"Procédé de production de protéines correspondant à la
toxine diphtérique" Procédé de production de protéines correspondant
à la toxine diphtérique
La présente invention concerne un procédé de production d'une protéine qui correspond à la toxine diphtérique, par culture, dans un milieu nutritif liquide contenant des ions fer à une concentration de 0,05 ug/ml à 0,5 ug/ml, à une température de 30[deg.] à 40[deg.]C, dans un milieu de culture neutre et dans des conditions aérobies, d'un microorganisme appartenant au genre Corynebacterium diphtheriae avec deux phages (bactériophages) mutants codant pour la protéine qui correspond à la toxine diphtérique et intégrés en mode non-tandem dans leurs chromosomes.
La toxine diphtérique est une protéine qui est remarquablement toxique envers les cellules eucaryotes.
Cette toxine se compose de deux sous-unités, à savoir : le fragment B qui peut se fixer aux récepteurs qui se trouvent sur la membrane de la cellule eucaryote, et le fragment A, qui est toxique et qui, après avoir pénétré les cellules, y bloque la synthèse de la protéine.
La toxine diphtérique est codée par un gène, dont la structure primaire a récemment été déterminée (C. Ratti, R. Rappuoli, E.G. Giannini, Nucleic Acid Research, 11, 6589,
6595, (1983), et qui est présent dans l'ADN de quelques
<EMI ID=1.1>
Corynebacterium diphtheriae (J. J. Costa et al., J. Bacteriol., 148, 124-130 (1981) ; V. Freeman, J. Bacteriol.
<EMI ID=2.1>
Ces phages, après avoir infecté la bactérie, peuvent la dissoudre et ainsi la tuer, ou bien peuvent s'intégrer au chromosome bactérien, rester inactifs et être repliqués chaque fois que la bactérie est elle-même repliquée.
L'ADN du phage intégré sera transmis en même temps que le chromosome bactérien aux cellules-filles qui contiendront ainsi le gène codant la protéine.
A l'heure actuelle, on produit la toxine
<EMI ID=3.1>
détoxication avec du formol, pour la préparation du vaccin antidiphtérique.
<EMI ID=4.1>
par traitement à la nitrosoguanidine, par Uchida et al.
(Nature New Biol., 233, 8-11, (1973)).
De tels phages mutants qui sont intégrés au chromosome bactérien du micro-organisme Corynebacterium diphtheriae, codent la synthèse de protéines correspondant à la toxine diphtérique, dont ils diffèrent quant à leur structure et/ou quant à leur fonction en raison de la présence d'une ou de plusieurs mutations insérées dans le gène structurel de la toxine.
Les protéines du type mentionné ci-dessus ont été dénommées "substances de réaction croisée" (CRM), vu qu'elles entraînent une réaction croisée immunologique avec la toxine diphtérique.
Parmi les plusieurs phages mutants qui ont été isolés, on a plus particulièrement exploré ceux qui codent pour les protéines CRM 176, CRM 197, CRM 228 et CRM 45
(Uchida et al., J. Biol. Chem., 218, 3838-3844 (1973)).
Plus particulièrement, la protéine CRM 45 est une protéine qui se compose d'un fragment A, ressemblant par sa structure et par sa fonction à la toxine diphtérique, et
d'un fragment B, qui est dépourvu d'un segment capable de fixer la protéine aux récepteurs qui se trouvent à la surface des cellules eucaryotes.
Le résultat est que la protéine CRM 45, bien qu'ayant un fragment A qui est totalement actif in vitro,
n'a absolument aucune activité in vivo, étant donné qu'elle est incapable de pénétrer les cellules.
Inversement, le fragment B possède, non modifiée,
la structure hydrophobe qui est nécessaire pour faire passer le fragment A à l'intérieur de la cellule.
En raison de ces caractéristiques, c'est-à-dire présence du fragment actif A, présence, dans le fragment B,
de la structure qui est requise pour faire passer le fragment A à l'intérieur de la cellule, et absence de la région qui est capable de reconnaître les récepteurs des membranes cellulaires, il a été envisagé de faire appel à la protéine CRM 45 pour constituer des toxines hybrides. En fait, en remplaçant le segment manquant par une substance telle que :
anticorps, anticorps monoclonal, hormone ou autre substance d'intérêt biologique, capable de reconnaître des molécules spécifiques sur les surfaces de quelques cellules, telles
que des cellules-cibles, on a obtenu une toxine hybride, qui est capable de ne tuer sélectivement que quelques sortes de cellules.
Une telle toxine hybride peut trouver une application élective dans le domaine pharmacologique et, pardessus tout, pour le traitement de quelques types de tumeurs
(P. Bacha et al., J. Biol. Chem., 258, 1565-1570, (1983)).
La protéine CRM 197 a le même poids moléculaire que la toxine diphtérique et se compose d'un fragment B qui est identique, par sa fonction et par sa structure, à la toxine, et d'un fragment A, qui est atoxique et qui diffère du fragment d'origine par un amino-acide. La protéine CRM 197, qui est atoxique, ne peut pas être distinguée immunologiquement
de la toxine diphtérique et peut ainsi constituer une solution de rechange au toxoïde diphtérique qui est employé
à l'heure actuelle pour la production du vaccin.
En fait, un traitement doux de la protéine CRM 197 avec du formol suffit à obtenir des niveaux protecteurs satisfaisants d'anticorps diphtériques chez les cochons d'Inde (M. Porro et al., J. Infect Dis., 142, 5 (1980)).
Mais jusqu'à présent, des développements plus poussés de produits dérivant de protéines correspondant à la toxine diphtérique et obtenus selon le mode opératoire
révélé par Uchida, ont été entravés par les faibles rendements des synthèses de ces protéines par culture.
En conséquence, un objet de la présente invention est de procurer un procédé de production de protéines correspondant à la toxine diphtérique, qui comprend une étape de culture, dans un milieu nutritif liquide contenant des ions fer à une concentration de 0,05 �g/ml à 0,5 �g/ml, à une température de 30[deg.]C à 40[deg.]C, dans un milieu de culture neutre et dans des conditions aérobies, d'un micro-organisme appartenant au genre Corynebacterium diphtheriae avec deux phages mutants qui codent pour la protéine correspondant à la toxine diphtérique et qui sont intégrés en mode non-tandem dans leurs chromosomes.
Plus particulièrement, l'objet de la présente invention est de procurer un procédé de production de la protéine CRM 45 avec des rendements de 50 Lf/ml à 200 Lf/ml, et la protéine CRM 197 avec des rendements de 30 Lf/ml à
60 Lf/ml, par culture de la souche C7 (S45) M8 avec deux
<EMI ID=5.1>
La présente invention est basée essentiellement sur la découverte relativement surprenante du fait que la souche C7 (ATCC 27010) de Corynebacterium diphtheriae possède dans son propre chromosome deux points de fixation attB où l'ADN bactériophage peut être intégré. Les processus lysogènes d'un phage d'après la méthode de Campbell (Epitomes Adv. Genetics,
11, 101-145, (1982)), illustré sur la Figure 1A, suppose
la coupure de l'ADN bactériophage circulaire en un point spécifique, attP, et l'intégration, en un point tout aussi spécifique, du chromosome bactérien, attB, qui est appelé point de fixation. Jusqu'à maintenant, dans toutes les configurations connues, un seul point attP et un seul point attB ont été identifiés.
Il a maintenant été constaté que la souche C7
(ATCC 27010) de Corynebacterium diphtheriae possède dans son chromosome deux points de fixation, attB1 et attB2, où
l'ADN bactériophage peut être intégré. En utilisant le milieu de culture TYE, modifié selon l'invention, on a isolé, dans le procédé de lysogénisation de cette bactérie, les souches lysogènes suivantes : monolysogènes, lorsque le phage n'est présent qu'une seule fois en attB1 ou attB2 ; bi-lysogènes
(tandem) lorsque deux phages sont simultanément présents en un même point attB ; et bi-lysogènes non-tandem, lorsque deux phages sont simultanément présents, l'un en attB1 et l'autre en attB2 (Figure 1B).
Selon la présente invention, on a infecté la souche C7 (ATCC 27010) de Corynebacterium diphtheriae avec un phage mutant qui code pour la protéine correspondant à la toxine diphtérique, par "placage" sur un milieu de culture CY.
Après 48 heures de croissance à une température de
35[deg.]C, on a observé les plaques de lyse du phage, qui contenaient en leur sein une zone opaque due à la croissance de ces bactéries, dans laquelle le phage avait été intégré au chromosome bactérien.
On a prélevé les souches d'une manière stérile et on les a plaquées sur un milieu CY de manière à isoler les différentes colonies, pour les analyser ensuite afin de vérifier la présence de phages lysogènes par la "méthode de libération des phages" (Miller et al., Virology, 29, 410-425,
(1966)).
On a procédé à un tri des bi-lysogènes en se basant sur le fait que les lysogènes qui contenaient deux couples du phage intégré possédaient deux gènes codant pour la protéine correspondant à la toxine diphtérique, si bien qu'ils sont capables de synthétiser une quantité deux fois plus grande
de ladite protéine.
On a préparé des plaques du milieu de culture TYE, contenant respectivement 3, 4, 6, 8 et 12 unités/ml de sérum d'antitoxine diphtérique, et on a ensuite titré la concentration de chaque lysogène dans le sérum, par transfert de plaques. On a fait précipiter la protéine produite par les différents lysogènes, par diffusion à travers la gélose, à partir de l'anticorps qui se trouvait dans le milieu, formant ainsi un halo dont la taille était directement proportionnelle à la quantité de CRM produite par chacune des colonies.
Dans les plaques qui contenaient une concentration d'anticorps égale à 3 unités/ml, tous les lysogènes formaient un halo identique. Dans celles de concentration intermédiaire, 4 à 6 unités/ml d'anticorps, on a observé des halos de tailles différentes : très petits pour les monolysogènes et plus grands pour les bi-lysogènes.
Dans les plaques contenant une concentration d'anticorps de 8 à 12 unités/ml, seuls les bi-lysogènes faisaient apparaître un halo de précipitation.
La Figure 2 est la photographie d'une plaque TYE contenant 6 unités/ml d'anticorps, sur laquelle il est possible de distinguer trois halos de tailles différentes, correspondant à des lysogènes différents : monolysogènes (petit halo), bilysogènes en tandem (halo A) et bi-lysogènes non-tandem
(halo B). On a fait la démonstration du fait que les lygosènes ayant le halo le plus grand contiennent deux phages intégrés dans leurs chromosomes respectifs en mettant en évidence l'organisation moléculaire des phages par purification de l'ADN chromosomique selon des modes opératoires classiques. Sur la Figure 1B, on peut voir qu'en coupant l'ADN bactériophage aux points A et B à l'aide d'une enzyme de restriction, on obtient un fragment AB, alors que, si l'on utilise la même enzyme pour le monolysogène, on devrait obtenir deux fragments, A et B, contenant chacun une partie
du chromosome bactérien, quatre fragments pour le bi-lysogène non-tandem et trois pour le bi-lysogène tandem.
En fait, les analyses effectuées par le mode opératoire de la tache de Southern (J. Mol. Biol., 98, 503-
517, (1975), en utilisant comme sonde le fragment �Bam 4 contenant le point attP marqué au phosphore 32 correspondent, comme le montre la Figure 3, aussi bien par le nombre que
par la position des bandes, à ce qui avait été prévu selon l'invention à partir de l'analyse de la Figure 1B.
Sur la Figure 3, l'ADN du phage donne une bande unique (A), celui du monolysogène deux bandes (B), celui du bi-lysogène non-tandem quatre bandes (C), tandis que le bilysogène tandem donne trois bandes, dont l'une migre en même temps que celle du phage (D).
On a vérifié la stabilité des bi-lysogènes en prélevant des colonies isolées de cultures anciennes (5 jours), en les plaquant sur un milieu CY, et en analysant par la méthode du halo la présence d'un ou de deux phages. Cette analyse a donné les résultats suivants : les bi-lysogènes en tandem étaient médiocrement stables en raison de leur tendance à perdre un phage et à se transformer en monolysogènes. Sur 250 colonies essayées, 180 environ étaient devenues des monolysogènes, tandis que les bi-lysogènes du type non-tandem étaient extrêmement stables . en fait, sur
450 colonies essayées, on n'a trouvé aucun monolysogène.
Selon la présente invention, on a infecté la
<EMI ID=6.1>
ont été déposées à l'American Type Culture Collection (ATCC) et les numéros ATCC-39526 et ATCC 39255 leur ont été attribués.
On a examiné les différentes souches lysogènes pour voir si elles produisaient les protéines CRM 45 et
CRM 197 en les cultivant dans des conditions aérobies et dans un milieu liquide nutritif contenant des ions fer à une concentration de 0,05 ug/ml à 0,5 �g/ml, de préférence de 0,1 �g/ml, à une température de 30[deg.]C à 40[deg.]C, de préférence
de 35[deg.]C à 37[deg.]C, à pH neutre et pendant un laps de temps suffisant pour accumuler une quantité considérable de protéines dans le milieu de culture.
On a ensuite recueilli la protéine et on l'a purifiée par l'un quelconque des modes opératoires classiques connus de l'homme du métier.
Milieux de culture utilisés dans le mode opératoire :
Milieu TYE permettant de produire le halo de précipitation
On a modifié le milieu suivant par rapport à la formule d'origine de Pappenheimer (Inf. Imm., 18, 203-209,
(1977)), et il avait la composition suivante : tryptose :
10 g ; extrait de levure : 5 g ; NaCl : 5 g ; KH2P04 . 5 g ; eau : 1 litre.
On a ajusté le pH à 7,4 et on a ajouté au milieu
2 ml de chlorure de calcium à 50 % avant de le faire passer à l'autoclave. On a laissé décanter le précipité, après quoi on a ajouté 2 ml/1 d'une solution II, 1 ml/1 d'une solution. III et 12 ml/1 de gélose noble.
Enfin, on a ajouté du sérum de sang de cheval antidiphtérique à une concentration de 4, 6, 8 ou 12 unités/ml, en fonction du halo qui était attendu.
Milieu CY permettant la production de protéines CRM
Extrait de levure : 20 g; amino-acides dérivés de la caséine:
<EMI ID=7.1>
7,4, on porte à ébullition et on filtre sur papier Whatman pendant que l'ébullition continue. On ajoute 2 ml de solution II, 1 ml de solution III, puis on met le mélange réactionnel dans un autoclave. Avant de l'utiliser, on lui ajoute 3 ml d'une solution de maltose et de chlorure de calcium par fraction de 100 ml de milieu.
Solution II
<EMI ID=8.1>
nicotinique : 115 mg. On ajoute ensuite 1 ml d'eau et d'acide chlorhydrique concentré pour dissoudre les composants, après
<EMI ID=9.1>
et 3 ml d'acide chlorhydrique concentré, puis de l'eau jusqu'à 100 ml.
Solution III
L-cystine : 20 g ; acide chlorhydrique concentré :
20 ml ; eau jusqu'à 100 ml.
Solution de maltose -- chlorure de calcium :
maltose 50 g; 2 ml de chlorure de calcium à 50 %; 1 g de KH2P04, et de l'eau jusqu'à 100 ml. On ajuste le pH à 7,4
et on filtre la solution sur papier filtre Whatman 40, après quoi on place la solution dans un autoclave.
Description des dessins :
Figure 1A : processus de lysogénisation selon Campbell. L'ADN bactériophage est cassé en un point spécifique attP et est intégré en un point tout aussi spécifique, attB, du chromosome bactérien. <EMI ID=10.1>
(ATCC 27010) de Corynebacterium diphtheriae.
L'ADN bactériophage est cassé au point de fixation attP et peut être intégré au niveau des deux
<EMI ID=11.1>
présents dans le chromosome bactérien pour donner des monolysogènes, des bi-lysogènes tandem et des bi-lysogènes non-tandem.
Figure 2 : plaque avec milieu TYE contenant six unités/ml de sérum antidiphtérique. On peut distinguer trois halos de précipitation, à savoir : halo très petit (monolysogènes), halo intermédiaire A
(bi-lysogènes tandem) et grand halo B (bilysogènes non-tandem). Figure 3 : analyse de l'ADN des lysogènes par la méthode de la tache de Southern. On a fait digérer l'ADN avec du BamH- et on a séparé les fragments sur gel d'agarose (1,3 %) puis on les a transférés dans de la nitrocellulose, après quoi on les a <EMI ID=12.1>
On peut voir un fragment unique AB dans l'ADN bactériophage (A), deux fragments AB dans le monolysogène (B), quatre fragments dans le bilysogène non-tandem (C) et trois fragments dans le bi-lysogène tandem (D).
Figure 4 : production de la protéine CRM 197 avec la souche
<EMI ID=13.1>
Les petits carrés pleins /0, indiquent la densité optique de la culture.
Les exemples expérimentaux qui suivent sont des illustrations et non des limitations de l'invention. EXEMPLE 1
On prépare des ballons de 125 ml contenant chacun
10 ml de milieu CY et on les stérilise à 120[deg.]C pendant 15 <EMI ID=14.1>
pendant 24 heures à 35[deg.]C sur des plaques CY.
On cultive pendant une nuit à 35[deg.]C les ballons qui ont été ainsi inoculés.
On inocule 0,1 ml de chaque culture isolée dans des fioles d'Erlenmeyer ayant une capacité de 125 ml, dont chacune contient 10 ml de milieu CY déferrisé et
<EMI ID=15.1>
agitateur tournant à 240 tours par minute pendant 45 heures
à une température de 35[deg.]C.
On prélève des échantillons à intervalles de deux heures, et on détermine alors la densité optique et le
contenu de CRM 197 libéré dans le surnageant. On mesure la densité optique à 590 nm à l'aide d'un spectrophotomètre "PerkinElmer"Modèle 35 (marque déposée) (longueur du trajet des rayons lumineux 1 ci?) et on détermine la protéine CRM 197 par la méthode immunoélectrophorétique (Murfy et al., J. Clin. Microbiol., 7, 91-
96 (1978)) et/ou par floculation (G. Ramon. C.R. Soc. Biol.,
86, 661-671, (1922)). Par "Lf/ml", on entend l'unité de floculation telle qu'elle est définie par G. Ramon dans C.R.
Soc. Biol. (Paris), 86, 661-671 (1922)).
Les résultats que l'on a obtenus sont illustrés sur la Figure 4. Ainsi qu'on peut le voir, la production de CRM
197 ne peut pas commencer avant que la densité optique (O.D.) de la culture ait atteint une valeur de 4,5 à 5, correspondant
à la fin de la phase logarithmique. Au début de la partie
finale de cette dernière phase, la production massive de CRM
197 commence, et elle se poursuit jusqu'au début de la phase stationnaire (20 heures environ), au moment où l'on observe
la densité optique maximale et la quantité maximale de CRM
197.
Après la 24ème heure de culture, on observe une diminution de 25 % de la production de CRM 197 après 30heures
et après 45 heures,cette diminution est de 75%. La tendance de la
courbe de production de CRM 197 est pratiquement
la même pour les différents lysogènes, tandis que la production est de : 20 Lf/ml pour les monolysogènes, 30 Lf/ml pour les bi-lysogènes tandem et 60 Lf/ml pour les bi-lysogènes non tandem.
Exemple 2
On prépare par le même mode opératoire que celui indiqué à l'exemple 1, les
<EMI ID=16.1>
On inocule 0,1 ml de chaque culture dans des ballons de 125 ml contenant chacun 10 ml de milieu CY déferrisé , et complété avec 0,1 �g/ml de Fe++.
On met en incubation les ballons pendant 36 heures à une température de 35[deg.]C sur un agitateur tournant (240 tours par minute). On analyse les échantillons prélevés au bout de
20 heures et de 30 heures après le début de la fermentation, par le même mode opératoire que celui de l'Exemple 1 pour déterminer la densité optique et la production de la protéine CRM 45 libérée dans le surnageant.
Les résultats qui ont été obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous :
TABLEAU 1
<EMI ID=17.1>
Les résultats rapportés ci-dessus montrent que la production maximale de CRM 45 est détectée après 30 heures
de culture et est pratiquement la même pour les monolysogènes et pour les bi-lysogènes tandem, et est presque deux fois plus grande pour les bi-lysogènes non-tandem.
EXEMPLE 3
<EMI ID=18.1>
comme décrit à l'Exemple 1, et on a transféré 2 ml de cette préculture dans deux fioles d'Erlenmeyer de 2.000 ml contenant chacune 500 ml de milieu CY déferrisé, avec un supplément de 0,1 �g/ml de Fe++, et on a cultivé en agitant (240 tours par minute) à une température de 35[deg.]C pendant 24 heures.
On a inoculé 1.000 ml de la culture de lysogènes résultante dans 40 1 d'un milieu de culture CY ayant une concentration en ions Fe de 0,1 ug/ml, contenu dans un fermenteur ayant un volume de 50 1, et on a cultivé à une température de 37[deg.]C en aérant à un débit de 15 1/minute^ de bas en haut, en agitant à 600 tours/minute et en maintenant le pH du milieu de culture entre 6,5 et 7,5 à l'aide d'une solution de glucose à 20 %, ou bien à l'aide d'une solution de soude 4 N, pendant 40 heures. La quantité de CRM 45, après 30 heures de fermentation, était de 200 Lf/ml. On a centrifugé le bouillon de culture résultant dans une centrifugeuse à circulation continue et on a récupéré la protéine du surnageant en la faisant précipiter avec du sulfate d'ammonium complété à un degré de saturation de 75 %.
On a centrifugé la bouillie ainsi obtenue et on a purifié le sédiment, par lavage avec un tampon de phosphate
à pH 7,5, dans une colonne garnie d'une résine échangeuse d'ions (diméthylammoniuméthylcellulose).
On a recueilli la protéine en éluant la colonne avec un gradient de chlorure de sodium, avec un rendement de
80 %.
REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'une protéine correspondant à la toxine diphtérique, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver, dans un milieu nutritif liquide contenant des ions fer à une concentration de 0,05 ug/ml à 0,5 ug/ml, à une température de 30[deg.]C à 40[deg.]C, à pH neutre et dans des conditions aérobies, un micro-organisme appartenant au genre Corynebacterium diphtheriae, avec deux phages mutants qui codent pour la protéine correspondant à la toxine diphtérique et qui sont intégrés en mode non-tandem aux deux points de fixation du chromosome bactérien.
"Process for the production of proteins corresponding to the
diphtheria toxin "Process for producing corresponding proteins
with diphtheria toxin
The present invention relates to a process for producing a protein which corresponds to the diphtheria toxin, by culture, in a liquid nutritive medium containing iron ions at a concentration of 0.05 μg / ml to 0.5 μg / ml, a temperature of 30 [deg.] to 40 [deg.] C, in a neutral culture medium and under aerobic conditions, of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium diphtheriae with two mutant phages (bacteriophages) coding for the corresponding protein with diphtheria toxin and integrated in non-tandem mode into their chromosomes.
Diphtheria toxin is a protein that is remarkably toxic to eukaryotic cells.
This toxin consists of two subunits, namely: fragment B which can attach to receptors which are on the membrane of the eukaryotic cell, and fragment A, which is toxic and which, after having penetrated the cells, blocks the synthesis of the protein.
Diphtheria toxin is encoded by a gene, the primary structure of which has recently been determined (C. Ratti, R. Rappuoli, E.G. Giannini, Nucleic Acid Research, 11, 6589,
6595, (1983), and which is present in the DNA of a few
<EMI ID = 1.1>
Corynebacterium diphtheriae (J. J. Costa et al., J. Bacteriol., 148, 124-130 (1981); V. Freeman, J. Bacteriol.
<EMI ID = 2.1>
These phages, after having infected the bacteria, can dissolve it and thus kill it, or else can integrate into the bacterial chromosome, remain inactive and be replicated each time the bacterium is itself replicated.
The integrated phage DNA will be transmitted along with the bacterial chromosome to daughter cells, which will contain the gene encoding the protein.
At present, we produce the toxin
<EMI ID = 3.1>
detoxification with formalin, for the preparation of the diphtheria vaccine.
<EMI ID = 4.1>
by treatment with nitrosoguanidine, by Uchida et al.
(Nature New Biol., 233, 8-11, (1973)).
Such mutant phages which are integrated into the bacterial chromosome of the microorganism Corynebacterium diphtheriae, encode the synthesis of proteins corresponding to the diphtheria toxin, from which they differ in their structure and / or in their function due to the presence of a or several mutations inserted into the structural gene for the toxin.
Proteins of the type mentioned above have been called "cross-reactive substances" (CRM), since they cause an immunological cross-reaction with diphtheria toxin.
Among the several mutant phages which have been isolated, we have more particularly explored those which code for the proteins CRM 176, CRM 197, CRM 228 and CRM 45
(Uchida et al., J. Biol. Chem., 218, 3838-3844 (1973)).
More particularly, the protein CRM 45 is a protein which is composed of a fragment A, resembling in structure and in function by diphtheria toxin, and
a fragment B, which lacks a segment capable of binding the protein to receptors which are found on the surface of eukaryotic cells.
The result is that the CRM 45 protein, although having a fragment A which is fully active in vitro,
has absolutely no activity in vivo, since it is unable to penetrate cells.
Conversely, fragment B has, unmodified,
the hydrophobic structure which is necessary to pass the fragment A inside the cell.
Due to these characteristics, i.e. presence of active fragment A, presence in fragment B,
of the structure which is required to pass the fragment A inside the cell, and absence of the region which is capable of recognizing the receptors of cell membranes, it has been envisaged to use the protein CRM 45 to constitute hybrid toxins. In fact, by replacing the missing segment with a substance such as:
antibody, monoclonal antibody, hormone or other substance of biological interest, capable of recognizing specific molecules on the surfaces of some cells, such as
as target cells, a hybrid toxin has been obtained, which is capable of selectively killing only a few kinds of cells.
Such a hybrid toxin can find an elective application in the pharmacological field and, above all, for the treatment of some types of tumors
(P. Bacha et al., J. Biol. Chem., 258, 1565-1570, (1983)).
The protein CRM 197 has the same molecular weight as the diphtheria toxin and is composed of a fragment B which is identical, by its function and by its structure, to the toxin, and of a fragment A, which is non-toxic and which differs of the original fragment with an amino acid. The protein CRM 197, which is non-toxic, cannot be distinguished immunologically
diphtheria toxin and may therefore be an alternative to the diphtheria toxoid that is used
currently for vaccine production.
In fact, gentle treatment of the protein CRM 197 with formalin is sufficient to obtain satisfactory protective levels of diphtheria antibodies in guinea pigs (M. Porro et al., J. Infect Dis., 142, 5 (1980 )).
But until now, further developments of products derived from proteins corresponding to the diphtheria toxin and obtained according to the operating mode
revealed by Uchida, were hampered by the low yields of syntheses of these proteins by culture.
It is therefore an object of the present invention to provide a process for the production of proteins corresponding to diphtheria toxin, which comprises a cultivation step, in a liquid nutritive medium containing iron ions at a concentration of 0.05 � g / ml at 0.5 g g / ml, at a temperature of 30 [deg.] C to 40 [deg.] C, in a neutral culture medium and under aerobic conditions, from a micro -organism belonging to the genus Corynebacterium diphtheriae with two mutant phages which code for the protein corresponding to the diphtheria toxin and which are integrated in non-tandem mode in their chromosomes.
More particularly, the object of the present invention is to provide a process for producing the CRM 45 protein with yields from 50 Lf / ml to 200 Lf / ml, and the CRM 197 protein with yields from 30 Lf / ml to
60 Lf / ml, by culture of strain C7 (S45) M8 with two
<EMI ID = 5.1>
The present invention is essentially based on the relatively surprising discovery that the C7 strain (ATCC 27010) of Corynebacterium diphtheriae has in its own chromosome two attachment points attB where the bacteriophage DNA can be integrated. The lysogenic processes of a phage according to the Campbell method (Epitomes Adv. Genetics,
11, 101-145, (1982)), illustrated in Figure 1A, assumes
the cutting of circular bacteriophage DNA at a specific point, attP, and the integration, at an equally specific point, of the bacterial chromosome, attB, which is called attachment point. Until now, in all known configurations, a single attP point and a single attB point have been identified.
It has now been found that the C7 strain
(ATCC 27010) of Corynebacterium diphtheriae has in its chromosome two attachment points, attB1 and attB2, where
bacteriophage DNA can be integrated. Using the TYE culture medium, modified according to the invention, the following lysogenic strains were isolated in the lysogenization process of this bacterium: monolysogenic, when the phage is present only once in attB1 or attB2 ; bi-lysogenic
(tandem) when two phages are simultaneously present at the same attB point; and non-tandem bi-lysogens, when two phages are simultaneously present, one in attB1 and the other in attB2 (Figure 1B).
According to the present invention, the C7 strain (ATCC 27010) of Corynebacterium diphtheriae was infected with a mutant phage which codes for the protein corresponding to the diphtheria toxin, by "plating" on a CY culture medium.
After 48 hours of growth at a temperature of
35 [deg.] C, the phage lysis plates were observed, which contained within them an opaque zone due to the growth of these bacteria, in which the phage had been integrated into the bacterial chromosome.
The strains were removed in a sterile manner and they were plated on a CY medium so as to isolate the different colonies, to then analyze them in order to verify the presence of lysogenic phages by the "phage release method" (Miller et al., Virology, 29, 410-425,
(1966)).
We sorted the bi-lysogens based on the fact that the lysogens which contained two couples of the integrated phage had two genes coding for the protein corresponding to the diphtheria toxin, so that they are able to synthesize a quantity twice as large
of said protein.
TYE culture medium plates were prepared, containing respectively 3, 4, 6, 8 and 12 units / ml of diphtheria antitoxin serum, and the concentration of each lysogen in the serum was then titrated by transfer of plates . The protein produced by the various lysogens was precipitated, by diffusion through the agar, from the antibody which was in the medium, thus forming a halo whose size was directly proportional to the quantity of CRM produced by each. colonies.
In the plates which contained an antibody concentration of 3 units / ml, all the lysogens formed an identical halo. In those of intermediate concentration, 4 to 6 units / ml of antibody, halos of different sizes were observed: very small for the monolysogens and larger for the bi-lysogens.
In the plates containing an antibody concentration of 8 to 12 units / ml, only the bi-lysogens showed a precipitation halo.
Figure 2 is a photograph of a TYE plate containing 6 units / ml of antibody, on which it is possible to distinguish three halos of different sizes, corresponding to different lysogens: monolysogens (small halo), bilysogens in tandem (halo A) and non-tandem bi-lysogens
(halo B). It has been demonstrated that the lygosenes having the largest halo contain two phages integrated into their respective chromosomes by demonstrating the molecular organization of the phages by purification of the chromosomal DNA according to conventional procedures. In FIG. 1B, it can be seen that by cutting the bacteriophage DNA at points A and B with the aid of a restriction enzyme, one obtains a fragment AB, whereas, if one uses the same enzyme for monolysogen, we should get two fragments, A and B, each containing a part
from the bacterial chromosome, four fragments for the non-tandem bi-lysogen and three for the tandem bi-lysogen.
In fact, the analyzes carried out by the procedure of the Southern blot (J. Mol. Biol., 98, 503-
517, (1975), using as fragment the fragment Bam Bam 4 containing the attP point labeled with phosphorus 32 correspond, as shown in Figure 3, both in number and
by the position of the bands, to what had been provided according to the invention from the analysis of Figure 1B.
In FIG. 3, the phage DNA gives a single band (A), that of the two-band monolysogen (B), that of the four-band non-tandem bi-lysogen (C), while the tandem bilysogen gives three bands, one of which migrates at the same time as that of the phage (D).
The stability of the bi-lysogens was verified by removing colonies isolated from old cultures (5 days), by plating them on a CY medium, and by analyzing by the halo method the presence of one or two phages. This analysis gave the following results: the bi-lysogens in tandem were poorly stable because of their tendency to lose a phage and to transform into monolysogens. Out of 250 colonies tested, around 180 had become monolysogens, while bi-lysogens of the non-tandem type were extremely stable. in fact on
450 colonies tested, no monolysogen was found.
According to the present invention, the
<EMI ID = 6.1>
have been deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) and have been assigned the numbers ATCC-39526 and ATCC 39255.
We examined the different lysogenic strains to see if they produced CRM 45 proteins and
CRM 197 by growing them under aerobic conditions and in a nutritive liquid medium containing iron ions at a concentration of 0.05 ug / ml to 0.5 g g / ml, preferably 0.1 # ; g / ml, at a temperature of 30 [deg.] C to 40 [deg.] C, preferably
from 35 [deg.] C to 37 [deg.] C, at neutral pH and for a sufficient time to accumulate a considerable quantity of proteins in the culture medium.
The protein was then collected and purified by any of the standard procedures known to those of skill in the art.
Culture media used in the procedure:
TYE medium to produce the precipitation halo
The following medium was modified compared to the original formula of Pappenheimer (Inf. Imm., 18, 203-209,
(1977)), and it had the following composition: tryptose:
10 g; yeast extract: 5 g; NaCl: 5 g; KH2P04. 5 g; water: 1 liter.
The pH was adjusted to 7.4 and added to the medium
2 ml of 50% calcium chloride before autoclaving it. The precipitate was allowed to settle, after which 2 ml / l of solution II, 1 ml / l of solution were added. III and 12 ml / 1 of noble agar.
Finally, anti-diphtheria horse blood serum was added at a concentration of 4, 6, 8 or 12 units / ml, depending on the halo which was expected.
CY medium allowing the production of CRM proteins
Yeast extract: 20 g; amino acids derived from casein:
<EMI ID = 7.1>
7.4, brought to the boil and filtered through Whatman paper while the boiling continues. 2 ml of solution II, 1 ml of solution III are added, then the reaction mixture is placed in an autoclave. Before using it, 3 ml of a maltose and calcium chloride solution are added to it per fraction of 100 ml of medium.
Solution II
<EMI ID = 8.1>
nicotinic: 115 mg. Then 1 ml of water and concentrated hydrochloric acid are added to dissolve the components, after
<EMI ID = 9.1>
and 3 ml of concentrated hydrochloric acid, then water to 100 ml.
Solution III
L-cystine: 20 g; concentrated hydrochloric acid:
20 ml; water up to 100 ml.
Maltose solution - calcium chloride:
maltose 50 g; 2 ml of 50% calcium chloride; 1 g of KH2PO4, and water up to 100 ml. The pH is adjusted to 7.4
and the solution is filtered on Whatman 40 filter paper, after which the solution is placed in an autoclave.
Description of the drawings:
Figure 1A: Lysogenization process according to Campbell. Bacteriophage DNA is broken at a specific point attP and is integrated into an equally specific point, attB, of the bacterial chromosome. <EMI ID = 10.1>
(ATCC 27010) from Corynebacterium diphtheriae.
The bacteriophage DNA is broken at the attP attachment point and can be integrated into both
<EMI ID = 11.1>
present in the bacterial chromosome to give monolysogens, tandem bi-lysogens and non-tandem bi-lysogens.
Figure 2: plate with TYE medium containing six units / ml of diphtheria serum. We can distinguish three precipitation halos, namely: very small halo (monolysogenic), intermediate halo A
(tandem bi-lysogens) and large halo B (non-tandem bilysogens). Figure 3: DNA analysis of lysogens by the Southern blot method. The DNA was digested with BamH- and the fragments were separated on agarose gel (1.3%) and then they were transferred to nitrocellulose, after which they were <EMI ID = 12.1>
We can see a single AB fragment in bacteriophage DNA (A), two AB fragments in monolysogen (B), four fragments in non-tandem bilysogen (C) and three fragments in tandem bi-lysogen (D).
Figure 4: production of protein CRM 197 with the strain
<EMI ID = 13.1>
The small solid squares / 0 indicate the optical density of the culture.
The following experimental examples are illustrations and not limitations of the invention. EXAMPLE 1
125 ml flasks are prepared, each containing
10 ml of CY medium and they are sterilized at 120 [deg.] C for 15 <EMI ID = 14.1>
for 24 hours at 35 [deg.] C on CY plates.
The flasks which were thus inoculated are cultivated overnight at 35 [deg.] C.
0.1 ml of each isolated culture is inoculated into Erlenmeyer flasks with a capacity of 125 ml, each of which contains 10 ml of deferrized CY medium and
<EMI ID = 15.1>
agitator rotating at 240 rpm for 45 hours
at a temperature of 35 [deg.] C.
Samples are taken at two hour intervals, and the optical density and the
content of CRM 197 released in the supernatant. The optical density is measured at 590 nm using a "PerkinElmer" Model 35 spectrophotometer (registered trademark) (length of the light ray path 1 ci?) And the CRM 197 protein is determined by the immunoelectrophoretic method (Murfy and al., J. Clin. Microbiol., 7, 91-
96 (1978)) and / or by flocculation (G. Ramon. C.R. Soc. Biol.,
86, 661-671, (1922)). By "Lf / ml" is meant the flocculation unit as defined by G. Ramon in C.R.
Soc. Biol. (Paris), 86, 661-671 (1922)).
The results that we obtained are illustrated in Figure 4. As can be seen, the production of CRM
197 cannot start until the optical density (O.D.) of the culture has reached a value of 4.5 to 5, corresponding
at the end of the logarithmic phase. At the start of the game
end of this last phase, the massive production of CRM
197 begins, and it continues until the beginning of the stationary phase (about 20 hours), when we observe
maximum optical density and maximum quantity of CRM
197.
After the 24th hour of culture, there is a 25% decrease in the production of CRM 197 after 30 hours
and after 45 hours, this reduction is 75%. The trend of
production curve of CRM 197 is practically
the same for the different lysogens, while the production is: 20 Lf / ml for monolysogens, 30 Lf / ml for tandem bi-lysogens and 60 Lf / ml for non-tandem bi-lysogens.
Example 2
The same procedure as that indicated in Example 1 is used to prepare the
<EMI ID = 16.1>
0.1 ml of each culture is inoculated into 125 ml flasks each containing 10 ml of deferrized CY medium, and supplemented with 0.1 g / ml Fe ++.
The flasks are incubated for 36 hours at a temperature of 35 [deg.] C on a rotating shaker (240 rpm). We analyze the samples taken after
20 hours and 30 hours after the start of fermentation, by the same procedure as that of Example 1 to determine the optical density and the production of the CRM 45 protein released in the supernatant.
The results which have been obtained are summarized in the table below:
TABLE 1
<EMI ID = 17.1>
The results reported above show that the maximum production of CRM 45 is detected after 30 hours
and is practically the same for monolysogens and for tandem bi-lysogens, and is almost twice as large for non-tandem bi-lysogens.
EXAMPLE 3
<EMI ID = 18.1>
as described in Example 1, and 2 ml of this preculture were transferred into two 2,000 ml Erlenmeyer flasks each containing 500 ml of deferrized CY medium, with an additional 0.1 g g / ml of Fe ++, and cultured with shaking (240 rpm) at a temperature of 35 [deg.] C for 24 hours.
1,000 ml of the resulting lysogen culture was inoculated into 40 l of CY culture medium having a concentration of Fe ions of 0.1 µg / ml, contained in a fermenter having a volume of 50 l, and cultured at a temperature of 37 [deg.] C by aerating at a flow rate of 15 l / minute ^ from bottom to top, stirring at 600 revolutions / minute and keeping the pH of the culture medium between 6.5 and 7.5 using a 20% glucose solution, or alternatively using a 4N sodium hydroxide solution, for 40 hours. The quantity of CRM 45, after 30 hours of fermentation, was 200 Lf / ml. The resulting culture broth was centrifuged in a continuous flow centrifuge and the protein was recovered from the supernatant by precipitating with completed ammonium sulfate to a degree of saturation of 75%.
The resulting slurry was centrifuged and the sediment was purified by washing with phosphate buffer
at pH 7.5, in a column packed with an ion exchange resin (dimethylammoniumethylcellulose).
The protein was collected by eluting the column with a sodium chloride gradient, with a yield of
80%.
CLAIMS
1. Method for producing a protein corresponding to the diphtheria toxin, characterized in that it consists in cultivating, in a liquid nutritive medium containing iron ions at a concentration of 0.05 ug / ml to 0.5 ug / ml, at a temperature of 30 [deg.] C to 40 [deg.] C, at neutral pH and under aerobic conditions, a microorganism belonging to the genus Corynebacterium diphtheriae, with two mutant phages which code for the protein corresponding to diphtheria toxin and which are integrated in non-tandem mode at the two attachment points of the bacterial chromosome.