BG105246A - Method for producing plants with increased flavonoid and pohenolic compound content - Google Patents

Method for producing plants with increased flavonoid and pohenolic compound content Download PDF

Info

Publication number
BG105246A
BG105246A BG105246A BG10524601A BG105246A BG 105246 A BG105246 A BG 105246A BG 105246 A BG105246 A BG 105246A BG 10524601 A BG10524601 A BG 10524601A BG 105246 A BG105246 A BG 105246A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
plants
plant
flavonoids
flavanone
activity
Prior art date
Application number
BG105246A
Other languages
Bulgarian (bg)
Inventor
Wilhelm Rademacher
Klaus Kraemer
Juergen Schweden
Karin Herbers
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US1999/013658 external-priority patent/WO2000078900A1/en
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of BG105246A publication Critical patent/BG105246A/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9771Ginkgophyta, e.g. Ginkgoaceae [Ginkgo family]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789Magnoliopsida [dicotyledons]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9794Liliopsida [monocotyledons]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06Antihyperlipidemics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06Free radical scavengers or antioxidants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/52Stabilizers
    • A61K2800/522Antioxidants; Radical scavengers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
    • A61K2800/782Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/86Products or compounds obtained by genetic engineering

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

The invention relates to a method for increasing flavonoid content in plants. Said method is characterized that a plant is produced using molecular genetic methods in which the activity of enzyme flavanon-3-hydroxylase is reduced. 5 claims, 3 figures

Description

Област на техникатаTechnical field

Настоящето изобретение се отнася до метод за повишаване на съдържанието на флавоноиди и фенолни вещества в растения, характеризиращ се с това, че по метод на молекулната генетика се получава растение, в което е понижена активността на ензима флаванон-3-хидроксилаза.The present invention relates to a method for increasing the content of flavonoids and phenolic substances in plants, characterized in that a molecular genetics method produces a plant in which the activity of the flavanone-3-hydroxylase enzyme is reduced.

Освен това методът съгласно изобретението се характеризира с това, че активността на ензима флаванон-3-хидроксилаза се понижава чрез молекулно биологичен метод (напр. Anti-SenseKonstrukt, съсупресия, експресия на специфични антитела или експресия на специфични инхибитори) напълно или частично, за продължително време или за кратко време, в цялото растение или в части от растението.Furthermore, the method according to the invention is characterized in that the activity of the flavanone-3-hydroxylase enzyme is reduced by a molecular biological method (e.g., Anti-SenseConstruct, suppression, expression of specific antibodies or expression of specific inhibitors) for a long or long time. time or for a short time, in the whole plant or in parts of the plant.

Друг обект на изобретението са растения с повишено съдържание на флавоноиди и фенолни съставни вещества, характеризиращи се с това, че е понижена ензимната активност на ензима флаванон-3-хидроксилаза в тях.Another object of the invention are plants with a high content of flavonoids and phenolic constituents, characterized in that the enzymatic activity of the flavanone-3-hydroxylase enzyme in them is reduced.

Освен това обект на изобретението е използване на растения, получени по метода съгласно изобретението ,· ·.· на части от тези растения, като хранителни средства, кат»? .. ·ώβκη в храните или за получаване на лечебни, подобряващи здс словното състояние или подсилващи средства (сокове, чай, екстракти, /203/02-ПБ ····Furthermore, it is an object of the invention to use plants obtained by the method according to the invention in parts of these plants, such as nutrients, such as? .. · ώβκη in food or for the preparation of medicinal, health-enhancing, or enhancing agents (juices, tea, extracts, / 203/02-PB ····

ферментационни продукти), за хората или за животни, както и за получаване на козметични продукти.fermentation products), for humans or animals, and for the preparation of cosmetic products.

Предшествуващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

В растенията са налични различни фенолни вещества, напр. кафеена киселина, ферулова киселина, хлорогенова киселина, галова киселина, евгенол, лигнан, кумарин, лигнин, стилбен, (полидатин, ресвератрол), флавоноиди (флавони, катехини, флаванони, антоцианидини, изофлавони), полиметоксилирани флавони. Съответно феноли са също и основните съставки на много хранителни и вкусови средства. Определени фенолни вещества са от особено значение, тъй като при приемането им с храната те могат да упражняват антиоксидантно действие при човешкия или животинския обмен на веществата (Baum, В.О.; Perun, A.L. Antioxidant efficiency versus structure, Soc. Plast. Engrs Trans 2: 250-257, (1962); Gardner, P.T., McPhail, D.B., Duthie, G.G. Electron spin resonance spectroscopic assessment of the antioxidant potential of teas in aqueous and organic media, J. Sci. Food Agric. 76: 257-262, (1997); Rice-Evans, C.A., Miller, N.J., Pananga, G. Structure-antioxidant activity relationship of flavonoides and phenolic acids, Free Radio. Biol. Med. 20: 933-956, (1996); Salah, N.. Miller, N.J., Paganga, G., Tijburg, L., Bolwell, G.P., RiceEvans, C. Polyphenolic flavonoids as scavenger of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants, Arch Biochem Biophys, 322: 339-346, (1995); Stryer, L., Biochemistry S. Francisco: Freeman, (1975); Vieira, 0., Escargueil-Blanc, I., Meilhac, 0., Basile, J.P., Laranjinha, J., Almeida, L., Salvayre, R., Negre-Salvayre, A. Effect of dietary phenolic compounds on apoptosis of human cultured endothelial cells induced by oxidized LDL, Br. J. Pharmacol. 123: 565-573, (1998)). Освен това полифенолите имат многостранноVarious phenolic substances are available in plants, e.g. caffeic acid, ferulic acid, chlorogenic acid, gallic acid, eugenol, lignan, coumarin, lignin, stilben, (polydatin, resveratrol), flavonoids (flavones, catechins, flavanones, anthocyanidins, isoflavones), polymethoxylics. Accordingly, phenols are also the main constituents of many nutrients and flavors. Certain phenolic substances are of particular importance because when taken with food, they may exert an antioxidant effect on human or animal metabolism (Baum, VA; Perun, AL; Antioxidant efficiency versus structure, Soc. Plast. Engrs Trans 2: 250-257, (1962); Gardner, PT, McPhail, DB, Duthie, GG Electron spin resonance spectroscopic evaluation of the antioxidant potential of teas in aqueous and organic media, J. Sci. Food Agric. 76: 257-262 , (1997); Rice-Evans, CA, Miller, NJ, Pananga, G. Structure-antioxidant activity relationship of flavonoids and phenolic acids, Free Radio. Biol. Med 20: 933-956, (1996); Salah, N .. Miller, NJ, Paganga, G., Tijburg, L., Bolwell, G.P., RiceEvans, C. Polyphenolic flavonoids as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants, Arch Biochem Biophys, 322: 339-346, (1995); Stryer, L., Biochemistry S. Francisco: Freeman, (1975); Vieira, 0., Escargueil-Blanc, I., Meilhac, 0., Basile, J. P. , Laranjinha, J., Almeida, L., Salvayre, R., Negre-Salvayre, A. Effect of dietary phenolic compounds on apoptosis of human cultured endothelial cells induced by oxidized LDL, Br. J. Pharmacol. 123: 565-573 (1998)). In addition, polyphenols are multifaceted

01/203/02-ПБ • · · ·01/203/02-PB • · · ·

действие върху обменните процеси в клетката. Между другото ензимите на сигналтрансдукцията, като протеинкиназа С, тирозин-протеинкиназа и фосфатидилинозитол-3-киназа се модулират (Agullo, G., Gamet-payrastre, L.; Manenti, S., Viala. C., Remesy, C., Chap, H., Payrastre, B., Relationship between flavonoid structure and inhibition of phosphatidilinositol 3-kinase: a comparison with tyrosine kinase and protein Kinase C inhibition, Biochem. Pharmacol. 53: 1649-1657, (1997); Ferriola, P.C., Cody, V., Middleton, E., Protein kinase C inhibition by plant flavonoids. Kinetic mechanisms and structure activity relationship, Biochem Pharmacol. 38: 1 61 7-1 624, (1989); Cushman, M., Nagarathman, D., Burg, D.L., Geahlen, R.L. Synthesis and protein-tyrosine kinase inhibitory activity of flavonoids analogues, J. Meed Chem 34: 798806, (1991), Hagiwara, M., Inoue, S., Tanaka, T., Nunoki K., Ito, M., Hidaka, H., Differential effects of flavonoids as inhibitors of tyrosine protein kinases and serine/'threonin protein kinases, Biochem. Pharmacol. 37: 2987-2992, (1988)), регулират в посока към понижаване способната да се индуцира NO-синтаза (Kobuchi, Н., Droy-Lefaix, М.Т., Christen, Y., Packer, L., Ginkgo biloba extract (EGb761), Inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7. Biochrem. Pharmacol. 53: 897-903, (1997); и редуцират ген-експрасията напр. на интерлевкини и адхезионни морекули (ICAM-1, VCAM-1) (Kobuchi, Н., Droy-Lefaix,action on the metabolic processes in the cell. Incidentally, signal transduction enzymes such as protein kinase C, tyrosine protein kinase and phosphatidylinositol-3-kinase are modulated (Agullo, G., Gamet-payrastre, L.; Manenti, S., Viala. C., Remesy, C., Chap , H., Payrastre, B., Relationships between flavonoid structure and phosphatidylinositol 3-kinase inhibition: a comparison with tyrosine kinase and protein Kinase C inhibition, Biochem. Pharmacol 53: 1649-1657, (1997); Ferriola, PC. Cody, V., Middleton, E., Protein kinase C inhibition by plant flavonoids.Kinetic mechanisms and structure activity relationship, Biochem Pharmacol 38: 1 61 7-1 624, (1989); Cushman, M., Nagarathman, D. , Burg, DL, Geahlen, RL Synthesis and protein-tyrosine kinase inhibitors of flavonoids analogues activity, J. Meed Chem 34: 798806, (1991), Hagiwara, M., Inoue, S., Tanaka, T., Nunoki K. , Ito, M., Hidaka, H., Differential effects of flavonoids as inhibitors of tyrosine protein kinases and serine / 'threonine protein kinases, Biochem. Pharmacol. 37: 2987-2992, (1988)), regulate towards the reduction of NO synthase inducible (Kobuchi, N., Droy- Lefaix, M.T., Christen, Y., Packer, L., Ginkgo biloba extract (EGb761), Inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7. Biochrem. Pharmacol. 53: 897-903 (1997); and reduce gene expression e.g. of interleukins and adhesion morcules (ICAM-1, VCAM-1) (Kobuchi, N., Droy-Lefaix,

М.Т., Christen, Y., Packer, L., Ginkgo biloba extract (EGb761), Inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7. Biochrem. Pharmacol. 53: 897-903, (1997), Wolle, J., Hill, R.R., Ferguson, E., Devall, L.J., Travedi, B.K., Newton, R.S., Saxena, U..Selective inhibition of Tumor necrosis Factor-induced vascular cell adhesion molecule-1 gene expression by a novelMT, Christen, Y., Packer, L., Ginkgo biloba extract (EGb761), Inhibitory effect on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7. Biochrem. Pharmacol. 53: 897-903, (1997), Wolle, J., Hill, R.R., Ferguson, E., Devall, L.J., Travedi, B.K., Newton, R.S., Saxena, U..Selective inhibition of Tumor necrosis Factor-induced vascular cell adhesion molecule-1 gene expression by a novel

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

flavonoid. Lack of effect on transcriptional factor NF-kB., Atherioscler. Tromb. Vase. Biol. 16: 1501-1508, (1996)). Смята се за потвърдено, че тези действия влияят позитивно за избягване и профилактика на инфаркти, на заболявания на сърцето и кръвоносните съдове, на диабет, на определени видове от различни ракови заболявания, видове тумори и на други хронични заболявания (Bertuglia, S., Malandrino, S., Colantuoni, A., Effects of the natural flavonoid delphiniden on diabetic microangiopathy, Arznei-Forsch./Drug Res., 45: 481-485, (1995); Griffiths, K., Adlercreutz, H., Boyle, P., Denis, L., Nicholson, R.I., Morton, M.S. Nutrition and Cancer, Oxford, Isis Medical Media, (1996); Hertog,flavonoid. Lack of effect on transcriptional factor NF-κB., Atherioscler. Thromb. Yours. Biol. 16: 1501-1508 (1996). It is believed that these actions have a positive effect on the avoidance and prevention of heart attacks, heart and blood vessel diseases, diabetes, certain types of different cancers, types of tumors and other chronic diseases (Bertuglia, S., Malandrino , S., Colantuoni, A., Effects of natural flavonoid delphiniden on diabetic microangiopathy, Arznei-Forsch./Other Res., 45: 481-485, (1995); Griffiths, K., Adlercreutz, H., Boyle, P., Denis, L., Nicholson, R.I., Morton, M.S. Nutrition and Cancer, Oxford, Isis Medical Media, (1996);

M.G.L., Fesrens, E.J.M., Hollman, P.C.K., Katan, M.B., Kromhout, D., Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study, The Lancet 342: 1007-101 1, (1993); Kapiotis, S., Hermann, M., Held, I., Seelos, C., Ehringer, H., Gmeiner, B.M., Genistein, the dietary-derived angiogenesis inhibitor, prevents LDL oxidation and protects endothelial cells from damage by atherogenic LDL, Arterioscler. Tromb. Vase. Biol., 17: 2868-74, (1997); Stampfer, M.J., Hennekens, C.H., Manson, J.E., Colditz, G.A., Rosner, B., Willet, W.C., Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women, New Engl. J. Med. 328: 1444-1449, (1993); Tijburg, L.B.M., Mattern, T., Folts, J.D., Weisgerber, U.M., Katan, M.B., Tea flavonoids and cardiovascular diseases: a review, Crit Rev. Food Sci. Nutr. 37: 771 -785, (1 997); Kirk, E.A., Sutherland, P., Wang, S.A., Chait, A., LeBoeuf. R C., Dietary isoflavones reduce plasma chelesterol and atherosclerosis in C57BL/6 mice but not LDL receptor-deficient mice, J. Nutr 128: 954-9, (1998)- Zitate -). От подходящи растения са получени вече поредица от лекарствени, здравословни или засилващи организмаM.G.L., Fesrens, E.J.M., Hollman, P.C.K., Katan, M.B., Kromhout, D., Dietary antioxidant flavonoids and the risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study, The Lancet 342: 1007-101 1, (1993); Kapiotis, S., Hermann, M., Held, I., Seelos, C., Ehringer, H., Gmeiner, B.M., Genistein, the dietary-derived angiogenesis inhibitor, prevents LDL oxidation and protects endothelial cells from damage by atherogenic LDL , Arterioscler. Thromb. Yours. Biol., 17: 2868-74, (1997); Stampfer, M. J., Hennekens, C. H., Manson, J. E., Colditz, G. A., Rosner, B., Willet, W. C., Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women, New Engl. J. Med. 328: 1444-1449, (1993); Tijburg, L.B.M., Mattern, T., Folts, J.D., Weisgerber, U.M., Katan, M.B., Tea flavonoids and cardiovascular diseases: a review, Crit Rev. Food Sci. Nutr. 37: 771-785, (1 997); Kirk, E.A., Sutherland, P., Wang, S.A., Chait, A., LeBoeuf. R C., Dietary isoflavones reduce plasma chelesterol and atherosclerosis in C57BL / 6 mice but not LDL receptor-deficient mice, J. Nutr 128: 954-9, (1998) - Zitate -). Suitable plants have already received a number of medicinal, healthy or invigorating organisms

/203/02-ПБ средства, действието на които се основава на това, че съдържат фенолни съединения (Gerritsen, М.Е., Carley, W.W., Ranges, G.E.,/ 203/02-PB agents whose action is based on the fact that they contain phenolic compounds (Gerritsen, M.E., Carley, W.W., Ranges, G.E.,

Shen, C.P., Phan, S.A., Ligon, G.F., Perry, C.A., Flavonoids inhibit cytokine-induced endothelial cell adhesion protein gene expression, of protein , Chen, Y.C., kinase C andShen, C. P., Phan, S. A., Ligon, G. F., Perry, C. A., Flavonoids inhibit cytokine-induced endothelial cell adhesion protein gene expression, Chen, Y. C., kinases C and

Huang, nuclear of cancer chemoprevention by apigenin and curcuminHuang, nuclear cancer chemoprevention by apigenin and curcumin

J. Cell Biochem.J. Cell Biochem.

Suppl., 28-29: 39-48, 1997; Zi, X.,Suppl., 28-29: 39-48, 1997; Zi, X.,

Mukhtar, H., Agarval, R,,Mukhtar, H., Agarval, R ,,.

Novel cancer chemoprevenctive effects of a flavonoid anti.oxidant promoterNovel cancer chemoprevenctive effects of a flavonoid anti.oxidant promoter

TNF alpha, Biochem. Biophys. Res. Comm. 239: 334-339, 1997. Освен това е известно, че определени растителни храни или призведени от растения вкусови средства имат позитивно въздействие спрямо различни заболявания. Съдържащият се в бялото вино, а особено в червеното вино ресвератрол (заедно с други компоненти) действа например срещу инфаркти на сърдечно-съдовата система и срещу рак (Gehm, B.D., McAndrews, J.М., Chien, Ρ.-Υ, Jameson, J.L. Resveratrol, a polyphenolic compaund found in grapes and wine, is an agonist for estrogen receptor, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 14138-14143 (1997); Jang,TNF alpha, Biochem. Biophys. Really. Comm. 239: 334-339, 1997. In addition, certain plant foods or plant-derived flavoring agents are known to have a positive effect on various diseases. Resveratrol (in combination with other components) contained in white wine, and especially in red wine, acts, for example, against myocardial infarction and cancer (Gehm, BD, McAndrews, J.M., Chien, Ρ.-Υ, Jameson , JL Resveratrol, a polyphenolic compound found in grapes and wine, is an estrogen receptor agonist, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 14138-14143 (1997);

M., Cai, L., Udeani, G.O., Slowing, K.V., Thomas, C.F., Beecher, C.W.W., Fong, H.H.S., Farnsworth, N.R., Kinghorn, A.D., Mehtha, R.G., Moon, R.C., Pezzuto, J.M., Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes, Science, 275:M., Cai, L., Udeani, G. O., Slowing, K. V., Thomas, C. F., Beecher, C. W. W., Fong, H. H., Farnsworth, N. R., Kinghorn, A. D., Mehtha, R. G., Moon, R. C., Pezzuto, J. M., Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes, Science, 275:

218-220, (1997). Подобно действие имат вещества като катехин, епикатехин-3-галат, епигалокатехин, епигалокатехин-3-галат, които се намират в листата на чай (Camellia sinensis). Особено напитки, приготвени от неферментирали листа от чай (зелен чай)218-220, (1997). Substances such as catechin, epicatechin-3-gallate, epigallocatechin, epigallocatechin-3-gallate, which are found in tea leaves (Camellia sinensis), have similar effects. Especially beverages made from unfermented tea leaves (green tea)

·· /203/02-ПБ • ··· / 203/02-PB • ·

оказват положително влияние върху здравето. (Hu, G., Han, С., Chen, J. Inhibition of oncogene expression by green tea and (-)epigallocatechin gallate in mice, Nutr. Cancer 24: 203-209, (1995); Scholz, E., Bertram, B., Camellia sinensis (L.) O. Kuntze. Der Teestrauch. Z. Phytotherapie, 1 7: 235-250, (1995); Yu, R., Jiao, J.J., Duh, J.L., Gudehithlu, K., Tan, T.H., Kong, A.N. Activation of mitogen-activated protein kinases by green tea polyphenols: potential signaling pathways in the regulation of antioxidant responsive elements-mediated phase II enzyme gene expression, Carcinigenesis 18: 451-456, (1997); Jankun, J., Selman, S.H., Swiercz, R., Why drinking green tea could prevent cancer, Nature 387: 561, (1997). Освен това също полиметоксилираните флавони от цитрусовите плодове проявяват потенциална антитуморна активност (Chem. J., Montanari, A.М., Widmer, W.W., Two new polymethoxylierte flavone, a class of compounds with potential anticancer activity, isolated from cold pressed dancy tangerine peel oil solids, J. Agric Food Chem. 45: 364-368, (1997)).have a positive effect on health. (Hu, G., Han, S., Chen, J. Inhibition of oncogene expression by green tea and (-) epigallocatechin gallate in mice, Nutr. Cancer 24: 203-209, (1995); Scholz, E., Bertram , B., Camellia sinensis (L.) O. Kuntze. Der Teestrauch. Z. Phytotherapie, 1 7: 235-250, (1995); Yu, R., Jiao, J. J., Spirit, J. L., Gudehithlu, K., Tan, TH, Kong, AN Activation of mitogen-activated protein kinases by green tea polyphenols: potential signaling pathways in the regulation of antioxidant responsive elements-mediated phase II enzyme gene expression, Carcinigenesis 18: 451-456, (1997); J., Selman, SH, Swiercz, R., Why drinking green tea could prevent cancer, Nature 387: 561, (1997) In addition, polymethoxylated citrus fruit flavors also exhibit potential antitumor activity (Chem. J., Montanari, A. .M., Widmer, WW, Two new polymethoxylierte flavones, a class of compounds with potential anticancer activity isolated from cold pressed dancy tangerine peel oil solids, J. Agric Food Chem. 45: 364-368 (1997).

Задача на настоящето изобретение е да се създаде прост за вещества.It is an object of the present invention to provide a simple substance.

изпълнение и икономически изгоден метод за повишаване на съдържанието на флавоноиди и фенолни съставки в културни растения.implementation and cost-effective method of increasing the content of flavonoids and phenolic constituents in cultivated plants.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

На базата на физиологични изследвания при използване на регулатори на растежа от групата на ацилциклохексадиони сега по изненадващ начин е създаден генно-технологичен мет д с помощта на който се получават растения с повишено сь.г о-кание на лечебни, подобряващи здравето или засилващи органи ма ····On the basis of physiological studies using growth regulators from the acylcyclohexadione group, a gene-technological method has now been surprisingly created to help plants with increased growth of medicinal, health-enhancing or enhancing organisms. ····

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

Ацилциклохексадиони, като прохексадион-Са и тринексапакетил (по-старото наименование е цимектакарб) се използват като биорегулатори за забавяне на израстване на растенията (на дължина). Тяхното биорегулиращо действие се проявява чрез блокиране на биосинтеза на гиберилините, причиняващи израстване на дължина. При това те въз основа на тяхното структурно сродство с 2-оксоглутаровата киселина инхибират определени диоксигенази, които се нуждаят от 2-оксоглутарова киселина като Ко-субстрат (Rademacher, W., Biochemical effects of plant growth retardants, in: Plant Biochemical Regulators, Gausman, HW (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, стр. 169-200 (1991)). Известно е, че такива съединения играят роля също при обмена на феноли и така при много растения може да се въздейства за инхибиране на образуването на антоциани (Rademacher, W. et al., The mode of action of acylcyclohexanediones - a new type of growth retardant, in: Progress in Plant Growth Regulation, Karssen, CM, van Loon, LC, Vreugdenhil, D (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1992)). Подобни ефекти на фенолните съставни вещества са посочени като причина за страничното действие на прохексадион-Са срещу главня (Rademacher, W et al., Prohexadione-Ca - a new plant growth regulator for apple with interesting biochemical features, Poster auf dem 25-th Annual Meeting of the Plant Growth Regulation Society of America, 7-10. Juli 1998, Chicago). A. Lux-Endrich (Dissertation Technische Universitaet Muenchen in Weihenstephan, 1998) установявя по време на своите изследвания относно механизма на действие на прохексадион-Са срещу главня, че в клетъчните култури на ябълка чрез прохексадион-Са се достига до многократно повишаване на съдържанието на фенолни вещества и че при това се установяват поредица отAcylcyclohexadions, such as prohexadione-Ca and trinexapacetyl (the older name is cimectacarb), are used as bioregulators to slow down plant growth (in length). Their bioregulatory action is manifested by blocking the biosynthesis of giberillins causing length growth. In addition, based on their structural affinity with 2-oxoglutaric acid, they inhibit certain dioxygenases that need 2-oxoglutaric acid as a Co-substrate (Rademacher, W., Biochemical effects of plant growth retardants, in: Plant Biochemical Regulators, Gausman , HW (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-200 (1991). It is known that such compounds also play a role in the exchange of phenols, and so many plants can be affected to inhibit anthocyanin formation (Rademacher, W. et al., The mode of action of acylcyclohexanediones - a new type of growth retardant , in: Progress in Plant Growth Regulation, Karssen, CM, van Loon, LC, Vreugdenhil, D (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1992). Similar effects of the phenolic constituents are cited as the cause of the side effect of prohexadione-Ca against comb (Rademacher, W et al., Prohexadione-Ca - a new plant growth regulator for apple with interesting biochemical features, Poster auf dem 25th Annual Meeting of the Plant Growth Regulation Society of America, July 7-10, 1998, Chicago). A. Lux-Endrich (Dissertation Technische Universitaet Muenchen in Weihenstephan, 1998) found during his studies on the mechanism of action of prohexadion-Ca against the major that in cell cultures of apple by prohexadion-Ca, the content of phenolic substances and that a series of

ΗΗ

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

феноли, които обичайно не са налични. В рамките на това изследване е установено също, че под влияние на прохексадион-Са се наблюдават относително високи количества от лутеолифлаван и ериодиктиол в тъкани на ябълка. Лутеолифлаван обичайно не се наблюдава във филизни тъкани от ябълка, а ериодиктолът е наличен в малки количества само като междинен продукт при обмяната на флавоноидни вещества. Очакваните флавоноиди катехин и цианидин обаче не са доказани в изследваните тъкани или са установени само в значително намалени количества. (S. Roemmelt et al, Vortrag 8-th International Work- shop on Fire Blight, Kusadasi, Tuerkei, 12-15 Oktober 1998).phenols which are not normally available. Within the framework of this study, it was also found that, under the influence of prohexadion-Ca, relatively high amounts of luteoliflavan and eriodictiol were observed in apple tissues. Lutheoliflavan is not commonly observed in apple tissue tissues, and eryodictol is only present in small quantities as an intermediate in flavonoid metabolism. However, the expected flavonoids catechin and cyanidin were not demonstrated in the tissues examined or were found only in significantly reduced amounts. (S. Roemmelt et al, Vortrag 8th International Workshop on Fire Blight, Kusadasi, Tuerkei, October 12-15, 1998).

Може да се смята за потвърдено, че прохексадион-Са, тринексапак-етил и други ацилциклохексадиони инхибират зависимите от 2-оксоглутаровата киселина хидроксилази, които са от значение при обмена на фенолни вещества. При това се касае основно до халконсинтетаза (CHS) и до флаванон-3-хидроксилаза (F3H) (W. Heller und G. Forkmann, Biosynthesis, in: The Flavonoides, Harborne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York, 1 988). Bee пак не може да се изключи, че ацилциклохексадионите инхибират също и други, досега непознати хидроксилази, зависими от !Prohexadione-Ca, trinexapac-ethyl and other acylcyclohexadions can be considered to inhibit 2-oxoglutaric acid-dependent hydroxylases, which are important in the metabolism of phenolic substances. It mainly concerns chalconsynthetase (CHS) and flavanone-3-hydroxylase (F3H) (W. Heller und G. Forkmann, Biosynthesis, in: The Flavonoides, Harborne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York , 1 988). Bee still cannot exclude that acylcyclohexadione also inhibits other hitherto unknown dependent hydroxylases!

2-оксоглутаровата киселина. Би трябвало освен това да е близкоj2-oxoglutaric acid. It should also be close

I до ума, че недостиг от катехин, цианидин или други крайни про-j дукти на флавоноидния синтез ще се регистрира от растението и| чрез механизъм на обратна връзка ще се повиши активността на| ключовия ензим фенилаланин-амониева лиаза (PAL). Чрез| следващо инхибиране на CHS и F3H тези флавоноидни крайни ί продукти могат да не се образуват, което ще доведе до едноII to the mind that a deficiency in catechin, cyanidin or other flavonoid synthesis end products will be detected by the plant and | the feedback mechanism will increase the activity of | the key enzyme phenylalanine-ammonium lyase (PAL). Through | subsequent inhibition of CHS and F3H, these flavonoid end products may not form, which will result in one

I повишено получаване на лутеолифлаван, ериодиктиол и други феноли (Фиг. 1).|I increased production of luteoliflavan, eriodictiol and other phenols (Fig. 1).

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

Чрез понижаване на ензимната активност на ензима флаванон-3-хидроксилаза (F3H) се образуват в повишени количества флавоноидите ериодиктиол, проантоцианидин, които са заместени при С-атома на 3-то място с водород, напр. лутеофорол, лутеолифлаван, апигенифлаван и трицетифлаван, както и хомогенни и хетерогенни олигомери и полимери на посочените и на структурно подобни вещества.By reducing the enzymatic activity of the enzyme, flavanone-3-hydroxylase (F3H) produces increased amounts of flavonoids, eriodictiol, proanthocyanidin, which are substituted at the C-atom at the 3-position by hydrogen, e.g. luteophorol, luteoliflavan, apigeniflavan and tricetiflavan, as well as homogeneous and heterogeneous oligomers and polymers of said and structurally similar substances.

Установява се наличие на повишени концентрации на фенолните хидроксиканелена киселина (р-кумаринова, ферулова киселина, синапинова киселина), салицилова киселина или 4-хидроксикумарин, включително на получените от тях хомогенни и хетерогенни олигомери или полимери в растенията след понижаване на ензимната активност на ензима флаванон-3хидроксилаза (F3H). Също така се повишава концентрацията на халкони, като флоретин, и на стилбени, като напр. ресвератрол.Increased concentrations of phenolic hydroxycannelic acid (p-coumaric, ferulic acid, sinapic acid), salicylic acid or 4-hydroxycoumarin have been detected, including homogeneous and heterogeneous oligomers or polymers obtained in the plants after enzyme reduction. -3 Hydroxylase (F3H). The concentration of chalcones, such as phloretin, and stilbene, such as e.g. resveratrol.

Чрез понижаване на ензимната активност на ензима флаванон-3-хидроксилаза се повишава също и концентрацията на гликозиди на фловоноидите, на фенолните съединения, на халкона и на стилбена.By reducing the enzymatic activity of the flavanon-3-hydroxylase enzyme, the glycoside concentration of flavonoids, phenolic compounds, chalcone and stilbene is also increased.

На базата на тези установени изменения и на направените от тях хипотези се създават генетично променени културни растения, в които активността на флаванон-3-хидроксилазата е понижена частично или напълно, за постоянно или временно, в цялото растение или в отделни органи или тъкани на растението, чрез метода Anti-Sense-Konstrukte, така че в тях се подобрява количествено и качествено съставът на лечебни, здравословни и засилващи съставни вещества.On the basis of these established changes and their hypotheses, genetically modified crop plants are created in which the activity of flavanone-3-hydroxylase is partially or completely reduced, permanently or temporarily, throughout the plant or in individual organs or tissues of the plant. , by the method of Anti-Sense-Konstrukte, so that they improve the quantity and qualitative composition of therapeutic, healthy and enhancing constituents.

Методът съгласно изобретението за повишаване на съдържанието на флавоноиди и и фенолни съединения чрез експресия наThe method according to the invention for increasing the content of flavonoids and phenolic compounds by expression of

Itaaa·Itaaa ·

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

флаванон-3-хидроксилаза в Апйзепзе-ориентация може да се приложи успешно при следните растения: грозде, череша, домати, сливи, трънки, боровинки, ягоди, цитрусови плодове (като портокали, грейпфрут), папая, червено зеле, броколи, брюкселско зеле, какао, листно зеле, моркови, магданоз, целина, лук, чесън, чай, кафе, хмел, соя, рапица, овес, пшеница, ръж, Aronia melanocarpa, Ginko biloba, при което методът не трябва да се ограничава само до тях.flavanone-3-hydroxylase in Upzepse orientation can be successfully applied to the following plants: grapes, cherries, tomatoes, plums, thorns, blueberries, strawberries, citrus fruits (such as oranges, grapefruit), papaya, red cabbage, broccoli, Brussels sprouts , cocoa, leaf cabbage, carrots, parsley, celery, onions, garlic, tea, coffee, hops, soybeans, rapeseed, oats, wheat, rye, Aronia melanocarpa, Ginko biloba, and the method should not be limited to them.

Обект на изобретението са освен това растения с повишено съдържание на флавоноиди и фенолни съставни вещества, получени по метода съгласно изобретението, характеризиращи се с това, че в тях е понижена ензимната активност на ензима флаванон-3-хидроксилаза.It is also an object of the invention that plants with a high content of flavonoids and phenolic constituents obtained by the process according to the invention are characterized in that they reduce the enzymatic activity of the flavanone-3-hydroxylase enzyme.

Алтернативно, за получаването на растения, в които е понижена активността на флаванон-3-хидроксилаза с помощта на Anti-sense-технологите, могат да се използват и други известни от литературата методи на молекулната генетика, като съсупресия или експресия на специфични антитела, с цел да се постигне този ефект.Alternatively, for the preparation of plants in which the activity of flavanone-3-hydroxylase is reduced by Anti-sense technologies, other known molecular genetics methods, such as suppression or expression of specific antibodies, with aim to achieve this effect.

Освен това обект на изобретението е използване на растения, получени по метода съгласно изобретението, или на части от тези растения, като хранителни средства, хранителни добавки или за получаване на лечебни, здравословни или подсилващи средства (сокове, чайове, екстракти, ферментационни продукти) за човека и животните, както за получаване на козметика.Furthermore, it is an object of the invention to use plants obtained by the process of the invention, or parts of such plants, as nutrients, nutritional supplements or for the preparation of medicinal, healthy or invigorating agents (juices, teas, extracts, fermentation products) for man and animals, both for getting cosmetics.

Сега е установено по изненадващ начин, че под влияние на получените по метода съгласно изобретението растения или на части от тези растения, или на произведени от тях продукти (чай, екстракти, ферментационни продукти, сокове и т.н.) се постига:It has now been surprisingly found that, under the influence of plants obtained by the process according to the invention, or parts of these plants, or products produced by them (tea, extracts, fermentation products, juices, etc.), it is possible to achieve:

01/203/02-ПБ ·· ·01/203/02-PB ·· ·

1) подобряване на антиокислителния капацитет in vitro (електронен спин-резонанс (ESR), LDL-окисление, тотален антиокислителен капацитет, NO-отстраняване);1) enhancement of antioxidant capacity in vitro (electron spin resonance (ESR), LDL oxidation, total antioxidant capacity, NO removal);

2) появяване на модулиращо действие на ензими, преди всичко на ензимите на сигнално преобразуване (протеинкиназа С, тирозин-протеинкиназа, фосфатидилинозитол-3-киназа);2) the occurrence of a modulating action of enzymes, primarily of signaling conversion enzymes (protein kinase C, tyrosine protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase);

3) индуциране на модулация на редокси-сензитивните транскрипционни фактори (NF-кв, АР-1) в ендотелни клетки, лимфоцити и клетките на гладките мускули;3) inducing modulation of redox-sensitive transcription factors (NF-κB, AP-1) in endothelial cells, lymphocytes and smooth muscle cells;

4) модулиране на регулацията на ген-експресията на определени гени, свързани с патогенезата на възпалителни заболявания (цитокин IL-1 и IL-8, macrophage chemoattractant protein 1 (МСР-1), адхезионните фактори ICAM-1 и VCAM-1);4) modulating the regulation of gene expression of certain genes related to the pathogenesis of inflammatory diseases (cytokine IL-1 and IL-8, macrophage chemoattractant protein 1 (MCP-1), adhesion factors ICAM-1 and VCAM-1);

5) индуциране на антиагрегационно действие;5) induction of anti-aggregation action;

6) инхибиране на синтеза на холестерин в хепатоцити;6) inhibition of cholesterol synthesis in hepatocytes;

7) проява на антипролифератйвни/антинеопластични ефекти.7) manifestation of antiproliferative / antineoplastic effects.

Примери за изпълнение на изобретениетоExamples of carrying out the invention

Пример 1Example 1

Клониране на ген на флаванон-3-хидроксилаза отCloning of a flavanone-3-hydroxylase gene from

Lycopersicon esculentum Mill.cv. MoneymakerLycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker

Зрели домати от сорта Lycopersicon esculentum Mill с.ν Moneymaker се измиват, подсушават и с помощта на стерилно острие перикарпът се освобождава от семената, средната носеща част и от твърдите части. Перикарпът (около 50 ; се замразява с течен азот. След това материалът се надробена с миксер. Надробеният материал се смесва в предварителн охладен хаван с 100 ml хомогенизираща среда и се разбърква. Получената суспензия се прехвърля в центрофуга, в която тя сеRipe tomatoes of the variety Lycopersicon esculentum Mill p.ν Moneymaker are washed, dried and, with the help of a sterile blade, the pericarp is released from the seeds, the middle bearing part and the solids. The pericarp (about 50; freezes with liquid nitrogen. The material is then crushed with a mixer. The crushed material is mixed in a pre-cooled mortar with 100 ml of homogenizing medium and stirred. The resulting suspension is transferred to a centrifuge in which it is stirred.

01/203/02-ПБ ♦··· ··♦01/203/02-PB ♦ ··· ·· ♦

пресова чрез стерилни пропускащи платна. След това се прибавя 1/10 обемни части 10 % SDS и добре се размесва. След престой в продължение на 10 минути върху лед се прибавя 1 обем фенол/хлороформ, центрофугата се затваря и съдържанието й се размесва добре. След центрофугиране в продължение на 15 минути със скорост 4000 rpm остатъкът се прехвърля в нов реакционен съд. Провеждат се три следващи екстракции с фенол/хлороформ и една с хлороформ. След това се прибавя 1 обем 3 М NaAC и 2.5 обема етанол. Утаяването на нуклеинови киселини се провежда в продължение на една нощ при -20°С. На другата сутрин нуклеиновите киселини се гранулират в продължение на 15 минути при скорост 10000 rpm в центрофуга с охлаждане (4°С). Утайката се изважда и гранулите се ресуспендират в 5-10 ml студен 3 М NaAc. Този етап на пречистване се повтаря двукратно. Гранулите се промиват с 80 %-ен етанол. Напълно изсушените гранули се разреждат с около 0.5 ml стерилна DEPC вода и концентрацията на RNA се определя фотометрично.pressed through sterile sealing webs. Then 1/10 volumes of 10% SDS was added and mixed well. After standing for 10 minutes on ice, 1 volume of phenol / chloroform is added, the centrifuge is closed and its contents are mixed thoroughly. After centrifugation for 15 minutes at 4000 rpm, the residue was transferred to a new reaction vessel. Three subsequent extractions were performed with phenol / chloroform and one with chloroform. Then, 1 volume of 3 M NaAC and 2.5 volumes of ethanol were added. Nucleic acid precipitation was performed overnight at -20 ° C. The next morning, the nucleic acids were granulated for 15 minutes at a speed of 10000 rpm in a cooling centrifuge (4 ° C). The precipitate was removed and the granules resuspended in 5-10 ml of cold 3 M NaAc. This purification step is repeated twice. The granules were washed with 80% ethanol. The fully dried granules are diluted with about 0.5 ml of sterile DEPC water and the RNA concentration is determined photometrically.

цд обща RNA (рибонуклеинова киселина) се смесва първоначално с 3.3 μΙ ЗМ разтвор на натриев ацетат, 2 μΙ 1М разтвор на магнезиев сулфат и в съда се долива до краен обем 100 μΙ DEPC вода. Добавя се 1 микролитър от ензима Rnase, несъдържащ Dnase (произв. на Boehringer Mannheim) и пробата се инкубира в продължение на 45 минути при 37°С. След отстраняване на ензима чрез разклащане с фенол/хлороформ/изоамилалкохол се утаява RNA с етанол и гранулите се разреждат с 100 μΙ DEPC-вода. 2.5 μ g RNA от този разтвор чрез транскрипция с един cDNA-кит (Gibco BRL) се превръща в cDNA.µg total RNA (ribonucleic acid) was initially mixed with 3.3 μΙ 3M sodium acetate solution, 2 μΙ 1M magnesium sulfate solution and made up to 100 μΙ DEPC water in a container. 1 microliter of Dnase-free enzyme Rnase (manufactured by Boehringer Mannheim) was added and the sample was incubated for 45 minutes at 37 ° C. After removal of the enzyme by shaking with phenol / chloroform / isoamyl alcohol, the RNA was precipitated with ethanol and the granules were diluted with 100 μΙ DEPC-water. 2.5 μg of RNA from this solution is converted to cDNA by transcription with a single cDNA kit (Gibco BRL).

При използване на последователности от аминокиселини, които произхождат от кодирани за флаванон-3-хидроксилаза • · · · • ·Using amino acid sequences derived from flavanone-3-hydroxylase encoded · · · · • ·

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

cDNA клонове, могат да се идентифицират консервираните области в първичната последователност (Britsch et al., Eur. J. Biochem. 217, 745-754 (1993), които служат като основа за конституиране на дегенерирани PCR олигонуклеотиди. 5’-Олигонуклеотидът се установява при използване на пептидната последователност SRWPDK (аминокиселина 147-152 в последователност FL3H PETHY от Petunia hybrids) и има следната последователност:cDNA clones, the conserved regions in the primary sequence can be identified (Britsch et al., Eur. J. Biochem. 217, 745-754 (1993), which serve as the basis for the constitution of degenerated PCR oligonucleotides. The 5'-oligonucleotide is established using the peptide sequence SRWPDK (amino acid 147-152 in the FL3H PETHY sequence from Petunia hybrids) and has the following sequence:

5’-ТС1 (А/С) G (A/G) TGG CC(A/C/G) GA (С/Т) АА (А/G) СС-3.5′-TC1 (A / C) G (A / G) TGG CC (A / C / G) GA (C / T) AA (A / G) CC-3.

Получената при използване на пептидната последователност DHQAVV (аминокиселина 276281 в последователността FL3H PETHY от Petunia hybrida) последователност на олигонуклеотиди има следния вид:The oligonucleotide sequence obtained using the peptide sequence DHQAVV (amino acid 276281 in the FL3H PETHY sequence of Petunia hybrida) is as follows:

5‘-СТТ САС АСА (C/G/T) GC (С/Т) TG (A/G)TG (A/G)TC-3.5′-CTT CAC OCA (C / G / T) GC (C / T) TG (A / G) TG (A / G) TC-3.

PCR-реакцията се провежда при използване на tTth-полимераза, производство на Perkin-Elmer, съгласно указанията на производителя. Като шаблон се въвежда 1/8 от cDNA (отговаря наThe PCR reaction was carried out using tTth polymerase produced by Perkin-Elmer according to the manufacturer's instructions. 1/8 of cDNA is entered as template (corresponds to

0.3 цд0.3 cd

RNA). PCR-програмата е следната:RNA). The PCR program is as follows:

цикъла степен степен степен степен секунди секунди минути минутиcycle degree degree degree degree seconds seconds seconds minutes minutes

Фрагментът се клонира по указанията на производителя във вектор pGEM-T от Promega .The fragment is cloned according to the manufacturer's instructions in Promega vector pGEM-T.

Точността на фрагментите се проверява чрез секвениране.The accuracy of the fragments is verified by sequencing.

PCR-фрагментът се изолира при използване на намиращите се в полилинкера на вектора pGEM-T рестрикционни места на скъсвания Ncol и Rstl и получените крайни части се превръщат в равни краища при използване на Т4-полимераза. Този фрагмент • · · · • ·The PCR fragment was isolated using the pGEM-T restriction sites of the broken Ncol and Rst1 located in the polylinker, and the resulting end portions were converted to equal ends using T4 polymerase. This fragment • · · · • ·

/203/02-ПБ се клонира в тъп (blunt) нарязан вектор pBinAR (Hoefgen und Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230 (1990)) (вж. фиг. 2). Той съдържа Збв-промотор на CaMV (мозаечен вирус на цветното зеле) (Franck et al., Cell 21: 285-294 (1980) и терминационния сигнал на октопин-синтазния ген (Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846 (1984)). Този вектор създава в растението резистентност спрямо антибиотика канамицин. Получените DNA-конструкти съдържат PCRфрагменти в sense- и antisense-ориентация. Методът antisensekonstrukt се използва за получаване на трансгенни растения./ 203/02-PB is cloned into blunt cut pBinAR vector (Hoefgen und Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230 (1990)) (see Fig. 2). It contains the 3BB promoter of CaMV (mosaic cabbage mosaic virus) (Franck et al., Cell 21: 285-294 (1980) and the termination signal of the octopine synthase gene (Gielen et al., EMBO J. 3: 835- 846 (1984) .This vector creates in the plant resistance to the antibiotic kanamycin The resulting DNA constructs contain PCR fragments in sense and antisense orientation The antisense construct is used to produce transgenic plants.

фиг. 2: Фрагмент А (529 Ьр), съдържа Збв-промотор на CaMV (нуклеотиди 6909 до 7437 на мозаичен вирус на цветното зеле), фрагмент В е фрагмент на F3H ген в antisense-ориентация, фрагмент С (192 Вр) съдържа терминаторен сигнал на октопинсинтазен ген.FIG. 2: Fragment A (529 bp), contains the 3Bb promoter of CaMV (nucleotides 6909 to 7437 of mosaic cabbage virus), fragment B is a fragment of the F3H gene in antisense orientation, fragment C (192 Bp) contains a terminator signal octopinsyntase gene.

Клониране на един по-голям cDNA фрагмент на флаванон-3хидроксилаза от Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker при използване на 5’ RACE-системаCloning of a larger flavanone-3 hydroxylase cDNA fragment from Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker using a 5 'RACE system

За да се изключи възможността, че получаването на растение с понижено количество mRNA равновесна течливост на F3H на базата на понижената големина на използваните F3H при метода antisense-konstrukt PCR-фрагменти не е успешно, се налага да се получи втори antisense-konstrukt при използване на по-голям F3H фрагмент.To exclude the possibility that the production of a plant with reduced mRNA equilibrium fluidity of F3H based on the reduced size of F3H used in the antisense construct PCR fragments method is not successful, it is necessary to obtain a second antisense construct using larger F3H fragment.

За целите на клониране на по-голям фрагмент от F3H се използва методът 5‘RACE (System for Rapid amplification of cDNA ends).For the purpose of cloning a larger fragment than F3H, the 5′RACE (System for Rapid Amplification of cDNA ends) method is used.

• · · · • ·• · · ·

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

Удължаването на F3H PCR-фрагменти се провежда по метода 5’RACE, при използване на 5’ RACE System for Rapid amplification of cDNA ends, Version 2 ~ 0 von Life Tecgnologies™.Extension of F3H PCR fragments was performed by the 5′RACE method using the 5 ′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA ends, Version 2 ~ 0 von Life Tecgnologies ™.

От зрели домати от сорта Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker се изолира обща RNA (вж. по-горе).Of ripe tomatoes of the variety Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker isolates total RNA (see above).

Синтезът на първи клон на cDNA се провежда съгласно указанията на производителя при използване на GSP-1 (Gen spezifischer Primer) 5'-TTCACCACTGCCTGGTGGTCC-3’. При включване на Rnase Verdau получената cDNA се пречиства при използване на GlassMAX spin Systems von Life Tecgnologies™, съгласно указанията на производителя.First cDNA clone synthesis was performed according to the manufacturer's instructions using GSP-1 (Gen spezifischer Primer) 5'-TTCACCACTGCCTGGTGGTCC-3 '. When Rnase Verdau was turned on, the resulting cDNA was purified using GlassMAX spin Systems von Life Tecgnologies ™ according to the manufacturer's instructions.

На 3’-края на пречистената едноклонирана F3H cDNA се присъединява един цитозин хомополимер при използване на терминална дезоксинуклеотидил-трансфераза съгласно указанията на производителя.At the 3'-end of the purified single-cloned F3H cDNA, a cytosine homopolymer was attached using terminal deoxynucleotidyl transferase according to the manufacturer's instructions.

Прилагането на 5'-удължената F3H cDNA се провежда при използване на втора ген-специфична основа (GSP-2), която се свързва в областта 3’ преди GSP-1 разпознаващата последователност и по този начин дава възможност за вместена PCR. Като 5' основа се използва получена от производителя 5’RACE abrided anchor primer, която е допълнителна към хомополимерния dCкрай на cDNA.The administration of the 5'-extended F3H cDNA was carried out using a second gene-specific base (GSP-2), which binds in the 3 'region before the GSP-1 recognition sequence and thus allows for pooled PCR. The 5'RACE abrided anchor primer, which is complementary to the cDNA homopolymer dC terminus, is used as the 5 'base.

Полученият по този начин и обозначен като F3Hexten(jed cDNA фрагмент се клонира съгласно указанията на производителя във вектора pGEM-T от Promega.The thus obtained and designated F3H ex t en (a single cDNA fragment is cloned according to the manufacturer's instructions in the Promega vector pGEM-T.

Идентичността на cDNA се потвърждава чрез секвениране. фрагментът F3HeX|encje(j cDNA се изолира при използване на намиращите се в полилинкера на вектора pGEM-T рестрикционни места на скъсване Ncol и Pstl и получените крайни части сеThe identity of the cDNA is confirmed by sequencing. the F3H eX fragment | enc j e ( j cDNA was isolated using the pGEM-T vector restriction sites of Ncol and Pstl located in the polylinker and the resulting terminal portions were

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

превръщат в.равни краища при използване на Т4-полимераза.convert even edges using T4 polymerase.

Този фрагмент се клонира в тъп нарязан вектор pBinAR (HoefgenThis fragment was cloned into a blunt cut vector pBinAR (Hoefgen

und Willmitzer, 1990) (вж. Фиг. 3). Той съдържа 35в-промотор на CaMV (мозаечен вирус на цветното зеле) (Franck et al., 1980) и терминационния сигнал на октопин-синтазния ген (Gielen et al., 1984). Този вектор създава в растението резистентност спрямо антибиотика канамицин. Получените DNA-конструкти съдържат PCR-фрагменти в sense- и antisense-ориентация. Методът antisense-konstrukt се използва за получаване на трансгенни растения.und Willmitzer, 1990) (see Fig. 3). It contains the 35B promoter of CaMV (cauliflower mosaic virus) (Franck et al., 1980) and the termination signal of the octopine synthase gene (Gielen et al., 1984). This vector creates in the plant antibiotic resistance kanamycin. The resulting DNA constructs contain PCR fragments in sense- and antisense-orientation. The antisense construct method is used to produce transgenic plants.

фиг. 3: фрагмент А (529 Ьр), съдържа 35Б-промотор на CaMV (нуклеотиди 6909 до 7437 на мозаичен вирус на цветното зеле), фрагмент В е фрагмент на F3H ген в antisense-ориентация, фрагмент С (192 Вр) съдържа терминаторен сигнал на октопинсинтазен ген.FIG. 3: fragment A (529 bp), contains a 35B promoter of CaMV (nucleotides 6909 to 7437 of mosaic cabbage virus), fragment B is a fragment of the F3H gene in antisense orientation, fragment C (192 Bp) contains a terminator signal octopinsyntase gene.

Пример 2Example 2

Получаване на трансгенен сорт Lycopersicon esculentumPreparation of transgenic Lycopersicon esculentum

Mill.cv. Moneymaker, който експресира частичен фрагмент на флаванон-3-хидроксилаза в antisense-ориентацияMill.cv. Moneymaker that expresses a partial fragment of flavanone-3-hydroxylase in antisense orientation

Работи се по метода на Ling et al., Plant Cell ReportThis was done using the method of Ling et al., Plant Cell Report

847 (1998). Култивирането се провежда при около 22°С часа светлина на 8 часа тъмнина.847 (1998). The cultivation was carried out at about 22 ° C light for 8 hours dark.

7, 843при режим7, 843With mode

Семена от домати maker) се инкубират в продължение на 10 минути в разтвор на натриев хипохлорит, след това се промиват 3 - 4 пъп ьс стерилна дестилирана вода и се поставят върху MS среди захароза при pH 6.1 да покълнат. След период на покълване от 7 до 10 дена котиледоните се влагат за трансформация.Tomato maker seeds) were incubated for 10 minutes in sodium hypochlorite solution, then washed 3 - 4 with sterile distilled water and placed on MS sucrose media at pH 6.1 to germinate. After a germination period of 7 to 10 days, the cotyledons are put into transformation.

/203/02-П Б/ 203/02-P B

Ден 1: Петриеви стъкла със среда MSBN се наслояват с 1.5 ml от 10 дневна суспензионна култура от тютюн. Стъклата се покриват с фолио и се инкубират до следващия ден при стайна температура.Day 1: Petri dishes with MSBN medium are coated with 1.5 ml of a 10-day tobacco suspension culture. The glasses were coated with foil and incubated until the next day at room temperature.

Ден 2: Върху наслоените със суспензионна тютюнева култура петриеви стъкла се поставя стерилна филтърна хартия, свободна от въздушни мехурчета. Отгоре се поставят напречно нарязаните покълнали листа с горната страна насочена надолу. Петриевите стъкла се инкубират 3 дни в културалното помещение.Day 2: Sterile filter paper, free of air bubbles, is placed on the slides of the tobacco culture. Above are transverse cut germinated leaves with the top side pointing down. Petri dishes were incubated for 3 days in the culture room.

Ден 5: Агробактерийната култура (LBA4404) се утаява чрез центрофугиране със скорост около 3000 g в продължение на 10 минути и се ресуспендира в MS-среда, така че OD да бъде 0.3. В тази суспензия се поставят късчетата от поникналите листенца, които се инкубират при леко разклащане в продължение на 30 минути при стайна температура. След това късчетата от поникнали листенца се подсушават леко със стерилна филтърна хартия и отново се връщат върху техните изходни съдчета, за да се продължи тяхното съкултивиране в продължение на още 3 дни в културалното помещение.Day 5: Agrobacterial culture (LBA4404) was precipitated by centrifugation at a rate of about 3000 g for 10 minutes and resuspended in MS medium so that OD was 0.3. In this suspension, fragments of sprouting petals are incubated, which are incubated with gentle shaking for 30 minutes at room temperature. The drooping petals are then lightly dried with sterile filter paper and returned to their original vessels again to continue their co-cultivation for another 3 days in the culture room.

Ден 8: Съкултивираните късчета от поникнали листенца се поставят върху MSZ2K50 + B и в следващите 4 седмици се култивират в културалното помещение. След това се провежда субкултивиране.Day 8: Cocultured sprouted bits of petals were placed on MSZ2K50 + B and cultured in the culture room for the next 4 weeks. Subculturing is then carried out.

Поникналите филизи се поставят върху среда, индуцираща корени.The sprouted shoots are placed on a root-inducing medium.

След успешно вкореняване растенията могат да се изследват и да се прехвърлят във вегетационна къща.After successful rooting, the plants can be examined and transferred to a growing house.

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

Пример 3Example 3

Инхибиране биосинтеза на холестерин в култури с първични хепатоцити от плъховеInhibition of cholesterol biosynthesis in cultures of primary rat hepatocytes

Получаване на основните разтвориPreparation of stock solutions

От лиофилизат на зрели домати от сорта Moneymaker се получава:The lyophilisate of ripe tomatoes of the Moneymaker variety yields:

A) само нативния флаванон-3-хидроксилазен ген (контрола) иA) only the native flavanone-3-hydroxylase gene (control) and

B) както е описано в Пример 2 допълнително един частичен фрагмент на флаванон-3-хидроксилаза в Antisense-ориентация се отмерва точно в количество между 10 и 20 mg и се смесва със същото количество диметилсулфоксид, така че се получава основен разтвор на 10 тМ общи флавоноиди. От този разтвор непосредствено преди започване на опита се правят разредени разтвори в културална среда. Разрежданията се правят на 10 стъпала между 10-4 и 10‘8 М.B) as described in Example 2, an additional partial fragment of flavanone-3-hydroxylase in the Antisense orientation is measured exactly in an amount between 10 and 20 mg and mixed with the same amount of dimethyl sulfoxide to give a basic solution of 10 mM total flavonoids. From this solution, dilute solutions in culture medium are made immediately before the experiment begins. Dilutions are made in 10 steps between 10 -4 and 10 ' 8 M.

Получаване на хепатоцитни културиPreparation of hepatocyte cultures

Първични хепатоцити се получават от дробчета на мъжки плъхове от вида Spraque-Dawley (240-290 g) чрез колагеназна перфузия (Gebhardt et al., Arzneimittel-Forschung/Drug Res. 41: 800-804 (1991/1990). Култивирането се провежда в наслоени с колаген петриеви стъкла (6-гнездови плочки, Greiner, Nuertingen) с гъстота на клетките 125.000 клетки/cm2 в среда от вида Williams Medium Е с 10 % телешки серум. Повече данни особено за културалната среда могат да се намерят в Gebhardt et al . Cell Biol. Toxicol. 6: 369-372 (1990) и в Mewes et al., Cancer Ras 53: 5135-5142 (1993). Културите се прехвърлят след 2 часа върху не съдържаща серум среда с добавяне на 0.1 μΜ инсулин. След още • ·Primary hepatocytes were obtained from the liver of male rats of the Spraque-Dawley species (240-290 g) by collagenase perfusion (Gebhardt et al., Arzneimittel-Forschung / Drug Res. 41: 800-804 (1991/1990). in collagen-coated petri dishes (6-well plates, Greiner, Nuertingen) with a cell density of 125,000 cells / cm 2 in Williams Medium E medium with 10% calf serum. More details especially on culture media can be found in Gebhardt et al. Cell Biol Toxicol 6: 369-372 (1990) and in Mewes et al. Cancer Ras 53: 5135-5142 (1993) The cultures were transferred after 2 hours to serum-free medium with the addition of 0.1 μΜ insulin. After more • ·

01/203/02-ПБ часа те се използват за опитите. Всяко от опитните вещества се изследва при три независими култури от 2-3 плъха.01/203/02-PB hours are used for the experiments. Each test substance was tested in three independent cultures of 2-3 rats.

Инкубация на клетъчни култури от дроб с опитните вещества А) и В)Incubation of liver cell cultures with test substances A) and B)

За доказване на влиянието на опитните вещества А) и В) върху холестериновата биосинтеза, хепатоцитните култури се държат общо 22 часа. След това несъдържаща серум среда Williams Medium Е с добавка на 14С-ацетат (само индикаторни количества) се инкубира в продължение на 2 часа с изследваните вещества при дадените концентрации. При всяка серия се прави опит и с контрола. Използва се методиката, описана подробно от Gebhardt (1991) и Gebhardt, Lipids 28: 613-619 (1993). Индикаторните количества от белязан ^С-ацетат се размесват бързо с интрацелуларния ацетил-СоА Pool и дава възможност за точно определяне на вграждането на 14С-ацетат в стеролната фракция, която се състой до > 90 % от холестерин (Gebhardt, 1993).For demonstration of the effect of test substances A) and B) on cholesterol biosynthesis, hepatocyte cultures were kept for a total of 22 hours. Then serum free Williams Medium E supplemented with 14 C-acetate (indicative amounts only) was incubated for 2 hours with the test substances at the given concentrations. Each series is also tried and tested. The methodology described in detail by Gebhardt (1991) and Gebhardt, Lipids 28: 613-619 (1993) is used. Indicator quantities of labeled N-acetate are rapidly mixed with the intracellular acetyl-CoA Pool and allow accurate determination of the incorporation of 14 C-acetate into the sterol fraction consisting of> 90% of cholesterol (Gebhardt, 1993).

Анализ за влиянието върху биосинтеза на холестерин Вграждането на 14С-ацетат в стеролната фракция (неосапуняеми липиди) се измерва по Gebhardt (1991). При използваните екстракционни средства Extrelut®-Saeulen (Merck, Darmstadt), 14С-ацетатът (и произхождащите от него малки количества от други нискомолекулни метаболити) се отделя до повече от 95 %. Чрез този тест могат да се получат сравнителни данни за отношението на синтезните продукти от холестерин и предхождащите стероли под влияние на опитните вещества (Gebhardt, 1993).Analysis of the effect on cholesterol biosynthesis The incorporation of 14 C-acetate into the sterol fraction (non-soapy lipids) was measured by Gebhardt (1991). With the Extrelut®-Saeulen extraction agents (Merck, Darmstadt) used, the 1 4 C-acetate (and the small amounts of other low-molecular metabolites derived therefrom) was separated to more than 95%. Through this test, comparative data can be obtained on the ratio of cholesterol synthesis products and precursors to sterols under the influence of test substances (Gebhardt, 1993).

···· ·· ·· :· : :···· ·· ··: ·:

• : .· · :•:. · ·:

• · ·♦ ·· «• · · · ·

01/203/02-ПБ01/203/02-PB

Визуално и микробно изследване на качествата на хепатоцитните културиVisual and microbial examination of the properties of hepatocyte cultures

Всички използвани култури се изследват визуално на микроскоп преди и след инкубацията за контаминация (сливане) с микроорганизми и за цялостност на клетъчния монослой. При нито една от пробите не се наблюдават различими изменения на клетъчната морфология (особено при по-високи концентрации). Това изключва влияние чрез цитотоксично действие на опитните вещества върху резултатите от опита.All cultures used were visually examined on a microscope before and after incubation for contamination (fusion) with microorganisms and for the integrity of the cell monolayer. No changes in cell morphology were observed in any of the samples (especially at higher concentrations). This eliminates the cytotoxic effects of the test substances on the test results.

Проведените рутинни тестове за стерилитет п.ри всички култури не дава указание за контаминация с микроорганизми.Conducted routine tests for infertility in all cultures do not indicate contamination with microorganisms.

РезултатиResults

Пробите А) от генетично немодифицирани домати (контроли) не проявяват никакво действие върху биосинтеза на холестерин. За разлика от тях биосинтезът на холестерин е значително инхибиран в пробите В), от домати, които съдържат частичен фрагмент от флаванон-3-хидроксилаза в Antisens-ориентация.Genetically unmodified tomato samples (controls) showed no effect on cholesterol biosynthesis. In contrast, cholesterol biosynthesis is significantly inhibited in samples B) from tomatoes that contain a partial fragment of flavanone-3-hydroxylase in an Antisens orientation.

Claims (5)

1. Метод за повишаване на съдържанието на флавоноиди и фенолни вещества в растения, характеризиращ се с това, че по метод на молекулната генетика се получава растение, в което е понижена активността на ензима флаванон-3-хидроксилаза.A method for increasing the content of flavonoids and phenolic substances in plants, characterized in that a molecular genetics method produces a plant in which the activity of the flavanone-3-hydroxylase enzyme is reduced. 2. Метод съгласно претенция 1, за повишаване на съдържанието на флавоноиди и фенолни вещества в растенията, характеризиращ се с това, че активността на ензима флаванон-3хидроксилаза се понижава чрез молекулно биологичен метод (напр. Anti-Sense-Konstrukt, съсупресия, експресия на специфични антитела или експресия на специфични инхибитори) напълно или частично, за постоянно или временно, в цялото растение или в части от растението.A method according to claim 1, for increasing the content of flavonoids and phenolic substances in plants, characterized in that the activity of the flavanone-3 hydroxylase enzyme is reduced by a molecular biological method (eg Anti-Sense-Construct, suppression, expression of specific antibodies or expression of specific inhibitors) in whole or in part, permanently or temporarily, throughout the plant or in parts of the plant. 3. Метод съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че растенията са грозде, череша, домати, сливи, трънки, боровинки, ягоди, цитрусови плодове (като портокали, грейпфрут), папая, червено зеле, броколи, брюкселско зеле, какао, листно зеле, моркови, магданоз, целина, лук, чесън, чай, кафе, хмел, соя, рапица, овес, пшеница, ръж, Aronia melanocarpa, Ginko biloba.The method according to claims 1 and 2, characterized in that the plants are grapes, cherries, tomatoes, plums, thorns, blueberries, strawberries, citrus fruits (such as oranges, grapefruit), papaya, red cabbage, broccoli, Brussels sprouts, cocoa, leaf cabbage, carrots, parsley, celery, onion, garlic, tea, coffee, hops, soybeans, rapeseed, oats, wheat, rye, Aronia melanocarpa, Ginko biloba. 4. Растение c повишено съдържание на флавоноиди и фенолни съставни вещества, получено по метод, съгласно претенции 1 до 3, характеризиращо се с това, че в него е понижена ензимната активност на ензима флаванон-3-хидроксилаза.A plant with a high content of flavonoids and phenolic constituents, obtained by the method according to claims 1 to 3, characterized in that the enzyme activity of the flavanone-3-hydroxylase enzyme is reduced. 5. Използване на растения или на части от тези растения, получени по метода съгласно претенции 1 до 3, като хранителни средства, като добавки в храните или за получаване на лечебни, подобряващи здравословното състояние или подсилващи средства (сокове, чай, екстракти, ферментационни продукти), за хората или за животни, както и за получаване на козметични продукти.Use of plants or parts of such plants obtained by the method according to claims 1 to 3 as nutrients, as food additives or for the preparation of medicinal, health-enhancing or enhancing agents (juices, tea, extracts, fermentation products) ), for humans or animals, and for cosmetic products.
BG105246A 1999-06-17 2001-02-13 Method for producing plants with increased flavonoid and pohenolic compound content BG105246A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19927574A DE19927574A1 (en) 1999-06-17 1999-06-17 Increasing content of flavonoids and phenols in plants, useful for e.g. preventing cardiovascular disease, by reducing activity of flavanone-3-hydroxylase
PCT/US1999/013658 WO2000078900A1 (en) 1998-05-11 1999-06-18 Soybean oil based electrically insulating fluid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG105246A true BG105246A (en) 2001-10-31

Family

ID=7911499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG105246A BG105246A (en) 1999-06-17 2001-02-13 Method for producing plants with increased flavonoid and pohenolic compound content

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP1102855A1 (en)
JP (1) JP2003503032A (en)
KR (1) KR20020068256A (en)
CN (1) CN1314943A (en)
AR (1) AR024381A1 (en)
AU (1) AU5970400A (en)
BG (1) BG105246A (en)
BR (1) BR0006869A (en)
CA (1) CA2340319A1 (en)
CO (1) CO5280139A1 (en)
DE (1) DE19927574A1 (en)
HU (1) HUP0103307A2 (en)
IL (1) IL141173A0 (en)
PL (1) PL346059A1 (en)
WO (1) WO2000078980A1 (en)
ZA (1) ZA200101328B (en)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100642939B1 (en) * 2003-02-11 2006-11-10 학교법인 신천학원 Bathroom soap comprising plum extracts and extracting method thereof
KR100553522B1 (en) * 2004-02-06 2006-02-20 학교법인 건국대학교 Isoflavone Fortifying Sprouted Mung Bean and the Method Thereof
WO2005074710A1 (en) * 2004-02-06 2005-08-18 Konkuk University Industrial Coorperation Corp Sprouted bean containing high concentration of isoflavone and the preparing method thereof
KR100663669B1 (en) * 2005-05-18 2007-01-02 금호석유화학 주식회사 Transgenic rice line producing high level of flavonoids in the endosperm
KR20120003009A (en) * 2009-04-21 2012-01-09 하스, 존 아이. Animal feed compositions and feeding methods
EP2286669A1 (en) * 2009-07-29 2011-02-23 Nestec S.A. Flavanones-containing food compositions
US20140072692A1 (en) * 2012-06-07 2014-03-13 Ichiro Yamada Garlic egg yolk composition
KR101415687B1 (en) * 2012-09-19 2014-07-10 농업회사법인 호트팜 주식회사 Multiple Propagation Methods of in vitro Plantlets Derived from Node Cultures of Aronia using Tissue Culture Techniques
WO2015140589A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 Hongkong Chuanghui International Limited Method for preparation multifunctional liquid medicament from vegetable feedstock, and the product produced by the method
CN105985936A (en) * 2015-02-02 2016-10-05 中国人民解放军第二军医大学 Erigeron breviscapus flavanone-3-hydroxylase as well as coding gene and application thereof
CN111875689B (en) * 2020-08-07 2022-02-01 山东玄康种业科技有限公司 Method for creating male sterile line by using tomato green stem close linkage marker
JPWO2022045091A1 (en) 2020-08-25 2022-03-03
CN112391362B (en) * 2020-11-04 2022-07-05 江南大学 Flavone 3 beta-hydroxylase mutant with improved catalytic activity and application thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
AU668548B2 (en) * 1992-03-09 1996-05-09 Washington State University Research Foundation Methods for the regulation of plant fertility
GB9525459D0 (en) * 1995-12-13 1996-02-14 Zeneca Ltd Genetic control of fruit ripening
EP1066385A1 (en) * 1998-02-25 2001-01-10 E.I. Du Pont De Nemours & Company Incorporated Plant flavanone-3-hydroxylase
AU2687000A (en) * 1999-02-22 2000-09-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Transgenic plants and method for transforming carnations

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0103307A2 (en) 2001-12-28
CO5280139A1 (en) 2003-05-30
BR0006869A (en) 2001-08-07
CA2340319A1 (en) 2000-12-28
AU5970400A (en) 2001-01-09
WO2000078980A1 (en) 2000-12-28
CN1314943A (en) 2001-09-26
ZA200101328B (en) 2002-02-18
KR20020068256A (en) 2002-08-27
IL141173A0 (en) 2002-02-10
AR024381A1 (en) 2002-10-02
PL346059A1 (en) 2002-01-14
JP2003503032A (en) 2003-01-28
EP1102855A1 (en) 2001-05-30
DE19927574A1 (en) 2000-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shi et al. Metabolomic and transcriptomic analyses of anthocyanin biosynthesis mechanisms in the color mutant Ziziphus jujuba cv. Tailihong
Liu et al. Ectopic expression of a BZR1‐1D transcription factor in brassinosteroid signalling enhances carotenoid accumulation and fruit quality attributes in tomato
Gosch et al. Phloridzin: biosynthesis, distribution and physiological relevance in plants
Halbwirth et al. Two-phase flavonoid formation in developing strawberry (Fragaria× ananassa) fruit
Valiñas et al. Chlorogenic acid, anthocyanin and flavan-3-ol biosynthesis in flesh and skin of Andean potato tubers (Solanum tuberosum subsp. andigena)
Kim et al. Analysis of eight phytohormone concentrations, expression levels of ABA biosynthesis genes, and ripening-related transcription factors during fruit development in strawberry
Fan et al. Cs-miR156 is involved in the nitrogen form regulation of catechins accumulation in tea plant (Camellia sinensis L.)
Gagné et al. Leucoanthocyanidin reductase and anthocyanidin reductase gene expression and activity in flowers, young berries and skins of Vitis vinifera L. cv. Cabernet-Sauvignon during development
BG105246A (en) Method for producing plants with increased flavonoid and pohenolic compound content
KR100697738B1 (en) Method of Increasing the Content of Flavonoids and Phenolic Substances in Plants
Boba et al. Methyl salicylate level increase in flax after Fusarium oxysporum infection is associated with phenylpropanoid pathway activation
Li et al. Purple canola: Arabidopsis PAP1 increases antioxidants and phenolics in Brassica napus leaves
Moyo et al. Plant regeneration and biochemical accumulation of hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acid derivatives in Hypoxis hemerocallidea organ and callus cultures
Li et al. Development of marker-free transgenic potato tubers enriched in caffeoylquinic acids and flavonols
Wang et al. Expression of chalcone synthase and chalcone isomerase genes and accumulation of corresponding flavonoids during fruit maturation of Guoqing No. 4 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow)
Zhao et al. Cold stress-induced glucosyltransferase CsUGT78A15 is involved in the formation of eugenol glucoside in Camellia sinensis
Zhang et al. Genome-wide analysis and metabolic profiling unveil the role of peroxidase CsGPX3 in theaflavin production in black tea processing
Gosch et al. Substrate specificity and contribution of the glycosyltransferase UGT71A15 to phloridzin biosynthesis
Siebeneichler et al. Changes in the abscisic acid, phenylpropanoids and ascorbic acid metabolism during strawberry fruit growth and ripening
Spring et al. Spatial and developmental synthesis of endogenous sesquiterpene lactones supports function in growth regulation of sunflower
Hata et al. Effect of photoperiod on growth of the plants, and sesamin content and CYP81Q1 gene expression in the leaves of sesame (Sesamum indicum L.)
Kim et al. Characterization of genes for a putative hydroxycinnamoyl-coenzyme A quinate transferase and p-coumarate 3′-hydroxylase and chlorogenic acid accumulation in tartary buckwheat
Castrillón-Arbeláez et al. Secondary metabolism in Amaranthus spp.—a genomic approach to understand its diversity and responsiveness to stress in marginally studied crops with high agronomic potential
TW202302853A (en) Methods of high production of polyphenols from red lettuces and uses thereof
Li et al. Identification and functional characterization of a new flavonoid synthase gene MdFLS1 from apple