"Procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale
et solution aqueuse ou poudre stables contenant ce facteur" La présente invention concerne un procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale et une solution aqueuse ou une poudre stables contenant ce facteur.
Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale, dans lequel on ajoute une protéine spécifique à une solution aqueuse ou à une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale ainsi qu'une solution aqueuse ou une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale et une quantité efficace d'une telle protéine spécifique.
Carswell et coll. ont découvert un Facteur de
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plifier par l'abréviation "TNF"). Ils ont indiqué que le TNF est une substance présente dans le sérum des souris, des rats ou des lapins traités par une endotoxine, qui ont été sensibilisés avec
un immunopotentiateur tel q ue le bacille de Calmette et Guérin
(BCG), des corynébactéries ou du Zymosan, et que le TNF provoque une nécrose de diverses tumeurs transplantées à la souris sans effet toxique surle receveur portant la tumeur [voir Proc. Nat. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 72 (9), 3666-3670 (1975)].
Ensuite, de nombreux articles ont été publiés relativement aux propriétés biochimiques et physiologiques du TNF de souris et du TNF de lapin [voir par exemple Proc. Nat. Acad. Sci.
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47, 53-60 (1979); Br. J. Cancer, 38, 302-309 (1978) et ibid., 42,
416-422 (1980)]. Il convient de noter qu'un facteur cytotoxique
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également mentionné par certains chercheurs [voir par exemple
Infect. Immun., 28(1), 204-211 (1980)].
La production in vitro de TNF a également été mentionnée. Par exemple, Matthews a déterminé et indiqué les conditions optimales dans lesquelles le TNF est produit in vitro par les phagocytes mononucléaires à partir de divers tissus de lapins normaux et de lapins ayant reçu une injection de BCG (voir Br. J. Cancer,
44, 418-424 (1981)]. Selon cette publication, les quantité optimales de TNF sont produites par les phagocytes mononucléaires en présence d'une endotoxine et les macrophages alvéolaires et péritonéaux sont les producteurs les plus puissants de TNF. De plus, selon cette publication, les macrophages de lapins ayant reçu une injection de BCG produisent nettement plus de TNF que ceux des animaux
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d'exsudat péritonéal enrichi en macrophages de souris ayant reçu une injection de BCG libèrent un facteur cytotoxique lorsqu'on les stimule in vitro avec un lipopolysaccharide (endotoxine)
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156-164 (1981)].
En ce qui concerne les propriétés caractéristiques du TNF, on sait que le TNF, en plus de son activité d'induction de. la nécrose de diverses tumeurs, exerce une activité non spécifique de l'espèce des animaux. Par exemple, le TNF de lapin peut provoquer la nécrose des tumeurs de la souris. De plus, on sait que le TNF in vitro n'exerce aucun effet cytotoxique notable sur les cellules normales et a un effet cytotoxique sur certains types de lignées cellulaires néoplasiques (par exemple les cellules L-M et Meth-A). Comme indiqué ci-dessus, le TNF a une activité antitumorale, exerce une activité non spécifique de l'espèce des animaux et n'exerce aucun effet nuisible notable sur les cellules normales. Donc, les espérances des applications cliniques du TNF comme médicament antitumoral ont été grandes dans l'art.
On sait également que seule une très petite quantité de TNF est induit chez un mammifère ou un système de culture tissulaire. Par conséquent, pour assurer une application clinique étendue et sans danger du TNF comme médicament antitumoral, il est absolument nécessaire d'isoler et de purifier fortement le TNF brut produit chez un mammifère ou dans un système de culture tissulaire.
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destiné à l'emploi comme médicament antitumoral, il est généralement nécessaire de stocker le TNF fortement purifié sous forme d'une solution ou d'une masse congelée pendant une période prolongée et de lyophiliser la solution de TNF. Cependant, les demanderesses
ont découvert que l'activité du TNF fortement purifié diminue nettement lors de son stockage, de sa congélation, de sa décongélation et de sa lyophilisation.
Pour autant que les présents inventeurs le sachent,
il n'existe pas de publication dans lequelle la stabilité du TNF fortement purifié ait été étudiée. Dans ces circonstances, une fourniture efficace et régulière de TNF fortement purifié, en particulier à l'échelle industrielle, ne peut pas être assurée, bien que l'on sache que le TNF est un médicament antitumoral efficace.
Pour résoudre la difficulté exposée ci-dessus relative à la stabilité du TNF, les demanderesses ont effectué des
études importantes et poussées. Elles ont débouché sur la découverte très surprenante que l'addition d'une quantité efficace d'une protéine spécifique comme agent stabilisant à une solution aqueuse ou
à une poudre contenant du TNF permet de conserver le TNF pendant
une période prolongée sans qu'il perde son activité et rend le TNF stable à la congélation, la décongélation, la lyophilisation et similaires. L'invention repose sur cette découverte.
L'invention a donc pour objets :
- de fournir un procédé pour stabiliser le TNF; et
- de fournir une solution ou une poudre stables de TNF conservant leur activité pendant une période prolongée et stables à la congélation, la décongélation, la lyophilisation et similaires.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, faite en regard des dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la sérum-albumine humaine sur l'activité résiduelle <EMI ID=7.1>
- la figure 2 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la gélatine partiellement hydrolysée sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4[deg.]C;
- la figure 3 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la y-globuline humaine sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4[deg.]C; et
- la figure 4 est un graphique montrant l'effet de la concentration du sulfate de protamine de saumon sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4[deg.]C.
Une explication détaillée complémentaire des figures est exposée ci-après relativement à l'exemple 2.
Selon un de ses aspects, l'invention fournit un procédé pour stabiliser un TNF qui comprend l'addition à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du TNF d'une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine
et un sel de protamine. Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit une solution aqueuse ou une poudre stables contenant du TNF et une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi
parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine.
Le terme "TNF" tel qu'on l'emploie ici désigne une. substance à activité physiologique qui est produite par l'administration d'au moins une substance capable de stimuler le système réticulo-endothélial d'un mammifère, puis injection d'une endotoxine d'une bactérie à gram négatif au mammifère ou par addition d'une endotoxine d'une bactérie à gram négatif à un système de culture tissulaire contenant des macrophages activés d'un mammifère, cette substance provoquant la nécrose de certaines tumeurs lorsqu'elle est transférée de façon passive à des mammifères porteurs
de tumeur, ou une substance produite selon un procédé quelconque et ayant des propriétés semblables à celles de la substance à activité physiologique ci-dessus.
Le TNF que l'on emploie dans l'invention est produit selon plusieurs procédés connus dans l'art, y compris les procédés
de Matthews et coll. [voir Br. J. Cancer, 42, 416-422 (1980)] et le procédé de Green et coll. [voir J. Natl. Cancer Inst., 59(5),
1519-1522 (1977)].
Des procédés typiques pour préparer le TNF que l'on emploie dans la présente invention sont les suivants.
Tout d'abord, on injecte par voie intraveineuse ou intrapéritonéale à un mammifère (par exemple souris, lapin, cobaye, etc.) au moins une substance ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial. Comme substances ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial, on emploie généralement des bactéries à gram positif, des protozoaires ou des levures, que l'on administre au mammifère à l'état soit de micro-organismes vivants, soit de microorganismes morts (par exemple, après.traitement par la chaleur ou traitement avec la formaline), soit un extrait de cellules de micro-organismes.
Des exemples des bactéries à gram positif comprennent les propionibactéries telles que Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) et Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), des mycobactéries telles que le bacille de Calmette et Guérin (BCG) et Mycobacterium smegmatis, et des nocardias telles que Nocardia erythropolis et Nocardia gardneri. Comme protozoaires appropriés, on peut par exemple employer des plasmodiums ou des toxoplasmes. Comme levure appropriée, on emploie généralement le Zymosan extrait de Saccharomyces cerevisiae ou autres. On peut aussi employer des composés synthétiques de poids moléculaire élevé tels qu'un copolymère de pyranne. Ensuite, 7 à 8 jours après l'administration de la substance précitée ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial, on injecte par voie intraveineuse audit mammifère une endotoxine
d'une bactérie à gram négatif, par exemple un lipopolysaccharide dérivé d'Escherichia coli, de Pseudomonas aeruginosa ou de Salmonella typhosa. Enfin, 1,5 à 2 h après l'injection, on prélève des liquides de l'organisme (par exemple le liquide d'ascite, la lymphe, etc.) et/ou du sérum ou du plasma desdits mammifères ou on homogénéise des viscères tels que le fois, la rate, etc. et on les extrait avec une solution salée physiologique. On peut employer ces liquides de l'organisme, sérum, plasma et/ou extrait de viscères comme solution brute
de TNF. Cependant, on emploie généralement parmi eux le sérum ou
le plasma.
Comme indiqué ci-dessus, le procédé pour préparer
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dessus. On peut également employer de façon efficace le procédé reposant sur le génie génétique et le procédé de culture tissulaire où on emploie des cellules capables de produire du TNF. Il convient de noter que ces procédés peuvent également être appliqués à la produc� tion de TNF humain.
Le TNF brut produit selon l'un quelconque des procédés indiqués ci-dessus peut être purifié selon les techniques biochimiques classiques indiquées ci-dessous isolément ou en combinaison, pour fournir une solution aqueuse purifiée de TNF que l'on lyophilise pour obtenir une poudre purifiée de TNF. Comme techniques <EMI ID=9.1>
par exemple une technique de relargage dans laquelle on emploie
du sulfate d'ammonium, une chromatographie par échange d'ions,
dans laquelle on emploie une résine échangeuse d'ions, une technique de filtration sur gel et une technique d'électrophorèse. Lorsque la
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dessus de purification, on constate que le TNF devient progressivement instable. Par exemple, un échantillon de TNF purifié pour qu'il ait une activité spécifique de 500 000 unités/mg (l'activité spécifique est exprimée en unités d'activité de TNF par mg de protéine; l'unité d'activité du TNF est définie ci-après) est très instable comme le montrent les valeurs indiquées dans les exemples. Même les échantillons de TNF ayant une activité spécifique inférieure à
500 000 unités/mg présentent également un certain degré de baisse
de l'activité lorsqu'on les stocke ou les soumet à une congélation, une décongélation, une lyophilisation ou d'autres opérations.
Par conséquent, l'invention concerne la stabilisation du TNF que l'on a purifié à un degré élevé et que l'on a rendu instable. Le TNF à stabiliser selon l'invention peut être soit sous forme d'une solution, soit sous forme d'une poudre. Cependant, on préfère que le TNF stabilisé soit sous forme d'une solution.
On préfère que la solution de TNF à stabiliser selon l'invention ait constamment un pH de 5 à 10 et, de plus, on préfère que le solvant de la solution de TNF soit stabilisé par
un tampon approprié. Comme tampon approprié, on peut mentionner
par exemple un tampon phosphate et un tampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane-HCl. A la demande, on ajoute à la solution de TNF un sel tel que le chlorure de sodium et le chlorure de potassium. Par exemple, on ajoute un sel à la solution de TNF pour préparer une solution isotonique lorsque la solution de TNF est utilisée pour l'injection. Ce n'est pas le seul but de l'addition d'un sel. La concentration d'un tel sel dans la solution de TNF peut être déterminée selon le but de l'addition du sel. Par exemple, lorsque la finale de TNF est utilisée pour l'injection, on prépare une solution isotonique à partir de la solution de TNF par addition de chlorure de sodium jusqu'à une concentration de 0,15 M.
Selon le procédé de l'invention, on ajoute une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du TNF.
Comme albumine appropriée, on peut mentionner les albumines de divers animaux, tels que les bovins, les chevaux,
les moutons, les chèvres, les poulets et l'homme. Comme exemples spécifiques d'albumine appropriée, on peut mentionner la sérumalbumine bovine, la sérum-albumine humaine, l'albumine d'oeuf de poule, la lactalbumine bovine et la lactalbumine humaine. On n'observe pas de différence significative en ce qui concerne la capacité de stabiliser le TNF entre les albumines précitées. Cependant, comme agent de stabilisation des préparations injectables, on préfère tout particulièrement la sérum-albumine humaine.
Comme gélatine appropriée, on peut mentionner une gélatine ordinaire produite selon des procédés courants et une gélatine partiellement hydrolysée. Le poids moléculaire de la gélatine n'a pas d'importance stricte. Cependant, comme agent stabilisant pour les préparations injectables, on préfère particulièrement une gélatine partiellement hydrolysée soluble dans l'eau. La gélatine partiellement hydrolysée est obtenue par hydrolyse enzymatique d'une gélatine au moyen d'une enzyme protéolytique, telle que la papaïne ou par hydrolyse catalysée par un acide ou un alcali d'une gélatine.
Comme globuline appropriée, on peut mentionner les globulines sériques de divers mammifères, tels que les bovins, les chevaux, les moutons, les chèvres et l'homme et leurs dérivés. On n'observe pas de différence notable en ce qui concerne la capacité
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parmi elles, on préfère tout particulièrement une y-globuline et
un dérivé correspondant obtenu par traitement enzymatique ou modification chimique de la globuline de départ. Comme agent stabilisant pour les préparations injectables, on préfère tout particulièrement une y-globuline humaine et ses dérivés tels qu'une y-globuline humaine traitée par la fibrinolysine ou traitée par la pepsine et une y-globuline humaine sulfonée.
Comme protamine appropriée, on peut mentionner les protamines provenant d'espèces de poissons appropriées, telles que le saumon, le hareng et le maquereau. Comme sel de protamine approprié, on peut mentionner les chlorhydrates, sulfates et phosphates de protamines. On n'observe pas de différence notable en ce qui concerne la capacité de stabiliser le TNF entre les protamines et leurs sels précités.
Les agents stabilisants que l'on emploie dans l'invention peuvent être utilisés isolément ou en mélange.
L'agent stabilisant que l'on emploie dans l'inven-
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(l'unité d'activité est définie plus loin). La limite supérieure
de la quantité d'agent stabilisant est généralement déterminée du point de vue de la solubilité de l'agent stabilisant et de la viscosité de la solution obtenue et du point de vue économique. La limite supérieure de la quantité d'agent stabilisant est généralement de
50 mg, de préférence de 10 mg par ml de la solution de TNF. Lorsque le TNF est stabilisé sous forme d'une poudre, on ajoute l'agent stabilisant en une quantité telle que la solution aqueuse obtenue par dissolution du TNF en poudre, présentant une activité de 102 à
109 unités/ml, présente les concentrations précitées de l'agent stabilisant.
La façon dont on ajoute l'agent stabilisant n'a pas d'importance stricte. Par exemple, l'agent stabilisant sous forme d'une poudre peut être ajouté directement à la solution de TNF. Sinon, la poudre de l'agent stabilisant peut être préalablement dissoute dans de l'eau ou un tampon approprié et ajoutée à la solution de TNF. De plus, on peut également mélanger la poudre de l'agent stabilisant avec la poudre de TNF. L'addition de l'agent stabilisant peut être effectuée en un moment quelconque du stade de purification ou du stade de fabrication des préparations pharmaceutiques.
Lorsqu'on emploie deux ou plusieurs types différents d'agets stabilisants, on les ajoute en une quantité telle que leur quantité totale soit comprise dans la gamme des quantités définie ci-dessus.
On préfère que la conservation, la purification et la fabrication de préparations pharmaceutiques à partir de la
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Lorsque la solution de TNF est conservée à l'état congelé, on préfère que la température de conservation soit maintenue en dessous de 0[deg.]C et mieux en dessous de -20[deg.]C.
La solution de TNF à laquelle est incorporée une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant_selon l'invention conserve son activité de TNF pendant la conservation, qu'elle soit sous forme d'une solution ou sous une forme congelée et également pendant les stades de purification et de fabrication des préparations pharmaceutiques.
De plus, le procédé pour stabiliser le TNF selon l'invention s'applique également à la lyophilisation. Généralement, lorsqu'on lyophilise des solutions de TNF (en particulier dans le cas de TNF très purifié), leur activité diminue nettement. Cependant, les solutions de TNF contenant une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant selon l'invention peuvent être lyophilisées sans perte de l'activité pour fournir une poudre de TNF. La poudre de TNF peut être dissoute pour former une solution aqueuse stable de TNF
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sont comprises dans les gammes définies ci-dessus. L'agent stabilisant comme défini dans l'invention peut sinon être incorporé aux préparations lyophilisées de TNF. Lorsque le TNF est conservé sous forme d'une poudre, on préfère que la température de conservation soit maintenue à 25[deg.]C ou moins.
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ralement deux procédés, le procédé in vivo dans lequel on mesure in vivo l'effet de nécrose tumorale et le procédé in vitro dans lequel on mesure in vitro l'effet cytotoxique sur des cellules néoplasiques.
Comme procédé in vivo, on peut mentionner par exemple le procédé de Carswell et coll. [voir Proc. Nat. Acad. Sci. Etats-
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(2 x 10 cellules) par voie intradermique dans l'aisselle de souris
(BALB/c x C57BL/6)F. et, 7 jours plus tard, on choisit pour l'évaluation des souris porteuses de tumeurs de 7 à 8 mm de diamètre
bien vascularisées et sans nécrose centrale spontanée. On injecte dans la veine de la queue de chacune des souris un échantillon de TNF (0,5 ml) dilué avec une solution salée physiologique. On évalue l'activité de l'échantillon de TNF après 24 h selon les critères suivants.
(-) : pas de changement
(+) : légère nécrose hémorragique
(++) : nécrose hémorragique modérée (nécrose centrale atteignant
environ 50% de la surface tumorale)
(+++) : nécrose hémorragique nette (nécrose massive laissant un
petit anneau viable sur le pourtour de la tumeur).
Comme procédé in vitro de détermination de l'activité du TNF, on peut mentionner par exemple le procédé de Ruff et coll. [voir Lymphokines, vol. 2, édité par E. Pick, Académie Press. N.Y.,
245-248 (1980)] et le procédé de Kull et coll. [voir J. Immunol.,
126(4), 1279-1283 (1981)].
Le procédé in vitro que les demanderesses ont employé pour la détermination de l'activité du TNF a été mis au point par amélioration des procédés classiques précités. Dans le procédé in vitro des demanderesses où on mesure l'activité cytotoxique du TNF vis-à-vis de cellules L-M (American Type Culture Collection CCL 1.2), on opère comme suit. Comme récipient de culture, on emploie des
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Inc. (Etats-Unis d'Amérique) et on cultive les cellules L-M dans du milieu essentiel minimal de Eagle [voir Science, 130, 432-437
(1959)] contenant 10% v/v de sérum de veau foetal inactivé par chauffage. On dilue en série un échantillon de 0,1 ml de TNF et
on mélange la suspension de cellules L-M (0,1 ml; 1 x 104 cellules) dans chaque cupule des plaques et on incube les plaques à 37[deg.]C pendant 48 h dans de l'air contenant 5% de gaz carbonique. A la
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à 20% de glutaraldéhyde pour fixer les cellules. Après la fixation, on lave les plaques avec de l'eau distillée et on laisse sécher, puis on ajoute 0,1 ml de bleu de méthylène à 0,05% pour colorer
les cellules vivantes. On lave à fond les plaques avec de l'eau distillée pour éliminer l'excès de colorant et on laisse sécher. On ajoute 0,2 ml d'acide chlorhydrique à 3% dans chaque cupule pour extraire le colorant des cellules colorées. On mesure l'absorbance de chaque cupule à 665 nm avec un Titertek Multiskan produit par Flow Laboratories, Inc. L'absorbance est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. L'activité du TNF, unité(U)/ml, est
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toxicité de 50% et on peut l'obtenir par établissement d'un graphique de la dilution en fonction de l'absorbance. Toutes les activités de TNF déterminées selon le procédé in vitro qui sont indiquées ci-après sont exprimées au moyen de l'unité déterminée ci-dessus.
Le procédé de l'invention permet la fourniture efficace et régulière à l'échelle commerciale de TNF très purifié que l'on estime être un médicament antitumoral efficace applicable en clinique, grâce au fait que l'activité du TNF est maintenue pendant la conservation, que le TNF soit sous forme d'une solution, d'une masse congelée ou d'une préparation lyophilisée, et pendant les stades de purification et de fabrication des préparations pharmaceutiques.
Les demanderesses ont également découvert que la solution ou poudre de TNF à laquelle est incorporé au moins un agent stabilisant choisi parmi la sérum-albumine humaine, une gélatine, une y-globuline humaine, un dérivé de y-globuline humaine, une protamine et un sel de protamine, peut être administrée sans danger à l'organisme humain et que, par conséquent, la nouvelle composition de l'invention est particulièrement utile lors de l'application clinique du TNF comme médicament antitumoral.
L'invention va être décrite de façon plus détaillée, par l'exemple de référence, les exemples et les exemples comparatifs suivants qui ne limitent en rien la portée de l'invention.
Dans les exemples suivants, les noms des agents stabilisants sont abrégés comme suit :
HSA : sérum-albumine humaine
BSA : sérum-albumine bovine
PHG-1 : gélatine partiellement hydrolysée obtenue par hydrolyse catalysée par un alcali de la gélatine (poids moléculaire moyen :
environ 7 000)
HGG : y-globuline humaine
SPS : sulfate de protamine de saumon
HPS : sulfate de protamine de hareng
BGG : y-globuline bovine
CEA : albumine d'oeuf de poule
BLA a-lactalbumine bovine
PHG-2 : gélatine partiellement hydrolysée obtenue par hydrolyse catalysée par un acide de la gélatine (poids moléculaire moyen :
environ 7 000)
PHG-3 : gélatine partiellement hydrolysée ayant une faible solidité
de gel
PG : gélatine purifiée
SPF : protamine de saumon (base libre)
SPP : phosphate de protamine de saumon
EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique.
EXEMPLE DE REFERENCE
On injecte par voie intraveineuse à des lapines pesant 2 à 3 kg 75 mg de cellules tuées par la formaline de Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Welcome Research Laboratories, Angleterre). Huit jours plus tard, on injecte par voie intraveineuse à chaque lapine lOOug d'endotoxine (lipopolysaccharide d'Escherichia coli 026:B6, produit par Difco Laboratories, Etats-Unis d'Amérique). On prélève le sang de ch.aque lapine par poncticn cardiaque 2 h après l'injection d'endotoxine et on mélange le sang obtenu avec une petite quantité d'héparine. On centrifuge le sang à 3 000 tr/min pendant
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2500 U/ml.
On dilue le plasma ainsi obtenu (10 1) contenant du TNF avec 5 1 de tampon phosphate 0,03 M (pH 7,8). On applique le plasma dilué à une colonne (10 x 42 cm) de DEAE-Sepharose CL-6B (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) équilibrée avec du tampon phosphate 0,03 M (pH 7,8) 0,13 M en NaCl. On lave la colonne avec 2,5 1 de tampon phosphate 0,03 M (pH 7,8), 0,13 M en NaCl et on élue
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est de 230 ml/h et on recueille des fractions de 45 ml. On observe l'activité de TNF dans les fractions éluées avec le NaCl 0,20-0,24 M.
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une nuit contre du tampon Tris-HCl 0,03 M (pH 7,2) 0,13 M en NaCl.
On rechromatographie la solution dialysée de TNF sur une colonne de DEAE-Sepharose CL-6B (3,0 x 30 cm) équilibrée avec du tampon Tris-HCl 0,03 M (pH 7,2) 0,15 M en NaCl. On élue le TNF adsorbé
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du tampon d'équilibrage et 500 ml de tampon Tris-HCl 0,03 M (pH 7,8) 0,3 M en NaCl. Le débit est de 40 ml/h et on recueille des fractions de 10 ml. On regroupe et concentre les fractions ayant une activité
de TNF.
On soumet le concentré à une filtration sur gel avec une colonne (5 x 100 cm) de Sephacryl S-200 (fabriqué et vendu par Pharmacia) équilibrée avec du tampon phosphate 5 mM (pH 7,0) 0,15 M
en NaCl. On effectue l'élution avec le tampon d'équilibrage. Le débit est de 80 ml/h et on recueille des fractions de 13 ml. On regroupe
les fractions ayant une activité de TNF et on concentre par ultrafiltration.
La solution de TNF ainsi obtenue se révèle avoir une activité spécifique de 5,0 x 10 U/mg de protéines et une pureté
10 000 fois supérieure à celle observée dans le plasma.
On soumet la solution de TNF ainsi obtenue à une nouvelle chromatographie sur la même colonne (Sephacryl S-200) en utilisant le même tampon pour obtenir une solution de TNF ayant une activité spécifique de 1,0 x 10 U/mg de protéines.
EXEMPLE 1
On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0)
0,15 M en chlorure de sodium du TNF de lapin ayant une activité spécifique de 5,0 x 105 U/mg obtenu selon le mode opératoire décrit dans l'exemple de référence pour obtenir une solution de TNF ayant une activité de TNF de 1 200 U/ml. A des portions de la solution de TNF ainsi obtenue, on ajoute séparément comme agents stabilisants de la HSA (sérum-albumine humaine), de la BSA (sérum-albumine bovine), de la PHG-1 (gélatine partiellement hydrolysée, de la HGG (y-globuline humaine) et du SPS (sulfate de protamine de saumon) pour former dans chaque cas deux solutions différentes ayant une concentration de
0,1 mg/ml ou de 1,0 mg/ml.
Pour chacune des solutions obtenues, on détermine l'activité résiduelle relativement à 1) les échantillone obtenus par conservation respectivement pendant 2 jours, 7 jours et 30 jours à
40[deg.]C, 2) les échantillons soumis respectivement à 1 cycle et 3 cycles de congélation (-70[deg.]C) et de décongélation et 3) l'échantillon soumis
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pendant 7 jours à 25[deg.]C. Pour effectuer l'essai ci-dessus, on emploie comme témoin la solution de TNF à laquelle on n'a pas incorporé d'agent stabilisant. En ce qui concerne la préparation lyophilysée [voir 3)], on la dissout dans de l'eau distillée stérile puis on la
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Pour déterminer l'activité résiduelle, on mesure l'activité de chaque échantillon in vitro ou in vivo selon les procédés décrits précédemment. Dans le procédé in vitro, on calcule l'activité résiduelle (%) à partir de la valeur de dosage selon l'équation suivante :
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où A est l'activité de TNF de l'échantillon après conservation ou traitement physique et B est l'activité de TNF de l'échantillon avant conservation ou traitement physique.
Dans le procédé in vivo, on concentre chaque échantillon de solution pour que la concentration soit 20 fois supérieure à celle de départ au moyen du mini-module NM-3 (marque du commerce de l'appareil d'ultrafiltration fabriqué et vendu par Asahi Chemical Industry Co. Ltd., Japon). On injecte ensuite 0,5 ml de chacune des solutions de TNF ainsi concentrées dans la veine de la queue à un groupe de 5 souris porteuses de tumeurs. On détermine l'activité du TNF 24 h après selon le critère précédemment décrit. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 1.
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EXEMPLE 2
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activité de TNF que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute séparément de la HSA, de la PHG-1, de la HGG et du SPS (ces protéines sont les mêmes que celles employées dans l'exemple 1) comme agent stabilisant à diverses concentrations. On conserve chacune des solutions obtenues à 4[deg.]C pendant 7 jours, puis on les soumet à la détermination de l'activité du TNF selon le procédé in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont illustrés par les figures 1 à 4.
EXEMPLE 3
<EMI ID=32.1> une activité de TNF de 1 000 U/ml. A des portions de la solution de TNF ainsi obtenue, on ajoute conjointement deux types différents d'agents stabilisants choisis parmi diverses albumines, globulines, protamines et gélatines, à diverses concentrations comme indiqué dans le tableau 2. On conserve chacune des solutions obtenues à 4[deg.]C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité de TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 2.
TABLEAU 2
Effet stabilisant de divers agents stabilisants
<EMI ID=33.1>
Nota : Comme BSA, HSA, PHG-1, HGG et SPS, on uti lise les mêmes
matières que celles employées dans l'exemple 1.
HPS : produit de Sigma Chemical Co.
BGG : produit de Sigma Chemical Co.
CEA : produit de Nutritional Biochemicals Corp.
EXEMPLE 4 .
A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses albumines indiquées dans le tableau 3 en une quantité telle que la solution obtenue ait une
<EMI ID=34.1>
nues à 4[deg.]C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule
<EMI ID=35.1>
résultats obtenus figurent dans le tableau 3.
TABLEAU 3
Effet stabilisant de diverses albumines
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
employées dans les exemples 1 et 3.
Fraction de HSA : fraction de sérum-albumine humaine (fraction
V de Cohn), produit de Sigma Chemical Co.
<EMI ID=38.1>
de Cohn), produit de Sigma Chemical Co.
BLA : produit de Sigma Chemical Co.
EXEMPLE 5
A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses gélatines comme indiqué dans le tableau 4 en une quantité telle que la solution obtenue ait
<EMI ID=39.1>
obtenues à 4[deg.]C pendant 7 jours et on détermine l'activité de TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4.
TABLEAU 4
Effet stabilisant de diverses gélatines.
<EMI ID=40.1>
Nota : Comme PHG-1, on emploie la même matière que celle utilisée
dans l'exemple 1.
PHG-2 : produit de Nippi Co., Ltd.
PHG-3 : produit de Sigma Chemical Co., (Gélatine type IV :
environ 60 Bloom)
<EMI ID=41.1>
EXEMPLE 6
A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément diverses globulines comme indiqué dans le tableau 5 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de
1 0 mg/ml. On conserve chacune des solutions obtenues à 4[deg.]C pendant 7 jours et on les soumet à la détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 5.
TABLEAU 5
Effet stabilisant de diverses globulines
<EMI ID=42.1>
Nota : Comme HGG et BGG, on emploie les mêmes matières que celles
utilisées dans les exemples 1 et 3.
HGG traitée par la fibrinolysine : Venoglobulin (marque de
commerce), produit de The Green Cross Corporation, Japon.
HGG traitée par la pepsine : Gamma-Venin (marque du commerce),
produit de Hoechst Japan Ltd.
HGG sulfoné : Venilon (marque du commerce), produit de Chemo-
Sero-Therapeutic Research Institute, Japon.
Fraction de HGG : fraction de y-globuline humaine (fraction II
de Cohn), produit de Sigma Chemical Co.
EXEMPLE 7
A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses protamines comme indiqué dans le tableau 6 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml. On conserve chacune des solutions obtenues à 4[deg.]C pendant 7 jours et on les soumet à la détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 6.
TABLEAU 6
Effet stabilisant de diverses protamines.
<EMI ID=43.1>
Nota : Comme SPS et HPS, on emploie les mêmes matières que celles
utilisées dans les exemples 1 et 3.
SPF : produit de Sigma Chemical Co.
SPP : produit de Sigma Chemical Co.
EXEMPLE 8
On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium, du TNF de lapin ayant une activité spécifique de 1,0 x 106 U/mg, obtenu selon les modes opératoires décrits dans l'exemple de référence pour préparer des solutions
<EMI ID=44.1>
1 000 U/ml, 10 000 U/ml et 100 000 U/ml. A une portion de chacune des solutions de TNF ainsi préparées, on ajoute de la HSA en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml. On conserve chacune des solutions de TNF obtenues à
4[deg.]C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Comme témoins, on soumet une autre portion de chacune des solutions de TNF auxquelles on n'a pas incorporé de HSA à la détermination de l'activité du TNF. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 7.
TABLEAU 7
Effet stabilisant de la HSA
<EMI ID=45.1>
[Les valeurs représentent l'activité résiduelle du TNF (%)]. EXEMPLE COMPARATIF
A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute séparément à diverses concentrations, comme indiqué dans le tableau 8, chacun de divers aminoacides, sels métalliques et agents chélatants qui sont des agents stabilisants bien connus des solutions des substances ordinaires à activité physiologique. On conserve chacune des
<EMI ID=46.1>
détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 8.
TABLEAU 8
Comparaison de l'effet stabilisant de divers agents stabilisants.
<EMI ID=47.1>
Nota : Comme HSA, PHG-1, HGG et SPS, on emploie les mêmes matières
que celles utilisées dans l'exemple 1.
Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'in vention.
REVENDICATIONS S
1 - Procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition à une solution aqueuse ou à une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale d'une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine.
"Method for stabilizing a Tumor Necrosis Factor
and stable aqueous solution or powder containing this factor "The present invention relates to a method for stabilizing a Tumor Necrosis Factor and a stable aqueous solution or powder containing this factor.
More particularly, the invention relates to a method for stabilizing a Tumor Necrosis Factor, in which a specific protein is added to an aqueous solution or to a powder containing a Tumor Necrosis Factor as well as an aqueous solution or a powder containing a Factor of Tumor Necrosis and an effective amount of such a specific protein.
Carswell et al. have discovered a
<EMI ID = 1.1>
please use the abbreviation "TNF"). They indicated that TNF is a substance found in the serum of endotoxin-treated mice, rats or rabbits, which have been sensitized with
an immunopotentiator such as bacillus Calmette and Guérin
(BCG), corynebacteria or Zymosan, and that TNF causes necrosis of various tumors transplanted to mice without toxic effect on the recipient carrying the tumor [see Proc. Nat. Sci. United States of America, 72 (9), 3666-3670 (1975)].
Next, numerous articles have been published relating to the biochemical and physiological properties of mouse TNF and rabbit TNF [see for example Proc. Nat. Acad. Sci.
<EMI ID = 2.1>
47, 53-60 (1979); Br. J. Cancer, 38, 302-309 (1978) and ibid., 42,
416-422 (1980)]. It should be noted that a cytotoxic factor
<EMI ID = 3.1>
also mentioned by some researchers [see for example
Infect. Immun., 28 (1), 204-211 (1980)].
The in vitro production of TNF was also mentioned. For example, Matthews determined and reported the optimal conditions under which TNF is produced in vitro by mononuclear phagocytes from various tissues of normal rabbits and rabbits injected with BCG (see Br. J. Cancer,
44, 418-424 (1981)]. According to this publication, the optimal quantities of TNF are produced by mononuclear phagocytes in the presence of an endotoxin and the alveolar and peritoneal macrophages are the most powerful producers of TNF. In addition, according to this publication, macrophages of rabbits injected with BCG produce significantly more TNF than those of animals.
<EMI ID = 4.1>
of peritoneal exudate enriched in macrophages from mice injected with BCG release a cytotoxic factor when stimulated in vitro with a lipopolysaccharide (endotoxin)
<EMI ID = 5.1>
156-164 (1981)].
Regarding the characteristic properties of TNF, it is known that TNF, in addition to its induction activity. the necrosis of various tumors, exerts a non-specific activity of the species of animals. For example, rabbit TNF can cause necrosis in mouse tumors. In addition, it is known that TNF in vitro has no significant cytotoxic effect on normal cells and has a cytotoxic effect on certain types of neoplastic cell lines (eg L-M and Meth-A cells). As indicated above, TNF has an antitumor activity, exerts a non-specific activity of the animal species and does not exert any noticeable harmful effect on normal cells. Therefore, the expectations of clinical applications of TNF as an anti-tumor drug have been high in the art.
It is also known that only a very small amount of TNF is induced in a mammal or a tissue culture system. Therefore, to ensure a broad and safe clinical application of TNF as an antitumor drug, it is absolutely necessary to isolate and strongly purify the crude TNF produced in a mammal or in a tissue culture system.
<EMI ID = 6.1>
Intended for use as an anti-tumor drug, it is generally necessary to store the highly purified TNF in the form of a solution or a frozen mass for an extended period and to freeze-dry the TNF solution. However, the plaintiffs
have discovered that the activity of highly purified TNF decreases markedly during storage, freezing, thawing and lyophilization.
As far as the present inventors know,
there is no publication in which the stability of highly purified TNF has been studied. Under these circumstances, an efficient and regular supply of highly purified TNF, particularly on an industrial scale, cannot be ensured, although it is known that TNF is an effective anti-tumor drug.
To resolve the difficulty set out above relating to the stability of the TNF, the applicants have carried out
important and extensive studies. They led to the very surprising discovery that the addition of an effective amount of a specific protein as a stabilizing agent to an aqueous solution or
TNF-containing powder keeps TNF for
a prolonged period without losing activity and making TNF stable on freezing, thawing, freeze-drying and the like. The invention is based on this discovery.
The subject of the invention is therefore:
- to provide a process for stabilizing TNF; and
- to provide a stable solution or powder of TNF retaining their activity for a prolonged period and stable in freezing, thawing, lyophilization and the like.
Other characteristics and advantages of the invention will appear on reading the detailed description which follows, given with reference to the appended drawings, in which:
- Figure 1 is a graph showing the effect of the concentration of human serum albumin on residual activity <EMI ID = 7.1>
- Figure 2 is a graph showing the effect of the concentration of partially hydrolyzed gelatin on the residual activity of TNF after 7 days of storage at 4 [deg.] C;
- Figure 3 is a graph showing the effect of the concentration of human γ-globulin on the residual activity of TNF after 7 days of storage at 4 [deg.] C; and
- Figure 4 is a graph showing the effect of the concentration of salmon protamine sulfate on the residual activity of TNF after 7 days of storage at 4 [deg.] C.
A further detailed explanation of the figures is set out below in relation to Example 2.
According to one of its aspects, the invention provides a method for stabilizing a TNF which comprises adding to an aqueous solution or to a powder containing TNF an effective amount of at least one stabilizing agent chosen from the group consisting of albumin, gelatin, globulin, protamine
and a protamine salt. According to another of its aspects, the invention provides a stable aqueous solution or powder containing TNF and an effective amount of at least one chosen stabilizing agent.
from the group consisting of albumin, gelatin, globulin, protamine and a protamine salt.
The term "TNF" as used herein denotes a. substance with physiological activity which is produced by the administration of at least one substance capable of stimulating the reticuloendothelial system of a mammal, then injection of an endotoxin of a gram negative bacterium into the mammal or by the addition of an endotoxin from a gram-negative bacterium to a tissue culture system containing activated macrophages of a mammal, this substance causing necrosis of certain tumors when it is passively transferred to mammalian carriers
tumor, or a substance produced by any process and having properties similar to those of the above physiologically active substance.
The TNF which is used in the invention is produced by several methods known in the art, including methods
of Matthews et al. [see Br. J. Cancer, 42, 416-422 (1980)] and the method of Green et al. [see J. Natl. Cancer Inst., 59 (5),
1519-1522 (1977)].
Typical methods for preparing TNF which are used in the present invention are as follows.
First of all, a mammal (for example mouse, rabbit, guinea pig, etc.) is injected intravenously or intraperitoneally with at least one substance having the capacity to stimulate the reticuloendothelial system. As substances capable of stimulating the reticuloendothelial system, gram-positive bacteria, protozoa or yeasts are generally used, which are administered to the mammal either as living microorganisms or as dead microorganisms (for example, after heat treatment or treatment with formalin), or an extract of cells from microorganisms.
Examples of gram-positive bacteria include propionibacteria such as Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) and Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), mycobacteria such as Bacillus Calmette and Guérin (BCG) and Mycobacterium smegmatis such as nocardiasias such as nocardia and Nocardia gardneri. As suitable protozoa, for example, plasmodiums or toxoplasmas can be used. As a suitable yeast, Zymosan extract from Saccharomyces cerevisiae or others is generally used. It is also possible to use synthetic compounds of high molecular weight such as a pyran copolymer. Then, 7 to 8 days after the administration of the abovementioned substance having the capacity to stimulate the reticuloendothelial system, an endotoxin is injected intravenously into said mammal
of a gram negative bacterium, for example a lipopolysaccharide derived from Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa or Salmonella typhosa. Finally, 1.5 to 2 hours after the injection, liquids are taken from the body (for example ascites fluid, lymph, etc.) and / or serum or plasma from said mammals or homogenized viscera such as fold, spleen, etc. and they are extracted with a physiological saline solution. These body fluids, serum, plasma and / or viscera extract can be used as the crude solution
from TNF. However, serum or
plasma.
As indicated above, the process for preparing
<EMI ID = 8.1>
above. The genetic engineering method and the tissue culture method in which cells capable of producing TNF can also be used effectively. It should be noted that these processes can also be applied to produc � tion of human TNF.
The crude TNF produced according to any one of the methods indicated above can be purified according to the conventional biochemical techniques indicated below individually or in combination, to provide a purified aqueous solution of TNF which is lyophilized to obtain a purified powder from TNF. As techniques <EMI ID = 9.1>
for example a salting out technique in which we use
ammonium sulfate, ion exchange chromatography,
in which an ion exchange resin, a gel filtration technique and an electrophoresis technique are used. When the
<EMI ID = 10.1>
above purification, it is observed that TNF becomes progressively unstable. For example, a sample of TNF purified so that it has a specific activity of 500,000 units / mg (the specific activity is expressed in units of TNF activity per mg of protein; the unit of TNF activity is defined below) is very unstable as shown by the values indicated in the examples. Even TNF samples with specific activity less than
500,000 units / mg also show some degree of decline
activity when stored or subjected to freezing, thawing, freeze-drying or other operations.
Consequently, the invention relates to the stabilization of TNF which has been purified to a high degree and which has been made unstable. The TNF to be stabilized according to the invention can be either in the form of a solution or in the form of a powder. However, it is preferred that the stabilized TNF is in the form of a solution.
It is preferred that the TNF solution to be stabilized according to the invention constantly has a pH of 5 to 10 and, moreover, it is preferred that the solvent of the TNF solution is stabilized by
an appropriate buffer. As an appropriate buffer, there may be mentioned
for example a phosphate buffer and a tris (hydroxymethyl) aminomethane-HCl buffer. On request, a salt such as sodium chloride and potassium chloride is added to the TNF solution. For example, a salt is added to the TNF solution to prepare an isotonic solution when the TNF solution is used for injection. It is not the only purpose of adding salt. The concentration of such a salt in the TNF solution can be determined depending on the purpose of adding the salt. For example, when the TNF final is used for injection, an isotonic solution is prepared from the TNF solution by adding sodium chloride to a concentration of 0.15 M.
According to the process of the invention, an effective amount of at least one stabilizing agent chosen from the group consisting of an albumin, a gelatin, a globulin, a protamine and a protamine salt is added to an aqueous solution or to a powder. containing TNF.
As suitable albumin, there may be mentioned the albumin of various animals, such as cattle, horses,
sheep, goats, chickens and humans. As specific examples of suitable albumin, there may be mentioned bovine serum albumin, human serum albumin, chicken egg albumin, bovine lactalbumin and human lactalbumin. No significant difference was observed with regard to the ability to stabilize TNF between the abovementioned proteins. However, as stabilizing agent for injections, human serum albumin is particularly preferred.
As suitable gelatin, there may be mentioned an ordinary gelatin produced by common methods and a partially hydrolyzed gelatin. The molecular weight of gelatin is not of strict importance. However, as a stabilizing agent for injections, a partially hydrolyzed water-soluble gelatin is particularly preferred. Partially hydrolyzed gelatin is obtained by enzymatic hydrolysis of a gelatin using a proteolytic enzyme, such as papain, or by acid or alkali catalyzed hydrolysis of a gelatin.
As suitable globulin, there may be mentioned the serum globulins of various mammals, such as cattle, horses, sheep, goats and humans and their derivatives. There is no noticeable difference in capacity
<EMI ID = 11.1>
among them, a y-globulin is particularly preferred and
a corresponding derivative obtained by enzymatic treatment or chemical modification of the starting globulin. As stabilizing agent for injections, very particularly preferred is a human γ-globulin and its derivatives such as a human γ-globulin treated with fibrinolysin or treated with pepsin and a sulfonated human γ-globulin.
As a suitable protamine, there may be mentioned protamins from suitable fish species, such as salmon, herring and mackerel. As the appropriate protamine salt, there may be mentioned the protamine hydrochlorides, sulfates and phosphates. There is no significant difference in the ability to stabilize TNF between the protamines and their aforementioned salts.
The stabilizing agents which are used in the invention can be used individually or as a mixture.
The stabilizing agent which is used in the invention
<EMI ID = 12.1>
(the activity unit is defined below). The upper limit
the amount of stabilizing agent is generally determined from the point of view of the solubility of the stabilizing agent and the viscosity of the solution obtained and from the economic point of view. The upper limit of the amount of stabilizer is generally
50 mg, preferably 10 mg per ml of the TNF solution. When the TNF is stabilized in the form of a powder, the stabilizing agent is added in an amount such as the aqueous solution obtained by dissolving the powdered TNF, having an activity of 102 to
109 units / ml, presents the aforementioned concentrations of the stabilizing agent.
The way in which the stabilizing agent is added is not of strict importance. For example, the stabilizing agent in powder form can be added directly to the TNF solution. Otherwise, the powder of the stabilizing agent can be dissolved beforehand in water or an appropriate buffer and added to the TNF solution. In addition, the powder of the stabilizing agent can also be mixed with the TNF powder. The addition of the stabilizing agent can be carried out at any time during the purification stage or during the manufacturing stage of the pharmaceutical preparations.
When two or more different types of stabilizing agents are used, they are added in an amount such that their total amount is within the range of amounts defined above.
It is preferred that the preservation, purification and manufacture of pharmaceutical preparations from the
<EMI ID = 13.1>
When the TNF solution is stored in a frozen state, it is preferred that the storage temperature is kept below 0 [deg.] C and better still below -20 [deg.] C.
The TNF solution to which an effective amount of at least one stabilizing agent is incorporated according to the invention retains its TNF activity during storage, whether in the form of a solution or in a frozen form and also during the stages for the purification and manufacture of pharmaceutical preparations.
In addition, the method for stabilizing TNF according to the invention also applies to lyophilization. Generally, when freeze-dried solutions of TNF (in particular in the case of highly purified TNF), their activity decreases markedly. However, TNF solutions containing an effective amount of at least one stabilizing agent according to the invention can be lyophilized without loss of activity to provide a TNF powder. TNF powder can be dissolved to form a stable aqueous solution of TNF
<EMI ID = 14.1>
are included in the ranges defined above. The stabilizing agent as defined in the invention can otherwise be incorporated into the lyophilized preparations of TNF. When TNF is stored as a powder, it is preferred that the storage temperature be maintained at 25 [deg.] C or less.
<EMI ID = 15.1>
two methods, the in vivo method in which the effect of tumor necrosis is measured in vivo and the in vitro method in which the cytotoxic effect is measured in vitro on neoplastic cells.
As an in vivo method, there may be mentioned, for example, the method of Carswell et al. [see Proc. Nat. Acad. Sci. States-
<EMI ID = 16.1> <EMI ID = 17.1>
(2 x 10 cells) intradermally in the armpit of mice
(BALB / c x C57BL / 6) F. and, 7 days later, one chooses for the evaluation of the mice carrying tumors of 7 to 8 mm in diameter
well vascularized and without spontaneous central necrosis. A TNF sample (0.5 ml) diluted with physiological saline is injected into the tail vein of each of the mice. The activity of the TNF sample is evaluated after 24 h according to the following criteria.
(-) : no change
(+): slight hemorrhagic necrosis
(++): moderate haemorrhagic necrosis (central necrosis reaching
about 50% of the tumor area)
(+++): clear hemorrhagic necrosis (massive necrosis leaving a
small viable ring around the edge of the tumor).
As an in vitro method for determining the activity of TNF, mention may, for example, be made of the method of Ruff et al. [see Lymphokines, vol. 2, edited by E. Pick, Académie Press. N.Y.,
245-248 (1980)] and the method of Kull et al. [see J. Immunol.,
126 (4), 1279-1283 (1981)].
The in vitro method that the applicants used for determining the activity of TNF was developed by improving the conventional methods mentioned above. In the in vitro process of the applicants where the cytotoxic activity of TNF is measured against L-M cells (American Type Culture Collection CCL 1.2), the procedure is as follows. As the culture vessel,
<EMI ID = 18.1>
Inc. (United States of America) and L-M cells are grown in Eagle's minimum essential medium [see Science, 130, 432-437
(1959)] containing 10% v / v fetal calf serum inactivated by heating. A 0.1 ml sample of TNF is serially diluted and
the suspension of L-M cells (0.1 ml; 1 x 104 cells) is mixed in each well of the plates and the plates are incubated at 37 [deg.] C for 48 h in air containing 5% carbon dioxide. To the
<EMI ID = 19.1>
with 20% glutaraldehyde to fix the cells. After fixing, the plates are washed with distilled water and left to dry, then 0.1 ml of 0.05% methylene blue is added to color
living cells. The plates are washed thoroughly with distilled water to remove excess dye and allowed to dry. 0.2 ml of 3% hydrochloric acid is added to each well to extract the dye from the stained cells. The absorbance of each well is measured at 665 nm with a Titertek Multiskan produced by Flow Laboratories, Inc. The absorbance is proportional to the number of living cells. The activity of TNF, unit (U) / ml, is
<EMI ID = 20.1>
50% toxicity and can be obtained by drawing up a graph of the dilution as a function of absorbance. All the TNF activities determined according to the in vitro method which are indicated below are expressed by means of the unit determined above.
The process of the invention allows the efficient and regular supply on a commercial scale of highly purified TNF which is considered to be an effective antitumor drug applicable in clinic, thanks to the fact that the activity of TNF is maintained during storage, whether the TNF is in the form of a solution, a frozen mass or a lyophilized preparation, and during the stages of purification and manufacture of the pharmaceutical preparations.
The applicants have also discovered that the TNF solution or powder in which is incorporated at least one stabilizing agent chosen from human serum albumin, gelatin, human γ-globulin, a human γ-globulin derivative, a protamine and a protamine salt, can be administered safely to the human body and that, therefore, the new composition of the invention is particularly useful during the clinical application of TNF as an anti-tumor drug.
The invention will be described in more detail, by the reference example, the following examples and comparative examples which in no way limit the scope of the invention.
In the following examples, the names of the stabilizers are abbreviated as follows:
HSA: human serum albumin
BSA: bovine serum albumin
PHG-1: partially hydrolyzed gelatin obtained by hydrolysis catalyzed by an alkali of the gelatin (average molecular weight:
about 7,000)
HGG: human y-globulin
SPS: salmon protamine sulfate
HPS: herring protamine sulfate
BGG: bovine y-globulin
CEA: chicken egg albumin
BLA a-bovine lactalbumin
PHG-2: partially hydrolyzed gelatin obtained by acid catalyzed hydrolysis of gelatin (average molecular weight:
about 7,000)
PHG-3: partially hydrolyzed gelatin with low strength
gel
PG: purified gelatin
SPF: salmon protamine (free base)
SPP: salmon protamine phosphate
EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid.
REFERENCE EXAMPLE
Rabbits weighing 2 to 3 kg are injected intravenously with 75 mg of cells killed by formalin from Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Welcome Research Laboratories, England). Eight days later, each rabbit is injected intravenously with 100 μg of endotoxin (lipopolysaccharide from Escherichia coli 026: B6, produced by Difco Laboratories, United States of America). The blood of each rabbit is taken by cardiac puncture 2 h after the injection of endotoxin and the blood obtained is mixed with a small amount of heparin. The blood is centrifuged at 3000 rpm for
<EMI ID = 21.1>
2500 U / ml.
The plasma thus obtained (10 l) containing TNF is diluted with 5 l of 0.03 M phosphate buffer (pH 7.8). The diluted plasma is applied to a column (10 x 42 cm) of DEAE-Sepharose CL-6B (manufactured and sold by Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden) equilibrated with 0.03 M phosphate buffer (pH 7.8) 0, 13 M in NaCl. The column is washed with 2.5 l of 0.03 M phosphate buffer (pH 7.8), 0.13 M in NaCl and eluted
<EMI ID = 22.1>
is 230 ml / h and 45 ml fractions are collected. TNF activity is observed in the fractions eluted with 0.20-0.24 M NaCl.
<EMI ID = 23.1>
overnight against 0.03 M Tris-HCl buffer (pH 7.2) 0.13 M NaCl.
The dialyzed TNF solution is rechromatographed on a DEAE-Sepharose CL-6B column (3.0 x 30 cm) equilibrated with 0.03 M Tris-HCl buffer (pH 7.2) 0.15 M in NaCl. Eluted adsorbed TNF
<EMI ID = 24.1>
equilibration buffer and 500 ml of 0.03 M Tris-HCl buffer (pH 7.8) 0.3 M in NaCl. The flow rate is 40 ml / h and 10 ml fractions are collected. We group and concentrate the fractions having an activity
from TNF.
The concentrate is subjected to gel filtration with a column (5 x 100 cm) of Sephacryl S-200 (manufactured and sold by Pharmacia) balanced with 5 mM phosphate buffer (pH 7.0) 0.15 M
in NaCl. Elution is carried out with the equilibration buffer. The flow rate is 80 ml / h and 13 ml fractions are collected. We regroup
fractions with TNF activity and concentrated by ultrafiltration.
The TNF solution thus obtained is found to have a specific activity of 5.0 x 10 U / mg of proteins and a purity
10,000 times greater than that observed in plasma.
The TNF solution thus obtained is subjected to a new chromatography on the same column (Sephacryl S-200) using the same buffer to obtain a TNF solution having a specific activity of 1.0 x 10 U / mg of proteins.
EXAMPLE 1
Dilute with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0)
0.15 M sodium chloride of rabbit TNF having a specific activity of 5.0 x 105 U / mg obtained according to the procedure described in the reference example to obtain a TNF solution having a TNF activity of 1 200 U / ml. To portions of the TNF solution thus obtained, HSA (human serum albumin), BSA (bovine serum albumin), PHG-1 (partially hydrolyzed gelatin, HGG) are added separately as stabilizing agents. (human y-globulin) and SPS (salmon protamine sulfate) to form in each case two different solutions having a concentration of
0.1 mg / ml or 1.0 mg / ml.
For each of the solutions obtained, the residual activity is determined relative to 1) the samples obtained by conservation respectively for 2 days, 7 days and 30 days at
40 [deg.] C, 2) the samples subjected respectively to 1 cycle and 3 cycles of freezing (-70 [deg.] C) and of defrosting and 3) the sample submitted
<EMI ID = 25.1>
for 7 days at 25 [deg.] C. To carry out the above test, the TNF solution to which no stabilizing agent has been incorporated is used as a control. As regards the lyophilized preparation [see 3)], it is dissolved in sterile distilled water and then it is
<EMI ID = 26.1>
To determine the residual activity, the activity of each sample is measured in vitro or in vivo according to the methods described above. In the in vitro process, the residual activity (%) is calculated from the dosage value according to the following equation:
<EMI ID = 27.1>
where A is the TNF activity of the sample after conservation or physical treatment and B is the TNF activity of the sample before conservation or physical treatment.
In the in vivo process, each sample of solution is concentrated so that the concentration is 20 times higher than that of the starting point by means of the mini-module NM-3 (trademark of the ultrafiltration device manufactured and sold by Asahi Chemical Industry Co. Ltd., Japan). 0.5 ml of each of the TNF solutions thus concentrated is then injected into the tail vein into a group of 5 tumor-bearing mice. The activity of TNF is determined 24 h after according to the criterion described above. The results obtained are shown in Table 1.
<EMI ID = 28.1>
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
EXAMPLE 2
<EMI ID = 31.1>
TNF activity as that used in Example 1, HSA, PHG-1, HGG and SPS are added separately (these proteins are the same as those used in Example 1) as a stabilizing agent at various concentrations. Each of the solutions obtained is stored at 4 [deg.] C for 7 days, then they are subjected to the determination of the activity of TNF according to the in vitro process. The residual TNF activity (%) is calculated in the same way as in Example 1. The results obtained are illustrated in Figures 1 to 4.
EXAMPLE 3
<EMI ID = 32.1> TNF activity of 1000 U / ml. To portions of the TNF solution thus obtained, two different types of stabilizing agents chosen from various albumin, globulin, protamine and gelatin are added together, at various concentrations as indicated in Table 2. Each of the solutions obtained is kept at 4 [deg.] C for 7 days and subjected to a determination of TNF activity according to the in vitro test method. The residual TNF activity (%) is calculated in the same way as in Example 1. The results obtained are shown in Table 2.
TABLE 2
Stabilizing effect of various stabilizing agents
<EMI ID = 33.1>
Note: Like BSA, HSA, PHG-1, HGG and SPS, we use the same
materials than those used in Example 1.
HPS: product of Sigma Chemical Co.
BGG: product of Sigma Chemical Co.
CEA: product of Nutritional Biochemicals Corp.
EXAMPLE 4.
To portions of TNF solution having the same TNF activity as that used in Example 3, various albumin indicated in Table 3 are added separately as a stabilizing agent in an amount such that the solution obtained has a
<EMI ID = 34.1>
naked at 4 [deg.] C for 7 days and subjected to a determination of TNF activity according to the in vitro test method. We calculate
<EMI ID = 35.1>
results obtained are shown in Table 3.
TABLE 3
Stabilizing effect of various proteins
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
used in Examples 1 and 3.
HSA fraction: fraction of human serum albumin (fraction
V of Cohn), product of Sigma Chemical Co.
<EMI ID = 38.1>
from Cohn), a product of Sigma Chemical Co.
BLA: product of Sigma Chemical Co.
EXAMPLE 5
To portions of TNF solution having the same TNF activity as that used in Example 3, various gelatins are added separately as stabilizing agent as indicated in Table 4 in an amount such that the solution obtained has
<EMI ID = 39.1>
obtained at 4 [deg.] C for 7 days and the activity of TNF is determined according to the in vitro test method. The residual TNF activity (%) is calculated in the same way as in Example 1. The results obtained are shown in Table 4.
TABLE 4
Stabilizing effect of various gelatins.
<EMI ID = 40.1>
Note: Like PHG-1, we use the same material as that used
in example 1.
PHG-2: product of Nippi Co., Ltd.
PHG-3: product of Sigma Chemical Co., (Gelatin type IV:
about 60 Bloom)
<EMI ID = 41.1>
EXAMPLE 6
To portions of TNF solution having the same TNF activity as that used in Example 3, various globulins are added separately as indicated in Table 5 in an amount such that the solution obtained has a concentration of
10 mg / ml. Each of the solutions obtained is stored at 4 [deg.] C for 7 days and is subjected to the determination of the activity of TNF according to the in vitro test method. The residual TNF activity (%) is calculated in the same way as in Example 1. The results obtained are shown in Table 5.
TABLE 5
Stabilizing effect of various globulins
<EMI ID = 42.1>
Note: Like HGG and BGG, we use the same materials as those
used in examples 1 and 3.
HGG treated with fibrinolysin: Venoglobulin (brand of
commerce), product of The Green Cross Corporation, Japan.
HGG treated with pepsin: Gamma-Venom (trademark),
product of Hoechst Japan Ltd.
Sulfonated HGG: Venilon (trademark), product of Chemo-
Sero-Therapeutic Research Institute, Japan.
HGG fraction: fraction of human y-globulin (fraction II
from Cohn), a product of Sigma Chemical Co.
EXAMPLE 7
To portions of TNF solution having the same TNF activity as that used in Example 3, various protamins are added separately as stabilizing agent as indicated in Table 6 in an amount such that the solution obtained has a concentration of 1, 0 mg / ml. Each of the solutions obtained is stored at 4 [deg.] C for 7 days and is subjected to the determination of the activity of TNF according to the in vitro test method. The residual TNF activity (%) is calculated in the same way as in Example 1. The results obtained are shown in Table 6.
TABLE 6
Stabilizing effect of various protamins.
<EMI ID = 43.1>
Note: Like SPS and HPS, we use the same materials as those
used in examples 1 and 3.
SPF: product of Sigma Chemical Co.
SPP: product of Sigma Chemical Co.
EXAMPLE 8
Diluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) 0.15 M in sodium chloride, rabbit TNF having a specific activity of 1.0 × 10 6 U / mg, obtained according to the procedures described in the reference example for preparing solutions
<EMI ID = 44.1>
1,000 U / ml, 10,000 U / ml and 100,000 U / ml. To a portion of each of the TNF solutions thus prepared, HSA is added in an amount such that the solution obtained has a concentration of 1.0 mg / ml. Each of the TNF solutions obtained is stored at
4 [deg.] C for 7 days and subjected to a determination of TNF activity according to the in vitro test method. The residual TNF activity (%) is calculated in the same way as in Example 1. As controls, another portion of each of the TNF solutions to which HSA has not been incorporated is subjected to the determination of l TNF activity. The results obtained are shown in Table 7.
TABLE 7
Stabilizing effect of HSA
<EMI ID = 45.1>
[The values represent the residual activity of TNF (%)]. COMPARATIVE EXAMPLE
To portions of TNF solution having the same TNF activity as that used in Example 1, each of various amino acids, metal salts and chelating agents which are agents is added separately at various concentrations, as indicated in Table 8. well-known stabilizers of solutions of ordinary substances with physiological activity. We keep each of the
<EMI ID = 46.1>
determination of TNF activity according to the in vitro test method. The residual TNF activity (%) is calculated in the same way as in Example 1. The results obtained are shown in Table 8.
TABLE 8
Comparison of the stabilizing effect of various stabilizing agents.
<EMI ID = 47.1>
Note: Like HSA, PHG-1, HGG and SPS, the same materials are used
than those used in Example 1.
Of course, various modifications can be made by those skilled in the art to the devices or methods which have just been described solely by way of nonlimiting examples without departing from the scope of the invention.
CLAIMS S
1 - Method for stabilizing a Tumor Necrosis Factor, characterized in that it comprises the addition to an aqueous solution or to a powder containing a Tumor Necrosis Factor of an effective amount of at least one stabilizing agent chosen from group consisting of albumin, gelatin, globulin, protamine and protamine salt.