки и получената смес бе разбърквана енергично, докато се разтвори (по-малко от 30 min за по-малките обеми, и около 60 - 120 min за по-големите обеми). След разтварянето на N-(hпропил) изомера I, pH на получения разтвор бе измервано. Ако pH бе пониско от pH, описано в колона 2, то бе повишавано до описаното в колона 2 с 10 % натриев хидроксид. Ако pH бе по-високо от pH описано в)колона 7, то бе понижавано с подходяща киселина(и). За всеки експеримент разтворът бе нагряван при температурата, отбелязана в колона 3, докато бе получена равновесна смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II, както бе определено с един от HPLC анализите, описани по-долу. В някои експерименти смесите бяха нагрявани за период от време, по-дълъг отколкото се изисква за равновесието (проценти по-големи от 100 % в колона 8), за определяне ефектите от удълженото нагряване върху степента на онечистване.

За проследяване на равновесието аликвотни части от реакционната смес бяха анализирани с HPLC в различни моменти по време на равновесието. За мнозинството от равновесните експерименти показани на Таблица 1, аликвотните части бяха разредени с 40 тМ калиево-фосфатен буфер (pH 6.0) до концентрация от приблизително 0.5 mg от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προππη) изомер II за mL общ обем на пробата и подложени на хроматография при използване на Asahipak ODP-50, 5 pm, 250 х 4.0 тт колона (40 % ацетонитрил/35 % метанол/25 % 40 тМ калиев фосфат; pH 8.5 подвижна фаза; скорост на потока 0.7 mL/min; стайна температура) на HP 1090 Течен хроматограф, снабден с външен програмируем .детектор на абсобция Applied Biosistems 783А. Пиковете бяха определени чрез проследяване на ултравиолетовата абсорбция при 210 nm. За останалите равновесни експерименти показани на Таблица 1 (експерименти 31 D-46E), аликвотни части бяха разредени с 20 % ацетонитрил/50 % метанол/30 % 50 тМ калиев фосфат (pH 5.5) до концентрация от 1-0 mg от М-(н-пропил) изомер I и И-(н-пропил) изомер II за mL от общия обем на пробата и подложени на хроматография при използване на YMC Pro-Pack С_10| 3 pm, 50 х 2.0 тт колона (20 % ацетонитрил/50 % метанол/30 % 50 тМ калиев фосфат; pH 7.0 подвижна фаза; скорост на потока 0.5 ml/min; стайна температура) на HP 1090 Течен хроматограф с вътрешен UV детектор. Пиковете бяха определени чрез проследяване на ултравиолетовата абсорбция при 210 nm. Относителните количества от Ν-(Η-προπππ) изомера I и И-(н-пропил) изомера II бяха определени чрез използване отношението на техните съответни площи на пиковете на хроматограмите. При горните условия на HPLC, Ν-(Η-προππη) изомерът I има време на задържане от приблизително 13-23 min, и Ν-(Η-ηροππη) изомерът II има относително време на задържане (RRT) от приблизително 0.8 до 0.9. Под “RRT се разбира времето на задържане свързано с това на Ν-(Η-προπππ) изомера I при гореописаните HPLC условия.

I

Чистотата на равновесните проби в Таблица 1 бе определена при използване на HPLC съгласно една от три процедури. В експерименти 1А24В, 48F, и 50G, аликвотните части бяха разредени с 25 т.М калиевофосфатен буфер (pH 5.5) до концентрация от 1.25 mg на Щн-пропил) изомера I и Щн-пропил) изомера II за mL общ обем на пробата и анализирани при използване на Eclipse XDB-Cs, 5 pm, 250 х 4.6 mm колона (22 % ацетонитрил/58 % метанол/20 % 25 тМ калиев фосфат; pH 8.0 подвижна фаза; скорост на потока 0.6 mL/min; стайна температура) на сепарационен модул Waters Alliance 2690 с BAS CC-5/LC-4C амперометричен детектор. Пиковете бяха открити електрохимично с един електрод при +0.70 V, втори електрод при +0.88 V и обхват от 0.5 рА. В експерименти 25С - 41D, аликвотните части бяха разредени с 50 тМ лимонена киселина (pH 5.5) до концентрация от 0.25 mg от сместа на N-(hпропил) изомера I и Щн-пропил) изомера II за mL от общия обем на пробата и анализирани като се използва YMC Pro-Pack С₁₈, 3 pm, 150 х 4.6 mm колона (70 % метанол/30 % 50 тМ фосфат; pH 7.0 подвижна фаза; скорост на потока 1 mL/min; стайна температура) на Waters Alliance системата. Пиковете бяха открити електрохимично само с един електрод при +0.90 V. В експерименти 42Е - 43Е, аликвотните части бяха разредени с 50 тМ лимонена киселина (pH 5.5) до концентрация от 0.25 mg от сместа на И-(н-пропил) изомера I и Ν-(Η-προπππ) изомера II за mL от общия обем на пробата и анализирани като се използва YMC Pro-Pack С₁₈₁ 3 pm, 150 х 4.6 mm колона (70 % метанол/30 % 50 тМ фосфат; pH 7.0 подвижна фаза; скорост на потока 1 mL/min; стайна температура) на HP 1090 Течен хроматограф с BAS CC-5/LC-4C Амперометричен детектор. Пиковете бяха открити електрохимично само с един електрод при +0.90 V. Процентът на равновесната смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II (колона 9) и онечиствания (колона 10), свързан с анализираната проба бе определен при използване площите под пиковете в хроматограмите. Някои от намерените онечиствания бяха: дескладинозен азалид (неговото RRT бе приблизително 0.26 на Eclipse XDB-Ca колона), ацеталдехиден инсерционен продукт (неговото RRT бе приблизително 1.75 на Eclipse XDB-Cg колона) и формалдехиден инсерционен продукт (неговото RRT бе приблизително 1.6 на Eclipse XDB-C_e колона).

Дескладинозният азалид има структурата:

Ацеталдехидният инсерционен продукт има структурата:

осн^

Формалдехидният инсерционен продукт има структурата:

Дескладинозният азалид, ацеталдехидният инсерционен продукт и формалдехидният инсерционен продукт, и техните фармацевтично приемливи соли, имат антибиотични свойства и са полезни като антибиотични средства.

Експериментите от групи А и В (идентифицирани чрез буквата, следваща номера на експеримента) в Таблица 1, бяха осъществени за определяне ефектите от pH, температурата, типа на киселината, концентрацията на киселината и концентрацията на Ь1-(н-пропил) изомера I върху равновесието. Експериментите от група С в Таблица 1 илюстрират ефектите от pH и температурата върху равновесието. Експериментите от група D в Таблица 1 илюстрират ефектите от pH, температурата и киселинната концентрация върху равновесието. Експериментите от група Е С в Таблица 1 илюстрират предпочитан метод за установяване на равновесие, който е при pH от около 7.0, равновесна температура от около 70 °C и концентрация на М-(н-лропил) изомера I от около 250 mg/mL. Експериментите в група F изследват ефектите от сменящи се; киселини и равновесни температури, и експеримент G бе осъществен в присъствието на съ-разтворител 50 % пропиленгликол.

Резултатите от тези експерименти показват, че даже при разнообразие от условия, равновесието на сместа от ЬЦн-пропйл) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II съгласувано води до образуването на около 90 % ± 4 % от Щн-пропил) изомер I и около 10 % ± 4 % от 1М-(н-пропил) изомер II. Равновесната температура и pH изглежда имат най-голям ефект върху равновесната скорост, при което по-високите температури обикновено водят до по-бързи скорости, даже при по-високи концентрации на И-(н-пропил) изомера I. В повечето случаи обаче, по-дългите равновесни времена водеха до по-висока концентрация на онечистванията и следователно, оптималните равновесни условия са тези, водещи до относително високи равновесни скорости, т.е., при които равновесната смес от N-(H-nponnn) изомер I и N-(hпропил) изомер II се образува за 1-3 h.

co

0»

bσ>

5

σ> CM

3

co o

XT CM

co o

§

CM co

in 00

in o

in co

o co

Т“ CM

co; Ш

co

o co

·-'

ri

in

1П

r>

rS

o

CM

d

CO

tn

co

CM

d

(\i

co

Експеримент Равновесна Киселина Начална % На N-(h- Време до % От времето % Равновесна номер & група pH температу- концентрация пропил) равновесие- до смес от изомери

0»

0>

co

b-

v~

CO

CM

CO

3

CM

co

in

o

CD

s.

co

o

co

o

in

b-

<*>

<0

b*

1П

V

w-

σ>

▼“

CM

co

b-

00

<o

3

Tt

<o

CO

o

b-’

CO

co

in

<b

3

co

in

b^

(D

co

σ>

0»

0>

CO

<3>

co

σ»

o>

σ>

o>

CD

o>

σ>

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0'0 0 ослоь-.о^оооь^оь-офошосо T-v-T-(*)v-(Ow-C4r-v-T-4— r-v-T-T-.T-T-

Ю ь* о in in ь*

ОТ

от σ <о х а.

<п σ

in о <0 co <η <0 ο

х с ш X о.

ra

а.

π χ ο.

от сг о ьο b^ от сг

tn σ tn от er θOT σ

o	o	o	•o	o
CO	<O	co	in	b-

ο ο bZ <0 ο ο <ο <ο ο ο ь2 ь2

co < σ>

10A 6.5 65 qs лимонена 112 11.3 3.3 100 96.63 3.37

«J X

co

b-

o u>

4*

10

r>

CM

<0

CM

co

b-

o

T-

V

<4

cm

Ю

0>

co

CM

to

o

b»

CM

co

a>

CM

o

T—

o

CM

o

T

T-

CM

T~

CO

eq

b*

cd

id

10

to

id

•0

10

IO

<0

b4

tn

10

to

<d

(0

<0

to

I <0

<0

in

uS

s	2	$	3	co 0»	o co	s	σ> co	σ> co	CO b·	- 00 ί co	tn <0
<d a»	c\i o>	3	5	cd σ>	cd σ>	3	cd <7>	cd cr>	cd σ>	cd σ>	cd σ>

CO CM

Μ·' 4 σ> σ>

Φ	1
X o		и*-»ч
Φ	(0	Q
co	Q.	o
o	Φ
X	c	(0
CO	S	ex
co	Φ
a.	H

Τ Ο.

<ο

Η

η m <ο cd см <η

σ> st <0 см ιο ιη

η см

1Л	1Л	o	o	o	o	o	o	o
8	CM	o	in	o	Ю	o	• o	Ю
CM	r>		co		co	co	4^-

ra	«3	X	<Q
X	X	Φ		X
φ	Ф	X		Φ
X	r	o	Q	X
o	o	3	X	o
S	3	X		3
X	X	G	<n	X
G	G	s	CT	G
tn	tn		<n
er	σ	4—		σ

ο

	73			73
co	X		Φ	X
X	Φ		X	Φ
Φ	X	«X*	Φ	X	___
X		o	z	o	o
2		X	g		X
X	CX	0	X	CZ	0
ex		CT	ex		CT
0			(0	2
CT			CT	τ-
	o			Ο

ο <0 btn ο <0 b^ ιο ιη ο <Ο bο bο <0 ο t> ο <0 <0 < bο <ο

10 CM	tn CM	o	in
b2	K	b4	b^

m to

CD co ο

ь4

CD

in	in	in
b^	b^

ο bCD co

Ш o>

Ш cm

Експеримент pH Равновесна Киселина Начална % На N-(h- Време до % От времето % Равновесна % номер & група температу- концентрация пропил) равновесие- до смес от изомери Онечиствания ра (°C) на Ν-(Η-προππη) изомера II то (часове) равновесието изомер I при

о>	<о	ь- о	h*.	σ>
	г-		<п	tn	o
ю	1П	ui	ui	tn	«0

	in	in	Ю	o	o	o	o
r-	r-'	<0	<o	I⁴-	t<		t<
o	O	o	O	O	O	Q	D
«П	<£>	b-	OO	σ>	o		CM
CM	CM	04	CM	CM	m	co	<n

τ— τ— <0 Ю СЧ см см ci

ο ο ο

101010 см CM CM «i X

s in CM	X ф X o	o X	2 in Γ-	X φ X ο	Ο X	X ο 2 3	Ο X
	2 s	и	Τ-	2 3	<Λ	G	ν>
o	σ	Ο	σ	2	σ
	c			G

ο

Ο QΟ

ГО тг1Л

CO ГОco

V“

ο ο <ο σ»

ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο
10	ιη	10	ιη	10	10	10	10
CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM

co

Експеримент pH Равновесна Киселина Начална % На N-(h- Време до % От времето % Рав» номер & група температу- концентрация пропил) равновесие- Д° смес от

см т см

2L

о о

ьco d

О ш см о кЛ см о кЛ см «J «8

X г: - X г; - х

2	X Ф	о	2	X ф	о	2	X ф	о
	X	X		X	X		X	X
τ-	о		V·	о			о
Ο	2 X	т σ	О	2 X	т σ	d	S X	<л сг
	с			Q			с

о >«ο σ» <о co кЛ Tt

ο кЛ см

о X <л σ

U. U.

$ 3

о о

-е

50G 7 70 qs лимонена 75 9.4 2.7 100

Пример 3

Стабилността на състави, съдържащи равновесна смес от N-(hпропил) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II, съхранявани при 50 °C за 12 седмици и стабилизирани със съ-разтворител е показана в Таблица 2 понататък. Резултатите показват, че съставите несъдържащи съ-разтворител са значително по-малко стабилни, отколкото състави, съдържащи съразтворител в количество от около 250 до около 500 mg за mL от състава (експерименти 1А - 11 В). Състави, имащи pH от около 5.4 и съдържащи пропиленгликол в количество от около 450 до около 550 mg за mL от състава, са най-стабилните. Могат да бъдат използвани други съразтворители за стабилизиране на съставите (експерименти 1Е - 2Е); обаче пропиленгликолът е предпочитан. Както е показано в Таблица 2, стабилността е зависима от pH и може също да бъде зависима от типа и количеството на използваната киселина, и концентрацията на равновесната смес от изомери.

Тези състави бяха получени както следва. След нагряване до желаната температура (колона 2) и оставяне на сместа от вода, киселина и Ν-(Η-προπππ) изомер I да стигнат до равновесие за времето, показано в колона 3, равновесните смеси от изомери бяха оставени да се охладят до

стайна температура. Когато смесите достигнаха стайна температура, бе добавено подходящото количество от желания съ-разтворител. (колона 6).

Процентът на съ-разтворителя показан в колона 6, е процент, тегло-обем (напр., 50 % PG е 500 mg пропиленгликол за mL от фармацевтичния състав). Когато бе използван антиоксидант или консервант, бяха добавяни подходящите количества (колони 8 и 9). pH на разтвор^ бе измерено и нагласено до стойността в колона 5 чрез добавяне на една или повече киселини и/или 10 % т/т натриев хидроксид. Обемите на получените разтвори след това бяха нагласявани чрез добавяне на вода; Съставите бяха филтрувани през 0.2 микронен стерилизиращ филтър. Флаконите бяха напълнени в аспирационна камина с ламинарен поток и горната част на флаконите бе продухана с подходяща газова смес (колона; 10) преди запечатване.

Равновесието и чистотата бяха проследявани при използване на HPLC както е описано по-горе в Пример 2. Стабилността на стабилизирани равновесни състави запечатани в стъклени флакони, бе определена след съхранение в продължение на 12 седмици при 50 °C. Бяха проследени ефектите от концентрацията на равновесната смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II, pH, количеството и типа на съ-разтворителя, типа и концентрацията на киселината, излагането на въздух, присъствието на консерванти и присъствието на антиоксиданти. Резултатите са показани в Таблица 2.

Експерименти 1А - ЗА бяха осъществени за проследяване ефекта от концентрацията на равновесната смес върху стабилността. Експерименти 2А, 6А, и 7А бяха осъществени за проследяване ефекта на pH върху стабилността. Експерименти 2А, 4А, и 5А показват ефекта от количеството на съ-разтворителя върху стабилността, и експерименти ЗА и 8А показват ефекта от използване на лимонена киселина самостоятелно, в противоположност на смеси от лимонена и фосфорна киселина, за получаване на кисело pH. Експерименти 1В -11В показват ефектите от pH и пропиленгликола (PG) използван като съ-разтворител, върху стабилността. Експерименти 1С и 2С показват ефекта на използваната винена киселина самостоятелно, в противоположност на смес от винена и солна киселина, за получаване на кисело pH. Експерименти 9В - 11В и ЗС показват ефектите от един консервант върху стабилността на сместа и експерименти 9В - 11 В, 4С, и 5С показват ефектите от един антиоксидант върху стабилността на сместа. Експерименти 6С и 70 показват ефектите от използването на смес от винена и солна киселина или смес от лимонена и солна киселина върху стабилността. Експерименти 1D - 12D показват ефектите от различните количества от антиоксиданта монотиоглицерол (MTG) и различните степени на излагане на кислород върху стабилността.

Експерименти 4D - 6D и 13D - 18D демонстрират ефектите от pH на състава и киселинната концентрация върху стабилността.

Резултатите от тези експерименти посочват, че след съхранение от 12 седмици при 50 °C, равновесните състави, които съдържат поне 50 % пропиленгликол и имат pH вариращо от около 5.2 до около 5.5, запазват повече от 93 % от началната концентрация на равновесната смес от N-(hпропил) изомер I и И-(н-пропил) изомер II. По-високо ниво на онечиствания бе намерено в състав, нямащ съ-разтворител (експеримент 4А). Съответно, присъствието на съ-разтворител изненадващо и неочаквано ограничи С количеството на онечистванията. Високо ниво на онечиствания беше намерено след 12 седмици в състави, имащи по-малко от 40 % съразтворител и pH от по-малко от 5.0. Концентрацията на киселината също влияе върху стабилността на фармацевтичните Състави. Състави с относително ниски концентрации на киселина (около 20 mM) и pH от около

5.4 показват най-голямата стабилност след съхранение. Обаче, ниски киселинни концентрации водят до ниска буферна сила, коеТо води до флуктуиращо pH и може да доведе до относително висока степен на онечистване при други времеви или температурни условия.

г

Таблица2

p °

H И И

X X X X X X _c -- -- &

tf>

Γ* a₽

o o

I I I I I M

- X - - - - c &

o p

X c a₽

ΜΊ

Г4

X c 8 £ η

X c &

f q , &

#,

«888888 « «0 <o « « ®<

8 8 8 8 88

Я 4 3 3 £3

o b*

i s

/**·

Hl lie

3 8 sax

S 9

Г4 Γ>

3 8

О» 0» o

ОИ OCOi

IIII & & & 8 * * #£ » ч ч4 b- b» r*w r> r> r>r>

8 8 8

V“ *- T- Т“ •Α Ά *> Q

а е <o tri

8 8 8 8

Cl 4 0» r> Г» £ £

8 v* r· «?

8 <*> CM

a <n <4 w α» <0

b.

cri

b*

4“ bl ci

CM w tn

σί

2 * (П r5	2 * “1 Г» r>	£ * •4 r>	ε # •4 rr>	2 # s	2 8	£ X 8	2 * 8	£ * 8	£ * 8	2 * 8
4 Ю	n tn	R tn	5	tn	s	OS'S	8 tn	8 tn	8 tn	8 ui

*

s s ci <*>

s s r> r>

S 8 « r> r>

c*>

o

d3gd|go|gd|gd

8? |8;

g.d J go

SjfSjjSjjS;

g.o j go I go 1 go

Пример 4

Приготвени бяха петдесет и два литра фармацевтичен състав за инжектиране, съдържащи 100 mg равновесна смес от Щн-пропил) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II на mL от състава, както следва. 16,584 kg вода за инжекции (качество USP) разпръсната с азот (качество NF) бяха добавени в съд от неръждаема стомана за смесване и разбъркването бе започнато. Използван бе също азот като атмосфера за намаляване излагането на разтвора в съда за смесване на кислорода по време на производството. Приблизително 1 kg безводна лимонена киселина (качество USP) бе прибавена към водата и получената смес бе разбърквана докато киселината се разтвори. Впоследствие към сместа бяха добавени 1.511 kg от 10 % (т/т) разтвор на солна киселина (качество NF) във вода (качество USP). Към разбъркваната смес бавно бяха прибавени 5.357 kg смес, съдържаща приблизително 97 % Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II (в съотношение от около 99:1), и 3 % едно '< или повече онечиствания, и бяха оставени да се разтворят. pH на получения разтвор бе нагласено до 7.0 ± 0.5 чрез добавяне 0.224 kg от 10 % (т/т) разтвор на солна киселина във вода. Равновесието на Ν-(Η-προπππ) изомера I и Ν-(ηпропил) изомера II бе постигнато чрез нагряване на разтвора до 70 °C ± 10 °C за 105 min. Щом равновесието бе постигнато, както бе установено с HPLC, разтворът бе оставен да се охлади до 25 °C ± 10 °C и към разбъркваната смес бяха добавени 26.008 kg пропиленгликол (качество USP). След като пропиленгликолът бе разбъркан напълно, към разтвора бяха прибавени 0.26 kg монотиоглицерол (качество NF) и pH повторно бе нагласено до 5.4 + 0.3 чрез добавяне на 2.349 kg от .10 % (т/т) солна киселина във вода. Крайният обем бе нагласен до 52.015 литра чрез добавяне 1.843 kg вода. Полученият състав съдържаше 100 mg равновесна смес от Щн-пропил) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II за mL от състава, 500 mg за mL пропиленгликол, лимонена киселина с концентрация от 0.1 Ми монотиоглицерол с концентрация от 5 mg/mL от състава.

Съставът бе филтруван през филтър от 6 микрона за предварително филтруване и после през краен стерилизиращ филтър от 0.2 микрона, който бе стерилизиран чрез влажностно-топлинно автоклавиране за 60 min при 121 °C и тестван за цялостта му като се използва метод с поддържане на налягане и преди стерилизацията, и след филтруване на продукта. Серумни стъклени флакони от 20 mL. кварц тип I (Wheaton Science Products, Millville, New Jersey), бяха стерилизирани и депирогенирани в тунелна сушилня при 250 °C за 240 min. Силиконизирани тапи от 20 mm 4432/50 сив хлоробутил (The West Company, Lionville, PA) бяха депирогенирани чрез промиване и бяха стерилизирани чрез влажностно-топлинно автоклавиране за 60 min при »

121 °C. Всеки от 2 525-те фпакона бе напъпнен при стерилни условия с 20 mL от получения състав плюс 0.6 mL препълване (20.6 mL/флакон е 2.06 g/флакон единица ефективност на фармацевтичния състав при 100 mg/mL равновесна смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II, базирана на действителна ефективност на серия от лекарствената субстанция от

97.1 %); горните пространства на флаконите бяха продухани с азот и флаконите бяха затворени с тапите и запечатани отгоре (20 mm алуминиеви уплътнения, продукт# 5120-1125, The West Company, Lionville, PA).

Пример 5

От около 0.125 mL до около 0.5 mL от фармацевтичен състав, имащ pH от 5.4 и съдържащ равновесна смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Ν-(ηпропил) изомер II, присъстваща в количество от 100 mg за mL от фармацевтичния състав, където 100 mg за mL е число за “фактическа ефективност; лимонена киселина присъстваща в количество от, 0.1 mmol за mL от фармацевтичния състав; солна киселина присъстваща в количество от 19.58 mg концентрирана киселина (сила от 36-38 тегл.%) за mL от фармацевтичния състав; натриев хидроксид, присъстващ в количество от 0.09 mg за 1.0 М разтвор на натриев хидроксид за mL от фармацевтичния състав; натриев хидроксид, присъстващ в количество от 0.09 mg за 10 М разтвор на натриев хидроксид за mL от фармацевтичния състав;

пропиленгликол присъстващ в количество от 501.25 mg. за mL от фармацевтичния състав и вода, присъстваща в количество от 418.20 mg за mL от фармацевтичния състав, бяха приложени на свине, инфектирани с Pasteurella multocida, за да се определи неговата терапевтична ефикасност. Както е използван тук, под Apotency-actual@ числото се разбират действителните mg за mL от съществено чиста смес или равновесна смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и ЬЦн-пропил) изомер II, присъстващи във фармацевтичния състав.

Петдесет клинично нормални и здрави прасета имащи съгласувано ζ* телесно тегло от приблизително 10 kg, бяха избрани от фонд от 60 животни.

Избраните животни (10 на третиране) бяха случайно определени за i

третиране и сортирани в кочини съответно. В ден 0, всяко животно бе заразено ендотрахеално с 25 mL Pasteurella multocida провокационна култура. Всяка серия животни бе инжектирана интрамускулно с еднократна доза от един от следните разтвори приблизително 1 h след заразяването: (1) около 1.5 mL стерилен 0.9 % натриев хлорид (физиологичен разтвор); (2) около 0.5 mL от 25 mg/mL данофлоксацин в доза от 1.25 mg/kg телесно тегло; (3) около 0.125 mL от фармацевтичния състав в доза от 1.25 mg/kg телесно тегло; (4) около 0.25 mL от фармацевтичния състав в доза от 2.5 mg/kg телесно тегло; или (5) около 0.5 mL от фармацевтичния състав в доза от 5 mg/kg телесно тегло. Само данофлоксацинът бе приложен отново във всеки от следващите два дни. Всички други лечения бяха дадени в инжекция с еднократна доза. Температурите и болестните оценки бяха записвани 6 h след въвеждането и веднъж дневно, започвайки 24 h след въвеждането. Животните, които развиха тежка пневмония (т.е., болестна оценка от 4) бяха евтанирани и описани като смъртност. Животните, които починаха по време на експеримента, бяха аутопсирани. Техните бели дробове бяха извадени и изследвани макроскопски за пневмонични поражения. Определена бе и бе записана една приблизителна оценка на процента на засегнатата белодробна тъкан. В ден 5 след въвеждането, всички преживели животни бяха евтанирани и аутопсирани, както бе описано по-горе.

Оценката на ефикасността бе установена на база сравнението на среднодневните болестни оценки, температурите и оценките за белодробните поражения. Разликите между леченията за среднодневните ректални температури и болестните оценки бяха преценени с анализ с повторни измервания на променливата. Разликите между средните оценки на белодробните поражения за всяко лечение бяха оценени при използване процедурата на факториален анализ на променливата. Сравнение на степените на смъртността между леченията бе осъществено с Chi-Square анализ и точен тест на Fisher.

Болестната симптоматика в това изследване бе относително тежка. Шест часа след въвеждането прасетата бяха депресирани, цианотични и показваха симптоми на задух. Ректалните температури бяха увеличени във всички третирани групи. Общата степен на смъртността за изследването бе 18 % (9/50 прасета). Изчисленията на среднодневните ректални температури не показаха статистически значителни разлики на тези значения измежду лекуваните групи. Въпреки че температурите бяха увеличени във всички групи 6 h след въвеждането, среднодневните температури за всички лекувани групи останаха в нормалния обхват. Животни, лекувани с фармацевтичния състав с 5 mg/kg телесно тегло или с

2.5 mg/kg телесно тегло, или с данофлоксацин, показаха статистически значителни (р<0.05) намаления на среднодневните болестни оценки (около 2) сравнени със среднодневните болестни оценки на животни, инжектирани с физиологичен разтвор (около 3). Не бяха наблюдавани. значителни разлики, когато се сравняват животни, лекувани с три дози данофлоксацин с животни, лекувани с еднократна доза от фармацевтичния състав при 5 mg/kg телесно тегло или 2.5 mg/kg телесно тегло. Сравненията на три лечения с фармацевтичния състав посочиха, че прасета лекувани с фармацевтичния състав с доза 5 mg/kg телесно тегло показаха статистически значителни (р<0.05) по-ниски клинични болестни оценки отколкото тези на прасета, лекувани с фармацевтичния състав с доза 1.25 mg/kg телесно тегло. Не бяха видяни значителни разлики в . болестните оценки между прасета, лекувани с фармацевтичния състав с 5 mg/kg или с фармацевтичния състав с 2.5 mg/kg телесно тегло.

Ефектите от различните лечения върху степените на смъртността и оценките за белодробните поражения са обобщени в Таблица 3 по-долу. Степените на смъртността варират от 0 % до 40 % в третираните животни. Четиридесет процента (4/10) от животните в контролната група третирана с физиологичен разтвор починаха от пневмония между 48 -' 72 h след въвеждането. Имаше едно починало в групата, лекувана с 2.5 mg/kg телесно тегло от фармацевтичния състав и 4 починали (40 %) в групата, лекувана с 1.25 mg/kg телесно тегло от фармацевтичния състав. Не се срещнаха починали в групите, лекувани с данофлоксацин или 5 mg/kg телесно тегло от фармацевтичния състав.

Средната оценка на белодробните поражения за контролните прасета, третирани с физиологичен разтвор, бе 44 %. Прасета, лекувани с данофлоксацин, или с 2.5 mg/kg телесно тегло, или с 5 mg/kg телесно тегло от фармацевтичния състав показаха статистически значителни (р<0.05) намаления в средните оценки за белодробните поражения, когато се сравняват с контролите с физиологичен разтвор. Когато се сравняват

I лекувани животни, животните, лекувани с данофлоксацин, или 2.5 mg/kg телесно тегло или 5 mg/kg телесно тегло от фармацевтичния състав, показаха статистически значителни (р<0.05) намаления в средните оценки на белодробните поражения, когато се сравняват с животни, лекувани с 1.25 mg/kg телесно тегло от фармацевтичния състав.

Таблица 3

Лечение (интрамускулна Смъртност Средна оценка на инжекция) белодробните поражения (%)

Физиологичен разтвор (1.5 ml)	4/10(40%)	44.0
Данофлоксацин (1.25 mg/kg)	0/10(0%)	1.9
Фармацевтичен състав	0/10(0%)	3.8
(5 mg/kg)
Фармацевтичен състав	1/10(10%)	6.6
(2.5 mg/kg)
Фармацевтичен състав	4/10 (40 %)	29.2
(1.25 mg/kg)

Пример 6

От около 1.25 mL до около 5.0 mL от фармацевтичния състав, имащ pH от 4.9 и съдържащ смес от Щн-пропил) изомер I и 1М-(н-пропил) изомер II в съотношение от около 95 % до около 99 % Щн-пропил) изомер I и от около 1 % до около 5 % Щн-пропил) изомер II, присъстващи в количество от 200 mg за mL фармацевтичен състав, където 200 mg за mL е числото за фактическа ефективност; лимонена киселина присъстваща в количество от 85.09 mg за mL фармацевтичен състав; пропиленгликол присъстващ в количество от 253.40 mg за mL фармацевтичен състав; и вода присъстваща в количество от 541.46 mg за mL фармацевтичен състав, бяха приложени на телета с естествено срещаща се бактериална респираторна болест при говедата. ·

Двеста и тринадесет телета (средно тегло от 200 kg) бяха закупени и смесени за приблизително 2-3 дни в мястото на събиране и превозени приблизително 1 000 мили с открита товарна платформа за доставяне при ветеринарните съоръжения. Не бе давано антибактериално лечение в който и да е момент по време на придобиването или обработката преди изследването. При пристигането, животните бяха разтоварени в приемни обори, маркирани на ухото и с предоставен достъп до вода и фуражен материал. Животните бяха ваксинирани с BOVISHIELD 4+L5 ваксина, съдържаща модифицирани живи вируси IBR, PI, BVD и BRSV, й бактерии, съдържащ 5 сервоварс срещу Leptospira (Pfizer Animal .Health). В допълнение, те бяха лекувани с антипаразитното средство DECTOMAX (Pfizer Animal Health) и имплантирани с растежен промотор (SYNOVEX-C, Syntex Laboratories). Започвайки от деня след пристигането, всички животни бяха наблюдавани ежедневно за клинични симптоми съответстващи на респираторна болест при говедата. Отделните животни показващи клинични симптоми на остра респираторна болест бяха подбрани (изтеглени) и техните ректални температури бяха записвани.

Критериите за избор за включване в изследването бяха клинично представяне съответстващо на остра респираторна болест (т.е. болестна оценка по-голяма от или равна на 1 и по-малка от 4) и хипертермия (ректална температура по-голяма от или равна на 104.0 °F (40 °C)). Веднъж избрани, животните бяха случайно разпределени към една от пет лечебни групи като бе използвано случайно блоково разпределение. Всички лечения бяха еднакво представени във всеки тестов обор (2 животни/лечение/обор). Всяка серия животни бе инжектирана субкутанно с еднократна дйза от един от следните разтвори в деня, когато селекционните критерии бяха изпълнени: (1) около 6.6 mL стерилен 0.9 % натриев хлорид (физиологичен разтвор); (2) около 6.6 mL MICOTIL 300 в доза от 10 mg/kg телесно тегло;

(3) около 1.25 mL фармацевтичен състав в доза от 1.25 mg/kg телесно тегло;

(4) около 2.5 mL фармацевтичен състав в доза от 2.5 mg/kg телесно тегло; или (5) около 5 mL фармацевтичен състав в доза от 5 mg/kg телесно тегло. Всички разтвори бяха приложени в субкутанна инжекция с еднократна доза. По време на периода на наблюдение след лечението, допълнително лекарство не бе прилагано. Температурите и болестните оценки бяха записвани ежедневно за всички животни 14 дни след лечението. Започвайки h след лечението, животните, които показват болестна оценка по-голяма от или равна на 1 и температура от 104.0 °F бяха идентифицирани като повторни извадки по време на анализа на данните. Животните, които развиха тежка пневмония (т.е., болестна оценка от 4) бяха евтанирани и описани като смъртност. Животните, които умряха по време на курса на експеримента бяха претеглени и аутопсирани. Техните бели дробове бяха извадени и изследвани макроскопски за пневмонични поражения. Определена бе и бе записана една приблизителна оценка на процента на засегнатата белодробна тъкан. Когато бе възможно, белодробни проби от типично болестни зони бяха събрани от всички животни за бактериологична култура. В ден 14, всички преживели животни бяха евтанирани. Животните бяха аутопсирани и техните бели дробове бяха оценени макроскопски за поражения, както е описано по-горе. Белодробните проби от всички животни бяха събрани за бактериологична култура. Представянето на животните бе определено чрез оценяване индивидуалния прираст в теглото. Всяко животно бе претеглено в дните 7 и 14.

Оценката на ефикасността бе определена на база анализ на среднодневните болестни оценки, температурите и оценките за белодробните поражения. Съотношението на успешните отговори във всяко лечение в ден 14 бе определено като първоначален брой животни за третиране минус броя на починалите и повторно извадените. Едно сравнение между лечебните групи на частта на животните във всяка група показващи болестна оценка от 0 (нормална), или по-голяма от или равна на 1 в ден 14, бе оценявано при цзползване на Chi-Square анализ и точен тест на Fisher. Разликите в температурата и прираста в теглото.между леченията бяха оценени при използване на ANOVA с повторени измервания. Сравнението на степените на смъртността и степента на отговорилите между лечебните групи също бе осъществено с Chi-square анализ и точен тест на Fisher.

Избухването на респираторната болест в това изследване на естествено заболяване, бе извънредно тежко. Степента на смъртността за контролите с физиологичен разтвор бе 75 %. Средната оценка на белодробните поражения на контролите с физиологичен разтвор бе 38.4 %. С течение на времето началото на клиничните признаци на болестта бе типично за това, наблюдавано нормално в търговски двор за хранене с телета на тази възраст и среда. Изчисленията на среднодневните ректални температури показаха статистически значителни (р<0.01) намаления в среднодневните ректални температури във всички лечебни групи, когато се сравняват с контролите с физиологичен разтвор. Температурите в лекуваните групи останаха по-ниски от тези на контролите с физиологичен разтвор в течение на 7-мия ден от изследването. Животните, лекувани или с

2.5 mg/kg, или с 5 mg/kg фармацевтичен състав, показаха значително (р<0.01) по-ниски среднодневни ректални температури, отколкото животните лекувани с MICOTIL. Температурните отговори на животни, лекувани с 1.25 mg/kg фармацевтичен състав бяха подобни на тези на контролите с MICOTIL. Терапевтичното лечение на животни или с MICOTIL, или с фармацевтичен състав при всякакво ниво на дозата имаше , за резултат значителни (р<0.01) намаления на среднодневните болестни оценки сравнени с контролите с физиологичен разтвор. Когато се сравняват тези лечения, телета лекувани с фармацевтичния състав с 2.5 mg/kg показаха значително (р<0.05) намалени среднодневни болестни оценки, сравнени с лекуваните с MICOTIL телета. Телета, лекувани с фармацевтичния състав или с 1.25 mg/kg, или с 5 mg/kg показаха среднодневни болестни оценки, които бяха подобни на тези за телета, лекувани с MICOTIL₄

Данните за степените на повторно извадените, смъртността и белодробните поражения са обобщени в Таблица 4 по-долу. Седемдесет и пет процента от контролите с физиологичен разтвор отговарят на критериите за повторно изваждане в това изследване. Прилагането на MICOTIL или фармацевтичен състав с 1.25 mg/kg доведе до намаления в заболеваемостта на повторно извадените (55 % и 40 %, съответно) спрямо контролите с физиологичен разтвор. В противоположност, степените за повторно извадените животни, лекувани или с 2.5 mg/kg, или с 5 mg/kg фармацевтичен състав бяха значително (р<0.01) по-ниски отколкото тези на контролите с физиологичен разтвор. Степените за повторно, извадените животни, лекувани с 2.5 mg/kg фармацевтичен състав бяха значително пониски отколкото онези, наблюдавани с MICOTIL. Степените за повторно извадените животни, лекувани или с 1.25 mg/kg, или с 5 mg/kg фармацевтичен състав, бяха намалени спрямо MICOTIL. Петнадесет от двадесет (75 %) третирани с физиологичен разтвор контролни телета загинаха от пневмония по време на курса на изследването. Прилагането на MICOTIL доведе до значително (р<0.01) намаление в броя на смъртните случаи (25 %) спрямо контролите с физиологичен разтвор. Значителни (р<0.01) намаления в смъртността спрямо контролите с физиологичен разтвор също бяха наблюдавани за всички три групи животни, лекувани с фармацевтичен състав. Степените на относителна смъртност бяха значително (р<0.05) по-ниски за животни, лекувани с фармацевтичен състав прилаган с 5 mg/kg спрямо лекувани с MICOTIL телета. Двете по-ниски дози на фармацевтичния състав обезпечиха намаления в смъртността спрямо MICOTIL. Средната оценка на белодробните поражения на лекуваните с физиологичен разтвор телета бе 38.4 %. Животни, лекувани или с MICOTIL, или с фармацевтичен състав при всякакво ниво на дозата, показаха значителни (р<0.01) намаления в средните оценки за белодробните поражения спрямо контролите с физиологичен разтвор. Фармацевтичният състав приложен или с 2.5 mg/kg, или с 5 mg/kg обезпечи намаления в средните оценки за белодробните поражения спрямо MICOTIL. Оценките за белодробните поражения за животни, лекувани с 1.25 mg/kg фармацевтичен състав бяха подобни на тези за животни, лекувани с MICOTIL.

MIK*'

Лечение (субкутанна инжекция)

Таблица 4

Степен на Степен на Оценка на повторно смъртност белодробните извадени поражения

Физиологичен разтвор	15/20 (75 %)	15/20 (75 %)	38.4 %
(6.6 mL)
MICOTIL	11/20 (55%)	5/20 (25 %)	: 18.0 %
(10 mg/kg)
Фармацевтичен	8/20 (40 %)	1/20 (5 %)	’ 14.0 %
Състав
(1.25 mg/kg)
Фармацевтичен	2/20 (10 %)	1/20 (5 %)	8.6 %
Състав
(2.5 mg/kg)
Фармацевтичен	6/20 (30 %)	0/20 (0 %)	8.9%
Състав
(5 mg/kg)
Частта на отговорилите за всяко	лечение бе	изчислена чрез
изваждане броя на	смъртните случаи	и повторно	извадените от
първоначалния брой животни за третиране.	Степените на	отговорилите са

обобщени в Таблица 5. Двадесет и пет процента от животните, лекувани с MICOTIL посрещнаха критериите за отговорили. Степените на отговорилите t

за животни, лекувани или с 2.5 mg/kg, или с 5 mg/kg фармацевтичен състав бяха значително (р<0.01 и р<0.05. съответно) подобрени спрямо животните, лекувани с MICOTIL. Степента на отговорилите за животни, лекувани с 1.25 mg/kg фармацевтичен състав бе по-голяма от тази, наблюдавана за лекувани с MICOTIL животни. Като клинично здрави телета бяха дефинирани онези с болестна оценка от нула в ден 14 (Таблица 5). В това изследване, само една от контролите с физиологичен разтвор бе клинично здрава в ден 14. Терапевтичното прилагане на MICOTIL осигури увеличение в броя на здравите животни в ден 14. Частта на животните; които бяха характеризирани като клинично здрави в ден 14 във всяко от леченията с фармацевтичен състав бе значително (р<0.05) по-голяма от частта в контролната група, третирана с физиологичен разтвор. Подобно, частта на клинично здравите животни във всички групи за лечение с фармацевтичен състав бе по-голяма от частта на клинично здравите животни в групата на MICOTIL.

Таблица 5

Лечение	Степен на отговорилите	Съотношение на клинично здравите животни
Физиологичен разтвор (6.6 mL)	3/20 (15%)	1/20(5%)
MICOTIL	5/20 (25 %)	4/20 (20%)
(10mg/kg)
Фармацевтичен състав	12/20 (60)	9/20 (45 %)
(1.25mg/kg)
Фармацевтичен състав	17/20 (85 %)	8/20 (40 %)
(2.5 mg/kg)
Фармацевтичен състав	14/20 (70 %)	8/20 (40 %)

(5 mg/kg)

Таблица 6 по-долу, обобщава ефектите от терапевтичното лечение върху прираста в теглото на 7- и 14-ден. Животни, лекувани или с MICOTIL, или с фармацевтичен състав показаха значително (р<0.01) увеличен среднодневен прираст и за двата дни 7 и 14, спрямо контролите с физиологичен разтвор. Животни, лекувани или с 2.5 mg/kg, или с 5 mg/kg фармацевтичен състав показаха подобрен прираст в теглото спрямо животни, лекувани с MICOTIL. Животни, лекувани с 1.25 mg/kg фармацевтичен състав показаха подобен прираст в теглото като тези, лекувани с MICOTIL.

Таблица 6

Лечение	Среднодневен прираст в теглото в продължение на 7 дни (kg/ден)	Среднодневен прираст в теглото в продължение на 14 дни (kg/ден)
Физиологичен разтвор (6.6 mL)	-1.18	0.3.6
MICOTIL (10mg/kg)	0.60	0.78
Фармацевтичен Състав (1.25mg/kg)	0.71	0.77
Фармацевтичен Състав (2.5 mg/kg)	1.00	1.20
Фармацевтичен Състав (5 mg/kg)	1.20	1.3’5

Пример 7

От около 1.25 mL до около 5 mL от фармацевтичния състав, имащ pH 6.0 и съдържащ смес от Щн-пропил) изомер I и Ν-(Η-προπππ) изомер II в съотношение от около 95 % до около 99 % И-(н-пропил) изомер I и от около 1 % до около 5 % И-(н-пропил) изомер II, присъстващ в количество от 200 mg за mL фармацевтичен състав, където 200 mg за mL е числото за “фактическа ефективност; лимонена киселина присъстваща в количество от 60.00 mg за mL фармацевтичен състав; пропиленгликол присъстващ в количество от 251.01 mg за mL фармацевтичен състав; и вода присъстваща в количество от 569.00 mg за mL фармацевтичен състав, бяха приложени на телета в повишен риск за развитие на бактериална респираторна болест при говедата.

Двеста двадесет и две телета (средно тегло от 200 kg) бяха закупени, смесени за приблизително 2-3 дни в мястото на събиране и превозени приблизително 1 000 мили с открита товарна платформа за доставяне при ветеринарните съоръжения. Не бе давано анти-бактериално лечение в който и да е момент по време на придобиването или обработката преди изследването. При пристигането, животните бяха разтоварени в приемни обори, маркирани на ухото и с предоставен достъп до вода и фуражен материал. Всички животни бяха ваксинирани с BOVISHIELD 4+L5 ваксина, съдържаща модифицирани живи вируси IBR, PI, BVD и BRSV, и бактерии съдържащ 5 сервоварс срещу Leptospira (Pfizer Animal Health). В допълнение, те бяха лекувани с антипаразитното средство DECTOMАХ (Pfizer Animal Health). На следващия ден след пристигането (ден 0), клиничното състояние на всяко животно бе оценено и болестната оценка записана. В деня на разпределението (ден 0), животните, които показаха признаци на изтощение, включително лека депресия или липса на храна в търбуха, в отсъствието на клинични признаци на болестта, не бяха квалифицирани за болестна оценка по-голяма от или равна на 1. Животните, които показват болестна оценка от по-малко от или равна на 1 и телесна температура от по-малко от 104.0 °F бяха избрани за включване в изследването. Веднъж избрани, животните бяха случайно разпределени към една от пет лечебни групи (20 телета на група) при използване на систематично случайно блоково разпределение. Първите десет избрани животни бяха отделени за първия обор. Следващите животни бяха отделени за обори в групи от десет, докато се напълниха всички обори. Всеки обор съдържаше едно или повече животни и формираше всяка група за лечение. Всяко тегло, телесна температура и болестна оценка на животните бяха записани преди лечението в ден 0. Всяка серия животни бе инжектирана субкутанно с еднократна доза от един от следните разтвори, в рамките на първите 30 h след пристигането: (1) около 6.6 mL стерилен 0.9% натриев хлорид (физиологичен разтвор); (2) около 6.6 mL MICOTIL; (3) около 1.25 mL фармацевтичен състав в доза от 1.25 mg/kg телесно тегло; (4) около

2.5 mL фармацевтичен състав в доза от 2.5 mg/kg телесно тегло; или (5) около 5 mL фармацевтичен състав в доза от 5 mg/kg телесно тегло. Всички разтвори бяха приложени чрез инжекция с еднократна доза. Наблюденията за толерантност в акутно място на инжектиране бяха правени 24 и 48 h след инжекцията. Температурите и болестните оценки бяха записвани ежедневно за всички животни. Животните, които показаха болестна оценка по-голяма от или равна на 1 и температура по-голяма от или равна на 104 °F бяха идентифицирани като нездрави (извадени) по време на анализа^;на данните. Животните, които развиха тежка пневмония (т.е., болестна оценка от 4) бяха евтанирани и описани като смъртност. Животните, които умряха по време на курса на експеримента бяха претеглени и аутопсирани. Техните бели дробове бяха извадени и изследвани макроскопски за пневмонични поражения. Определена бе и бе записана една приблизителна оценка на процента на засегнатата белодробна тъкан. Където бе възможно, белодробни проби от типично болестни зони от белия дроб бяха събрани от всички животни за бактериологична култура. В ден 14, всички преживели С животни бяха евтанирани и аутопсирани, и белодробните проби бяха оценени макроскопски за поражения и събрани за бактериологична култура както е описано по-горе. Представянето на животните бе определено чрез оценяване индивидуалния прираст в теглото. Всяко животно бе претеглено в дните 7 и 14.

Оценката на ефикасността бе установена на база, сравнението на среднодневните болестни оценки, температурите и оценките за белодробните поражения. Частта на успешните отговори във всяко лечение в ден 14 бе установена като първоначален брой животни за третиране минус броя на починалите и извадените. Едно сравнение между лечебните групи на частта на животните във всяка група, показваща болестна оценка от 0 (нормална) или по-голяма от или равна на 1 в ден 14, бе оценявано при използване на Chi-Square анализ и точен тест на Fisher. Разликите в температурата и прираста в теглото между леченията бяха оценени чрез ANOVA с повторени измервания. Сравнението на смъртността, заболеваемостта и степента на отговорилите между леченията също бе осъществено при използване на Chi-Square анализ и точен тест на Fisher.

Избухването на респираторна болест в това изследване на естествено заболяване бе умерено тежко. Степента на заболеваемост за контролите с физиологичен разтвор бе 60 %, и 25 % от тези животни умряха от остра пневмония. Средната оценка на белодробните поражения на контролите с физиологичен разтвор бе 24.3 %. С течение на времето началото на клиничните признаци на болестта бе типично за това, наблюдавано нормално в търговски двор за хранене с телета на тази възраст и обкръжение. Статистически значителни (р<0.01) намаления в среднодневните ректални температури бяха забелязани във всички лечебни групи, когато се сравняват с контролите с физиологичен разтвор. Температурите в лекуваните групи останаха по-ниски от тези на контролите с физиологичен разтвор през цялото време на 10-тия ден от изследването. Животни, лекувани с която и да е от трите дози на фармацевтичния състав, показаха статистически значителни (р<0.01) по-ниски среднодневни ректални температури, отколкото тези на животните, лекувани с MICOTIL. Размерът на разликите бе най-голям за животни, лекувани или с 2.5 mg/kg, или с 5 mg/kg фармацевтичен състав. Метафилактичното лечение на телета или с MICOTIL, или с фармацевтичен състав имаше за резултат значителни (р<0.01) намаления на среднодневните болестни оценки сравнени с контролите с физиологичен разтвор. Когато се сравняват антибиотичните лечения, телетата, лекувани с 5 mg/kg фармацевтичен състав показаха статистически значителни (р<0.01) намаления в среднодневните болестни оценки сравнени с животните, лекувани с MICOTIL. Отговорите - болестни оценки, на животни лекувани или с 1.25 mg/kg, или с 2.5 mg/kg фармацевтичен състав, бяха подобни на тези на телета, лекувани с MICOTIL. ’

Степените на заболеваемост, степените на смъртност и данните за оценка на белодробните поражения са обобщени в Таблица 7 по-долу. В това изследване на природна инфекция с умерена тежест, контролите с физиологичен разтвор показаха 60 % заболеваемост. Всички антибиотични лечения показаха значителни (р<0.05) намаления в заболеваемостта спрямо контролите с физиологичен разтвор. Животни, лекувани с фармацевтичен състав показаха числени намаления в заболеваемостта спрямо контролите с MICOTIL; обаче никои от разликите не бяха статистически значителни. Шест от двадесет (30 %) контролни телета с физиологичен разтвор умряха от бронхопневмония по време на курса на изследването. Прилагането на MICOTIL доведе до намаление в броя на смъртните случаи спрямо контролите с физиологичен разтвор. Значителни (р<0.05) намаления в смъртността спрямо контролите с физиологичен разтвор бяха наблюдавани за всички три групи животни, Лекувани с фармацевтичен състав. Средната оценка на белодробните поражения за контролните телета с физиологичен разтвор бе 24.3 %.. Животни, лекувани с MICOTIL или фармацевтичен състав показаха значителни (р<0.01) намаления в средните оценки за белодробните поражения спрямо контролите с физиологичен разтвор. Телета, лекувани с фармацевтичния състав с 5 mg/kg, показаха значително (р<0.05) по-ниски оценки за белодробните поражения отколкото животните, лекувани с MICOTIL. Животни, лекувани или с 1.25 mg/kg, или с 2.5 mg/kg фармацевтичен състав, показаха намаления в средните оценки за белодробните поражения спрямо телета лекувани с MICOTIL.

Таблица 7

Лечение	Степен на заболеваемост	Степен на смъртност	Оценка на белодробните поражения
Физиологичен	12/20 (60 %)	6/20 (30 %)	24.3%
разтвор (6.6 mL) MICOTIL	5/20 (25 %)	1/20 (5 %)	10.4%
(10 mg/kg) Фармацевтичен	1/20 (5 %)	0/20 (0 %)	3.4 %
състав (1.25 mg/kg) Фармацевтичен	3/20 (15 %)	0/20 (0 %)	5.3 %
състав (2.5 mg/kg) Фармацевтичен	2/20 (10 %)	0/20 (0 %)	2.0 %
състав (5 mg/kg) Частта на	отговорилите	за всяко лечение бе изчислена чрез

изваждане броя на смъртните случаи и извадените, от първоначалния брой животни за третиране. Степените на отговорилите са обобщени в Таблица

8. Разликите в относителната степен на отговорилите, наблюдавани за различните лечения бяха подобни на разликите зд степените на заболеваемост. Като клинично здрави телета бяха дефинирани тези с болестна оценка от нула в ден 14. В това изследване само една от контролите с физиологичен разтвор бе клинично здрава в ден 14. Значително (р<0.01) по-голяма част от животните, лекувани или с MICOTIL или с фармацевтичен състав бе наблюдавано, че е клинично здрава в ден спрямо контролите с физиологичен разтвор. Подобно, по-голяма част от животните, лекувани с всяка от дозите на фармацевтичния състав бяха определени, че са клинично по-здрави, отколкото онези, лекувани с MICOTIL. Обаче тези разлики не бяха статистически значителни (р>0.05).

Таблица 8

Лечение	Степени на	Съотношение на клинично
	отговорилите	здравите животни
Физиологичен разтвор	8/20 (40 %)	1/20 (5 %)
(6.6 mL)
MICOTIL	15/20 (75 %)	10/20(50%)
(10mg/kg)
Фармацевтичен състав	19/20 (95 %)	14/20 (70%)
(1.25mg/kg)
Фармацевтичен състав	17/20 (85 %)	13/20 (65%)
(2.5 mg/kg)		•
Фармацевтичен състав	18/20 (90%)	14/20 (70 %)
(5 mg/kg)

Таблица 9 обобщава ефектите от метафилактичното лечение върху прираста в теглото на 7- и 14-ден. Животни, лекувани или с MICOTIL, или с фармацевтичен състав, показаха значително (р<0.05) увеличен среднодневен прираст и в двата дни 7 и 14, спрямо контролите с физиологичен разтвор. Отговорите в прираста на тегло за · различните антибиотични лечения бе подобен.

Таблица 9

Лечение	Среднодневен прираст	Среднодневен прираст
	в продължение на 7	в продължение на 14
	дни (kg/ден)	дни (kg/ден)
Физиологичен разтвор	0.21	0.46
(6.6 mL)
MICOTIL	1.15	0.94
(10mg/kg)
Фармацевтичен състав	1.09	1.20
(1.25mg/kg)
Фармацевтичен състав	0.96	1.00
(2.5 mg/kg)
Фармацевтичен състав	1.55	1.25

(5 mg/kg)

Акутните инжекционни места бяха изследвани на 24 и 48 .час и бяха направени оценки като се използва следната скала: 0 = не бе наблюдавана засегната (подуване/възпаление) площ ; 1 = малко засегната площ (подуване/възпаление) - по-малка от 6 инча (1 инч = 2.54 см) в диаметър;

= средно засегната площ (подуване/възпаление) - 6-8 инча в диаметър;

= голяма засегната площ (подуване/възпаление) - по-голяма от 8 инча в диаметър; 4 = извънредно засегната площ (подуване/възпаление) - поголяма от 8 инча и/или разпространяваща се в месото или причиняваща осакатяване. Степените бяха определени в зависимост от размера и обхвата на остро засегнатата площ. Оценките на 24 и 48 час са обобщени в Таблица 10. В това изследване бе оценена статистическата значимост на разликите в резултатите за частта на животните във всяко лечение, поголеми от или равни на 2, двадесет и четири часа след инжекцията. Нямаше статистически значителни разлики между леченията. Обаче, броят на анормалните инжекционни места бе по-голям за животни, лекувани с MICOTIL, отколкото за животни, лекувани с фармацевтичен състав.

	Таблица 10 24-часова оценка	48-часова оценка
Лечение	0	1	2 3	4	0	1	2	3	4
Физиологичен разтвор (6.6 mL)	100%	0%	0% 0%	0%	100%	0%	0%	0%	0 %
MICOTIL (10 mg/kg)	80%	15%	5% 0%	0%	95%	5%	0 %	0%	0%
Фармацевтичен състав	100%	0%	0% 0%	0%	100 %	0 %	0 %	0 %	0 %
(1.25 mg/kg)
Фармацевтичен състав	100%	0%	0% 0%	0%	100%	0%	0%	0%	0%
(2.5 mg/kg)							ί
Фармацевтичен състав	100%	0%	0% 0%	0%	100%	0%	0%	0%	0%
(5 mg/kg)
		Пример 8

От около 0.5 mL до около 2 mL от фармацевтичния състав имащ pH от

6.1 и съдържащ смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и Щн-пропил) изомер II в съотношение от около 95 % до около 99 % от Щн-пропил) изомер I и от около 1 % до около 5 % от Щн-пролил) изомер II, присъстваща в количество от 50 mg за mL фармацевтичен състав, където 50 mg за mL е числото за “фактическа ефективност; лимонена киселина присъстваща в количество от 15.00 mg за mL фармацевтичен състав; пропиленгликол присъстващ в количество от 250.13 mg за mL фармацевтичен състав; и вода присъстваща в количество от 734.43 mg за mL фармацевтичен състав бяха приложени на прасета в риск за развиване на инфекция от Actinobacillus pleuropneumoniae.

Сто и тридесет клинично здрави прасета, имащи средно телесно тегло от приблизително 10 kg бяха закупени, идентифицирани чрез маркиране на ухото и събрани на мястото за изследване 2 дни преди изследването да започне. В ден -1, всички животни бяха претеглени и 100 животни бяха избрани за съгласувано телесно тегло (около 10 kg) и липса на симптоми на клинични анормалности. Избраните животни (20 на лечение) бяха случайно определени за лечение и сортирани в индивидуални кочини. Една група от 25 допълнителни животни бяха случайно отделени като прасета разпространители (5 на третиране). В ден 0, животните бяха Инжектирани интрамускулно с еднократна доза от един от следните разтвори: (1) около

1.5 mL стерилен 0.9% натриев хлорид (физиологичен разтвор); (2) около 0.5 mL от 25 mg/mL данофлоксацин в доза от 1.25 mg/kg телесно тегло; (3) около 0.5 mL фармацевтичен състав в доза от 2.5 mg/kg телесно тегло; (4) около 1 mL фармацевтичен състав в доза от 5 mg/kg телесно тегло; или (5) около 2 mL фармацевтичен състав в доза от 10 mg/kg телесно тегло. Само данофлоксацинът бе повторно приложен във всеки от следващите два дни. Всички други лечения бяха приложени като инжекция с еднократна доза. Едновременно, в ден 0, 25 прасета разпространители бяха заразени с 3 mL/ноздра от Actinobacillus pleuropneumonia провокационна култура. Към всяка кочина с по 20 изследвани животни бяха вкарани по пет инфектирани животни разпространители. Изследваните животни и прасетата разпространители бяха събрани. Прасетата разпространители, които умряха по време на изследването, бяха отстранени от кочините. На 48 h след въвеждането, преживелите прасета разпространители бяха извадени от кочините за лечение и евтанирани. Температурите и болестните оценки бяха записвани ежедневно. Животните, които умряха по време на курса на експеримента бяха аутопсирани. Белите дробове бяха извадени и

Ci изследвани макроскопски за пневмонични поражения. Определена бе и бе записана една приблизителна оценка на процента на засегнатата белодробна тъкан. Животните с оценка на белодробните поражения поголяма от или равна на 5 %, бяха считани като патологични. В ден 7, всички преживели животни бяха евтанирани. Животните бяха аутопсирани и белите дробове извадени и изследвани макроскопски за пневмонични поражения.

Оценката на ефикасността бе определена на база сравнението на среднодневните болестни оценки, температурите и оценките за белодробните поражения. Разликите между обработките за среднодневните ректални температури и болестните оценки бяха оценени чрез анализ на променливите с повторни измервания. Едно сравнение между лечебните

групи на частта от животните във всяка група, показващи болестна оценка от 0 (нормална) или по-голяма от или равна на 1 в ден 7, бе направено с използване на Chi-Square анализ и точен тест на Fisher. Сравненията на заболеваемостта (по-голяма от или равна на 5 % оценка на белодробните поражения) и степените на смъртност между лечебните групи, бяха осъществени с използване на Chi-Square анализ и точен тест на Fisher.

Осемдесет процента от прасетата разпространители умряха от пневмония в рамките на 24 h от заразяването, сочещо адекватно излагане на изследваните животни на бактериалния патоген. Температурата на прасетата, лекувани с физиологичен разтвор започна да се повишава в ден 1 след излагането и остана значително увеличена през времетраенето на изследването, в сравнение с групите, лекувани с фармацевтичен състав и данофлоксацин. Среднодневните ректални температури за групите, лекувани с фармацевтичен състав с 5 mg/kg и с 10 mg/kg бяха значително (р<0.05) по-ниски от тези на лекуваните с данофлоксацин прасета. Начални намаления на температурата се срещаха в прасета, лекувани с фармацевтичния състав с 2.5 mg/kg, в сравнение с прасетата, лекувани с данофлоксацин. Обаче разликите в среднодневните ректални температури между тези две лечения не бяха статистически Значителни (р>0.05). Статистически значителни (р<0.05) увеличения : в среднодневните болестните оценки бяха забелязани в прасетата, лекувани с физиологичен разтвор, когато бяха сравнени с животните, лекувани с данофлоксацин и фармацевтичен състав. Обаче нямаше разлики в среднодневните болестни оценки между прасетата, лекувани с данофлоксацин и фармацевтичен състав. Едно сравнение между лечебните .групи на частта на животните във всяка група, показващи болестна оценка от 0 (нормална) или по-голяма от или равна на 1 в ден 7, не показа разлики между която и да е от лекуваните групи.

Данните, обобщаващи заболеваемостта и степените на смъртност са представени в Таблица 11. Критериите за заболеваемостта бяха установени от прасетата, имащи средна оценка на белодробните поражения по-голяма от или равна на 5 %. Едно статистически значително (р<0.05) увеличение на степента на заболеваемост бе видяно в контролната група, третирана с физиологичен разтвор в това изследване, сравнено с прасетата, лекувани с данофлоксацин и фармацевтичен състав. Обаче нямаше разлики в степените на заболеваемост между прасетата, лекувани с данофлоксацин и

фармацевтичен състав.	Таблица 11
Лечение	Съотношение на заболелите прасета

Физиологичен разтвор (1.5 mL) 13/20 (65 %)

Данофлоксацин (1.25 mg/kg)

Фармацевтичен състав (2.5 mg/kg)

Фармацевтичен състав (5 mg/kg)

Фармацевтичен състав (10 mg/kg)

6/20 (30 %)

1/20 (5 %)

5/20 (25 %)

Ефектите от различните лечения върху степените на смъртността и оценките за белодробните поражения са обобщени в Таблица 12 по-долу. Средната оценка за белодробни поражения за контролните прасета лекувани с физиологичен разтвор бе 22.2 %. Прасетата, лекувани с данофлоксацин и фармацевтичен състав показаха статистически значителни (р<0.05) намаления в средните оценки за белодробните поражения, когато се сравняват с контролите с физиологичен разтвор. Обаче нямаше статистически значителни (р<0.05) разлики в средните оценки за белодробните поражения между прасетата, лекувани с данофлоксацин и фармацевтичен състав.

Таблица 12

Лечение

Смъртност

Средна оценка на белодробните Поражения

Физиологичен разтвор (1.5 mL)	2/20 (10 %)	22.2 %
Данофлоксацин (1.25 mg/kg)	0/20 (0 %)	4.8 %
Фармацевтичен състав	0/20 (0 %)	4.6 %
(2.5 mg/kg)
Фармацевтичен състав	0/20 (0 %)	0.6 %·
(5 mg/kg)
Фармацевтичен състав	0/20 (0 %)	3.1%;

(10 mg/kg)

Пример 9

От около 3 mL до около 6 mL от фармацевтичния състав с рН от 5.4 и съдържащ равновесна смес от Ν-(Η-προπππ) изомер I и И-(н-пропил) изомер II, присъстваща в количество от 100 mg за mL фармацевтичен състав, където 100 mg за mL числото за фактическа ефективност; лимонена киселина присъстваща в количество от 0.1 mmol за mL фармацевтичен състав; солна киселина присъстваща в количество от 19.58 mg концентрирана киселина (сила 36 - 38 тегл.%) за mL фармацевтичен състав; натриев хидроксид присъстващ в количество от 0.09 mg от 1.0 М разтвор на натриев хидроксид за mL фармацевтичен състав; натриев; хидроксид присъстващ в количество от 0.09 mg от 10 М разтвор на натриев хидроксид за mL фармацевтичен състав; пропиленгликол присъстващ в количество от 501.25 mg за mL фармацевтичен състав; и вода присъстваща в количество от 418.20 mg за mL фармацевтичен състав, бяха приложени на телета заразени с 2 mL кокцидиална провокационна култура, съдържаща 125 000 спорулирани ооцисти с видова процентна сума от 93 % Eimeria bovis, 4 % Eimeria aubumenis и 3 % Eimeria zuemii кокцидиеви ооцисти.

Шестдесет телета, които преди това не са били подлагани на научни изследвания, тежащи приблизително 110 - 125 kg бяха закупени от местни млечни ферми, претеглени, идентифицирани чрез маркиране на ухото и наблюдавани за общи здравни оценки. Животните, счетени за физически анормални, недоразвити или умиращи при пристигането бяха изключени от изследването. Телетата бяха поместени в пет обора (12 животни/обор). Телетата бяха държани 7 дни преди да бъдат заразени, за да ги аклиматизират към съоръженията. Преди заразяването по усмотрение на изследователя от изследването бяха изключени телета. В дните -6, -4 и 2 V преди заразяването, бяха добити фекални проби за полуколичествени ооцистни преброявания. В ден -4 преди въвеждането, ако присъстват ооцисти, бе определен вида им.

В ден 8 след пристигането (ден 0 на изследването), телетата бяха инокулирани орално с култура от Eimeria. Започвайки в ден 1, температурите бяха определени и записвани в приблизително същото време всеки ден за времетраенето на изследването. Резултатите за i

положението, хидратирането и фекалната консистентност бяха оценявани ежедневно. След въвеждането, фекалните проби бяха събрани в дните 2, 4, 6, 8 и 10. Видовете ооцисти бяха определени в ден 10 след въвеждането. В V, ден 10 след въвеждането, петдесет животни бяха случайно разпределени към една от пет лечебни групи, като бе използвано случайно блоково разпределение. Леченията бяха еднакво представени във всеки обор. Животните бяха инжектирани субкутанно с еднократна доза от един от следните разтвори: (1) около 4 mL стерилен 0.9 % натриев хлорид (физиологичен разтвор); (2) около 4 mL от 300 mg/mL MICOJIL в доза от 10 mg/kg телесно тегло; (3) около 6 mL фармацевтичен състав в доза от 5 mg/kg телесно тегло; (4) около 3 mL фармацевтичен състав в доза от 2.5 mg/kg телесно тегло; или на животните бе дадена орално доза за животни с (5) около 2 унции (1 унция - 0.02957 L) ампролиум като 9.6 % орален разтвор в доза от 10 mg/kg телесно тегло. Само ампролиумът бе прилаган отново във всеки от следващите четири дни. Всички други лечения бяха дадени като инжекция с еднократна доза. Бяха изследвани фекални проби полуколичествено след лечението за излъчване на кокцидиеви ооцисти в дните 12, 14, 16 и 18. Започвайки в ден 19 и продължавайки до ден 28, дневните фекални проби бяха оценени с полуколичествени преброявания. Определянето на изхвърлените ооцисти бе осъществено в дните 19 - 21, 23, 26 и 28. Телетата, които умряха по време на курса на изследването или които бяха евтанирани поради умиращо състояние, свързано с клинична кокцидиоза, бяха преброени като смъртности. Смъртните случаи бяха С аутопсирани и обемистите находки бяха записвани. В края на изследването в ден 28, всички останали животни бяха претеглени, евтанирани и изследвани пост-мортално.

Оценката на лекарствената ефективност бе определена на база анализ на среднодневните клинични резултати, температура и изхвърляне на ооцисти. Разликите в клиничните резултати и температурата между различните лечения бяха оценени чрез ANOVA с повторни измервания. Разликите в прираста на тегло бяха определени с факториална ANOVA. Сравнението на степените на смъртност и изхвърлянето на ооцисти между леченията бе осъществено с използване на Chi-Square анализ и точен тест С на Fisher. :

В ден 19 след въвеждането бе определено изхвърлянето на ооцисти. Среднодневните ректални температури за всяко лечение останаха в нормалния обхват през времетраенето на изследването. Не бяха открити значителни разлики (р>0.05) между лечебните групи. Оценките на клиничните резултати включваха резултати за фекалната консистенция, хидратирането и положението. Положението и фекалните резултати посочиха, че телета лекувани с MICOTIL, ампролиум или фармацевтичен състав при всяко ниво на дозата отговориха благоприятно на лечението, сравнени с контролните телета с физиологичен разтвор. Увеличенията във фекалните резултати, резултатите за хидратирането и резултатите за положението съответстваха на времето на откриваемото изхвърляне на ооцисти (ден 19). Животни, лекувани с ампролиум, MICOTIL или фармацевтичен състав при каквото и да е ниво на дозата, показаха статистически значителни намаления (р<0.05) в среднодневните резултати за фекална консистенция сравнени с лекуваните с физиологичен разтвор телета. Увеличените фекални резултати се срещаха 2-3 дни преди изхвърлянето на ооцисти и останаха повишени през цялото време на 28дневното изследване. Не бяха открити разлики при сравняване· на телета лекувани с ампролиум, MICOTIL или фармацевтичен състав. Телета W лекувани с ампролиум показаха статистически значителни намаления (р<0.05) в среднодневните резултати за хидратиране, сравнени с лекуваните с физиологичен разтвор телета. Не бяха забелязани разлики в резултатите за хидратиране между телетата, лекувани с ампролиум, MICOTIL или фармацевтичен състав. Лечението на телета с ампролиум, MICOTIL или фармацевтичен състав при каквото и да било ниво на дозата имаше за резултат значителни намаления (р<0.05) в среднодневните резултати за положението, сравнени с контролите с физиологичен разтвор. Разлики в резултатите за положението бяха отбелязани между телета, лекувани с ампролиум и физиологичен разтвор по времето на пиковото С ооцистно изхвърляне. Животни, лекувани с MICOTIL или фармацевтичен състав при каквото и да било ниво на дозата, показаха числено намаление в резултатите за положението спрямо контролните телета с физиологичен разтвор по време на последните седем дни от изследването. Не бяха забелязани значителни разлики (р>0.05) между лечебните групи с MICOTIL, ампролиум или фармацевтичен състав.

Степените на смъртност са обобщени в Таблица 13. Пет телета умряха поради кокцидиоза в това изследване. Три телета умряха в ден 23 след въвеждането и две телета умряха в ден 28 след инфекцията. Две животни умряха във всяка от лечебните групи с физиологичен разтвор и MICOTIL. Едно животно в групата, лекувана с ампролиум умря по време на курса на изследването. Нямаше смъртност измежду животните, лекувани с фармацевтичен състав. Нямаше статистически значителни (р>0.05) разлики в степените на смъртност измежду лекуваните не с физиологичен разтвор животни.

Таблица 13

Лечение Смъртност

Физиологичен разтвор (6 mL)	2/10 (20 %)
Ампролиум (2 унции)	1/10(10%)
MICOTIL (10mg/kg)	2/10 (20 %)
Фармацевтичен състав	0/10 (0 %)
(2.5 mg/kg)
Фармацевтичен състав	0/10(0%)
(5 mg/kg)

Таблица 14 обобщава ефектите от лечения върху прираста в теглото. Положителен среднодневен прираст бе забелязан във всички лечебни групи. Увеличения в тегловния прираст бяха забелязани в телета, лекувани с фармацевтичния състав и с ампролиум, сравнени с животните в лечебнте групи с физиологичен разтвор и MICOTIL. Животните, лекувани с MICOTIL и физиологичен разтвор отговориха подобно, когато бяха оценени среднодневните прирасти от 21-ден. Обаче не бяха забелязани статистически разлики в тегловния прираст сред групите, лекувани с нефизиологичен разтвор.

Таблица 14

Лечение Среднодневен прираст в 21-ден (kg)

Физиологичен разтвор (6 mL)	0.30 '
Ампролиум (2 унции)	0.60
MICOTIL (10mg/kg)	0.21
Фармацевтичен състав	0.45
(2.5 mg/kg)

Лечение Среднодневен прираст в 21-ден (кд)

Фармацевтичен състав 0.44 (5 mg/kg)

Изхвърлените Eimeria ооцисти бяха проследени преди заразяването и след въвеждането. Изхвърлянето на ооцисти бе откриваемо за пръв път на 19-тия ден след въвеждането. В това изследване статистически значителни (р<0.05) увеличения в изхвърлянето на ооцисти бяха забелязани при животните, лекувани с физиологичен разтвор, сравнени с животните, лекувани с MICOTIL, ампролиум и фармацевтичен състав. Също лекувани с MICOTIL животни показаха статистически значителни (р<0.05) увеличения в изхвърлянето на ооцисти сравнени с животни, лекувани с ампролиум. Обаче не бяха забелязани статистически значителни (р>0.05) разлики в изхвърлянето на ооцистите, когато бяха сравнявани телета, лекувани с MICOTIL и ампролиум, с тези, лекувани с която и да е доза от фармацевтичния състав.

В това изследване, 40 - 100 % от животните в контролната група третирана с физиологичен разтвор съгласувано изхвърляха ооцисти в дните 19, 20, 21, 23, 26 и 28 след въвеждането. Животните, лекувани с ампролиум, MICOTIL или фармацевтичен състав, показаха намалено изхвърляне на ооцисти сравнени с контролите с физиологичен разтвор. В това изследване на Е. bovis се дължаха приблизително 60 - 100 % от изхвърлените ооцисти на проба. На Е. aubumenis и Е. zuemii се дължаха приблизително 10-40 % от изхвърлените ооцисти на проба. Нямаше видимо увеличение в изхвърлянето на Е. zuemii ооцисти в ден 28 след въвеждането, което съответстваше на намаление в изхвърлянето на Е. bovis ооцисти. Все пак, в * продължение на целия проследяван период на изхвърляне, никое от изследваните съединения не изглеждаше да променя значително видовите профили на изхвърлените ооцисти.

При аутопсия мнозинството от животните показаха обща патология в съгласие с умерената до тежка кокцидиална инфекция. В това изследване, телета от всички лечебни групи показваха симптоми на хеморагичен илеит и колит. Четиринадесет процента от телетата в това изследване (7/50) не показаха обща патология при аутопсията. Все пак, изхвърлените ооцисти от телетата във всяка от лечебните групи предполагаха някакво ниво на кокцидиалната инфекция в тези животни.

Настоящото изобретение не следва да бъде ограничавано в обхват от специфичните изпълнения, разкрити в Примерите, които са предназначени за илюстрации на някои аспекти от изобретението. Всички изпълнения, които са функционални еквивалентни са в обхвата на това изобретение. Наистина, различни модификации на изобретението в допълнение към тези, показани и описани тук, ще станат явни за специалистите в областта и са предназначени да попаднат в приложените претенции.

Всички справки разкрити тук по този начин са включени чрез позоваване в тяхната цялост.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използване на състав, съдържащ:

(а) смес от: съединение с формула (I):

(I) или негова фармацевтично приемлива сол, и съединение с формула (II):

или негова фармацевтично приемлива сол, където и двете R групи са идентични и са избрани от групата, състояща се от водород, С_гСю алкилова група с права или разклонена верига, и С₃-С₇ циклоалкилова група; и (Ь) фармацевтично приемлив пълнител, в метод за производство на медикамент за лечение или предотвратяване на бактериална или протозойна инфекция в бозайник, състоящ се в прилагане на бозайника, нуждаещ се от такова лечение или предотвратяване, на еднократна доза от ефективно количество от медикамента.

G
2. Използване съгласно претенция 1, в което съединението с формула I или негова фармацевтично приемлива сол, и съединението с формула II или негова фармацевтично приемлива сол, присъстват в съотношение от около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 %, съответно.
3. Използване съгласно претенция 1 или 2, в което R е н-пропил.
4. Използване съгласно претенция 1 или 2, в което фармацевтично приемливият пълнител съдържа:

(a) вода;

(b) една или повече киселини, присъстващи в обща концентрация от около 0.2 mmol до около 1.0 mmol за mL от сместа; и

G (с) един или повече смесващи се с вода съ-разтворители, присъстващи в количество от около 250 до около 750 mg за mL от състава.
5. Използване съгласно претенция 4, в което единият или повече смесващи се с вода съ-разтворители са избрани от групата, състояща се от етанол, изопропанол, диетиленгликол монометилов етер, диетиленгликол бутилов етер, диетиленгликол моноетилов етер, диетиленгликол дибутилов етер, полиетиленгликол-300, полиетиленгликол-400, пропиленгликол, глицерин, 2-пиролидон, N-метил 2-пиролидон, глицеролформал, диметил сулфоксид, дибутилсебацат, полисорбат 80 и техни смеси.
6. Използване съгласно претенция 5, в което единият или повече смесващи се с вода съ-разтворители е пропиленгликол.
7. Използване съгласно претенция 6, в което пропиленгликолът присъства в количество от около 450 до около 550 mg за mL от състава.
8. Използване съгласно претенция 4, в което . съставът допълнително съдържа един или повече антиоксиданти, присъстващи в количество от около 0.01 mg до около 10 mg за mL от състава.
9. Използване съгласно претенция 8, в което единият или повече антиоксиданти е избран от групата, състояща се от натриев бисулфит, натриев сулфит, натриев метабисулфит, натриев тиосулфат, натриев формалдехид сулфоксилат, l-аскорбинова киселина, ериторбинова

Чг киселина, ацетилцистеин, цистеин, монотиоглицерол, тиогликолова киселина, тиомлечна киселина, тиоурея, дитиотреитол, дитиоеритреитол, глутатион, аскорбилпалмитат, бутилиран хидроксианизол, бутилиран хидрокситолуен, нордихидрогуаиаретова киселина, пропилгалат, атокоферол и техни смеси.
10. Използване съгласно претенция 9, в което единият или повече антиоксиданти е монотиоглицерол.
11. Използване съгласно претенция 10, в което монотиоглицеролът присъства в количество от около 4 mg до около 6 mg за mL от състава.
12. Използване съгласно претенция 4, в което . съставът допълнително съдържа един или повече консерванти, присъстващи в количество от около 0.01 до около 10 mg за mL от състава.
13. Използване съгласно претенция 12, в което единият или повече консерванти е избран от групата, състояща се от бензалкониев хлорид, бензетониев хлорид, бензоена киселина, бензинов алкохол, метилпарабен, етилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, натриев бензоат, фенол и техни смеси.
14. Използване съгласно претенция 13, в което единият или повече консерванти е фенол и присъства в количество от около 2.0 до около 3.0 mg за mL от състава.
15. Използване съгласно претенция 4, в което едната или повече киселини са избрани от групата, състояща се от оцетна киселина, бензенсулфонова киселина, лимонена киселина, бромоводородна киселина, солна киселина, D- и L-млечна киселина, метансулфонова киселина, фосфорна киселина, янтарна киселина, сярна киселина, D- и L-винена киселина, р-толуенсулфонова киселина, адипинова киселина, аспарагинова киселина, камфорсулфонова киселина, 1,2-етандисулфонова. киселина, лаурилсярна киселина, глюкохептонова киселина, глюконова киселина, 3хидрокси-2-нафтоена киселина, 1-хидрокси-2-нафтоена киселина, 2-хидроксиетансулфонова киселина, ябълчена киселина, лигава киселина, азотна киселина, нафталенсулфонова киселина, палмитинова киселина, Dглюкарова киселина, стеаринова киселина, малеинова! киселина, малонова киселина, фумарова киселина, бензоена киселина, холева киселина, етансулфонова киселина, глюкуронова киселина, глутамова киселина, хипурова киселина, лактобионова киселина, лизинова киселина, бадемена киселина, нападизилова киселина, никотинова киселина, полигалактуронова киселина, салицилова киселина, сулфосалицилова киселина, триптофанова киселина и техни смеси.
16. Използване съгласно претенция 1 или 2, в което бактериалната или протозойна инфекция е избрана от групата, състояща се от респираторна болест при говедата, респираторна болест при свинете, говежди инфекционен кератоконюнктивит, говежда кокцидиоза, свински илеит, говежди мастит, телешка ентеритна болест, свинска ентеритна болест, кучешка пневмония, котешка пневмония, кучешка пиодермия, котешка пиодермия, пастерелоза, анаплазмоза, инфекцирзен ‘кератинит; пневмония, отит медия, синузит, бронхит, тонзилит и мастоидит свързани с инфекция от Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, или Peptostreptococcus spp.; фарингит, ревматична треска и гломерулонефрит свързани с инфекция от Streptococcus pyogenes, Групи С и G стрептококи, Clostridium diptheriae или haemolyticum; инфекции на респираторния тракт, свързани с инфекция от Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae или Chlamydia pneumoniae; неусложнени кожни инфекции и инфекции на меки тъкани, абсцеси, остеомиелит и следродова треска, свързани с инфекция от Staphylococcus aureus, коагулазаположителни стафилококи (т.е., S. epidermidis, S. hemolyticus и т.н.), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, стрептококови групи C-F (минута-колония стрептококи), зеленеещи стрептококи, Corynebacterium minutissmnim, Clostridium spp. или Bartonella henselae; неусложнени остри инфекции на уринарния тракт, свързани с инфекция от Staphylococcus saprophyticus или Enterococcus spp.; уретрит и цервицит; болести, предавани по полов път, свързани с инфекция от Chlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi, Treponema patlidum, Ureaplasma Urealyticum или Neiserria gonorrheae; токсични заболявани, свързани c инфекция от S. aureus, или Групи А, В, и С стрептококи; язви, свързани с инфекция от Helicobacter pylori; системни фебрилни синдроми, свързани с инфекция от Borrelia recurrentis; Lyme болест, свързана с инфекция от Borrelia burgdorfeh; конюнктивит, кератит и дакриоцистит, свързани с инфекция от Chlamydia trachomatis, Neisseria gonormoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H.

V influenzae или Listeria spp.; болестта дисеминиран Mycobacterium avium комплекс (MAC), свързана c инфекция от Mycobacterium avium или Mycobacterium intracellulare; гастроентерит свързан c инфекция от Campylobacter jejuni; чревни протозои свързани с инфекция от Cryptosporidium spp.; одонтогенна инфекция свързана с инфекция от зеленеещи стрептококи; постоянна кашлица, свързана с. инфекция от Bordetella pertussis; газова гангрена, свързана с инфекция от Clostridium perfringens или Bacteroides spp.; атеросклероза, свързана с инфекция от Helicobacter pylori или Chlamydia pneumoniae; заразна болест по краката на кравите свързана с инфекция от Fusobacterium spp.; кравешки метрит свързан с инфекция от Е. coli; кравешки космати брадавици, свързани с ϋ’**** инфекция от Fusobacterium necrophorum или Bacteroides^: nodosus; преждевременен аборт при крави, свързан с инфекция от. протозои; инфекция на уринарния тракт при кучета и котки, свързана с инфекция от Е. coll·, кожни инфекции и инфекции на меките тъкани при кучета и котки, свързани с инфекция от Staph. Epidermidis, Staph, intermedius, коагулаза отр. Staph, или Р. multocida; инфекции на зъбите и устата при кучета и котки, свързани с инфекция от Alcaligenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp., Enterobacter spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas, или Prevotella; и инфекции на коне свързани с Actinobacillus equi, Rodococcus equi, Streptococcus equi и Streptococcus zooepidemicus.
17. Използване на състав, съдържащ:

(а) смес от:

съединение с формула (I):

(I) или негова фармацевтично приемлива сол и съединение с формула (II):

(II) *·* или негова фармацевтично приемлива сол, където и двете; R групи са идентични и са избрани от групата, състояща се от водород, С_гСю алкилова група с права или разклонена верига, и С₃-С₇ циклоалкилова група;и (Ь) фармацевтично приемлив пълнител в метод за производство на лекарствено средство за увеличаване толерантността в акутно или хронично инжекционно място в бозайник, състоящо се в прилагане на бозайника, нуждаещ се от това, на еднократна доза от ефективно количество от лекарственото средство.
18. Използване съгласно претенция 17, в което съединението с W формула I или негова фармацевтично приемлива сол, и съединението с формула II или негова фармацевтично приемлива сол, присъстват в съотношение от около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 %, съответно.
19. Използване съгласно претенция 17 или 18, в което R е н-пропил.
20. Използване съгласно претенция 17 или 18, в което фармацевтично приемливият пълнител съдържа:

(a) вода;

(b) една или повече киселини присъстващи в обща концентрация от около 0.2 mmol до около 1.0 mmol за mL от сместа; и (c) един или повече смесващи се с вода съ-разтворители присъстващи в количество от около 250 до около 750 mg за mL от състава.

f*4β«
21. Използване съгласно претенция 20, в което единият или повече смесващи се с вода съ-разтворители са избрани от групата, състояща се от етанол, изопропанол, диетиленгликол монометилов етер, диетиленгликол бутилов етер, диетиленгликол моноетилов етер, диетиленгликол дибутилов етер, полиетиленгликол-300, полиетиленгликол-400, пропиленгликол, глицерин, 2-пиролидон, N- метил 2-пиролидон, глицеролформаг!, диметил сулфоксид, дибутилсебацат, полисорбат 80 и техни смеси.
22. Използване съгласно претенция 21, в което единият или повече смесващи се с вода съ-разтворители е пропиленгликол.
23. Използване съгласно претенция 22, в което пропиленгликол присъства в количество от около 450 до около 550 mg за mL от състава.
24. Използване съгласно претенция 20, в което . съставът допълнително съдържа един или повече антиоксиданти, присъстващи в количество от около 0.01 mg до около 10 mg за mL от състава.
25. Използване съгласно претенция 24, в което единият или повече антиоксиданти са избрани от групата, състояща се от натриев бисулфит, натриев сулфит, натриев метабисулфит, натриев тиосулфат, натриев формалдехид сулфоксилат, l-аскорбинова киселина, ериторбинова киселина, ацетилцистеин, цистеин, монотиоглицерол, тиогликолова киселина, тиомлечна киселина, тиоурея, дитиотреитол, дитиоеритреитол, глутатион, аскорбилпалмитат, бутилиран хидроксианизол, бутилиран хидрокситолуен, нордихидрогуаиаретова киселина, пропилгалат, Dтокоферол и техни смеси.
26. Използване съгласно претенция 25, в което единият или повече антиоксиданти е монотиоглицерол.
27. Използване съгласно претенция 26, в което монотиоглицеролът присъства в количество от около 4 mg до около 6 mg за mL от състава.
28. Използване съгласно претенция 20, в което съставът допълнително съдържа един или повече консерванти, присъстващи в количество от около 0.01 до около 10 mg за mL от състава.
29. Използване съгласно претенция 28, в което единият или повече консерванти са избрани от групата, състояща се от бензалкониев хлорид, бензетониев хлорид, бензоена киселина, бензилов алкохол, метилпарабен, етилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, натриев бензоат, фенол и техни смеси.
30. Използване съгласно претенция 29, в което единият или повече консерванти е фенол и присъства в количество от около 2,0 до около 3.0 mg за mL от състава.
31. Използване съгласно претенция 20, в което едната или повече V киселини са избрани от групата, състояща се от оцетна .киселина, бензенсулфонова киселина, лимонена киселина, бромоводородна киселина, солна киселина, D- и L-млечна киселина, метансулфонова киселина, фосфорна киселина, янтарна киселина, сярна киселина, D- и L-винена киселина, р-толуенсулфонова киселина, адипинова киселина, аспарагинова киселина, камфорсулфонова киселина, 1,2-етандисулфонова киселина, лаурилсярна киселина, глюкохептонова киселина, глюконова киселина, 3хидрокси-2-нафтоена киселина, 1-хидрокси-2-нафтоена киселина, 2хидроксиетансулфонова киселина, ябълчена киселина, лигава ' киселина, азотна киселина, нафталенсулфонова киселина, палмитинова киселина, DС глюкарова киселина, стеаринова киселина, малеинова киселина, малонова киселина, фумарова киселина, бензоена киселина, холева киселина, етансулфонова киселина, глюкуронова киселина, глутамова киселина, хипурова киселина, лактобионова киселина, лизинова киселина, бадемена киселина, нападизилова киселина, никотинова киселина, полигалактуронова киселина, салицилова киселина, сулфосалицилова киселина, триптофанова киселина и техни смеси.
32. Използване съгласно претенция 17 или 18, в което бактериалната или протозойна инфекция е избрана от групата, състояща се от респираторна болест при говедата, респираторна болест при свинете, говежди инфекционен кератоконюнктивит, говежда кокцидиоза, свински илеит, говежди мастит, телешка ентеритна болест, свинска ентеритна болест, кучешка пневмония, котешка пневмония, кучешка пиодермия, котешка пиодермия, пастерелоза, анаплазмоза, инфекциозен кератинит; пневмония, отит медия, синузит, бронхит, тонзилит и мастоидит свързани с инфекция от Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus или Peptostreptococcus spp.; фарингит, ревматична треска и гломерулонефрит свързани с инфекция от Streptococcus pyogenes, Групи С и G стрептококи, Closthdium cliptheriae или Actinobacillus haemolyticum; инфекции на респираторния тракт, свързани с С инфекция от Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae или Chlamydia pneumoniae; неусложнени кожни инфекции и инфекции на меки тъкани, абсцеси, остеомиелит и следродова треска, свързани с инфекция от Staphylococcus aureus, коагулаза-положителни стафилококи (т.е., S. epidermidis. S. hemolyticus и т.н.), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, стрептококови групи С-F (минута-колония стрептококи), зеленеещи *

стрептококи, Corynebacterium minutissimum, Clostridium spp. или Bartonella henselae; неусложнени остри инфекции на уринарния тракт, свързани с инфекция от Staphylococcus saprophyticus или Enterococcus spp.; уретрит и V цервицит; болести, предавани по полов път, свързани с инфекция от

Chlamydia trachomatis, Haemophitus ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma Urealyticum или Neiserria gonorrheae; токсични заболявани, свързани c инфекция от S. aureus или Групи А, В, и С стрептококи; язви, свързани с инфекция от Helicobacter pylori; системни фебрилни синдроми, свързани с инфекция от Borrelia recurrentis; Lyme болест свързана р инфекция от Borrelia burgdorferi; конюнктивит, кератит и дакриоцистит, свързани с инфекция от Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae или Listeha spp.; болестта дисеминиран Mycobacterium avium комплекс (MAC), свързана c инфекция от Mycobacterium avium или Mycobacterium intracellulore; гастроентерит свързан с инфекция от Campylobacter jejuni; чревни протозои свързани с инфекция от Cryptosporidium spp.; одонтогенна инфекция свързана с инфекция от зеленеещи стрептококи; постоянна кашлица, свързана с инфекция от Bordetella pertussis; газова гангрена, свързана с инфекция от Clostridium perfringens или Bacteroides spp.; атеросклероза, свързана с инфекция от Helicobacter pylori или Chlamydia pneumoniae; заразна болест по краката на кравите свързана с инфекция от Fusobacterium spp.; кравешки метрит свързан с инфекция от Е. coli; кравешки космати брадавици, свързани с инфекция от Fusobacterium necrophorum или Bacteroides , nodosus; преждевременен аборт при крави, свързан с инфекция от протозои; инфекция на уринарния тракт при кучета и котки, свързана с инфекция от Е. coli; кожни инфекции и инфекции на меките тъкани при кучета и котки, свързани с инфекция от Staph, epidermidis, Staph, intermedius, коагулаза отр. Staph, или Р. multocida; инфекции на зъбите и устата при кучета и котки, свързани с инфекция от Alcaligenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp., Enterobacter spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas, или Prevotella; и инфекции на коне, свързани с Actinobacillus equi, Rodococcus equi, Streptococcus equi, и Streptococcus zooepidemicus.
33. Набор, състоящ се от:

*»·> . . ·.

W (а) състав, съдържащ:

(1) смес от:

съединение с формула (I):

100 ,^^Λί· (I) или негова фармацевтично приемлива сол, и съединение с формула (II):

или негова фармацевтично приемлива сол, където и двете R групи са идентични и са избрани от групата, състояща се от водород, С_гСю алкилова група с права или разклонена верига, и C₃-C_z цикло-алкилова група; и (2) фармацевтично приемлив пълнител; и (Ь) предписания за използване в доза за еднократно приложение.
34. Набор съгласно претенция 33, в който съединението с формула I или негова фармацевтично приемлива сол, и съединението с формула II

101 или негова фармацевтично приемлива сол, присъстват в съотношение от около 90 % ± 4 % към около 10 % ± 4 %, съответно.
35. Набор съгласно претенция 33 или 34, в който R е н-пропил.
36. Набор съгласно претенция 33 или 34, в който фармацевтично приемливият пълнител съдържа:

(а) вода;

(Ь) една или повече киселини, присъстващи в обща концентрация от около 0.2 mmol до около 1.0 mmol за mL от сместа; и (с) един или повече смесващи се с вода съ-разтворители присъстващи в количество от около 250 до около 750 mg за mL от състава.
37. Набор съгласно претенция 36, в който единият или повече смесващи се с вода съ-разтворители са избрани от групата, състояща се от етанол, изопропанол, диетиленгликол монометилов етер, диетиленгликол бутилов етер, диетиленгликол моноетилов етер, диетиленгликол дибутилов етер, полиетиленгликол-300, полиетиленгликол-400, пропиленгликол, глицерин, 2-пиролидон, N-метил 2-пиролидон, глицеролформал, диметил сулфоксид, дибутилсебацат, полисорбат 80 и техни смеси.
38. Набор съгласно претенция 37, в който единият или повече смесващи се с вода съ-разтворители е пропиленгликол.
39. Набор съгласно претенция 36, в който пропиленгликолът присъства в количество от около 450 до около 550 mg за mL от състава.
40. Набор съгласно претенция 39, в който съставът допълнително съдържа един или повече антиоксиданти, присъстващи в количество от около 0.01 mg до около 10 mg за mL от състава.
41. Набор съгласно претенция 40, в което единият или повече антиоксиданти са избрани от групата, състояща се от натриев бисулфит, натриев сулфит, натриев метабисулфит, натриев тиосулфат, натриев формалдехид сулфоксилат, l-аскорбинова киселина, ериторбинова киселина, ацетилцистеин, цистеин, монотиоглицерол, тиогликолова киселина, тиомлечна киселина, тиоурея, дитиотреитол, дитиоеритреитол,

102 глутатион, аскорбилпалмитат, бутилиран хидроксианизол, бутилиран хидрокситолуен, нордихидрогуаиаретова киселина, пропил^алат, атокоферол и техни смеси.
42. Набор съгласно претенция 41, в който единият или повече антиоксиданти е монотиоглицерол.
43. Набор съгласно претенция 42, в който монотиоглицеролът присъства в количество от около 4 mg до около 6 mg за mL от състава.
44. Набор съгласно претенция 36, в който съставът допълнително съдържа един или повече консерванти, присъстващи в количество от около мг*·' —· 0.01 до около 10 mg за mL от състава.
45. Набор съгласно претенция 44, в който единият или повече консерванти са избрани от групата, състояща се от бензалкониев хлорид, бензетониев хлорид, бензоена киселина, бензилов алкохол, метйлпарабен, етилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, натриев бензоат, фенол и техни смеси.
46. Набор съгласно претенция 45, в който единият или повече консерванти е фенол и присъства в количество от около 2.0 до около 3.0 mg за mL от състава.
47. Набор съгласно претенция 36, в който едната или повече W киселини са избрани от групата, състояща се от оцетна киселина, бензенсулфонова киселина, лимонена киселина, бромоводородна киселина, солна киселина, D- и L-млечна киселина, метансулфонова киселина, фосфорна киселина, янтарна киселина, сярна киселина, D- и L-винена киселина, р-толуенсулфонова киселина, адипинова киселина, асПарагинова киселина, камфорсулфонова киселина, 1,2-етандисулфонова; киселина, лаурилсярна киселина, глюкохептонова киселина, глюконова киселина, 3хидрокси-2-нафтоена киселина, 1-хидрокси-2-нафтоена киселина, 2хидроксиетансулфонова киселина, ябълчена киселина, лигава киселина, азотна киселина, нафталенсулфонова киселина, палмитинова киселина, Dглюкарова киселина, стеаринова киселина, малеинова киселина, малонова

103 киселина, фумарова киселина, бензоена киселина, холева киселина, етансулфонова киселина, глюкуронова киселина, глутамова киселина, хипурова киселина, лакгобионова киселина, лизинова киселина, бадемена киселина, нападизилова киселина, никотинова киселина, полигалактуронова киселина, салицилова киселина, сулфосалицилова киселина, триптофанова киселина и техни смеси.
48. Използване съгласно претенция 1, в което единичната доза е в обхвата от около 0.5 mg от съединения с формули 1 и 2 взети заедно, на kg телесно тегло (mg/kg), до около 20 mg/kg.
49. Използване съгласно претенция 48, в което единичната доза е в обхвата от около 1.25 mg от съединения с формули 1 и 2 взети заедно, на kg телесно тегло (mg/kg) до около 10 mg/kg.
50. Използване съгласно претенция 49, в което единичнауа доза е в обхвата от около 2.0 mg съединения с формули 1 и 2 взети заедно, на kg телесно тегло (mg/kg) до около 5.0 mg/kg.