RU2078138C1 - Strain of bacterium arthrobacter globiformis - a producer of coproporphyrin-iii and a method of coproporphyrin-iii preparing - Google Patents
Strain of bacterium arthrobacter globiformis - a producer of coproporphyrin-iii and a method of coproporphyrin-iii preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2078138C1 RU2078138C1 RU93053635A RU93053635A RU2078138C1 RU 2078138 C1 RU2078138 C1 RU 2078138C1 RU 93053635 A RU93053635 A RU 93053635A RU 93053635 A RU93053635 A RU 93053635A RU 2078138 C1 RU2078138 C1 RU 2078138C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- coproporphyrin
- iii
- water
- coproporphyrin iii
- strain
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и, в частности к технологии получения копропорфирина III. The invention relates to the medical and microbiological industry, and in particular to a technology for the production of coproporphyrin III.
Задачей данного технического решения явилось получение копропорфирина III в водорастворимой форме, которая может быть использована в медицине для диагностики и лечения рака более эффективно и с меньшими побочными явлениями, чем известные водонерастворимые формы. The objective of this technical solution was to obtain coproporphyrin III in a water-soluble form, which can be used in medicine for the diagnosis and treatment of cancer more effectively and with fewer side effects than the known water-insoluble forms.
В ходе решения поставленной задачи был отобран продуцент, обладающий высокой способностью синтезировать копропорфирин III. In the course of solving the problem, a producer was selected that has a high ability to synthesize coproporphyrin III.
Известен ряд микроорганизмов, способных синтезировать в процессе жизнедеятельности порфирины и, в частности копропорфирин III (патент ФРГ N 2809093, патент США N 4436663). Однако продуктивность их в отношении синтеза копропорфирина III не превышает 100 мг/л. A number of microorganisms are known that are capable of synthesizing porphyrins and, in particular, coproporphyrin III (German patent N 2809093, US patent N 4436663). However, their productivity in relation to the synthesis of coproporphyrin III does not exceed 100 mg / L.
Наиболее высоким по производительности является штамм Arthrobacter globiformis B-658, который выбран за прототип (авт. св. СССР N 1482946). Штамм образует до 240 мг/л копропорфирина III. Однако продуктивность штамма очень варьирует и может опускаться до 60 мг копропорфирина III в 1 л культуральной жидкости. The highest productivity is a strain of Arthrobacter globiformis B-658, which is selected for the prototype (ed. St. USSR N 1482946). The strain forms up to 240 mg / l of coproporphyrin III. However, the productivity of the strain varies greatly and can drop to 60 mg of coproporphyrin III in 1 liter of culture fluid.
Предлагаемый штамм A. globiformis ИНБИ-121 является более продуктивным в отношении синтеза копропорфирина III, и уровень продуктивности, в отличие от прототипа, не подвержен широким колебаниям. Штамм по изобретению получен из штамма B-658 селекционным путем методом ступенчатого отбора по признаку устойчивости к копропорфирину и последующей селекцией на подобранных средах. Штамм по изобретению хранится во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии под N 479 в группе эпифитных микроорганизмов. The proposed strain A. globiformis INBI-121 is more productive in relation to the synthesis of coproporphyrin III, and the level of productivity, in contrast to the prototype, is not subject to wide fluctuations. The strain according to the invention was obtained from strain B-658 by selection by the method of stepwise selection on the basis of resistance to coproporphyrin and subsequent selection on selected media. The strain according to the invention is stored in the All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology under N 479 in the group of epiphytic microorganisms.
СУЩЕСТВЕННЫЕ ПРИЗНАКИ ЗАЯВЛЯЕМОГО ШТАММА ARTHROBACTER GLOBIFORMIS ИНБИ-121, общие с прототипом. Предлагаемый штамм и прототип на плотной питательной среде образуют круглые бесцветные колонии, гладкие с ровным краем, диаметром 1,5 2,0 мм. На сложных средах образуют красный пигмент (копропорфирин III), диффундирующий в агар. Характерен жизненный цикл кокк-палочка-кокк. Строгие аэробы, хемоорганотрофы, используют неорганический азот в качестве единственного источника азота. Восстанавливают нитраты. Не расщепляют целлюлозу. Гидролизуют желатину. SIGNIFICANT SIGNS OF THE STATED ARTHROBACTER GLOBIFORMIS INBI-121, common with the prototype. The proposed strain and prototype in a dense nutrient medium form round colorless colonies, smooth with a smooth edge, with a diameter of 1.5 to 2.0 mm On complex media they form a red pigment (coproporphyrin III), which diffuses into agar. The life cycle of cocci-bacillus-cocci is characteristic. Strict aerobes, chemorganotrophs, use inorganic nitrogen as their sole source of nitrogen. Recover nitrates. Do not break down cellulose. Hydrolyzed gelatin.
При глубинной ферментации накапливают в культуральной жидкости копропорфирин III. With deep fermentation, coproporphyrin III is accumulated in the culture fluid.
ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ ПРЕДЛАГАЕМОГО ШТАММА ОТ ИЗВЕСТНОГО (ПРОТОТИПА). Заявляемый штамм отличается от прототипа устойчивостью к копропорфирину III в среде в концентрации 500 800 мг/л. Заявляемый штамм на 10 20% превосходит по уровню биосинтеза копропорфирина III прототип (заявляемый штамм 170 270 мг/л, прототип 60 240 мг/л). DISTINCTIVE SIGNS OF THE SUGGESTED STRAIN FROM THE KNOWN (PROTOTYPE). The inventive strain differs from the prototype resistance to coproporphyrin III in the medium at a concentration of 500 to 800 mg / L. The inventive strain is 10 20% higher in terms of the biosynthesis of coproporphyrin III prototype (the claimed strain 170 270 mg / l, prototype 60 240 mg / l).
МОРФОЛОГО-КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ. Заявляемый штамм образует на плотной питательной среде бесцветные круглые колонии, гладкие с ровным краем, диаметром 1,5 2,0 мм. На сложных средах образует красный пигмент (копропорфирин III), диффундирующий в агар. MORPHOLOGICAL AND CULTURAL SIGNS. The inventive strain forms a dense nutrient medium colorless round colonies, smooth with a smooth edge, with a diameter of 1.5 to 2.0 mm On complex media it forms a red pigment (coproporphyrin III), diffusing into agar.
Клетки штамма A. globiformis претерпевают изменения в форме на протяжении ростового цикла, причем изменения эти весьма заметны. Культуры в стационарной фазе (2 7 дней) полностью состоят из кокковидных клеток. В культуре могут встречаться крупные кокковидные клетки, в 2 4 раза больше остальных; в определенных условиях культивирования они могут преобладать. При пересевах на свежую сложную среду рост происходит путем увеличения кокковидных клеток, после чего один или оба конца клетки удлиняются, в результате образуются палочки, толщина которых меньше диаметра кокковидной клетки. Последующий рост и деление ведут к образованию палочек неправильной формы, которые варьируют по величине и могут быть прямыми, изогнутыми, клиновидными и булавовидными, образовывать различные сочетания (V-, T-, L-видные). Истинный мицелий не образуется. По мере прохождения экспоненциальной фазы палочки укорачиваются и в конце концов заменяются кокковидными клетками, которые характерны для стационарной фазы культуры. Эндоспор не образует. The cells of the strain A. globiformis undergo changes in shape throughout the growth cycle, and these changes are very noticeable. The cultures in the stationary phase (2-7 days) are completely composed of cocciform cells. Large cocciform cells can be found in culture, 2-4 times larger than the rest; under certain cultivation conditions, they may prevail. When replanting onto a fresh complex medium, growth occurs by increasing cocciform cells, after which one or both ends of the cell are elongated, resulting in the formation of sticks, the thickness of which is less than the diameter of the cocciform cell. Subsequent growth and division lead to the formation of sticks of irregular shape, which vary in size and can be straight, curved, wedge-shaped and club-shaped, to form various combinations (V-, T-, L-prominent). True mycelium does not form. As the exponential phase passes, the rods are shortened and eventually replaced by coccoid cells, which are characteristic of the stationary phase of culture. The endospore does not form.
ФИЗИКО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Клетки кокковидной формы штамма по изобретению грамположительны. Однако палочки могут легко обесцвечиваться (грамвариабельны), и грамположительными остаются только гранулы. Некислотоустойчивы. Строгий аэроб, хемоорганотроф, метаболизм дыхательный, никогда не бродильный. Имеет потребность в биотине (5 10 мкг/мл). Использует неорганический азот в качестве единственного источника азота. Восстанавливает нитраты. Не расщепляет целлюлозу. Гидролизует желатину. PHYSICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS. The coccoid cells of the strain of the invention are gram-positive. However, the sticks can easily discolor (gram-variable), and only granules remain gram-positive. Non-acid resistant. Strict aerob, chemoorotroph, respiratory metabolism, never fermentation. There is a need for biotin (5 10 μg / ml). Uses inorganic nitrogen as the sole source of nitrogen. Restores nitrates. Does not break down cellulose. Hydrolyzes gelatin.
Температурный оптимум для роста и развития 30oC, минимальная температура роста 15 20oC, выдерживает максимальную температуру 37 - 40oC.The optimum temperature for growth and development is 30 o C, the minimum growth temperature is 15 20 o C, can withstand a maximum temperature of 37 - 40 o C.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ ЗАЯВЛЯЕМОГО ШТАММА. Штамм хранится на мясо-пептонном агаре при +4oC в течение 1 месяца. В виде лиофильно-высушенной культуры и в жидком азоте (-196oC) с использованием в качестве криопротектора 2,5%-ного раствора желатины с глюкозой, срок хранения штамма до 3 лет.STORAGE CONDITIONS OF THE DECLARED STRAIN. The strain is stored on meat-peptone agar at +4 o C for 1 month. In the form of freeze-dried culture and in liquid nitrogen (-196 o C) using a 2.5% solution of gelatin with glucose as a cryoprotectant, the shelf life of the strain is up to 3 years.
АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Антагонистических свойств в отношении других микроорганизмов не наблюдали. ANTAGONISTIC SIGNS. Antagonistic properties in relation to other microorganisms were not observed.
Заявляемый штамм не токсичен и не относится к микроорганизмам, обладающим патогенными свойствами. The inventive strain is not toxic and does not apply to microorganisms with pathogenic properties.
При глубинной ферментации заявляемый штамм накапливает в культуральной жидкости копропорфирин III. When deep fermentation of the claimed strain accumulates coproporphyrin III in the culture fluid.
УСЛОВИЯ ОБРАЗОВАНИЯ КОПРОПОРФИРИНА III. Для получения копропорфирина III штамм культивируют при (29±1oC) на качалке (180 об/мин) в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава, мас. глюкоза 1,0; кукурузный экстракт 6 8; (NH4)2SO4 0,1 и вода, pH 7,2. Колбы инокулируют по 5 мл посевного материала, полученного двухступенчатым культивированием в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл (29±1oC, 180 об/мин), содержащих 100 мл мясо-пептонного бульона.CONDITIONS OF EDUCATION OF COPROPORPHORINE III. To obtain coproporphyrin III strain is cultured at (29 ± 1 o C) on a shaker (180 rpm) in Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml, containing 100 ml of medium of the following composition, wt. glucose 1.0; corn extract 6 8; (NH 4 ) 2 SO 4 0.1; and water, pH 7.2. The flasks were inoculated with 5 ml of inoculum obtained by two-stage cultivation in Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml (29 ± 1 o C, 180 rpm) containing 100 ml of meat-peptone broth.
Для приготовления посевного материала использовали косяки с мясо-пептонным агаром, содержащим биотин в концентрации 5 10 мг/мл. Косяки инокулировали двое суток при (29±1oC).For the preparation of inoculum, shoals with meat-peptone agar containing biotin at a concentration of 5-10 mg / ml were used. Weeds were inoculated for two days at (29 ± 1 o C).
В процессе биосинтеза копропорфирина III ежесуточно дозировали глюкозу в количестве 1% на объем культуральной жидкости, а также доводили pH среды до 7,0 7,2 раствором NaHCO3. Продолжительность культивирования 12 суток. Содержание копропорфирина III 170 270 мг/л (спектрофтометрический метод определения по Falk J. in ("Porphyrins and Metalloporhyrins. Amsterdam Elsevier Co. 1964).During the biosynthesis of coproporphyrin III, glucose was dosed daily in an amount of 1% per volume of culture fluid, and the medium was adjusted to pH 7.0 with 7.2 NaHCO 3 solution. The cultivation duration is 12 days. The content of coproporphyrin III 170 270 mg / l (spectrophotometric method according to Falk J. in ("Porphyrins and Metalloporhyrins. Amsterdam Elsevier Co. 1964).
В ходе дальнейшего решения поставленной задачи возникла необходимость разработки оптимальных условий биосинтеза копропорфирина III новым продуцентом. In the course of further solving the problem, it became necessary to develop optimal conditions for the coproporphyrin III biosynthesis by a new producer.
Наиболее близким по технической сущности является способ биосинтеза порфиринов по авт. св. СССР N 1482946. В указанном изобретении биосинтез копропорфиринов осуществляют культивированием Arthrobacter globiformis ВКМ B-658 на среде, содержащей, мас. глюкоза 0,5 1,5; (NH4)2SO - 0,05 0,15; кукурузный экстракт 5 6 или смесь кукурузного экстракта (1 - 6) с молочной сывороткой или гидролизатом оболочек белково-витаминного концентрата (1 3). Культивирование осуществляют при 28 30oC на качалке при 180 об/мин. Через 48 ч ферментации в колбы ежедневно вносят глюкозу в виде 50%-ного стерильного водного раствора из расчета 1% глюкозы на объем культуральной жидкости, а также доводят pH среды до 7,0 7,2 10%-ным раствором соды. Максимальный выход копропорфиринов составляет при этом 240 мг/л культуральной жидкости. Продолжительность ферментации 12 сут; производительность 5 20 мг/сут.The closest in technical essence is the method of biosynthesis of porphyrins according to ed. St. USSR N 1482946. In the specified invention, the biosynthesis of coproporphyrins is carried out by culturing Arthrobacter globiformis VKM B-658 on a medium containing, by weight. glucose 0.5 1.5; (NH 4 ) 2 SO - 0.05 0.15; corn extract 5 6 or a mixture of corn extract (1 - 6) with whey or hydrolyzed shells of protein-vitamin concentrate (1 3). Cultivation is carried out at 28-30 o C on a rocking chair at 180 rpm After 48 hours of fermentation, glucose is introduced into the flasks daily in the form of a 50% sterile aqueous solution based on 1% glucose per volume of culture fluid, and the medium is adjusted to pH 7.0 with 7.2 10% soda solution. The maximum yield of coproporphyrins is 240 mg / l of culture fluid. The duration of the fermentation is 12 days; productivity 5 20 mg / day.
Недостатком прототипа является нестабильный уровень синтеза копропорфирина III, который может варьировать от 60 до 240 мг в 1 л культуральной жидкости к концу ферментации. Кроме того, в способе биосинтеза по прототипу необходима ежесуточная дозация глюкозы и соды для поддержания оптимальных условий биосинтеза целевого продукта. Предлагаемый способ позволяет повысить производительность процесса биосинтеза и обеспечивает направленный синтез копропорфирина III в условиях стабильного pH без вмешательства извне. The disadvantage of the prototype is an unstable level of synthesis of coproporphyrin III, which can vary from 60 to 240 mg per 1 liter of culture fluid at the end of fermentation. In addition, in the method of biosynthesis of the prototype requires a daily dosage of glucose and soda to maintain optimal biosynthesis of the target product. The proposed method allows to increase the productivity of the biosynthesis process and provides directed synthesis of coproporphyrin III at a stable pH without external interference.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. The proposed method is as follows.
В качестве продуцента используют штамм Arthrobacter globiformis ИНБИ-121. Для получения копропорфирина III продуцент культивируют на среде следующего состава, мас. глюкоза 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH4)2HPO4 0,05 2,0; смесь аминокислот гидролизатных (САГ) 0,2 0,5; вода остальное; pH 6,8 7,2.As a producer, a strain of Arthrobacter globiformis INBI-121 is used. To obtain coproporphyrin III, the producer is cultured on a medium of the following composition, wt. glucose 8.0; corn extract 3.0; (NH 4 ) 2 HPO 4 0.05 2.0; a mixture of hydrolyzate amino acids (SAG) 0.2 0.5; water the rest; pH 6.8 7.2.
Культивирование Arthrobacter globiformis штамм ИНБИ-121 осуществляют в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл при температуре 32 36oC в аэробных условиях на качалках 180 об/мин в течение 8 10 сут. По окончании ферментации концентрация копропорфирина III составляет 200 300 мг/л культуральной жидкости. Причем на его долю приходится не менее 70% от общего содержания порфиринов в культуральной жидкости.Cultivation of Arthrobacter globiformis strain INBI-121 is carried out in Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml at a temperature of 32 36 o C under aerobic conditions on a rocking chair 180 rpm for 8 10 days. After fermentation, the concentration of coproporphyrin III is 200 300 mg / l of culture fluid. Moreover, it accounts for at least 70% of the total content of porphyrins in the culture fluid.
Таким образом, в состав среды наряду с обычно используемым кукурузным экстрактом вводят смесь аминокислот гидролизатных (САГ) в концентрации 0,2 - 0,5 мас. и двузамещенную аммонийную соль фосфорной кислоты в концентрации 0,05 0,2 мас. Глюкозы вводят в среду перед посевом в концентрации 8% Такой состав ферментационной среды обеспечивает оптимальный для биосинтеза копропорфирина III уровень глюкозы и pH. Это позволяет не проводить дозирования в течение первых 8 сут, которых в условиях используемого температурного режима (32 36oC), в большинстве случаев, достаточно для достижения максимального уровня синтеза копропорфирина III.Thus, along with the commonly used corn extract, a mixture of hydrolyzate amino acids (SAG) at a concentration of 0.2 - 0.5 wt. and disubstituted ammonium salt of phosphoric acid at a concentration of 0.05 to 0.2 wt. Glucose is introduced into the medium before inoculation at a concentration of 8%. Such a composition of the fermentation medium provides the optimal glucose level and pH for biosynthesis of coproporphyrin III. This allows not to carry out dosing for the first 8 days, which under the conditions of the used temperature regime (32 36 o C), in most cases, is sufficient to achieve the maximum level of synthesis of coproporphyrin III.
При проведении биосинтеза свыше 8 сут в ферментационную среду вводят глюкозу в виде 50%-ного раствора до концентрации по редуцирующим веществам 2% и при необходимости добавляют 10%-ный раствор соды, до pH 6,8 7,2. When carrying out biosynthesis for more than 8 days, glucose is introduced into the fermentation medium in the form of a 50% solution to a concentration of 2% for reducing substances and, if necessary, a 10% solution of soda is added to a pH of 6.8 to 7.2.
Осуществимость предлагаемого способа биосинтеза копропорфирина III подтверждается следующими примерами. The feasibility of the proposed method for the biosynthesis of coproporphyrin III is confirmed by the following examples.
Пример 1. Посевной материал Arthrobacter globiformis ИНБИ-121 выращивают в течение двух суток при (29±1oC) на качалках (180 об/мин) в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл мясо-пептонного бульона.Example 1. Seed material Arthrobacter globiformis INBI-121 is grown for two days at (29 ± 1 o C) on shakers (180 rpm) in Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml containing 100 ml of meat-peptone broth.
Для приготовления посевного материала используют косяки с МПА с биотином в концентрации 5 10 мкг/мл. Культуру выращивают двое суток при (29±1)oC.For the preparation of seed, shoals with MPA and biotin are used at a concentration of 5-10 μg / ml. The culture is grown for two days at (29 ± 1) o C.
Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл в питательной среде (100 мл) следующего состава, мас. глюкоза (по редуцирующим веществам) 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH4)2SO4 0,1; САГ - 0,4; вода; pH среды 7,1±0,1.Fermentation is carried out in Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml in a nutrient medium (100 ml) of the following composition, wt. glucose (for reducing substances) 8.0; corn extract 3.0; (NH 4 ) 2 SO 4 0.1; SAG - 0.4; water; pH of the medium is 7.1 ± 0.1.
Длительность ферментации 8 сут при 34oC на качалке (180 об/ мин). По окончании ферментации содержание копропорфирина III, в культуральной жидкости 260 мг/л; производительность процесса 33 мг/ сутки.The duration of fermentation is 8 days at 34 o C on a rocking chair (180 rpm). At the end of the fermentation, the content of coproporphyrin III in the culture fluid is 260 mg / l; process performance 33 mg / day.
Пример 2. Посевной материал выращивают аналогично примеру 1. Культивирование продуцента осуществляют в колбах вместимостью 750 мл, используя 100 мл питательной среды следующего состава: мас/: глюкоза 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH4)2HPO4 0,2; САГ 0,5; вода; pH 6,9±0,1. Культивирование осуществляют при 36oC, длительность 8 сут.Example 2. The seed is grown analogously to example 1. Cultivation of the producer is carried out in flasks with a capacity of 750 ml using 100 ml of culture medium of the following composition: wt /: glucose 8.0; corn extract 3.0; (NH 4 ) 2 HPO 4 0.2; SAG 0.5; water; pH 6.9 ± 0.1. Cultivation is carried out at 36 o C, duration 8 days.
Содержание копропорфирина в культуральной жидкости на 8 сут составляет 200 мг/л. Производительность процесса 25 мг/сут. The content of coproporphyrin in the culture fluid for 8 days is 200 mg / L. The productivity of the process is 25 mg / day.
Пример 3. Посевной материал выращивают аналогично примеру 1. В колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл вносят 100 мл питательной среды следующего состава, мас. глюкоза 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH4)2HPO4 0,05; смесь аминокислот гидрализатных 0,2; вода; pH 7,0 ±0,1. Культивирование осуществляют при 32oC на качалках 180 об/мин в течение 10 сут. Через 8 сут культивирования в среду вносят 50%-ный раствор глюкозы до концентрации 2% и подтитровывают pH до 7,0±1,10% -ным раствором соды. Содержание копропорфирина в культуральной жидкости на 10-е сутки составляет 300 мг/л; производительность процесса 30 мг/сут.Example 3. The seed is grown analogously to example 1. In Erlenmeyer flasks with a capacity of 750 ml contribute 100 ml of culture medium of the following composition, wt. glucose 8.0; corn extract 3.0; (NH 4 ) 2 HPO 4 0.05; a mixture of hydralizable amino acids 0.2; water; pH 7.0 ± 0.1. The cultivation is carried out at 32 o C on a rocking chair 180 rpm for 10 days. After 8 days of cultivation, 50% glucose solution is added to the medium to a concentration of 2% and pH is adjusted to 7.0 ± 1.10% soda solution. The content of coproporphyrin in the culture fluid on the 10th day is 300 mg / l; process productivity 30 mg / day.
Таким образом, предлагаемый способ биосинтеза обеспечивает получение 200 300 мг копропорфирина III в литре культуральной жидкости через 8 10 сут культивирования. Производительность процесса 20 30 мг/сутки. Thus, the proposed method of biosynthesis provides 200 300 mg of coproporphyrin III in a liter of culture fluid after 8 10 days of cultivation. The performance of the process is 20 to 30 mg / day.
По окончании культивирования биомассу клеток отделяют центрифугированием и из нативного раствора выделяют копропорфирин III. At the end of the cultivation, the biomass of the cells is separated by centrifugation and coproporphyrin III is isolated from the native solution.
Анализ патентной и научно-технической литературы свидетельствует о том, что традиционные методы очистки копропорфирина включают стадию этирификации и порфиринов и разделение их эфирных производных на оксиде алюминия. Это обусловлено общепринятым мнением, что различные формы порфиринов могут быть эффективно разделены в виде эфирных производных. Таким образом получают высокоочищенные нерастворимые в воде формы копропорфирина III (пат. США N 4347184, 4436663; авт.св. СССР N 1482946). Способы получения водорастворимых форм, согласно обнаруженным источникам, связаны с получением водонерастворимых эфиров порфиринов, их разделением и дальнейшем их преобразованием в водорастворимые формы. Так, наиболее близким аналогом (прототипом) получения водорастворимых копропорфиринов является патент ФРГ N 2809093, согласно которому очистку копропорфирина III осуществляют путем кислотного осаждения порфиринов из нативного раствора, переводом порфиринов в водонерастворимую форму метиловый эфир (методом этерификации смесью метанола с серной кислотой), хромат графической очисткой на оксиде алюминия и переводом очищенной водонерастворимой формы в водорастворимую (методом обработки щелочью в органической среде). Oписанный способ является трудоемким, осуществляется с использованием большого количества экологически- и взрывоопасных органических растворителей, малопроизводителен: 2,0 15,0 мг/сутки. An analysis of the patent and scientific and technical literature indicates that traditional methods of purification of coproporphyrin include the stage of etrification and porphyrins and separation of their ether derivatives on alumina. This is due to the generally accepted opinion that various forms of porphyrins can be effectively separated as ether derivatives. Thus, highly purified water-insoluble forms of coproporphyrin III are obtained (US Pat. Nos. 4,347,184, 4,436,663; ed. St. USSR N 1482946). The methods for producing water-soluble forms, according to the sources found, are associated with the preparation of water-insoluble esters of porphyrins, their separation and their further conversion to water-soluble forms. So, the closest analogue (prototype) for the production of water-soluble coproporphyrins is the Federal Republic of Germany patent N 2809093, according to which coproporphyrin III is purified by acid precipitation of porphyrins from the native solution, the conversion of porphyrins into a water-insoluble form of methyl ether (by esterification with a mixture of methanol and sulfuric acid), chromatographic purification on alumina and conversion of the purified water-insoluble form to a water-soluble one (by treatment with alkali in an organic medium). The described method is laborious, is carried out using a large number of environmentally and explosive organic solvents, low productivity: 2.0 to 15.0 mg / day.
Предлагаемый способ базируется на принципиально ином подходе к проблеме очистки копропорфирина III. Он основан на различной растворимости форм порфиринов, продуктов их расщепления и пигментов в растворах кислот разной концентрации (Досон Р. Элион Д. Джонс К. Справочник биохимика М. Мир, с. 174 187). Сочетание приемов переосаждения, проводимых в специально подобранном режиме, с сорбционной хроматографией дает возможность получать высокоочищенную водорастворимую форму копропорфирина III непосредственно из нативного раствора Arthrobacter globiformis ИНБИ-121, минуя стадию этирификации и разделения эфиров порфиринов на оксиде алюминия. The proposed method is based on a fundamentally different approach to the problem of purification of coproporphyrin III. It is based on the different solubilities of the forms of porphyrins, their cleavage products, and pigments in solutions of acids of different concentrations (Dawson R. Elion D. Jones K. Biochemist Handbook M. Mir, p. 174 187). The combination of reprecipitation techniques carried out in a specially selected mode with sorption chromatography makes it possible to obtain a highly purified water-soluble form of coproporphyrin III directly from the native solution of Arthrobacter globiformis INBI-121, bypassing the stage of etrification and separation of porphyrin esters on alumina.
Предлагаемый способ получения водорастворимой формы копропорфирина III осуществляют следующим образом. The proposed method for producing a water-soluble form of coproporphyrin III is as follows.
После отделения клеточной массы методом центрифугирования порфирина осаждают из нативного раствора, подкисляя его до pH 3,7 ±0,1 раствором соляной кислоты. Осадок отделяют центрифугированием, тщательно промывают водой. В нем содержится 10 15% копропорфирина III. Остальную часть составляют промежуточные продукты биосинтеза, близкие по физико-химической свойствам копропорфирину III: другие формы порфиринов, продукты их расщепления, пигменты, белки. After separation of the cell mass by centrifugation, porphyrin is precipitated from the native solution, acidifying it to a pH of 3.7 ± 0.1 with hydrochloric acid solution. The precipitate was separated by centrifugation, washed thoroughly with water. It contains 10 to 15% coproporphyrin III. The rest is made up of intermediate biosynthesis products similar in their physicochemical properties to coproporphyrin III: other forms of porphyrins, their cleavage products, pigments, and proteins.
Для выделения копропорфирина III из этой смеси осуществляют двухстадийное переосаждение из растворов соляной кислоты разной концентрации. To isolate coproporphyrin III from this mixture, a two-stage reprecipitation is carried out from solutions of hydrochloric acid of different concentrations.
На первой стадии этого этапа отделяют примеси, нерастворимые в относительно концентрированных растворах кислот. Для этого осадок с содержанием порфиринов 10 15% растворяют в 5 7%-ном растворе соляной кислоты. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием кислоты более 7% приводит к эмульгированию суспензии (за счет белковых примесей), плохому ее разделению, загрязнению экстракта. При концентрации кислоты ниже 5% увеличивается расход кислоты и длительность ее воздействия на порфиринсодержащий промежуточный полупродукт. In the first stage of this stage, impurities insoluble in relatively concentrated acid solutions are separated. For this, a precipitate with a content of porphyrins of 10 15% is dissolved in a 5 7% hydrochloric acid solution. Insoluble impurities are separated by centrifugation of the acid more than 7% leads to emulsification of the suspension (due to protein impurities), poor separation, contamination of the extract. When the acid concentration is below 5%, the acid consumption and the duration of its effect on the porphyrin-containing intermediate are increased.
Копропорфирин III и неотделившиеся примеси осаждают из супернатанта, добавляя раствор щелочи до pH 3,2 3,4. Осадок отделяют центрифугированием, промывают водой, высушивают. Эта предварительная сушка продукта после первой перекристаллизации, как показали проведенные исследования, имеет принципиальное значение. Она предотвращает отрицательные эффекты длительного воздействия соляной кислоты на влажную пасту порфиринов. Наиболее существенным из этих отрицательных эффектов, влияющим на дальнейших ход очистки, является образование порфиринов, имеющих отличные от мономеров физико-химические характеристики. Высушивание проводят в сушильном шкафу при температуре 110 - 130oС до влажности не более 10% Полученный таким образом продукт имеет степень чистоты 50 60%
На второй стадии переосаждения отделяют копропорфирин III от порфиринов, близких по структуре и свойствам, но отличных от него по растворимости в слабых растворах кислот. Для этого высушенный продукт растворяют в 2,0 - 3,5% -ном растворе соляной кислоты. Выбранный интервал концентрации соляной кислоты установлен экспериментально и обеспечивает существенное повышение степени чистоты целевого продукта, низкое содержание минеральных солей при последующем его осаждении подщелачиванием и оптимальный объем рабочего раствора. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугирование. Двойное переосаждение обеспечивает получение продукта с чистотой 75 85% Большую часть оставшихся примесей составляют пигменты, для отделения которых проводят сорбционную очистку на макропористом сополимере стирола и дивинилбензола, содержанием в качестве ионогенных групп первичные и вторичные аминогруппы (например, АН 80 7п и АН-21). Выбор сорбента обусловлен высокой сорбционной емкостью по отношению к копропорфирину III, полнотой десорбции, а также условиями проведения процесса, обеспечивающими оптимальный технологический режим при его экологической безопасности. Процесс сорбции осуществляют на солевой форме сорбента из нейтральных растворов, а десорбцию осуществляют 1,0 2,5-ным раствором аммиака.Coproporphyrin III and unseparated impurities are precipitated from the supernatant by adding an alkali solution to a pH of 3.2 to 3.4. The precipitate was separated by centrifugation, washed with water, dried. This preliminary drying of the product after the first recrystallization, as shown by studies, is of fundamental importance. It prevents the negative effects of prolonged exposure to hydrochloric acid on a wet porphyrin paste. The most significant of these negative effects, affecting the further course of purification, is the formation of porphyrins having physico-chemical characteristics different from monomers. Drying is carried out in an oven at a temperature of 110 - 130 o C to a moisture content of not more than 10%. The product thus obtained has a purity of 50 to 60%
At the second stage of reprecipitation, coproporphyrin III is separated from porphyrins, which are similar in structure and properties, but different from it in solubility in weak acid solutions. For this, the dried product is dissolved in a 2.0 - 3.5% hydrochloric acid solution. The selected concentration range of hydrochloric acid was established experimentally and provides a significant increase in the purity of the target product, a low content of mineral salts during its subsequent precipitation by alkalization, and an optimal volume of the working solution. Insoluble impurities remove centrifugation. Double reprecipitation provides a product with a purity of 75 85%. Most of the remaining impurities are pigments, for the separation of which sorption purification is carried out on a macroporous copolymer of styrene and divinylbenzene containing primary and secondary amino groups as ionogenic groups (for example, AN 80 7p and AN-21) . The choice of sorbent is due to the high sorption capacity with respect to coproporphyrin III, the completeness of desorption, as well as the process conditions that provide the optimal technological regime with its environmental safety. The sorption process is carried out on the salt form of the sorbent from neutral solutions, and desorption is carried out by 1.0 2.5-ammonia solution.
Из элюата копропорфирин III осаждают кислотой. Осадок, тщательно отмытый от минеральных солей, растворяют в воде, содержащей рассчитанное количество гидроксида калия, эквивалентное количеству карбоксильных групп полученного препарата копропорфирина III. Затем раствор высушивают лиофильно. Чистота полученного таким образом препарата составляет 90 96
Таким образом, предлагаемый способ биосинтеза и очистки копропорфирина III из культуральной жидкости Arthrobacter globiformis штамм ИНБИ-121 позволяет получить 200 300 мг копропорфирина III в виде тетракалиевой соли из 1 культуральной жидкости.From the eluate, coproporphyrin III is precipitated with acid. The precipitate, thoroughly washed from mineral salts, is dissolved in water containing the calculated amount of potassium hydroxide, equivalent to the number of carboxyl groups of the obtained coproporphyrin III preparation. Then the solution is freeze-dried. The purity of the preparation thus obtained is 90 96
Thus, the proposed method for the biosynthesis and purification of coproporphyrin III from the culture fluid Arthrobacter globiformis strain INBI-121 allows you to get 200 300 mg of coproporphyrin III in the form of tetrakali salt from 1 culture fluid.
Осуществимость предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами. The feasibility of the proposed method is illustrated by the following examples.
Пример 4. Биосинтез осуществляют согласно примера 3. Культуральную жидкость 1100 мл центрифугируют при 6000 об/мин, получают 1000 мл нативного раствора с содержанием порфиринов 300 мг/л. Указанный объем нативного раствора подкисляют с помощью соляной кислоты до pH 3,7 ± 0,1. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием 10 мин при 1000 g, промывают дистиллированной водой до получения неокрашенных промывных вод. Затем полученный осадок в количестве 10 г растворяют в 150 мл 5%-ного раствора соляной кислоты. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием обычным образом. Супернатант подщелачивают 25%-ным водным раствором аммиака до pH 3,3 ± 0,1. Кристаллы копропорфирина III отделяют центрифугированием обычным образом, промывают дистиллированной водой трижды по 50 мл. Влажный осадок высушивают при температуре ≅130oC. Получают 480 мг препарата копропорфирина III с чистотой 60% и растворяют в 50 мл 3%-ного раствора соляной кислоты. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием обычным образом, а копропорфирин III осаждают из супернатанта, приливая 25% раствора аммиака до pH 3,3 ± 0,1. Осадок отделяют, промывают дистиллированной водой, растворяют в 20 мл воды при подщелачивании 1 н. раствором гидроокиси калия до pH 6,0 8,0 и пропускают через колонку, заполненную 100 мл анионита АН-80-7п в Cl- форме. По окончании сорбции колонку отмывают дистиллированной водой до получения неокрашенного фильтрата. Десорбцию осуществляют, пропуская водный раствор аммиака (2,5%-ного раствор) до полной десорбции копропорфирина III (о полноте сорбции судят по обесцвечиванию сорбента). Получают 100 мл интенсивно окрашенного раствора, из которого получают копропорфирин III, приливая водный раствор соляной кислоты до pH 3,5 ±0,1. Осадок отделяют центрифугированием обычным образом, тщательно отмывают дистиллированной водой, высушивают в вакууме при температуре (70 ±2/oC). Получают 255 мг копропорфирина III с чистотой 95%). Полученный продукт тщательно растирают, добавляют 20 мл воды и расчетное количество гидроксида калия в виде 1 М раствора. Прозрачный раствор высушивают лиофильно. Получают 300 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 95% (в пересчете на свободный копропорфирин III).Example 4. The biosynthesis is carried out according to example 3. The culture fluid of 1100 ml is centrifuged at 6000 rpm, get 1000 ml of native solution with a porphyrin content of 300 mg / L. The specified volume of the native solution is acidified with hydrochloric acid to a pH of 3.7 ± 0.1. The precipitate formed is separated by centrifugation for 10 min at 1000 g, washed with distilled water to obtain unpainted wash water. Then the resulting precipitate in an amount of 10 g is dissolved in 150 ml of 5% hydrochloric acid solution. Insoluble precipitate is separated by centrifugation in the usual way. The supernatant is alkalinized with a 25% aqueous ammonia solution to a pH of 3.3 ± 0.1. Crystals of coproporphyrin III are separated by centrifugation in the usual manner, washed with distilled water three times in 50 ml. The wet precipitate is dried at a temperature of ≅130 o C. Obtain 480 mg of the preparation of coproporphyrin III with a purity of 60% and dissolved in 50 ml of a 3% solution of hydrochloric acid. Insoluble impurities are separated by centrifugation in the usual manner, and coproporphyrin III is precipitated from the supernatant by pouring a 25% ammonia solution to a pH of 3.3 ± 0.1. The precipitate is separated, washed with distilled water, dissolved in 20 ml of water with alkalization of 1 N. a solution of potassium hydroxide to a pH of 6.0 to 8.0 and passed through a column filled with 100 ml of anion exchanger AN-80-7p in Cl - form. At the end of sorption, the column is washed with distilled water to obtain an unpainted filtrate. Desorption is carried out by passing an aqueous solution of ammonia (2.5% solution) until complete desorption of coproporphyrin III (the completeness of sorption is judged by the discoloration of the sorbent). 100 ml of an intensely colored solution is obtained from which coproporphyrin III is obtained by pouring an aqueous solution of hydrochloric acid to a pH of 3.5 ± 0.1. The precipitate was separated by centrifugation in the usual way, thoroughly washed with distilled water, dried in vacuum at a temperature of (70 ± 2 / o C). Get 255 mg of coproporphyrin III with a purity of 95%). The resulting product is thoroughly triturated, add 20 ml of water and the estimated amount of potassium hydroxide in the form of a 1 M solution. The clear solution is freeze-dried. Get 300 mg of the tetrakalium salt of coproporphyrin III with a purity of 95% (in terms of free coproporphyrin III).
Пример 5. Биосинтез осуществляют согласно примеру 1. Культуральную жидкость в количестве 3000 мл разделяют на центрифуге, получают 2850 мл нативного раствора с содержанием порфиринов 260 мг/л. После осаждения и промывки получают влажный осадок порфиринов в количестве 30 г. К осадку при перемешивании приливают 200 мг 7 раствора соляной кислоты. Перемешивание продолжают в течение 15 20 мин, осадок отделяют центрифугированием и проводят повторную экстракцию 100 мг 7%-ного раствора соляной кислоты. Экстракты объединяют, подщелачивают раствором аммиака (25%), кристаллы копропорфирина III отделяют центрифугированием, тщительно отмывают дистиллированной водой от минеральных солей; высушивают при температуре не выше 130oC и получают 1320 мг копропорфирина III с чистотой 50 Полученные 1320 мг продукта растворяют в 250 мл 2,5%-ного раствора соляной кислоты при перемешивании, после чего осадок отделяют, копропорфирин III осаждают подщелачиванием раствором аммиака, отмывают дистиллированной водой от минеральных солей.Example 5. The biosynthesis is carried out according to example 1. The culture fluid in an amount of 3000 ml is separated in a centrifuge, get 2850 ml of a native solution with a porphyrin content of 260 mg / L. After precipitation and washing, a wet precipitate of porphyrins is obtained in an amount of 30 g. 200 mg of 7 hydrochloric acid solution are added to the precipitate with stirring. Stirring is continued for 15 to 20 minutes, the precipitate is separated by centrifugation and 100 mg of a 7% hydrochloric acid solution is re-extracted. The extracts are combined, alkalized with a solution of ammonia (25%), crystals of coproporphyrin III are separated by centrifugation, thoroughly washed with distilled water from mineral salts; dried at a temperature not exceeding 130 o C and get 1320 mg of coproporphyrin III with a purity of 50 Received 1320 mg of the product is dissolved in 250 ml of a 2.5% hydrochloric acid solution with stirring, after which the precipitate is separated, coproporphyrin III precipitated by alkalization with ammonia solution, washed distilled water from mineral salts.
Полученный влажный осадок суспендируют в дистиллированной воде и подщелачивают раствором гидроксида калия в концентрации 1 до pH 6 8. Полученный раствор в количестве 90 мл пропускают через колонку со 150 мл сорбента АН-21 в солевой форме. По окончании сорбции колонку отмывают дистиллированной водой и десорбируют целевой продукт 1%-ным раствором аммиака. Элюат собирают, замеряют объем и концентрацию копропорфирина в нем, осаждают целевой продукт 2% -ным раствором соляной кислоты, осадок тщательно отмывают от минеральных солей дистиллированной водой, получают влажную пасту, которую растворяют в 40 мл дистиллированной воды, прибавляя расчетное количество 1 М раствора гидроксида калия. The obtained wet cake was suspended in distilled water and made basic with potassium hydroxide solution at a concentration of 1 to pH 6 8. The resulting solution in an amount of 90 ml was passed through a column with 150 ml of AN-21 sorbent in salt form. At the end of sorption, the column is washed with distilled water and the target product is desorbed with a 1% ammonia solution. The eluate is collected, the volume and concentration of coproporphyrin in it are measured, the target product is precipitated with a 2% hydrochloric acid solution, the precipitate is thoroughly washed from mineral salts with distilled water, a wet paste is obtained, which is dissolved in 40 ml of distilled water, adding the calculated amount of 1 M hydroxide solution potassium.
Раствор высушивают лиофильно и получают 530 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 93%
Пример 6. Биосинтез проводят согласно примера 1. Получают 1000 мл культуральной жидкости, содержащей копропорфирин III с концентрации 260 мг/л. Выделение осуществляют согласно примера 5. В качестве экстрагента на первом этапе используют 5%-ный раствор соляной кислоты. Получают 375 мг копропорфирина III с чистотой 62% После предварительной сушки, как описано в примерах 4 и 5, вторую обработку полупродукта проводят 2%-ным раствором соляной кислоты в соотношении 1:300 (масс объем кислоты). Для последующей очистки используют 100 мл сорбента АН-80-7п. Последующую очистку ведут как в примере 5.The solution is freeze-dried and 530 mg of the tetrapotassium salt of coproporphyrin III are obtained with a purity of 93%
Example 6. The biosynthesis is carried out according to example 1. Get 1000 ml of culture fluid containing coproporphyrin III with a concentration of 260 mg / L. Isolation is carried out according to example 5. As an extractant, a 5% hydrochloric acid solution is used in the first step. Get 375 mg of coproporphyrin III with a purity of 62%. After preliminary drying, as described in examples 4 and 5, the second treatment of the intermediate is carried out with a 2% solution of hydrochloric acid in a ratio of 1: 300 (mass volume of acid). For subsequent cleaning using 100 ml of sorbent AN-80-7p. Subsequent cleaning is carried out as in example 5.
После лиофильной сушки получают 200 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 96%
Пример 7. Биосинтез проводят согласно примера 2. Получают культуральную жидкость в количестве 6000 мл с содержанием порфиринов 200 мг/л. Выделение ведут согласно примера 4 за исключением того, что первую перекристаллизацию ведут из 6%-ного раствора соляной кислоты (в соотношении масса порфиринсодержащего сырца к объему кислоты 1:120). После описанного в предыдущих примерах высушивания получают 2350 мг копропорфирина III с чистотой 55% Далее продукт растворяют в 200 мл 3,5%-ного раствора соляной кислоты, нерастворившийся осадок отбрасывают, целевой продукт осаждают подщелачиванием, отмывают от минеральных солей, влажный осадок растворяют при подщелачивании в дистиллированной воде и подают не ионообменную колонку с 200 мл сорбента АН-80-7п. Дальнейшая обработка ведет согласно примера 4. Получают 1200 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 92%After freeze-drying, 200 mg of the tetrapotassium salt of coproporphyrin III is obtained with a purity of 96%
Example 7. The biosynthesis is carried out according to example 2. Receive a culture fluid in an amount of 6000 ml with a porphyrin content of 200 mg / L. Isolation is carried out according to example 4 except that the first recrystallization is carried out from a 6% solution of hydrochloric acid (in the ratio of the mass of porphyrin-containing raw material to the volume of acid 1: 120). After the drying described in the previous examples, 2350 mg of coproporphyrin III is obtained with a purity of 55%. Next, the product is dissolved in 200 ml of a 3.5% hydrochloric acid solution, the insoluble precipitate is discarded, the target product is precipitated by alkalization, washed from mineral salts, and the wet precipitate is dissolved by alkalization. in distilled water and a non-ion exchange column with 200 ml of sorbent AN-80-7p is fed. Further processing is carried out according to example 4. Receive 1200 mg of the tetrakalium salt of coproporphyrin III with a purity of 92%
Claims (4)
Кукурузный экстракт 3
Смесь аминокислот гидролизатных 0,2 0,5
Двузамещенный фосфорнокислый аммоний 0,05 0,2
Вода Остальное
при pH 6,8-7,2.Glucose 8
Corn Extract 3
A mixture of hydrolyzate amino acids 0.2 0.5
Ammonium disodium phosphate 0.05 0.2
Water Else
at a pH of 6.8-7.2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU93053635A RU2078138C1 (en) | 1993-11-22 | 1993-11-22 | Strain of bacterium arthrobacter globiformis - a producer of coproporphyrin-iii and a method of coproporphyrin-iii preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU93053635A RU2078138C1 (en) | 1993-11-22 | 1993-11-22 | Strain of bacterium arthrobacter globiformis - a producer of coproporphyrin-iii and a method of coproporphyrin-iii preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU93053635A RU93053635A (en) | 1996-11-10 |
| RU2078138C1 true RU2078138C1 (en) | 1997-04-27 |
Family
ID=20149760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU93053635A RU2078138C1 (en) | 1993-11-22 | 1993-11-22 | Strain of bacterium arthrobacter globiformis - a producer of coproporphyrin-iii and a method of coproporphyrin-iii preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2078138C1 (en) |
-
1993
- 1993-11-22 RU RU93053635A patent/RU2078138C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Патент США N 4436663, кл. C 07 D 487/22, 1984. 2. Авторское свидетельство СССР N 1482946А, кл. C 12 P 1/04, 1989. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU943282A1 (en) | Process for producing l-treonine | |
| CN101955901B (en) | Corynebacterium glutamicum and method for preparing L-ornithine and salts thereof by using same | |
| IL24529A (en) | Process for preparing cephalosporin derivatives | |
| SU1003761A3 (en) | Process for preparing antibiotic g-6302 | |
| SU579901A3 (en) | Method of preparing 7-(d-a-aminophenylacetamido)-deacetoxycephalosporanic acid (cephalexine) | |
| SU469266A3 (en) | The method of obtaining 7-amino-deacetoxycephalosporanic acid | |
| RU2078138C1 (en) | Strain of bacterium arthrobacter globiformis - a producer of coproporphyrin-iii and a method of coproporphyrin-iii preparing | |
| SU511027A3 (en) | The method of obtaining antibiotic | |
| JPH01187090A (en) | Production of epsilon-polylysine and microorganism capable of producing epsilon-polylysine | |
| JPS60141293A (en) | Novel carcinostatic antibiotic substance 81-484 and its production | |
| JPS5810074B2 (en) | new microorganisms | |
| KR950009200B1 (en) | Process for producing d-alanine | |
| JPS62210996A (en) | Production of antibiotic substance emimycin | |
| JPS58121798A (en) | Polysaccharide mp-67 and its production | |
| KR830000617B1 (en) | Process for preparing antibiotics sf 2050 substances | |
| BE824987A (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF BETA-ERGOCRIPTINE | |
| JPS5932120B2 (en) | Method for producing 9-β-D arabinofuranosyl adenine | |
| KR830001103B1 (en) | Preparation method of antibiotic SB-72310 | |
| JPS61115100A (en) | Dc-79 and preparation thereof | |
| JPS6016597A (en) | Preparation of vitamin b12 | |
| JPS5918035B2 (en) | Antibiotic AB-85 | |
| JPS58107191A (en) | Preparation of l-1,4-cyclohexadiene-1-alanine | |
| JPS60180582A (en) | Novel microorganism | |
| JPS59173089A (en) | Preparation of l-threo-beta-hydroxyaspartic acid | |
| JPS61170396A (en) | Novel carcinostatic antibiotic substance 83-16-a and preparation thereof |