"Antibiotiques macrolides, leur. procédé de préparation et microorganismes s'y rapportant, leurs produits intermédiaires et compositions pharmaceutiques les contenant" <EMI ID=1.1>
érythronolide B.
L'invention a Egalement pour objet un nouveau microorganisme utile pour la production des antibiotiques macrolides de l'invention, ainsi que le procédé de préparation qui
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connue.
La présente invention concerne en outre de nouveaux produits intermédiaires dérivés de l'érythronolide A, de
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et le procéda chimique de synthèse correspondant.
Comme indique ci-dessus, les nouveaux antibiotiques macrolides semi-synthétiques de la présente invention sont utiles en tant qu'agents bactéricides, et ils présentent en fait par comparaison avec les ërythromycines de type connu des spectres d'activité de niveaux analogues ou plus étendus, ils sont moins susceptibles de dégradation dans une ambiance acide et il en découle qu'ils conviennent mieux à l'absorption par voie orale: leurs esters et leurs sels-esters ainsi que les dérives carbonates correspondants (que l'on peut obtenir
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plus complète en déterminant des niveaux hématiques plus élevés et prolonges des bases libres; en outre, les dérivés carbonates sont plus actifs que les antibiotiques correspondants.
Les nouveaux antibiotiques de l'invention, du fait de la présence du groupe basique, forment des sels d'addition soit avec des acides organiques, soit avec des acides inorganiques.
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base libre au moyen de procédés classiques en utilisant pour la préparation des sels d'addition dus antibiotiques basiques.
Les sels qui ne sont pas hydrosolubles sont utilisés dans
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dérives monoesters des nouveaux antibiotiques et les sels d'addition de ces derniers peuvent être en outre prépares au
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tion d'esters et de sels-esters d'érythromycine A.
Les esters et les sels-esters de l'erythromycine A et leurs procèdes de préparation sont connus dans ce domaine de la technique. Des exemples d'esters, de sels-esters et de
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butyrate, le succinate, le valérate, l'éthylsuccinate, le propionate de lauryl-sulfate, le stéarate, le lactobionate, le glucoheptonate, le sulfate, le lauryl-sulfate et similaires, et parmi ceux-ci le lactobionate et le glucoheptonate étant des sels hydro-solubles se prêtant à une administration par voie intraveineuse. L'éthyl-succinate de son côté convient à une administration aussi bien par voie orale que par voie parentéral(! .
Les nouveaux antibiotiques selon l'invention sont des
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de poudre, plus stables que 1'C.-rythromycine A en solution aqueuse à pH acide, et par ailleurs plus stables dans une ambiance acide gastrique. Les durées de division nar deux de l'activité initiale de l'érythromycine A et des antibiotiques macrolides de la présente invention, dans des solutions de pH divers sont consignées dans le Tableau 1 qui suit.
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<EMI ID=11.1>
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NOTA BENE: t 1/2 représente la durée de division nar deux de la
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Selon un premier aspect de l'invention, on prépare de <EMI ID=15.1>
obtenir par fermentation directe et en quantité notable, et
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pouvant fournir des antibiotiques ne présentant pas les inconvénients et les problèmes présentes par l'érythromycine elle-même, alors que du point de \vue industriel il apparaît comme très désirable de les utiliser.
On a maintenant découvert que les dérives de l'érythrono-
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érythronolide B que l'on peut obtenir par voie chimique d'une façon simple et industriellement avantageuse constituent des substrats utiles pour des procédés de fermentation qui, en utilisant des micro-organismes dérivés par mutagénèse de souches aptes à la production microbiologique de l'ërythromycine A, conduisent aux nouveaux antibiotiques macrolides de la présente invention, comme cela sera décrit plus spécifiquement ci-après..
Le procède chimique de préparation des nouveaux produits intermédiaires selon la présente invention est représente par le schéma qui suit:
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SCHEMA 1
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où X représente H, ou le groupe :
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et qui se caractérise par les étapes consistant en :
a) le traitement d'un composé (I) choisi parmi l'érythrono- <EMI ID=23.1>
B avec un acide anhydre, tel que l'acide acétique glacial ou encore une solution méthanolique d'hydroxylamine chlorhydrate, pour former le composé II, soit le B,9-anhydroérythronolide A 6,9-hémyacétal, le 8,9-anhydroérythronolide B-6,9-hémyacétal ou encore le 3-0-micarosyl-8,9-anhydroérythronolide B-6, 9hémiacétal ; b) la réaction du composé (II) avec un réactif capable d'engendrer du fluor électrophile, de préférence choisi parmi <EMI ID=24.1> <EMI ID=25.1>
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basse température; c) la réaction du composé (III) avec de l'acide aqueux chaud, avec formation du compose (IV) désira.
Référence étant faite à l'étape (b), celui des réactifs de la classe des fluoroxy-perfluoro-alcanes qui est le plus
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obtenir dans le commerce,
D'autres réactifs contenant des atomes de fluor à charge positive yue l'on peut utiliser dans cette réaction compren-
<EMI ID=28.1>
et le plomb tétraacêtate-acide fluorhydrique.
Parmi les solvants de réaction, on envisage les hydrocar-
<EMI ID=29.1>
11), le chloroforme, le chlorure de méthylène et analogues, le tétrahydroCuranne et leurs mélanges.
Il est préférable d'effectuer la réaction à basse tempe-
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continu.
La réaction se termine habituellement après une durée comprise entre 15 minutes et environ une heure.
<EMI ID=31.1>
geables du composé (IV) désire.
En ce qui concerne la troisième étape (c) de la réaction, on utilise des acides aqueux organiques ou minéraux, tels que l'acide acétique ou l'acide chlorhydrique. Pour la réaction,
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température du reflux. Le produit obtenu (IV) est récupéré sous une forme purifiée par recristallisation ou chromatographie.
Du fait que les composés (II), (III) et (IV) sont nouveaux, ils constituent également une partie de l'objet de l'invention.
L'invention se base, en plus de l'intermédiaire (IV), sur <EMI ID=33.1>
irradiation avec des rayons U.V. ou des rayons X, par voie biologique ou similaire.
<EMI ID=34.1>
sant le compose (IV) comme substrat conduit à la production de nouveaux antibiotiques tnacrolidcs de la classe des érythromycines (8S)-8-fluorurates (schéma II: P-80202, P-80203, P-
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antibiotiques ayant en outre des colorations spécifiques s'ils sont traités avec des réactifs chromatiques et réchauffés, le premier ayant une coloration brique (à chaud) , le second et le quatrième une coloration violet foncé (après refroidissement) et le troisième une coloration marron fonce (à chaud).
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<EMI ID=37.1>
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<EMI ID=39.1>
<EMI ID=40.1>
Un autre objet de l'invention est un procède microbiologigue de préparation des nouveaux antibiotiques macrolides de
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Schéma III:
<EMI ID=42.1>
u
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(P-80207)
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ATCC 31772 et Streptomyces antibioticus ATCC 31771 en utilisant les composes (IV) comme substrat pour obtenir les antibiotiques désires peut être réalisée en conformité avec diverses techniques de fermentation.
Lorsque la fermentation est terminée, on peut utiliser diverses procédures pour l'isolement et la purification des antibiotiques.
Parmi les procédures conseillées pour l'isolement et la purification figurent les techniques d'extraction avec un solvant, soit sous forme discontinue soit dans des colonnes d'extraction liquide-liquide à contre-courant, et la chromatographie avec pénétration de gel.
Selon une procédure préférée, les antibiotiques produits selon la présente invention sont récupères du milieu de culture par séparation du mycélium et de tout le solide non dissous du bouillon de fermentation par des moyens classiques tels yu'une filtration ou une centrifugation. Les antibiotiques sont donc extraits du bouillon filtré et centrifugé au moyen de techniques d'extraction avec distribution à contre-courant ou encore en travaillant par lots. L'extraction avec un solvant peut être réalisée en utilisant un intervalle de pH compris entre 8 et 10 et en employant comme solvant un sol-
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comprennent l'alcool tel que le méthanol, l'éhanol et similaires, les hydrocarbures chlorurés tels que le chloroforme,
<EMI ID=47.1>
préfère.
La purification finale des antibiotiques mentionnes peut être réalisée par chromatographie sur gel perméable.
Après filtration ou centrifugation du milieu de fermentation, il est possible d'utiliser la chromatographie sur couche mince, ou la chromatographie en phase liquide à haute pression pour individualiser par analyse les antibiotiques en question.
Il est en outra possible d'utiliser avantageusement la technique de la bioautographie.
Les exemples qui suivent sont des exemples non limitatifs de l'invention.
EXEMPLE 1
<EMI ID=48.1>
teur d'érythromycine a été soumise à un traitement mutagène avec des rayons ultraviolets (maximum d'émission 250 nm) à une dose suffisante pour tuer approximativement 99,6% des
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contenant un terrain nutritif et les colonies obtenues ont été analysées du point de vue de leur incapacité à produire
<EMI ID=50.1>
Les mutants bloqués au cours de la synthèse de l'érythromycine (environ 2% des survivants) ont donc été analysés en ce qui concerne leur capacité à reconnaître et transformer le composé (IV) comme substrat dans des nouveaux composés à activité antibiotique.
EXEMPK 2
<EMI ID=51.1>
(II).
Une solution de 4,185 g (0,01 mole) d'érythronolide A (I) décrite par R.A. Le Mahieu et al dans J. Med. Chem. 17, <EMI ID=52.1> au repos pendant deux heures à température ambiante. L'acide acétique a été ensuite replacé sous vide à la température de
<EMI ID=53.1>
roforme. La solution chloroformique a été lavée avec une solution saturée de sodium bicarbonate et ensuite à l'eau jusqu'à neutralité et finalement soumise à dessiccation sur Na-SO.. Après élimination du solvant sous vide, on a obtenu un produit brut qui a été purifié sur une colonne de gel de
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(1:1). L'élution avec du chlorure de méthylène méthanol (98:2) a permis d'obtenir des fractions contenant seulement
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ration à sec de ces fractions réunies et par cristallisation successive par acétone n-hexanc, on a obtenu 2,750 g du compose (II) présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 188-193[deg.]C
<EMI ID=56.1>
IR (Kl3r) 3630, 3520, 2495, 1710, 1465, 1450, 1440, 1400,
1370, 1350, 1310, 1235, 1230, 1200, 1170, 1140, 1090, 1075,
1060, 1050, 1035, 1020, 1010, 1000, 970, 950, 940, 920, 905,
<EMI ID=57.1>
calculé (en pourcentage) C 62.97;H 9.06
trouve (en pourcentage) C 63.12; H 9.10
EXEMPLE 3
<EMI ID=58.1>
On a prépare une solution de fluoroxy trifluorom�thane dans CC13F à -80[deg.]C: un excès de CF,OF (seulement d'environ 2
<EMI ID=59.1>
80[deg.]C sur de la glace sèche) par adjonction lente du gaz au travers d'un tube de vidange (alors que le cylindre contenant
<EMI ID=60.1>
agitation magnétique avec de l'oxyde de calcium (1,920 g) pour éloigner l'acide fluorhydrique. Le déroulement de la réaction a été contrôlé périodiquement par chromatographie
<EMI ID=61.1>
tion du pic de la caractéristique du composa II.
Après disparition (ou forte réduction) du pic du composé II, on a continue à agiter pendant 5 Minutes et on a fait barboter de l'azote gazeux au travers de la solution pour
<EMI ID=62.1>
Après élimination du solvant, on a obtenu un résidu solide qui a été ensuite purifie par chromatographie sur colonne de gel de silice (rapport 1:50) préparée dans du
<EMI ID=63.1>
concentrations croissantes de méthanol dans du chlorure de méthylène a donne:; des fractions contenant seulement (8S)-8-
<EMI ID=64.1>
3,435 g présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 192-3[deg.]C
<EMI ID=65.1>
UV (méthanol); aucune absorption correspondant à un groupe cétone.
<EMI ID=66.1>
mg présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 239-40[deg.]C
<EMI ID=67.1>
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
En procédant de façon analogue à l'Exemple 3, mais en partant d'une solution contenant 3,845 g (0,010 mole) de 8,9-
<EMI ID=70.1>
brevet US n[deg.] 3 697 547) , on a obtenu un produit brut qui, par .cristallisation par acétone-hexane, a donné 3,450 g de (SS)- <EMI ID=71.1>
UV (méthanol); aucune absorption correspondant à un groupe cétone;
IR(KBr) 3540, 3450, 1735, 1460, 1260, 1170, 1060, 1035, 980,
<EMI ID=72.1>
Quand les eaux mères ont Été purifiées par chromatographie sur colonne de gel de silice (rapport 1:50) avec du
<EMI ID=73.1>
obtenu 75 mg d'un second produit (8S)-8-fluoroGrythronolide B
(IV) présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 247-8[deg.]C
<EMI ID=74.1> <EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
retomber à 110[deg.]C pendant 15 minutes sous agitation, et on a
<EMI ID=77.1>
110[deg.]C, tout le matériau de départ était dissous. On a poursuivi le réchauffement pendant une demi-heure et la solution a
<EMI ID=78.1>
du sulfate de sodium, a été évaporée à sec et sous vide.
Quand le produit brut a été purifié par chromatographie en colonne de gel de silice (rapport 1:50) avec du
<EMI ID=79.1>
chimico-physiques égales au produit (IV) isolé à l'Exemple 4.
EXEMPLE 6
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1>
ambiante une solution de 5,465 g (0,010 mole) de 3-0-micarosylérythronolide B (I), décrit par J.R. Martin dans Biochemistry, 5, 2852 (1966), dans 32 ml d'acide acétique glacial.
L'acide acétique a été ensuite remis sous vide à la
<EMI ID=82.1>
de chloroforme. La solution chloroformique a été lavée avec une solution saturée de sodium bicarbonate et ensuite à l'eau
<EMI ID=83.1>
Après élimination du solvant sous.vide, on a obtenu un produit brut qui a été purifie sur colonne de gel de silice
(rapport 1:100) préparée dans du chloroforme.
L'élution avec concentrations croissantes de mGthanol dans le chloroforme a permis d'obtenir des fractions conte-
<EMI ID=84.1> <EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
tes:
<EMI ID=87.1>
trouvé (en pourcentage) C 63152; H 9109
EXEMPLE 7
<EMI ID=88.1>
travers un tube de vidange (alors que le cylindre contenant CF30F était continuellement pesé sur une balance électrique Sartorius) .
<EMI ID=89.1>
calcium (1,920 g) pour éloigner l'acide fluorhydrique.
Le déroulement de la réaction a été périodiquement con-
<EMI ID=90.1>
relation avec la disparition du pic caractéristique du compose II.
Après disparition (ou réduction importante) du pic relatif au composa II, on a poursuivi l'agitation pendant 5 minutes et on a fait gargouiller de l'azote gazeux au travers
<EMI ID=91.1>
L'élimination du solvant a permis d'obtenir un résidu solide qui a été ensuite purifie par chromatographie sur colonne de gel de silice (rapport 1:100) préparée dans du chloroforme.
L'élution avec des concentrations croissantes de méthanol dans du chloroforme ont donne des fractions contenant seule-
<EMI ID=92.1>
Après évaporation à sec des fractions contenant le composé III et leur cristallisation par de l'acétone, on a obtenu 1,100 g présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 175-7[deg.]C
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
cStone
IR (KBr) 3540, 3490, 1720, 1460, 1395, 1380, 1365, 1355,
1330, 1320, 1290, 1275, 1265, 1245, 1205, 1185, 1165, 1145,
1120, 1100, 1080, 1060, 1045, 1015, 1005, 990, 960, 940, 925,
<EMI ID=95.1>
250 mg présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 214-5[deg.]C
<EMI ID=96.1>
1465, 1380, 1365, 1340, 1300, 1275, 1250, 1180, 1115, 1080, <EMI ID=97.1>
6,9;9,11-acétal (III).
On a maintenu un mélangé forma par 6,560 g (0,012 mole)
<EMI ID=98.1>
(III) et 3000 ml d'une solution aqueuse (pH=3) d'acide acdtique à température ambiante sous agitation jusqu'à solution complète, puis on a ajouté 220 ml d'acide acétique.
La solution a été maintenue sous agitation à la température ambiante jusqu'à complète disparition du produit de départ (III) (le contrôle a été réalise par chromatographie en phase liquide et à haute pression), rendue neutre avec
<EMI ID=99.1>
La solution d'acétate d'éthyle, après anhydrification sur le sulfate de sodium, a été évaporée à sec et sous vide.
<EMI ID=100.1>
un produit présentant des caractéristiques chimico-physiques
<EMI ID=101.1>
EXEMPLE 9
<EMI ID=102.1>
d'une solution aqueuse (pH=3) d'acide acétique à 110[deg.]C pendant 15 minutes sous agitation, puis on a jouté 220 ml d'acide acétique.
Après une heure à 110[deg.]C, tout le matériau de départ était dissous.
On a continua de chauffer pendant une demi-heure et la solution a été ensuite refroidie le plus rapidement possible <EMI ID=103.1>
te avec de l'acétate d'éthyle.
La solution d'acétate d'éthyle, après anhydrification sur
<EMI ID=104.1>
thronolidc A (IV) .
Répétant la réaction sur le produit de départ récupéré et la purification cliroimatographiclue qui a suivi, il a été possible d'obtenir d'autres fractions contenant (SS)-8-
<EMI ID=105.1>
nolide A (IV) présentant les mêmes caractéristiques qui sont
<EMI ID=106.1>
EXEMPLE 10
<EMI ID=107.1>
Une culture ensemencée avec Streptomyces erythreus ATCC
31772, un mutant bloqué dans la biosynthèse de l'érythromycine, a été préparée dans un milieu constitue par (en grammes par litre): saccharose 30,0; mélasse de canne 8,0; huile de
<EMI ID=108.1>
On a laissé incuber la culture à 33[deg.]C pendant 48 heures sur un secoueur rotatif. L'inoculum a été ajouté jusqu'à un
<EMI ID=109.1>
contenant 30 ml d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante en. grammes par litre: dextrine de mais 3,0; amidon de mais brut 40,0; farine de graines de soja 30,0;
<EMI ID=110.1> rotatif (22U t.p.m., course de 4 cm) pendant 24 heures. On a
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
(UPLC).
A la fin de la fermentation, un échantillon du bouillon de fermentation ayant une activité d'environ 900-1000 mcg/ml
<EMI ID=113.1>
le liquide surnageant a été clarifie par adjonction de volumes égaux d'une solution aqueuse à 10% (P/V) d'nydroxyde de sodium. Après centrifugation, le liquide surnageant et limpide a été extrait par agitation tourbillonnaire avec un tiers de son volume d'acétate d'éthyle.
<EMI ID=114.1>
Un échantillon de la partie organique a été déposé sur une plaque de gel de silice G et développe dans CH2C12-
<EMI ID=115.1>
ceux-ci présentent des réactions chromatiques différentes après application d'un réactif pulvérisé et réchauffement:
couleur marron foncé (ci chaud) pour le composé le plus lent
(antibiotique P-80205) , et couleur violet fonce (après refroidissement) pour l'autre compose (antibiotique P-80206).
<EMI ID=116.1> <EMI ID=117.1>
0,87 (P-80206).
EXEMPLE 11
<EMI ID=118.1>
Selon le procédé décrit à l'Exemple 10 qui précède, diverses fermentations représentant un volume total de 2100 ml, auxquelles avaient été ajouté 1,00 g de
<EMI ID=119.1>
Le solide a été lave avec de l'eau et les filtrats combinés ont été réglas sur un pH de 5,5 avec de l'acide acétique. La solution aqueuse acide a été extraite trois fois au moyen
<EMI ID=120.1>
l'eau.
Après dessiccation (Na2S04) et éloignement du solvant sous vide, le résidu a été purifie par chromatographie de repartition en colonne sur gel de silice selon le procède indiqué par N.L. Oleinick dans J. Biol. Chem. vol. 244, n[deg.] 3, page
727 (1969).
Les fractions 90-174 contenant seulement l'antibiotique P-80206 ont été réunies et évaporées à sec à 40[deg.]C. Le résidu
<EMI ID=121.1>
les caractéristiques suivantes:
p.f. 183-4[deg.]C <EMI ID=122.1>
1400, 1370, 1345, 1330, 1305, 1280, 1190, 1170, 1120, 1090, <EMI ID=123.1>
890, 870, 855, 835, 800 (ce spectre est représenté à la figure 1) .
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
Les fractions 280-400 contenant seulement l'antibiotique
<EMI ID=126.1>
tant les caractéristiques suivantes:
p.f. 217-8[deg.]C
<EMI ID=127.1>
IR (KBr) 3550, 3500, 3440 {épaulement) , 3300 (large), 1730,
1455, 1425, 1410, 1380, 1360, 1340, 1330, 1305, 1280, 1270,
1245, 1200 (épaulèrent), 1170 (large), 1115, 1090, 1075,
1060, 1030, 1010, 1000, 980 (épaulement), 965, 955, 945, 935,
920, 905, 895, 870, 840, 830, 810 (le spectre correspondant étant représente à la figure 2) .
<EMI ID=128.1>
Après 24 heures a 28[deg.]C sur secoueur rotatif, cette cultu-
<EMI ID=129.1>
concentration de 2% (V/V) et elle a été ensuite soumise à incubation dans les mêmes conditions pendant 16 heures.
Cet inoculum a été ajouté à la concentration de 3% (V/V) <EMI ID=130.1>
milieu de fermentation ayant la composition suivante (en grammes par litre) :
<EMI ID=131.1>
3,0; levure du bière sèche 2,0; CaC03 20,0.
Les matras utilises pour la fermentation ont été soumis à incubation à 28[deg.]C sur secoueur rotatif (240 t.p.m., course de
<EMI ID=132.1>
A (IV) sous forme finement subdivisée ont été ajoutés à chaque matras et l'incubation avec agitation a été poursuivie pendant 64 heures.
A la fin de cette période, le titre de la culture expri-
<EMI ID=133.1>
traitement du bouillon de fermentation par analyse TLC a été effectué selon le système et les conditions indiqués à l'Exemple 10.
CONTROLE TLC
Conformément à la technique indiquée à l'Exemple 10, on a relevé un nouveau composé actif (antibiotique P-80207) qui indique la disparition du substrat qui a été ajouté. Son Rf
<EMI ID=134.1>
Conformément à la technique indiquée à l'Exemple 10, le nouveau compose actif (antibiotique P-80207) présente une durée de rétention par rapport à l'érythromycine A de 0.69 et par rapport à l'oléandomycine de 0.95.
EXEMPLE 13
<EMI ID=135.1>
Supercell pendant 30 min. et sous agitation, le mélange a été filtré. Le solide a été lavé à l'eau-méthanol (1:1) et les filtrats combinés ont été évaporés sous pression réduite jusqu'à moitié du volume de départ.
Le t'Il de la solution a été réglé ci 8, 2 par adjonction de KOH et la solution a été extraite trois fois selon des quanti-
<EMI ID=136.1>
été évaporée à sec et sous vide. Le résidu a été purifie par chromatographie de répartition sur colonne de gel de silice suivant le procède indique à l'Exemple 11.
Les fractions 45-80 contenant seulement l'antibiotique P-
80207 ont été réunies et portées à sec et sous vide a 40[deg.]C. Le résidu solide a été cristallisé par de l'éthanol absolu
<EMI ID=137.1>
8-fluoroérythronolide A (P-80207) présentant les caractéristiques suivantes:
p. f. 155-7[deg.]C
<EMI ID=138.1>
IR (KBr) 3480 (large), 1730, 1510, 1380, 1340 (large), 1305,
1275, 1195, 1165, 1105, 1095, 1075, 1050, 1030, 1010, 1000,
980, 960 (épaulement) , 935, 915, 895, 875, 930 (ce spectre étant représenté à la figure 3) .
<EMI ID=139.1>
calculé (en pourcentage) C 58,60; H 8,74; F 2,57; N 1,90 trouvé (en pourcentage) C 58,52; H 8,75; F 2,63; N 1,95
EXEMPLE 14
<EMI ID=140.1>
30 ml d'un milieu de fermentation ayant la composition suivante <EMI ID=141.1>
secoueur rotatif (220 t.p.m.; course de 4 cm) pendant 24 heures.
A chaque matras ont été ajoutes 15 my de (8S)-8-fluoro-
<EMI ID=142.1>
sée sous lumière ultraviolette pendant 15 minutes et l'incu-
<EMI ID=143.1>
Traitement des échantillons par chromatographie sur
<EMI ID=144.1>
<EMI ID=145.1>
un échantillon du bouillon de fermentation ayant une activité
<EMI ID=146.1> <EMI ID=147.1>
<EMI ID=148.1>
xyde de sodium. Après centrifuyation, le liquide surnageant limpide a été extrait par agitation tourbillonnaire avec un tiers de son volume d'acétate d'étyle.
CONTROLE TLC
Un échantillon de la partie organique a été déposé sur une plaque de gel de silice G et développé dans CH2C12-
<EMI ID=149.1>
(Sarcina lutea) ATCC 9341.
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
des deux composés actifs dont la valeur de Rst par rapport à l'érythromycine A est respectivement de 0,9 et de 1,13 (0,85
<EMI ID=152.1>
En outre, ils présentent des réactions chromatiques différentes après application d'un réactif pulvérisé et quand ils ont été réchauffes: couleur marron fonce (il chaud) pour le <EMI ID=153.1>
foncé (après refroidissement) pour l'autre compose (antibiotique P-80203).
CONTROLE I1PLC
Un échantillon de la partie organique a été évapore à
<EMI ID=154.1>
On a constaté deux pics avec un temps de rétention par rapport à l'érythromycine A de 0,79 (P-80202) et de 1,06 (P-80203).
EXEMPLE 15
<EMI ID=155.1>
Selon le procède décrit à l'Exemple 14 qui précède, diverses fermentations d'un volume total de ml 2100 et aux-
<EMI ID=156.1>
B ont été filtrées sous vide après adjonction sous agitation d'Hyflo Supercell (4% poids/volume). Le solide a été lavé
<EMI ID=157.1>
<EMI ID=158.1>
tone.
Ces derniers extraits organiques ont été réunis et lavés
<EMI ID=159.1>
éloignement du solvant sous vide, le résidu a été purifié au moyen de chromatographie de répartition en colonne sur gel de silice selon le procède indiqué par N.L. Oleinick dans J. Biol.Chem. Vol. 244, n[deg.] 3, page 727 (1969).
Les fractions 18-32 contenant seulement l'antibiotique P-
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
150 mg de (8S)-8-fluoroerythromycine B (P-80203) présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 164-6[deg.]C <EMI ID=162.1>
IR (KBr) 3480 (large), 1735, 1465, 1435, 1385, 1375, 1330,
1305, 1280, 1170, 1115, 1090, 1U75, 1055, 1035, 1020, 1000,
<EMI ID=163.1>
trouvé (en pourcentage) C 60,31; H 9,09; F 2,60; N 1,88
Les fractions 55-105 contenant seulement l'antibiotique
<EMI ID=164.1>
Le résidu solide par cristallisation par éthanol absolu a
<EMI ID=165.1>
sentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 213-15[deg.]C
<EMI ID=166.1>
IR (KBr) 3600, 3520, 3300 (large) , 1730, 1460, 1420, 1385,
1370, 1355, 1345, 1330, 1310, 1275, 1190, 1160, 1120, 1100,
1060, 1040, 1030, 1010, 1000, 995, 975, 960, 935, 920, 910,
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
trouvé (en pourcentage) C 59,87; H 8,85; F 2,63; N 1,88
EXEMPLE 16
<EMI ID=170.1>
ATCC 31771, mutant bloqué dans la biosynthèse de l'oléandomycine, a été préparée dans un milieu constitué (en grammes par litre d'eau déionisée) par de la farine de graines de
<EMI ID=171.1>
concentration de 2% (V/V) et elle a été ensuite incubée dans les mêmes conditions pendant 16 heures.
1 <EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
milieu de fermentation présentant la composition suivante (en grammes par litre) :
<EMI ID=174.1>
<EMI ID=175.1>
28[deg.]C sur secoueur rotatif (240 t.p.m., course de 4 cm) pen-
<EMI ID=176.1>
sous forme finement subdivisée ont été ajoutes à chaque matras et l'incubation avec agitation a été poursuivie pendant 64 heures.
A la fin de cette période, le titre de la culture exprimé
<EMI ID=177.1>
bouillon de fermentation par le procédé d'analyse TLC a été
<EMI ID=178.1>
ple 14.
CONTROLE TLC
Selon la technique indiquée à l'Exemple 14, on a relevé un nouveau composé actif (antibiotique P-30204) qui suit la
<EMI ID=179.1>
CONTROLE HPLC
Selon la technique indiquée à l'Exemple 14, le nouveau composé actif (antibiotique P-80204) présente un temps de rétention par rapport à l'Ôrythromycine B de 0,62 et par
<EMI ID=180.1>
EXEMPLE 17
<EMI ID=181.1>
La culture en bouillon total dérivée de 50 fermentations effectuées dans des matras d'Erlenmeyer, agitées et conduites comme indiqué à l'Exemple 16 qui précède, a été traitée avec un volume égal de méthanol. Après l'adjonction de l'Hyflo
<EMI ID=182.1>
filtré. Le solide a été lavé à l'eau-méthanol (1:1) et les filtrats combinés ont été évaporés sous pression réduite <EMI ID=183.1>
<EMI ID=184.1>
vide. Le résidu a été purifié par chromatographie de répartition en colonne de gel de silice selon le procédé indiqué à . l'Exemple 15.
Les fractions 17-42 contenant seulement l'antibiotique P-
<EMI ID=185.1>
1:1 et alliées avec le même solvant,
Les fractions contenant seulement le nouvel antibiotique
<EMI ID=186.1>
pour donner, après cristallisation par acétone-hexane 170 mg
<EMI ID=187.1>
B (P-80204) présentant les caractéristiques suivantes:
p.f. 195-6[deg.]C
<EMI ID=188.1>
IR (KBr) 3600, 3440 (large), 3250 (large), 1730, 1455, 1400,
1380, 1365, 1350, 1325, 1305, 1270, 1255, 1180, 1160, 1145,
1100, 1060, 1040, 1010, 995, 975, 960, 935, 915, 890, 875,
<EMI ID=189.1>
trouve (en pourcentage) C 59,94; H 9,06; F 2,69; N 1,83
EXEMPLE 18
<EMI ID=190.1>
La culture a été incubée à 33[deg.]C pendant 48 heures sur
<EMI ID=191.1>
Les matras de fermentation ont été incubés à 33[deg.]C sur
<EMI ID=192.1>
heures .
A chaque matras ont été ajoutés 20 mg de 3-0-micarosyl-
<EMI ID=193.1>
visée et stérilisée sous lumière ultraviolette pendant 15 minutes, et l'incubation avec agitation a été poursuivie pendant 96 heures.
Traitement des échantillons par chromatographie sur
<EMI ID=194.1>
haute pression (HPLC) : à la fin de la période de fermentation, un échantillon du bouillon de fermentation ayant une activité d'environ 900-1000 mcg/ml (titre exprimé comme érythromycine A) a été centrifugé et le liquide surnageant a été clarifié <EMI ID=195.1>
<EMI ID=196.1>
de de sodium. Après centrifugation, le liquide surnageant limpide a été extrait par agitation tourbillonnaire avec un tiers de son volume d'acétate d'éthyle.
CONTROLE TLC
Un échantillon de la partie or�aniqu� a été déposé sur une plaque de gel de silice G et développé en
<EMI ID=197.1>
acétique (85:0,5:5:10) et les composes actifs ont été révélés par bioauto�caphic sur plaques inoculées avec Micrococcus luteus (Sarc'ina lutca) ATCC 9341.
Les résultats du contrôle TLC ont montré la disparition
<EMI ID=198.1> la disparition des deux composes actifs dont les valeurs du
<EMI ID=199.1>
B).
En outre, ils présentaient des réactions chromatiques différentes après application d'un réactif pulvérise après avoir
<EMI ID=200.1>
<EMI ID=201.1>
foncé (après refroidissement) pour l'autre compose (antibiotique P-80203).
<EMI ID=202.1>
nytrile 36:64; flux de 2 ml/min; température colonne 40[deg.]C). On a pu mettre en évidence deux pics avec un temps de réten-
<EMI ID=203.1>
1,06 (P-80203).
EXEMPLE 19
<EMI ID=204.1>
Selon le procède décrit à l'Exemple 18 qui procède, diverses fermentations représentant un volume total de 2100
<EMI ID=205.1>
<EMI ID=206.1>
Le solide a été lavé avec de l'eau et les filtrats combi-
<EMI ID=207.1>
La solution aqueuse acide a été extraite trois fois avec des volumes égaux d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse a été évaporée sous pression réduite jusqu'à un volume de 1000 ml,
<EMI ID=208.1>
éloignement du solvant sous vide, le résidu a été purifié par chromatographie de répartition en colonne sur gel de silice <EMI ID=209.1>
<EMI ID=210.1>
Les fractions 23-38 contenant seulement l'antibiotique
<EMI ID=211.1>
40[deg.]C.
<EMI ID=212.1>
tant les caractéristiques suivantes:
p.f. 164-6[deg.]C
<EMI ID=213.1>
IR (KBr) 3480 (large) 1735, 1465, 1435, 1385, 1375, 1330,
1305, 1280, 1170, 1115, 1090, 1075, 1055, 1035, 1020, 1000,
<EMI ID=214.1>
<EMI ID=215.1>
<EMI ID=216.1>
Les fractions 65-120 contenant seulement l'antibiotique P-80202 ont été réunies et portées à sec et sous vide à 40[deg.]C. Le résidu solide par cristallisation par cthanol absolu a
<EMI ID=217.1>
les caractéristiques suivantes:
p.f. 213-15[deg.]C
<EMI ID=218.1>
1370, 1355, 1345, 1330, 1310, 1275, 1190, 1160, 1120, 1100,
1060, 1040, 1030, 1010, 1000, 995, 975, 960, 935, 920, 910,
<EMI ID=219.1>
rythromycine dans 30 ml d'acétone anhydre contenant 3,760 g de sodium bicarbonate ont été ajoutés 1,23 ml (0,013 mole) d'anhydride acétique. Le mélange a été maintenu sous agitation à 25[deg.]C pendant 2 heures et ensuite versé dans de l'eau conte-
<EMI ID=220.1>
avec du chloroforme, lavée rapidement avec une solution saturée de sodium bicarbonate et ensuite avec de l'eau.
<EMI ID=221.1>
anhydre et évaporée sous vide à sec pour donner 7, 545 g de résidu solide.
<EMI ID=222.1>
IR (KBr) 3480, 1740, 1455, 1370, 1340, 1280, 1235, 1160,
1110, 1085, 1050, 1030, 1010, 995, 975, 955, 930, 890, 870,
<EMI ID=223.1>
rythromycine propionate par estérification à'l'anhydride propionique Le produit final présentait les caractéristi-
<EMI ID=224.1>
IR (KBr) 3480, 1735, 1455, 1375, 1340, 1180 (épaulèrent),
<EMI ID=225.1>
<EMI ID=226.1>
EXEMPLE 22
<EMI ID=227.1>
rythromycine A butyrate par estérification à l'anhydride butyrique. Le produit final présentait les caractéristiques suivantes:
<EMI ID=228.1>
IR (KBr) 3490, 1740, 1455, 1370, 1340, 1180 (épaulement),
1160, 1085, 1050, 1030, 1010, 995, 975, 955, 930, 890, 865,
<EMI ID=229.1>
nate.
<EMI ID=230.1>
l'éthyle succinile chlorure. Le produit final présentait les caractéristiques suivantes:
<EMI ID=231.1>
IR (KBr) 3480, 1735, 1450, 1370, 1345, 1190 (épaulement),
<EMI ID=232.1>
EXEMPLE 24
Préparation de (8S)-8-fluoro�rythromycine A succinate.
Une solution contenant 7,520 g (0,010 mole) de (85)-8-
<EMI ID=233.1>
nique dans 37,5 ml d'acétone anhydre a été réchauffée à 80[deg.]C pendant 15 minutes, refroidie et maintenue à la température ambiante pendant 2 heures.On a ensuite procède selon l'Exemple 20 jusqu'à ce qu'on obtienne un résidu solide de 7,565 g. Par cristallisation du solide par éther Sthylique, on a
<EMI ID=234.1>
présentant les caractéristiques suivantes:
<EMI ID=235.1>
<EMI ID=236.1>
IR (KBr) 3450, 1730, 1575, 1455, 1370, 1340, 1190 (épaule- 1 ment), 1160, 1050, 990, 975, 950, 930, 885, 860, 825, 800 cm' , <EMI ID=237.1>
<EMI ID=238.1>
EXEMPLE 25
<EMI ID=239.1>
<EMI ID=240.1>
rythromycine A dans 40 ml d'acétone.
<EMI ID=241.1>
<EMI ID=242.1>
ensuite dissous dans 50 ml d'eau distillée et la solution
<EMI ID=243.1>
<EMI ID=244.1>
caractéristiques suivantes:
p. f. 145-55[deg.]C
<EMI ID=245.1>
Une solution de 2,85 g (0,010 mole) d'acide stéarique
<EMI ID=246.1>
<EMI ID=247.1>
cine A dans 40 ml d'acétone. La solution résultante a été ensuite évaporée sous vide à 40[deg.]C jusque ce qu'on obtienne un résidu solide qui, par cristallisation par acétone-hexane
<EMI ID=248.1>
caractérisée par:
p.f. 100-105[deg.]C (acétone-hexane n)
IR (KBr) 3470, 1730, 1455, 1375, 1340, 1160, 1105, 1050,
<EMI ID=249.1> EXEMPLE 27
<EMI ID=250.1>
solution ainsi obtenue 20 ml d'une solution aqueuse a 5% d'acide acétique. Le sel qui s'est formé a été filtré, lave
<EMI ID=251.1>
Une solution réchauffée en partie de 7,045 g (0,080 mole) d'éthylène carbonate dans 20 ml de benzène anhydre a été ajoutée goutte à goutte (pendant environ une heure) à un
<EMI ID=252.1>
A, 3,760 g de carbonate de potassium et 20 ml de benzène, agitée vigoureusement et réchauffée au reflux. A la fin de l'adjonction, le mélange de la réaction a été réchauffé au reflux pendant encore 15 minutes, et refroidi à la température ambiante. On a ensuite' ajouté sous agitation 40 ml d'eau. La phase benzénique a été séparée, lavée trois fois à l'eau, séchée sur Na2so4 anhydre et ensuite évaporée jusqu'à l'état
<EMI ID=253.1>
<EMI ID=254.1>
a été répétée plusieurs fois et le résidu en résultant a été ensuite purifié par chromatographie de répartition en colonne de gel de silice. On a r�uni les fractions contenant seule-
<EMI ID=255.1> <EMI ID=256.1>
On a préparé selon la même procédure les sels, les esters et les esters-sels correspondants des autres antibiotiques macrolides de l'invention.
Les nouveaux antibiotiques de l'invention, ainsi que les dérivés correspondants et cités ci-dessus, sont utilisés pour la préparation de compositions pharmaceutiques, surtout pour administration par voie orale, les produits étant obtenus au moyen de techniques pharmaceutiques classiques et en utilisant les excipients, véhicules, substances inertes, etc. habituels.
On peut ainsi réaliser des comprimés, des dragées, des capsules, des suspensions et des solutions contenant de 10 à
1000 mg de principe actif par dose, alors que-les dosages journaliers sont ceux qui sont naturellement adoptés pour
<EMI ID=257.1>
thromycine A, étant entendu que l'on procède de façon analogue pour les autres antibiotiques macrolides de la présente invention et que ces exemples ne doivent pas être considérés comme limitatifs de l'invention.
EXEMPLE 29
<EMI ID=258.1>
Préparation
On mélange do façon homogène les substances indiquées dans la formule et on procède au remplissage des capsules en gélatine dure selon la techniques habituelle.
Le contenu de chaque capsule est de 103 mg.
Chaque capsule contient 100 mg de principe actif.
EXEMPLE 30
<EMI ID=259.1>
Préparation
Môme technique que celle décrite à l'Exemple précédent.
<EMI ID=260.1>
<EMI ID=261.1>
EXEMPLE 31
<EMI ID=262.1>
Préparation
Même technique que celle décrite à l'Exemple précédent.
Chaque capsule contenant 515 mg de mélange de poudres correspond à 500 mg de principe actif.
EXEMPLE 32
<EMI ID=263.1>
Préparation
<EMI ID=264.1>
ne A, les parties d'amidon et de lactose et on procède à la granulation au moyen de la technique de granulation par voie humide, en utilisant comme liant la quantité restante d'amidon sous forme d'empois.
Le granulat séché est mélangé avec des lubrifiants et on procède à la compression. On obtient des comprimés pesant 190 mg.
Chaque comprime contient 100 mg de principe actif.
Les comprimés peuvent. être mis en cuvette et recouverts
<EMI ID=265.1>
Le poids des comprimas terminus est de 200 mg.
EXEMPLE 33
<EMI ID=266.1>
Préparation
Même technique que celle décrite à l'Exemple précédent.
<EMI ID=267.1>
actif.
EXEMPLE 34
<EMI ID=268.1>
Préparation
Même technique que celle décrite à l'exemple précèdent.
Chaque comprimé pesant 800 mg contient 500 mg de principe actif.
EXEMPLE 35
<EMI ID=269.1>
Préparation
Les ingrédients sont mélanges de façon intime et disposes
<EMI ID=270.1>
le réélit d'eau pour obtenir 60 ml de suspension, et on l'agita convenablement avant l'utilisation. La suspension reconstituée contient 10 my/ml de principe actif.
EXEMPLE 36
<EMI ID=271.1>
Préparation
Mené technique que celle décrite à l'Exemple précèdent. La suspension reconstitue contient 50 mg/ml de principe actif.
EXEMPLE 37
<EMI ID=272.1>
Préparation
On dispose dans un conteneur approprie muni d'un agitateur mécanique 90% de l'eau nécessaire à la préparation que
<EMI ID=273.1>
<EMI ID=274.1>
autres composants et on procède au remplissage des flacons
<EMI ID=275.1>
La suspension ainsi obtenue contient 50 mg/ml de principe actif.
<EMI ID=276.1>
<EMI ID=277.1>
Préparation
On utilise la même technique que décrite à l'Exemple précèdent: chayue ml de suspension contient 250 mg de principe actif.
EXEMPLE 39
<EMI ID=278.1>
Préparation
On utilise la même technique que celle qui a été décrite à l'Exemple 29. Le contenu par capsule est de 147 mg.
<EMI ID=279.1>
EXEMPLE 40
<EMI ID=280.1>
Préparation
On utilise la même technique que décrite à l'Exemple précèdent. Chaque capsule, qui contient 368 mg de poudres
<EMI ID=281.1>
fluoro�rythromycine A.
EXEMPLE 41
<EMI ID=282.1>
Préparation
On utilise la même technique que décrite à l'Exemple 32 qui précède.
On obtient des comprimés pesant 24 0 mg. Chaque comprimé
<EMI ID=283.1>
Les comprimés sont mis en cuvette et recouverts d'un film
<EMI ID=284.1>
mg.
EXEMPLE 42
<EMI ID=285.1>
Préparation
<EMI ID=286.1>
EXEMPLE 43
<EMI ID=287.1>
Préparation
On utilise la même technique que celle décrite à l'Exemple 35 qui précède.
<EMI ID=288.1>
dans de l'eau et après filtration stérile, on la soumet à lyophilisation. Le produit obtenu est subdivisé sous ambiance
<EMI ID=289.1>
Les antibiotiques macrolides de la présente invention ont été l'objet de recherches pharmacologiques en vue de déterminer:
- la puissance bactériostatique exprimée en tant que concentration inhibitrice minimale (MIC) sur des souches bactériennes aérobies et anaérobies Gram positives et Gram négatives, les résultats étant reports aux Tableaux 2 et 3. <EMI ID=290.1>
- le pouvoir bactéricide, exprimé en tant que concentration bactéricide minimale (MBC) sur certaines souches aérobics Gram positives (Tableau 5).
TABLEAU 2
<EMI ID=291.1>
<EMI ID=292.1>
P80206, P80207 et P80206 carbonate sur souches bactéricides aérobies et anaérobies, Gram positives et Gram négatives. Concentrations minimales inhibitrices exprimées en mcg/ml.
<EMI ID=293.1>
TABLEAU 2 (suite)
<EMI ID=294.1>
Pouvoir bactériostatique en terrain solide d'érythromicine A,
<EMI ID=295.1>
Concentrations minimales inhibitrices exprimées en mcg/ml.
<EMI ID=296.1>
TABLEAU 2 (suite)
<EMI ID=297.1>
Pouvoir bactériostatique en terrain solide d'érythromycine A, ërythromycine B, oléandomycine, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 et P80206 carbonate sur souches bactéricides aérobies et anaérobies, Gram positives et Gram négatives. Concentrations minimales inhibitrices exprimées en mcg/ml.
TABLEAU 2 (suite et fin)
<EMI ID=298.1>
Pouvoir bactériostatique en terrain solide d'érythromycine A, <EMI ID=299.1> �80206, P60207 et P80206 carbonate sur souches bactéricides aérobies et anaérobies, Gram positives et Gram négatives. Concentrations minimales inhibitrices exprimées en mcg/ml. TABLEAU 3
<EMI ID=300.1>
Pouvoir bactériostatique en terrain liquide
<EMI ID=301.1>
oléandomycine, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 et P80206 carbonate sur certaines souches aérobies Gram positives.
Concentrations minimales inhibitrices, exprimées en mcg/ml.
TABLEAU 3 (coite)
<EMI ID=302.1>
Pouvoir bactériostatique en terrain liquide
<EMI ID=303.1>
olôandomycine, P30202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 et P80206 carbonate sur certaines souches aérobies Gram positives.
Concentrations minimales inhibitrices, exprimées en mcg/ml.
<EMI ID=304.1>
<EMI ID=305.1>
Concentrations sériques de P80206 et d'érythromycine A base dans le rat après administration de 100 mg/kg par voie orale. Les valeurs aux divers moments de prélèvement correspondent à des mcg de produit par ml de sérum.
*'Le sérums des rats au moment 0 ne présentaient pas d'activi-
<EMI ID=306.1>
<EMI ID=307.1>
TABLEAU 5
<EMI ID=308.1>
<EMI ID=309.1>
oléandomycine, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 et P80206 carbonate
sur certaines souches aérobies Gram positives.
<EMI ID=310.1>
exprimées en mcg/ml ;
A côté est indiqué le rapport MBC/MIC.
<EMI ID=311.1>
<EMI ID=312.1>
<EMI ID=313.1>
oléandomycine, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 et P80206 carbonate sur certaines souches aérobies Gram positives
<EMI ID=314.1>
exprimées en mcg/ml ;
A côté est indiqué le rapport MBC/MIC
"Macrolide antibiotics, their preparation process and related microorganisms, their intermediates and pharmaceutical compositions containing them" <EMI ID = 1.1>
erythronolide B.
The subject of the invention is also a new microorganism useful for the production of the macrolide antibiotics of the invention, as well as the preparation process which
<EMI ID = 2.1>
known.
The present invention further relates to new intermediate products derived from erythronolide A,
<EMI ID = 3.1>
and the corresponding synthetic chemical procedure.
As indicated above, the new semisynthetic macrolide antibiotics of the present invention are useful as bactericidal agents, and in fact they exhibit, by comparison with erythromycins of known type, activity spectra of similar or more extensive levels. , they are less susceptible to degradation in an acid environment and it follows that they are better suited for oral absorption: their esters and their salt-esters as well as the corresponding carbonate derivatives (which can be obtained
<EMI ID = 4.1>
more complete by determining higher thematic levels and extended free bases; moreover, the carbonate derivatives are more active than the corresponding antibiotics.
The new antibiotics of the invention, due to the presence of the basic group, form addition salts either with organic acids or with inorganic acids.
<EMI ID = 5.1>
free base by conventional methods using for the preparation of basic antibiotic addition salts.
Salts that are not water soluble are used in
<EMI ID = 6.1>
monoesters of the new antibiotics and addition salts thereof can be further prepared
<EMI ID = 7.1>
tion of esters and ester salts of erythromycin A.
The esters and salt-esters of erythromycin A and their preparation methods are known in this field of the art. Examples of esters, salt-esters and
<EMI ID = 8.1>
butyrate, succinate, valerate, ethylsuccinate, lauryl sulfate propionate, stearate, lactobionate, glucoheptonate, sulfate, lauryl sulfate and the like, and among these lactobionate and glucoheptonate being water-soluble salts suitable for intravenous administration. Ethyl succinate for its part is suitable for both oral and parenteral administration (!.
The new antibiotics according to the invention are
<EMI ID = 9.1>
powder, more stable than C. rhythromycin A in aqueous solution at acidic pH, and moreover more stable in a gastric acid environment. The times of division nar two of the initial activity of erythromycin A and the macrolide antibiotics of the present invention, in solutions of various pH are given in Table 1 which follows.
<EMI ID = 10.1>
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1>
<EMI ID = 13.1>
NOTE: t 1/2 represents the duration of division nar two of the
<EMI ID = 14.1>
According to a first aspect of the invention, <EMI ID = 15.1>
obtain by direct fermentation and in significant quantities, and
<EMI ID = 16.1>
<EMI ID = 17.1>
can provide antibiotics without the disadvantages and problems present by erythromycin itself, while from the industrial point of view it appears to be very desirable to use them.
We have now discovered that the drifts of erythrono-
<EMI ID = 18.1>
erythronolide B which can be obtained chemically in a simple and industrially advantageous manner constitute useful substrates for fermentation processes which, using microorganisms derived by mutagenesis of strains capable of the microbiological production of erythromycin A, lead to the new macrolide antibiotics of the present invention, as will be described more specifically below.
The chemical process for preparing the new intermediate products according to the present invention is represented by the following diagram:
<EMI ID = 19.1>
DIAGRAM 1
<EMI ID = 20.1>
<EMI ID = 21.1>
where X represents H, or the group:
<EMI ID = 22.1>
and which is characterized by the stages consisting of:
a) the treatment of a compound (I) chosen from erythrono- <EMI ID = 23.1>
B with an anhydrous acid, such as glacial acetic acid or else a methanolic solution of hydroxylamine hydrochloride, to form compound II, namely B, 9-anhydroerythronolide A 6.9-hemacetal, 8.9-anhydroerythronolide B -6.9-hemycetal or 3-0-micarosyl-8.9-anhydroerythronolide B-6, 9hemiacetal; b) reacting the compound (II) with a reagent capable of generating electrophilic fluorine, preferably chosen from <EMI ID = 24.1> <EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
low temperature; c) the reaction of the compound (III) with hot aqueous acid, with formation of the compound (IV) desired.
Reference being made to step (b), that of the reagents of the class of fluoroxy-perfluoro-alkanes which is the most
<EMI ID = 27.1>
get it commercially,
Other reagents containing positively charged fluorine atoms which may be used in this reaction include
<EMI ID = 28.1>
and lead tetraacetate-hydrofluoric acid.
Among the reaction solvents, hydrocarbons are contemplated.
<EMI ID = 29.1>
11), chloroform, methylene chloride and the like, tetrahydroCuranne and mixtures thereof.
It is preferable to carry out the reaction at low temperature.
<EMI ID = 30.1>
continued.
The reaction usually ends after 15 minutes to about an hour.
<EMI ID = 31.1>
geables of the compound (IV) desired.
As regards the third stage (c) of the reaction, organic or inorganic aqueous acids are used, such as acetic acid or hydrochloric acid. For the reaction,
<EMI ID = 32.1>
reflux temperature. The product obtained (IV) is recovered in a purified form by recrystallization or chromatography.
Since the compounds (II), (III) and (IV) are new, they also constitute part of the subject of the invention.
The invention is based, in addition to the intermediary (IV), on <EMI ID = 33.1>
irradiation with UV or X-rays, biologically or similar.
<EMI ID = 34.1>
sant the compound (IV) as substrate leads to the production of new antibiotics tnacrolidcs of the class of erythromycins (8S) -8-fluorurates (scheme II: P-80202, P-80203, P-
<EMI ID = 35.1>
antibiotics having moreover specific coloring if they are treated with chromatic reagents and reheated, the first having a brick coloring (hot), the second and the fourth a dark purple coloring (after cooling) and the third a dark brown coloring (hot).
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
<EMI ID = 38.1>
<EMI ID = 39.1>
<EMI ID = 40.1>
Another object of the invention is a microbiological process for the preparation of new macrolide antibiotics from
<EMI ID = 41.1>
Diagram III:
<EMI ID = 42.1>
u
<EMI ID = 43.1>
(P-80207)
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
ATCC 31772 and Streptomyces antibioticus ATCC 31771 using the compounds (IV) as a substrate to obtain the desired antibiotics can be carried out in accordance with various fermentation techniques.
When fermentation is complete, various procedures can be used for the isolation and purification of antibiotics.
Recommended procedures for isolation and purification include solvent extraction techniques, either in batch form or in counter-current liquid-liquid extraction columns, and chromatography with gel penetration.
According to a preferred procedure, the antibiotics produced according to the present invention are recovered from the culture medium by separation of the mycelium and all the undissolved solid from the fermentation broth by conventional means such as filtration or centrifugation. Antibiotics are therefore extracted from the filtered broth and centrifuged using extraction techniques with countercurrent distribution or by working in batches. Solvent extraction can be carried out using a pH range of 8-10 and using a solvent as the solvent.
<EMI ID = 46.1>
include alcohol such as methanol, ethanol and the like, chlorinated hydrocarbons such as chloroform,
<EMI ID = 47.1>
prefer.
The final purification of the antibiotics mentioned can be carried out by chromatography on permeable gel.
After filtration or centrifugation of the fermentation medium, it is possible to use thin layer chromatography or high pressure liquid phase chromatography to individualize by analysis the antibiotics in question.
It is also possible to advantageously use the technique of bioautography.
The examples which follow are nonlimiting examples of the invention.
EXAMPLE 1
<EMI ID = 48.1>
erythromycin was subjected to mutagenic treatment with ultraviolet rays (maximum emission 250 nm) at a dose sufficient to kill approximately 99.6% of
<EMI ID = 49.1>
containing nutrient soil and the colonies obtained were analyzed for their inability to produce
<EMI ID = 50.1>
The mutants blocked during the synthesis of erythromycin (approximately 2% of the survivors) were therefore analyzed with regard to their capacity to recognize and transform the compound (IV) as a substrate in new compounds with antibiotic activity.
EXEMPK 2
<EMI ID = 51.1>
(II).
A solution of 4.185 g (0.01 mole) of erythronolide A (I) described by R.A. Le Mahieu et al in J. Med. Chem. 17, <EMI ID = 52.1> at rest for two hours at room temperature. The acetic acid was then replaced under vacuum at the temperature of
<EMI ID = 53.1>
shape. The chloroform solution was washed with saturated sodium bicarbonate solution and then with water until neutral and finally subjected to drying over Na-SO. After removal of the solvent under vacuum, a crude product was obtained which was purified on a column of gel
<EMI ID = 54.1>
(1: 1). Elution with methylene chloride methanol (98: 2) made it possible to obtain fractions containing only
<EMI ID = 55.1>
dry ration of these combined fractions and by successive crystallization with acetone n-hexanc, 2.750 g of compound (II) were obtained having the following characteristics:
m.p. 188-193 [deg.] C
<EMI ID = 56.1>
IR (Kl3r) 3630, 3520, 2495, 1710, 1465, 1450, 1440, 1400,
1370, 1350, 1310, 1235, 1230, 1200, 1170, 1140, 1090, 1075,
1060, 1050, 1035, 1020, 1010, 1000, 970, 950, 940, 920, 905,
<EMI ID = 57.1>
calculated (in percentage) C 62.97; H 9.06
finds (in percentage) C 63.12; H 9.10
EXAMPLE 3
<EMI ID = 58.1>
A solution of fluoroxy trifluorom tha thane was prepared in CC13F at -80 [deg.] C: an excess of CF, OF (only about 2
<EMI ID = 59.1>
80 [deg.] C on dry ice) by slowly adding gas through a drain tube (while the cylinder containing
<EMI ID = 60.1>
magnetic stirring with calcium oxide (1,920 g) to remove hydrofluoric acid. The progress of the reaction was periodically checked by chromatography
<EMI ID = 61.1>
tion of the peak of the characteristic of composa II.
After disappearance (or sharp reduction) of the peak of compound II, stirring was continued for 5 minutes and nitrogen gas was bubbled through the solution to
<EMI ID = 62.1>
After removing the solvent, a solid residue was obtained which was then purified by chromatography on a column of silica gel (ratio 1:50) prepared in
<EMI ID = 63.1>
increasing concentrations of methanol in methylene chloride gave: fractions containing only (8S) -8-
<EMI ID = 64.1>
3.435 g having the following characteristics:
m.p. 192-3 [deg.] C
<EMI ID = 65.1>
UV (methanol); no absorption corresponding to a ketone group.
<EMI ID = 66.1>
mg with the following characteristics:
m.p. 239-40 [deg.] C
<EMI ID = 67.1>
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
By proceeding in a similar manner to Example 3, but starting from a solution containing 3.845 g (0.010 mol) of 8.9-
<EMI ID = 70.1>
US Patent No. [deg.] 3,697,547), a crude product was obtained which, by crystallization with acetone-hexane, gave 3,450 g of (SS) - <EMI ID = 71.1>
UV (methanol); no absorption corresponding to a ketone group;
IR (KBr) 3540, 3450, 1735, 1460, 1260, 1170, 1060, 1035, 980,
<EMI ID = 72.1>
When the mother liquors have been purified by chromatography on a silica gel column (ratio 1:50) with
<EMI ID = 73.1>
obtained 75 mg of a second product (8S) -8-fluoroGrythronolide B
(IV) having the following characteristics:
m.p. 247-8 [deg.] C
<EMI ID = 74.1> <EMI ID = 75.1>
<EMI ID = 76.1>
fall back to 110 [deg.] C for 15 minutes with stirring, and we have
<EMI ID = 77.1>
110 [deg.] C, all the starting material was dissolved. The heating was continued for half an hour and the solution was
<EMI ID = 78.1>
sodium sulfate, was evaporated to dryness and under vacuum.
When the crude product has been purified by column chromatography on silica gel (ratio 1:50) with
<EMI ID = 79.1>
chemico-physical equal to the product (IV) isolated in Example 4.
EXAMPLE 6
<EMI ID = 80.1>
<EMI ID = 81.1>
ambient a solution of 5.465 g (0.010 mol) of 3-0-micarosylerythronolide B (I), described by J.R. Martin in Biochemistry, 5, 2852 (1966), in 32 ml of glacial acetic acid.
The acetic acid was then placed under vacuum at the
<EMI ID = 82.1>
chloroform. The chloroform solution was washed with saturated sodium bicarbonate solution and then with water
<EMI ID = 83.1>
After removal of the vacuum solvent, a crude product was obtained which was purified on a column of silica gel
(ratio 1: 100) prepared in chloroform.
Elution with increasing concentrations of mGthanol in chloroform made it possible to obtain fractions containing
<EMI ID = 84.1> <EMI ID = 85.1>
<EMI ID = 86.1>
your:
<EMI ID = 87.1>
found (in percentage) C 63152; H 9109
EXAMPLE 7
<EMI ID = 88.1>
through a drain tube (while the cylinder containing CF30F was continuously weighed on a Sartorius electric scale).
<EMI ID = 89.1>
calcium (1,920 g) to keep hydrofluoric acid away.
The course of the reaction was periodically monitored.
<EMI ID = 90.1>
relationship with the disappearance of the characteristic peak of compound II.
After disappearance (or significant reduction) of the peak relating to composa II, the stirring was continued for 5 minutes and nitrogen gas was gurgled through
<EMI ID = 91.1>
Removal of the solvent made it possible to obtain a solid residue which was then purified by chromatography on a column of silica gel (ratio 1: 100) prepared in chloroform.
Elution with increasing concentrations of methanol in chloroform gave fractions containing only-
<EMI ID = 92.1>
After evaporation to dryness of the fractions containing compound III and their crystallization with acetone, 1.100 g was obtained having the following characteristics:
m.p. 175-7 [deg.] C
<EMI ID = 93.1>
<EMI ID = 94.1>
cStone
IR (KBr) 3540, 3490, 1720, 1460, 1395, 1380, 1365, 1355,
1330, 1320, 1290, 1275, 1265, 1245, 1205, 1185, 1165, 1145,
1120, 1100, 1080, 1060, 1045, 1015, 1005, 990, 960, 940, 925,
<EMI ID = 95.1>
250 mg with the following characteristics:
m.p. 214-5 [deg.] C
<EMI ID = 96.1>
1465, 1380, 1365, 1340, 1300, 1275, 1250, 1180, 1115, 1080, <EMI ID = 97.1>
6.9; 9.11-acetal (III).
A mixed forma was maintained by 6.560 g (0.012 mole)
<EMI ID = 98.1>
(III) and 3000 ml of an aqueous solution (pH = 3) of acdtic acid at room temperature with stirring until complete solution, then 220 ml of acetic acid were added.
The solution was kept stirring at room temperature until complete disappearance of the starting product (III) (the control was carried out by liquid phase chromatography and at high pressure), made neutral with
<EMI ID = 99.1>
The ethyl acetate solution, after anhydrification on sodium sulfate, was evaporated to dryness and under vacuum.
<EMI ID = 100.1>
a product with chemical-physical characteristics
<EMI ID = 101.1>
EXAMPLE 9
<EMI ID = 102.1>
of an aqueous solution (pH = 3) of acetic acid at 110 [deg.] C for 15 minutes with stirring, then 220 ml of acetic acid were added.
After one hour at 110 [deg.] C, all of the starting material was dissolved.
We continued to heat for half an hour and the solution was then cooled as quickly as possible <EMI ID = 103.1>
te with ethyl acetate.
The ethyl acetate solution, after anhydrification on
<EMI ID = 104.1>
thronolidc A (IV).
Repeating the reaction on the recovered starting material and the subsequent cliroimatographiclue purification, it was possible to obtain other fractions containing (SS) -8-
<EMI ID = 105.1>
nolide A (IV) having the same characteristics which are
<EMI ID = 106.1>
EXAMPLE 10
<EMI ID = 107.1>
A culture seeded with Streptomyces erythreus ATCC
31772, a mutant blocked in the biosynthesis of erythromycin, was prepared in a medium constituted by (in grams per liter): sucrose 30.0; cane molasses 8.0; oil
<EMI ID = 108.1>
The culture was incubated at 33 [deg.] C for 48 hours on a rotary shaker. The inoculum was added to a
<EMI ID = 109.1>
containing 30 ml of a fermentation medium having the following composition in. grams per liter: corn dextrin 3.0; crude corn starch 40.0; soybean meal 30.0;
<EMI ID = 110.1> rotary (22U t.p.m., stroke 4 cm) for 24 hours. We have
<EMI ID = 111.1>
<EMI ID = 112.1>
(UPLC).
At the end of fermentation, a sample of the fermentation broth having an activity of about 900-1000 mcg / ml
<EMI ID = 113.1>
the supernatant was clarified by adding equal volumes of a 10% (W / V) aqueous solution of sodium hydroxide. After centrifugation, the clear supernatant liquid was extracted by vortexing with one third of its volume of ethyl acetate.
<EMI ID = 114.1>
A sample of the organic part was deposited on a plate of silica gel G and developed in CH2C12-
<EMI ID = 115.1>
these exhibit different chromatic reactions after application of a sprayed reagent and heating:
dark brown (warm) for the slowest compound
(antibiotic P-80205), and dark purple color (after cooling) for the other compound (antibiotic P-80206).
<EMI ID = 116.1> <EMI ID = 117.1>
0.87 (P-80206).
EXAMPLE 11
<EMI ID = 118.1>
According to the process described in Example 10 above, various fermentations representing a total volume of 2100 ml, to which had been added 1.00 g of
<EMI ID = 119.1>
The solid was washed with water and the combined filtrates were adjusted to a pH of 5.5 with acetic acid. The acidic aqueous solution was extracted three times using
<EMI ID = 120.1>
the water.
After drying (Na2SO4) and removing the solvent under vacuum, the residue was purified by column distribution chromatography on silica gel according to the procedure indicated by N.L. Oleinick in J. Biol. Chem. flight. 244, n [deg.] 3, page
727 (1969).
Fractions 90-174 containing only the antibiotic P-80206 were combined and evaporated to dryness at 40 [deg.] C. The residue
<EMI ID = 121.1>
the following features:
m.p. 183-4 [deg.] C <EMI ID = 122.1>
1400, 1370, 1345, 1330, 1305, 1280, 1190, 1170, 1120, 1090, <EMI ID = 123.1>
890, 870, 855, 835, 800 (this spectrum is shown in Figure 1).
<EMI ID = 124.1>
<EMI ID = 125.1>
Fractions 280-400 containing only the antibiotic
<EMI ID = 126.1>
both the following characteristics:
m.p. 217-8 [deg.] C
<EMI ID = 127.1>
IR (KBr) 3550, 3500, 3440 (shoulder), 3300 (wide), 1730,
1455, 1425, 1410, 1380, 1360, 1340, 1330, 1305, 1280, 1270,
1245, 1200 (shoulder), 1170 (wide), 1115, 1090, 1075,
1060, 1030, 1010, 1000, 980 (shoulder), 965, 955, 945, 935,
920, 905, 895, 870, 840, 830, 810 (the corresponding spectrum being represented in FIG. 2).
<EMI ID = 128.1>
After 24 hours at 28 [deg.] C on a rotary shaker, this culture
<EMI ID = 129.1>
concentration of 2% (V / V) and it was then incubated under the same conditions for 16 hours.
This inoculum was added at a concentration of 3% (V / V) <EMI ID = 130.1>
fermentation medium with the following composition (in grams per liter):
<EMI ID = 131.1>
3.0; dry brewer's yeast 2.0; CaC03 20.0.
The matras used for the fermentation were incubated at 28 [deg.] C on a rotary shaker (240 rpm, stroke of
<EMI ID = 132.1>
A (IV) in finely subdivided form were added to each flask and the incubation with shaking was continued for 64 hours.
At the end of this period, the title of culture expressed
<EMI ID = 133.1>
treatment of the fermentation broth by TLC analysis was carried out according to the system and the conditions indicated in Example 10.
TLC CONTROL
According to the technique indicated in Example 10, a new active compound was detected (antibiotic P-80207) which indicates the disappearance of the substrate which has been added. Its Rf
<EMI ID = 134.1>
In accordance with the technique indicated in Example 10, the new active compound (antibiotic P-80207) has a retention time with respect to erythromycin A of 0.69 and with respect to oleandomycin of 0.95.
EXAMPLE 13
<EMI ID = 135.1>
Supercell for 30 min. and with stirring, the mixture was filtered. The solid was washed with water-methanol (1: 1) and the combined filtrates were evaporated under reduced pressure to half the starting volume.
The amount of solution was adjusted to 8.2 by addition of KOH and the solution was extracted three times in quantities
<EMI ID = 136.1>
was evaporated to dryness and under vacuum. The residue was purified by distribution chromatography on a column of silica gel according to the procedure indicated in Example 11.
Fractions 45-80 containing only the antibiotic P-
80207 were combined and brought to dryness and vacuum at 40 [deg.] C. The solid residue was crystallized from absolute ethanol
<EMI ID = 137.1>
8-fluoroerythronolide A (P-80207) having the following characteristics:
p. f. 155-7 [deg.] C
<EMI ID = 138.1>
IR (KBr) 3480 (wide), 1730, 1510, 1380, 1340 (wide), 1305,
1275, 1195, 1165, 1105, 1095, 1075, 1050, 1030, 1010, 1000,
980, 960 (shoulder), 935, 915, 895, 875, 930 (this spectrum being shown in Figure 3).
<EMI ID = 139.1>
calculated (percent) C 58.60; H 8.74; F 2.57; N 1.90 found (in percentage) C 58.52; H 8.75; F 2.63; N 1.95
EXAMPLE 14
<EMI ID = 140.1>
30 ml of a fermentation medium having the following composition <EMI ID = 141.1>
rotary shaker (220 rpm; 4 cm stroke) for 24 hours.
To each flask were added 15 my of (8S) -8-fluoro-
<EMI ID = 142.1>
sat under ultraviolet light for 15 minutes and the incu-
<EMI ID = 143.1>
Sample treatment by chromatography on
<EMI ID = 144.1>
<EMI ID = 145.1>
a sample of the fermentation broth having activity
<EMI ID = 146.1> <EMI ID = 147.1>
<EMI ID = 148.1>
sodium xyde. After centrifugation, the clear supernatant was extracted by vortexing with one third of its volume of ethyl acetate.
TLC CONTROL
A sample of the organic part was deposited on a plate of silica gel G and developed in CH2C12-
<EMI ID = 149.1>
(Sarcina lutea) ATCC 9341.
<EMI ID = 150.1>
<EMI ID = 151.1>
of the two active compounds whose Rst value with respect to erythromycin A is 0.9 and 1.13 respectively (0.85
<EMI ID = 152.1>
In addition, they exhibit different chromatic reactions after application of a sprayed reagent and when they have been reheated: dark brown color (hot). <EMI ID = 153.1>
dark (after cooling) for the other component (antibiotic P-80203).
I1PLC CONTROL
A sample of the organic part was evaporated at
<EMI ID = 154.1>
Two peaks were found with a retention time with respect to erythromycin A of 0.79 (P-80202) and 1.06 (P-80203).
EXAMPLE 15
<EMI ID = 155.1>
According to the process described in Example 14 which precedes, various fermentations with a total volume of ml 2100 and aux-
<EMI ID = 156.1>
B were filtered under vacuum after addition with stirring of Hyflo Supercell (4% weight / volume). The solid has been washed
<EMI ID = 157.1>
<EMI ID = 158.1>
tone.
These last organic extracts have been combined and washed
<EMI ID = 159.1>
removal of the solvent under vacuum, the residue was purified by means of column distribution chromatography on silica gel according to the procedure indicated by N.L. Oleinick in J. Biol. Chem. Flight. 244, n [deg.] 3, page 727 (1969).
Fractions 18-32 containing only the antibiotic P-
<EMI ID = 160.1>
<EMI ID = 161.1>
150 mg of (8S) -8-fluoroerythromycin B (P-80203) having the following characteristics:
m.p. 164-6 [deg.] C <EMI ID = 162.1>
IR (KBr) 3480 (large), 1735, 1465, 1435, 1385, 1375, 1330,
1305, 1280, 1170, 1115, 1090, 1U75, 1055, 1035, 1020, 1000,
<EMI ID = 163.1>
found (in percentage) C 60.31; H 9.09; F 2.60; N 1.88
Fractions 55-105 containing only the antibiotic
<EMI ID = 164.1>
The solid residue by crystallization from absolute ethanol has
<EMI ID = 165.1>
feeling the following characteristics:
m.p. 213-15 [deg.] C
<EMI ID = 166.1>
IR (KBr) 3600, 3520, 3300 (large), 1730, 1460, 1420, 1385,
1370, 1355, 1345, 1330, 1310, 1275, 1190, 1160, 1120, 1100,
1060, 1040, 1030, 1010, 1000, 995, 975, 960, 935, 920, 910,
<EMI ID = 167.1>
<EMI ID = 168.1>
<EMI ID = 169.1>
found (in percentage) C 59.87; H 8.85; F 2.63; N 1.88
EXAMPLE 16
<EMI ID = 170.1>
ATCC 31771, mutant blocked in the biosynthesis of oleandomycin, was prepared in a medium constituted (in grams per liter of deionized water) by seed flour.
<EMI ID = 171.1>
concentration of 2% (V / V) and it was then incubated under the same conditions for 16 hours.
1 <EMI ID = 172.1>
<EMI ID = 173.1>
fermentation medium with the following composition (in grams per liter):
<EMI ID = 174.1>
<EMI ID = 175.1>
28 [deg.] C on rotary shaker (240 rpm, stroke 4 cm) during
<EMI ID = 176.1>
in finely subdivided form were added to each flask and the shaking incubation was continued for 64 hours.
At the end of this period, the title of the culture expressed
<EMI ID = 177.1>
fermentation broth by the TLC analysis process was
<EMI ID = 178.1>
ple 14.
TLC CONTROL
According to the technique indicated in Example 14, a new active compound (antibiotic P-30204) was identified which follows the
<EMI ID = 179.1>
HPLC CONTROL
According to the technique indicated in Example 14, the new active compound (antibiotic P-80204) has a retention time with respect to Orythromycin B of 0.62 and by
<EMI ID = 180.1>
EXAMPLE 17
<EMI ID = 181.1>
The total broth culture derived from 50 fermentations carried out in Erlenmeyer flasks, shaken and carried out as indicated in Example 16 above, was treated with an equal volume of methanol. After adding Hyflo
<EMI ID = 182.1>
filtered. The solid was washed with water-methanol (1: 1) and the combined filtrates were evaporated under reduced pressure <EMI ID = 183.1>
<EMI ID = 184.1>
empty. The residue was purified by distribution chromatography in a silica gel column according to the process indicated in. Example 15.
Fractions 17-42 containing only the antibiotic P-
<EMI ID = 185.1>
1: 1 and allied with the same solvent,
Fractions containing only the new antibiotic
<EMI ID = 186.1>
to give, after crystallization with acetone-hexane 170 mg
<EMI ID = 187.1>
B (P-80204) having the following characteristics:
m.p. 195-6 [deg.] C
<EMI ID = 188.1>
IR (KBr) 3600, 3440 (wide), 3250 (wide), 1730, 1455, 1400,
1380, 1365, 1350, 1325, 1305, 1270, 1255, 1180, 1160, 1145,
1100, 1060, 1040, 1010, 995, 975, 960, 935, 915, 890, 875,
<EMI ID = 189.1>
found (in percentage) C 59.94; H 9.06; F 2.69; N 1.83
EXAMPLE 18
<EMI ID = 190.1>
The culture was incubated at 33 [deg.] C for 48 hours on
<EMI ID = 191.1>
The fermentation matras were incubated at 33 [deg.] C on
<EMI ID = 192.1>
hours.
To each flask were added 20 mg of 3-0-micarosyl-
<EMI ID = 193.1>
aimed and sterilized under ultraviolet light for 15 minutes, and the incubation with shaking was continued for 96 hours.
Sample treatment by chromatography on
<EMI ID = 194.1>
high pressure (HPLC): at the end of the fermentation period, a sample of the fermentation broth having an activity of about 900-1000 mcg / ml (titre expressed as erythromycin A) was centrifuged and the supernatant was clarified <EMI ID = 195.1>
<EMI ID = 196.1>
of sodium. After centrifugation, the clear supernatant was extracted by vortexing with one third of its volume of ethyl acetate.
TLC CONTROL
A sample of the gold part � aniqu � was deposited on a silica gel plate G and developed in
<EMI ID = 197.1>
acetic (85: 0.5: 5: 10) and the active compounds were revealed by bioauto & caphic on plates inoculated with Micrococcus luteus (Sarc'ina lutca) ATCC 9341.
TLC test results show disappearance
<EMI ID = 198.1> the disappearance of the two active compounds whose values of
<EMI ID = 199.1>
B).
Furthermore, they exhibited different chromatic reactions after application of a sprayed reagent after having
<EMI ID = 200.1>
<EMI ID = 201.1>
dark (after cooling) for the other component (antibiotic P-80203).
<EMI ID = 202.1>
nytrile 36:64; flow of 2 ml / min; column temperature 40 [deg.] C). We were able to highlight two peaks with a retention time
<EMI ID = 203.1>
1.06 (P-80203).
EXAMPLE 19
<EMI ID = 204.1>
According to the process described in Example 18 which proceeds, various fermentations representing a total volume of 2100
<EMI ID = 205.1>
<EMI ID = 206.1>
The solid was washed with water and the combined filtrates
<EMI ID = 207.1>
The acidic aqueous solution was extracted three times with equal volumes of ethyl acetate. The aqueous phase was evaporated under reduced pressure to a volume of 1000 ml,
<EMI ID = 208.1>
removal of the solvent under vacuum, the residue was purified by column distribution chromatography on silica gel <EMI ID = 209.1>
<EMI ID = 210.1>
Fractions 23-38 containing only the antibiotic
<EMI ID = 211.1>
40 [deg.] C.
<EMI ID = 212.1>
both the following characteristics:
m.p. 164-6 [deg.] C
<EMI ID = 213.1>
IR (KBr) 3480 (large) 1735, 1465, 1435, 1385, 1375, 1330,
1305, 1280, 1170, 1115, 1090, 1075, 1055, 1035, 1020, 1000,
<EMI ID = 214.1>
<EMI ID = 215.1>
<EMI ID = 216.1>
Fractions 65-120 containing only the antibiotic P-80202 were combined and brought to dryness and vacuum at 40 [deg.] C. The solid residue by crystallization with absolute ethanol has
<EMI ID = 217.1>
the following features:
m.p. 213-15 [deg.] C
<EMI ID = 218.1>
1370, 1355, 1345, 1330, 1310, 1275, 1190, 1160, 1120, 1100,
1060, 1040, 1030, 1010, 1000, 995, 975, 960, 935, 920, 910,
<EMI ID = 219.1>
Rhythmromycin in 30 ml of anhydrous acetone containing 3.760 g of sodium bicarbonate was added 1.23 ml (0.013 mole) of acetic anhydride. The mixture was kept under stirring at 25 [deg.] C for 2 hours and then poured into water containing
<EMI ID = 220.1>
with chloroform, washed quickly with saturated sodium bicarbonate solution and then with water.
<EMI ID = 221.1>
anhydrous and evaporated to dry vacuum to give 7.545 g of solid residue.
<EMI ID = 222.1>
IR (KBr) 3480, 1740, 1455, 1370, 1340, 1280, 1235, 1160,
1110, 1085, 1050, 1030, 1010, 995, 975, 955, 930, 890, 870,
<EMI ID = 223.1>
rhythmromycin propionate by esterification with propionic anhydride The final product had the characteristics
<EMI ID = 224.1>
IR (KBr) 3480, 1735, 1455, 1375, 1340, 1180 (shoulder),
<EMI ID = 225.1>
<EMI ID = 226.1>
EXAMPLE 22
<EMI ID = 227.1>
rhythmromycin A butyrate by esterification with butyric anhydride. The final product had the following characteristics:
<EMI ID = 228.1>
IR (KBr) 3490, 1740, 1455, 1370, 1340, 1180 (shoulder),
1160, 1085, 1050, 1030, 1010, 995, 975, 955, 930, 890, 865,
<EMI ID = 229.1>
nate.
<EMI ID = 230.1>
ethyl succinile chloride. The final product had the following characteristics:
<EMI ID = 231.1>
IR (KBr) 3480, 1735, 1450, 1370, 1345, 1190 (shoulder),
<EMI ID = 232.1>
EXAMPLE 24
Preparation of (8S) -8-fluoro, Rhythromycin A succinate.
A solution containing 7.520 g (0.010 mole) of (85) -8-
<EMI ID = 233.1>
in 37.5 ml of anhydrous acetone was warmed to 80 [deg.] C for 15 minutes, cooled and kept at room temperature for 2 hours. Then proceed according to Example 20 until a solid residue of 7.565 g is obtained. By crystallization of the solid with ethyl ether, we have
<EMI ID = 234.1>
having the following characteristics:
<EMI ID = 235.1>
<EMI ID = 236.1>
IR (KBr) 3450, 1730, 1575, 1455, 1370, 1340, 1190 (shoulder- 1 ment), 1160, 1050, 990, 975, 950, 930, 885, 860, 825, 800 cm ', <EMI ID = 237.1>
<EMI ID = 238.1>
EXAMPLE 25
<EMI ID = 239.1>
<EMI ID = 240.1>
rhythmromycin A in 40 ml of acetone.
<EMI ID = 241.1>
<EMI ID = 242.1>
then dissolved in 50 ml of distilled water and the solution
<EMI ID = 243.1>
<EMI ID = 244.1>
following features:
p. f. 145-55 [deg.] C
<EMI ID = 245.1>
2.85 g (0.010 mole) solution of stearic acid
<EMI ID = 246.1>
<EMI ID = 247.1>
cine A in 40 ml of acetone. The resulting solution was then evaporated in vacuo at 40 [deg.] C until a solid residue was obtained which, by crystallization with acetone-hexane
<EMI ID = 248.1>
characterized by:
m.p. 100-105 [deg.] C (acetone-hexane n)
IR (KBr) 3470, 1730, 1455, 1375, 1340, 1160, 1105, 1050,
<EMI ID = 249.1> EXAMPLE 27
<EMI ID = 250.1>
solution thus obtained 20 ml of an aqueous solution containing 5% acetic acid. The salt that has formed has been filtered, washed
<EMI ID = 251.1>
A partially warmed solution of 7.045 g (0.080 mole) of ethylene carbonate in 20 ml of anhydrous benzene was added dropwise (over about an hour) to a
<EMI ID = 252.1>
A, 3.760 g of potassium carbonate and 20 ml of benzene, stirred vigorously and heated to reflux. At the end of the addition, the reaction mixture was warmed to reflux for another 15 minutes, and cooled to room temperature. 40 ml of water were then added with stirring. The benzene phase was separated, washed three times with water, dried over anhydrous Na2so4 and then evaporated to the state
<EMI ID = 253.1>
<EMI ID = 254.1>
was repeated several times and the resulting residue was then purified by column chromatography on silica gel. We joined the fractions containing only-
<EMI ID = 255.1> <EMI ID = 256.1>
The corresponding salts, esters and ester-salts of the other macrolide antibiotics of the invention were prepared according to the same procedure.
The new antibiotics of the invention, as well as the corresponding derivatives and cited above, are used for the preparation of pharmaceutical compositions, especially for oral administration, the products being obtained by means of conventional pharmaceutical techniques and by using the excipients , vehicles, inert substances, etc. usual.
It is thus possible to produce tablets, dragees, capsules, suspensions and solutions containing from 10 to
1000 mg of active ingredient per dose, whereas the daily dosages are those which are naturally adopted for
<EMI ID = 257.1>
thromycin A, it being understood that the procedure is analogous to the other macrolide antibiotics of the present invention and that these examples should not be considered as limiting the invention.
EXAMPLE 29
<EMI ID = 258.1>
Preparation
The substances indicated in the formula are mixed homogeneously and the capsules are filled with hard gelatin according to the usual techniques.
The content of each capsule is 103 mg.
Each capsule contains 100 mg of active ingredient.
EXAMPLE 30
<EMI ID = 259.1>
Preparation
Same technique as that described in the previous example.
<EMI ID = 260.1>
<EMI ID = 261.1>
EXAMPLE 31
<EMI ID = 262.1>
Preparation
Same technique as that described in the previous Example.
Each capsule containing 515 mg of powder mixture corresponds to 500 mg of active principle.
EXAMPLE 32
<EMI ID = 263.1>
Preparation
<EMI ID = 264.1>
ne A, the starch and lactose parts and granulation is carried out by means of the wet granulation technique, using the remaining amount of starch as a binder as a binder.
The dried aggregate is mixed with lubricants and compression takes place. Tablets weighing 190 mg are obtained.
Each tablet contains 100 mg of active ingredient.
Tablets can. be placed in a bowl and covered
<EMI ID = 265.1>
The weight of the terminated tablets is 200 mg.
EXAMPLE 33
<EMI ID = 266.1>
Preparation
Same technique as that described in the previous Example.
<EMI ID = 267.1>
active.
EXAMPLE 34
<EMI ID = 268.1>
Preparation
Same technique as that described in the previous example.
Each 800 mg tablet contains 500 mg of active ingredient.
EXAMPLE 35
<EMI ID = 269.1>
Preparation
The ingredients are intimately mixed and arranged
<EMI ID = 270.1>
re-elect water to obtain 60 ml of suspension, and shake well before use. The reconstituted suspension contains 10 my / ml of active ingredient.
EXAMPLE 36
<EMI ID = 271.1>
Preparation
Carried out technique as that described in the Example above. The reconstituted suspension contains 50 mg / ml of active ingredient.
EXAMPLE 37
<EMI ID = 272.1>
Preparation
90% of the water necessary for the preparation is placed in a suitable container fitted with a mechanical stirrer.
<EMI ID = 273.1>
<EMI ID = 274.1>
other components and the bottles are filled
<EMI ID = 275.1>
The suspension thus obtained contains 50 mg / ml of active principle.
<EMI ID = 276.1>
<EMI ID = 277.1>
Preparation
The same technique as described in the preceding Example is used: each ml of suspension contains 250 mg of active principle.
EXAMPLE 39
<EMI ID = 278.1>
Preparation
The same technique is used as that described in Example 29. The content per capsule is 147 mg.
<EMI ID = 279.1>
EXAMPLE 40
<EMI ID = 280.1>
Preparation
The same technique is used as described in the preceding Example. Each capsule, which contains 368 mg of powders
<EMI ID = 281.1>
fluoro, Rhythmromycin A.
EXAMPLE 41
<EMI ID = 282.1>
Preparation
The same technique is used as described in Example 32 above.
Tablets weighing 24 0 mg are obtained. Each tablet
<EMI ID = 283.1>
The tablets are placed in a bowl and covered with a film
<EMI ID = 284.1>
mg.
EXAMPLE 42
<EMI ID = 285.1>
Preparation
<EMI ID = 286.1>
EXAMPLE 43
<EMI ID = 287.1>
Preparation
The same technique is used as that described in Example 35 above.
<EMI ID = 288.1>
in water and after sterile filtration, it is subjected to lyophilization. The product obtained is subdivided under atmosphere
<EMI ID = 289.1>
The macrolide antibiotics of the present invention have been the subject of pharmacological research in order to determine:
- the bacteriostatic power expressed as minimum inhibitory concentration (MIC) on aerobic and anaerobic bacterial strains Gram positive and Gram negative, the results being reported in Tables 2 and 3. <EMI ID = 290.1>
- bactericidal power, expressed as minimum bactericidal concentration (MBC) on certain aerobic Gram positive strains (Table 5).
TABLE 2
<EMI ID = 291.1>
<EMI ID = 292.1>
P80206, P80207 and P80206 carbonate on aerobic and anaerobic bactericidal strains, Gram positive and Gram negative. Minimum inhibitory concentrations expressed in mcg / ml.
<EMI ID = 293.1>
TABLE 2 (continued)
<EMI ID = 294.1>
Bacteriostatic power in solid soil of erythromicin A,
<EMI ID = 295.1>
Minimum inhibitory concentrations expressed in mcg / ml.
<EMI ID = 296.1>
TABLE 2 (continued)
<EMI ID = 297.1>
Bacteriostatic power in solid ground of erythromycin A, erythromycin B, oleandomycin, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 and P80206 carbonate on aerobic and anaerobic bactericidal strains, Gram positive and Gram negative. Minimum inhibitory concentrations expressed in mcg / ml.
TABLE 2 (continuation and end)
<EMI ID = 298.1>
Bacteriostatic power in solid soil of erythromycin A, <EMI ID = 299.1> � 80206, P60207 and P80206 carbonate on aerobic and anaerobic bactericidal strains, Gram positive and Gram negative. Minimum inhibitory concentrations expressed in mcg / ml. TABLE 3
<EMI ID = 300.1>
Bacteriostatic power in liquid soil
<EMI ID = 301.1>
oleandomycin, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 and P80206 carbonate on certain aerobic Gram positive strains.
Minimum inhibitory concentrations, expressed in mcg / ml.
TABLE 3 (coite)
<EMI ID = 302.1>
Bacteriostatic power in liquid soil
<EMI ID = 303.1>
olôandomycin, P30202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 and P80206 carbonate on certain aerobic Gram positive strains.
Minimum inhibitory concentrations, expressed in mcg / ml.
<EMI ID = 304.1>
<EMI ID = 305.1>
Serum concentrations of P80206 and erythromycin A in the rat after administration of 100 mg / kg orally. The values at the various sampling times correspond to mcg of product per ml of serum.
* 'The sera of rats at time 0 showed no activity
<EMI ID = 306.1>
<EMI ID = 307.1>
TABLE 5
<EMI ID = 308.1>
<EMI ID = 309.1>
oleandomycin, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 and P80206 carbonate
on certain aerobic Gram positive strains.
<EMI ID = 310.1>
expressed in mcg / ml;
Next to it is indicated the MBC / MIC ratio.
<EMI ID = 311.1>
<EMI ID = 312.1>
<EMI ID = 313.1>
oleandomycin, P80202, P80203, P80204, P80205, P80206, P80207 and P80206 carbonate on certain aerobic Gram positive strains
<EMI ID = 314.1>
expressed in mcg / ml;
Next to it is indicated the MBC / MIC ratio