【発明の詳細な説明】
Microlonospora Carbonacea由来の新規オルトソマイシン
発明の要旨
化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＪを、微生物Micromonospora
Carbonacea var Africana（SCC 2146と命名）の発酵ブロス（broth）から単離
した。これらの化合物は、オルトソマイシン（orthosomycin）として同定された
。これらの化合物は抗菌剤である。培養物由来の成分（化合物Ａ）は、最も強力
な抗菌剤であることが見出された。
本発明は、新規な抗菌性化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＪ、
ならびにその調製に関し、そして、このような化合物を含む組成物に関する。本
発明はまた、微生物Micromonospora Carbonacea var Africanaの発酵ブロス、お
よびMicromonospora Carbonacea var Africanaの純粋培養物の培養により得るこ
とができる、その成分部分（component part）に関する。
本発明は、微生物Micromonospora Carbonacea var Africanaに関する。本発明
の別の局面は、酸素で覆った制御された条件下（controlled submerged aerobic
condition）において、実質的な抗生活性を有する目的の組成物が産生するまで
、炭素および窒素の吸収性供給源（assimilable source）を有する、pHおよび温
度が制御された水性栄養培地中で、Micromonospora Carbonacea var Africana株
を培養することにより産生される、抗生物質複合体に関する。本発明の培養物の
主要な成分は、米国特許第4,597,968号（本明細書中で参考として援用される）
に開示されるように、抗生物質13-384、成分１である。（培養物の他の主要な成
分は、対応するニトロソアナログである。）しかし、本発明は、以下に記載する
ように、培養物中の他の化合物を権利請求（claim）する。
本発明はまた、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＪからなる群
から選択される１つ以上の化合物の抗生有効量ならびに薬学的に受容可能なキャ
リアを含む、抗生物質組成物に関する。本発明はまた、細菌感染を処置する方法
に関し、この方法は、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＪからな
る群から選択される１つ以上の化合物の抗生有効量を投与する工程を包含する。
図面の説明
図１、２、４、５、６、７、および８は、それぞれ、化合物Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ、およびＪのプロトンNMRスペクトルである。図３は、化合物ＣおよびＤ
の混合物のプロトンNMRスペクトルである。
発明の詳細な説明
微生物の発酵
Micromonospora carbonacea亜種Africana、株PF6-3の凍結培養物１mLを、種培
地100mLを含む300mLのエーレンマイヤー振とうフラスコに移した。培地の組成（
g/L）は、以下の通りであった：牛肉抽出物（Difco）３、Tryptone（Difco）５
、Cerelose（CPC、2001）１、ジャガイモデキストリン（Avebe、WPD-650）24、
酵母抽出物（Universal、Taston）５、炭酸カルシウム（Pfizer、Albaglos）１
、およびシリコーン消泡剤（Union Carbide、SAG-471、30％懸濁液）0.3mL/L。
フラスコを30℃で激しく撹拌しながら48時間インキュベート（300rpm、１インチ
ストローク）し、そして培養物30mLを６×２Ｌフラスコ（それぞれ、同一の種培
地を500mL含む）に移した。上記のような48時間のインキュベーションの後、培
養物３Ｌを、さらなる24時間の培養のために、同一の培地300Lを含む接種発酵器
（inoculation fermenter）に移した。最終的に、接種発酵器の内容物を、産生
培地10,000Lを含むより大きい発酵器に移した。産生培地の組成（g/L）は、以下
の通りである：酵母抽出物５、肉ペプトン（meat peptone）（Marcor、PS型）６
、Cerelose 22、トウモロコシスティープ（steep）粉末（Marcor）２、ジャガイ
モデキストリン60、煮沸亜麻仁油（Kleenstrip）４、炭酸カルシウム４、塩化コ
バルト・６H2O(Mallinckrodt)0.002、シリコーン消泡剤0.5mL/L。溶解酸素を50
％〜100％飽和に維持しながら、通気および激しい撹拌下で、36℃において120時
間〜140時間発酵させた。１分あたり80標準立方フィート〜240標準立方フィート
の空気流を用いて、約120時間〜130時間、発酵を行った。
単離
発酵ブロスを、約25℃に冷却した。発酵ブロスの半量を、別の容器に移し、激
しく撹拌し、そして２Ｎ NaOHを用いて、pHを10.5に調整した。300L XAD-7樹脂
（Rohm&Haas非官能性アクリルエステルポリマー製吸着剤）を、発酵ブロスにチ
ャージし、そして0.5時間激しく撹拌した。pHを9.25に下げ、そして3.5時間激し
く撹拌した。pHを、さらに7.00に下げ、そして樹脂をスクリーニングによりブロ
スから分離した。タップ水を用いて洗浄し、ブロスおよび菌糸体の両方から樹脂
を除いた（free）。発酵ブロスの残りの半量（second half）を、同様の方法で
処理した。
吸着した樹脂約300Lを、脱イオン水100Lを含むテーパー状の500Lカラムにチャ
ージした。樹脂をアップフロー（upflow）で洗浄した。水性レベル（aqueous le
vel）を樹脂床に滴下した後、樹脂を脱イオン水900Lを用いてダウンフロー（dow
nflow）で洗浄した。抗生物質を、酢酸エチル900L（水酸化ナトリウムを用いてp
H８に調整された0.1Mリン酸ナトリウム一塩基緩衝液140Lで予め洗浄した）を10L
/分でカラムにチャージすることにより、樹脂ダウンフローから溶出させた。溶
出物を、150L〜200Lのカット（cut）中に回収した。カットを含む抗生物質複合
体を合わせ、そして水酸化ナトリウムでpH8に調整された0.1Mリン酸ナトリウム
一塩基緩衝液140Lを用いて抽出し、次いで脱イオン水２×60Lで抽出した。残留
する水の共沸蒸留により、酢酸エチル層を、30℃未満の温度において、最初の容
積の10分の１（約50mL）まで真空濃縮した。濃縮物を、ヘプタン100L（２容積）
中で沈澱させた。沈殿物を濾過し、そして窒素ブリード（bleed）を用いて真空
オーブン中、約25℃で乾燥させて、5.2kg〜5.5kgの粗物質（2.6kg〜3.1kgの抗生
物質複合体）を得た。
酸化
10kg〜11kgの粗抗生物質複合体を、抗生物質13-384の複合体のニトロソ成分を
酸化するために、激しく撹拌しながら80/20酢酸エチル-アセトン（10容積）に溶
解させた。重炭酸ナトリウム２kgと、バナジルアセチルアセトネート（acetyace
tonate）触媒50gを添加した。温度を25℃〜30℃に維持しながら、tert-ブチル過
酸化水素（2,2,4-トリメチルペンタン中の３Ｍ溶液）5.5Lを、0.5時間かけてゆ
っくり添加した。酸化の進行を、HPLC（高圧液体クロマトグラフィー）によりモ
ニタリングした。必要な場合、さらなる触媒を添加し、そして、反応が完結する
まで、反応混合物の激しい撹拌を続けた。
最初の精製
粗酸化物質の約2.5kgを、酢酸エチル９Ｌに溶解させ、そして、酢酸イソプロ
ピル（溶媒は、80/20酢酸エチル/ヘプタンでもあり得る）中の裸の（bare）不規
則シリカゲル（70μm〜250μm）70kgで充填された10フィート×直径１フィート
のカラムの頂部に付与した。カラムを、１平方インチゲージあたり35ポンドで、
５L/分〜７L/分の流速において、酢酸イソプロピルで溶出させた。画分１、２、
および３を、200Lカットとして回収した。抗生物質成分を、HPLCおよびTLCによ
りモニターした。TLCクロマトグラフィーに用いられた溶媒は、9:1塩化メチレン
-メチルアルコールであった。主要な抗生物質成分に富む画分５〜11を合わせ、
そして、30℃未満の温度において、約６Ｌまで真空濃縮した。激しく撹拌しなが
らこの濃縮物をヘプタン２容積に添加することにより、主要なカットを単離した
。沈殿物を濾過し、そして窒素ブリードを用いて、真空オーブン中で約25℃にお
いて乾燥して、生成物1.2kgを得た。不純物に富むヘッドカット画分３および４
を、同様の様式で処理し、生成物0.4kgを得た。不純物に富むテイルカット画分1
2〜15を、同様の様式で処理して、生成物0.2kgを得た。
抗生物質複合体のさらなる精製
精製を、２工程のクロマトグラフィー手順により達成した。最初の精製で得ら
れたヘッドカット（ID 33285-104-2）およびテイルカット（ID 33285-104-1）の
両方を、まず、ジオール結合シリカゲル（40〜63μ、不規則媒体）を用いる中圧
条件（medium presure conditions）下でクロマトグラフィーにかけた。カラム
を、窒素ガス下で、30ml/分〜50ml/分の流速において、CH2Cl2：ヘプタン：MeOH
（60：40：２ v/v/v）の３種混合物（ternary mixture）を用いて平衡化した。
サンプル付与後、移動相2.4L〜2.8Lを集め、そして廃棄した。次いで、移動相を
調整し、そしてジオールカラム床容積に基づく画分を集めた。次いで、新規な成
分を含む画分を、265nmにおけるUVシグナルモニタリングに基づくピーク収集を
行いながら、PVA-Sil（ポリビニルアルコール官能基化シリカゲル）上の半分取
（semi-preparative）高圧液体クロマトグラフィーを用いて精製した。個々の成
分の精製について、移動相の微調整がなされた（スキーム１を参照のこと）。
実施例１
富化されたテイルカット（ID 33285-104-1）５ｇを、CH2Cl2:MeOH（96:4 v/v
）20mL中に溶解させ、そしてガラスカラム（600×50mm、1.18L）中に含まれる予
備コンディショニングした（pre-conditioned）ジオール結合シリカ（40μ〜63
μ、不規則媒体）200g（約400mL）に付与した。サンプル付与前のジオールカラ
ムコンディショニング工程は、MeOH１Ｌに続いて最初の移動相CH2Cl2：ヘプタン
：MeOH（60：40：２ v/v/v）1.2Lを通過させる工程を包含した。サンプル付与後
、移動相の比を75：25：２に調整した後、移動相2.4Lを集め、そしてさらに８Ｌ
を維持した。個々の画分を得、そして以下のイソクラチック条件下で、分析HPLC
により少量成分の存在を評価した：PVA-Sil、５μ、15cm×4.6mm CH2Cl2：MeOH
（98:２）/20分。複合体１は、新規成分（化合物Ａ（これは、抗生物質13-384,
成分1よりも極性が低い））を15％含む材料200mgを生じた。複合体１を、そのサ
ンプル30mg〜40mgをCH2Cl2：MeOH（96：４ v/v）0.5ml中に溶解させ、そしてCH2
Cl2：MeOH（97.5：2.5 v/v）を用いて平衡化した半分取PVA-Silカラム（250×20
mm）上に注入することにより、さらに精製した。12mL/分の流速により、12分〜1
4.2分の溶出時間ウインドウ（elution time window）内で、所望の物質５mgを得
た。４回のさらなる注入がなされた後、計24mgの化合物Ａ（98％より高い純度）
を得た。
複合体２（100mg）を、CH2Cl2：ヘプタン：MeOH（78：20：２ v/v/v）溶媒系
を移動相として用いた以外は上記と同様の半分取HPLC条件を用いて、さらに精製
した。２つの純粋な成分（化合物Ｅ（1.5mg）および化合物Ｆ（9.5mg））が得ら
れた。しかし、第１の成分（2.4mg）は、スペクトルデータの分析に基づいて、
２つの成分（化合物Ｃおよび化合物Ｄ）の混合物として同定された。
実施例２
富化されたヘッドカット５ｇ（ID 33285-104-2）を、CH2Cl2：MeOH（96：４ v
/v）25mL中に溶解させ、そして再生したジオール結合シリカゲルカラム200gに付
与した。再生工程は、MeOHを通し、続いて最初の移動相CH2Cl2：ヘプタン：MeOH
（60：40：２ v/v/v）1.5Lを通す工程を包含した。サンプル付与後、移動相2.8L
を集め、そして溶出液を廃棄した。移動相を75：25：２（v/v/v）に調整し、そ
して画分400mLを集めた。分析HPLCに基づき、４つの画分を複合体３としてプー
ルし、そしてロータリーエバポレーターにかけて、黄色がかった粉末360mgを得
た。（画分の残りを、複合体４としてプールした。）PVA-Sil上での複合体３のH
PLC分析は、化合物Ａよりも早い流出時間を有する２つのピークを示した。分取
クロマトグラフィーのための最適化の研究により、n-ブチルクロリド：MeOHから
なる２種溶媒系（binary solvent system）が選択され、これにより、第３の実
在物（entity）の存在が明らかになった。次いで、複合体３の約40mg〜45mgを、
CH2Cl2：MeOH（96：４ v/v）1.0mL中に溶解させ、そして、n-ブチルクロリド：M
eOH（93：７ v/v）で平衡化された半分取PVA-Silカラム（250×20mm）上に注入
した。流速は15mL/分であり、そしてUV検出は265mnで行った。３つの成分を集め
た。最初の２成分（9.5mgおよび11.5mg）は不安定であり、同定することができ
なかった。第３の成分（39mg）のみが、化合物Ｂとして同定された。
複合体４（61mg）を、異なる移動相CH2Cl2：MeOH（97.5：2.5 v/v）を用いる
以外は上記の条件と同様である、改変された半分取HPLC法によりさらに精製した
。この複合体から、３つの純粋な成分（化合物Ｇ（6.1mg）、化合物Ｈ（8.7mg）
、および化合物Ｊ（27.5mg））を得た。
物理化学的特性
全ての化合物は、溶媒の除去後に白色粉末として得られた。この化合物は、メ
タノール、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、アセトン、およびクロロホルム
に可溶であり；ジエチルエーテル、ジクロロメタン、および1-クロロブタンに一
部可溶（partially soluble）であり；ヘキサン、石油エーテル、および水に不
溶である。本発明のこれらの化合物の物理化学的特性および分光学的データを表
１にまとめる。
本発明の化合物の構造決定
化合物の構造は、分光学的データ（紫外(UV)、赤外(IR)、高速原子衝撃質量分
析(FAB-MS)、プロトンおよび炭素-13核磁気共鳴(1Ｈおよび13Ｃ NMR)法を含む）
の分析に基づいて解明した。これらの化合物を、新規のエバニノマイシン（ever
ninomicin）関連の抗生物質として特徴付けた。２つの重要なオルトエステルの1 3
Ｃ NMRデータを表１に列挙した。個々の化合物の1Ｈ NMRスペクトルデータを、
それぞれ図１〜８に示す。いくつかの重要なプロトンおよび炭素の帰属は、プロ
トン付加試験(attanched proton test)（APT）、２次元核オーバーハウザー効果
分光法（NOESY）、ヘテロ核多重結合相関(heteronuclear multiple bond correl
ation)（HMBC）およびヘテロ核多量子コヒーレンス（HMQC）実験により、ならび
に米国特許第4,597,968号において権利化された抗生物質（13-384-成分-1、エバ
ニノマイシン）を参照標準としてスペクトルデータと直接比較することにより、
達成された。
実施例１
化合物Ａの構造解明を、質量分析データおよびNMRスペクトルデータの分析に
より達成した。FABマススペクトルデータは、参照試料（13-384-成分-1、エバニ
ノマイシン）と比較して34 amuの分子量の増加を示した。トリクロロ含有分子イ
オンクラスターを、FABマススペクトル中に観測した。両方の観測により、化合
物Ａ中に第３の塩素原子の存在が明らかになった。分子の右側上の芳香族エステ
ルフラグメントへのこれらの余分の塩素原子の結合を、参照試料（13-384-成分-
1、エバニノマイシン）と比較した２次フラグメンテーション分析に基づいて決
定した。（図解１）。しかし、マススペクトルデータでは、芳香族環上における
塩素原子の正確な位置を決めることができない。C-58でのこの塩素の位置を、NM
Rスペクトルデータ（NOESY実験におけるプロトン−60とメチルプロトン−62との
強い相関、およびHMBC実験におけるプロトン−60とメチル炭素−62との間の結合
性（Connectivity）を示す）に基づいてさらに決定した。従って、化合物Ａの構
造が、図解２に示されるように決定された。同じ方法を使用することにより、他
の化合物の構造もまた解明され、これらを図解２に示す。化合物ＣおよびＨを図
解３に示す。化合物Ｊが、以下の図解４に示されるようにオルトエステル官能基
を介して二環式芳香族エステル部分に連結した、比較的小さな二糖類として特徴
付けられたことに留意すべきである。
★エバニノマイシンは、米国特許第4,597,968号に開示されるような抗生物質1
3-384、成分-1である。
イタリック体の大文字は、本発明の化合物における環と同一である。
化合物ＣおよびＨの構造を、以下に示す。
化合物Ｊの構造を、以下の図解４に示す。
本発明の化合物の生物学的特性
少量の成分を、寒天ディスク拡散プロトコルに基づいて活性について試験した
。各成分を、CH2Cl2：MeOH（95:5 v/v）中に１mg/mLで溶解し、同じ媒質（vehic
le）中で10倍希釈した。各濃度の20マイクロリットルを８mmの標準ペーパーディ
スクに移し、そして30分間風乾させた。各セットのディスクを、２つのpH（7/8
）にてStaphylococcus aureusを接種した寒天上に配置し、そして35℃で一晩イ
ンキュベートした。阻害の領域（zone）のサイズは、阻害の円の直径として以下
に示され、そしてミリメーター単位で示される。その結果を以下の表にした：
本明細書に使用されるように、NTは試験していないことを意味する。
化合物Ａの、エバニノマイシンにほぼ等しい効力を、４倍希釈においてさらに
記録した。
インビボでの本発明の化合物の抗生活性は、マウスに皮下投与して示され得る
。
本発明は、薬学的に受容可能な組成物（これは、薬学的に受容可能なキャリア
と、Ａ、Ｂ，Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪからなる群から選択される１つ以
上の化合物とを含む）を用いて行われ得る。
このように、この抗生物質は、任意の適切な薬学的キャリアと共に投与され得
、そして経口的、非経口的、または局所的に種々の処方物で投与され得る。経口
投与のために、本発明の抗生物質は、錠剤、カプセル、エリキシルなどの形態で
調
合され得る。錠剤およびカプセルは、デンプンまたはラクトースのような賦形剤
をを含有し得；液体形態は、着色剤または香料を含み得る。局所調製物は、クリ
ーム、疎水性もしくは親水性の軟膏、または水性、非水性のエマルジョン型ロー
ションの形態であり得る。このような処方物のための代表的なキャリアは、水、
オイル、グリース、ポリエステル、およびポリオールである。非経口処方物（例
えば、注射可能な投薬形態）は、通常、溶液または懸濁液のような液体であり、
代表的なキャリアは蒸留水または生理食塩水溶液である。
特定の任意の投薬形態で投与される用量は、種々のファクター（例えば、処置
される動物種の特徴、感染した微生物の抗生物質に対する感受性、ならびに感染
の段階および重篤度）に依存する。一般的には、投与される投薬量は、１日当た
り約1.0mg〜約25mg/kg体重であり、分割投薬においては、特定の投薬量は、実施
者の裁量にまかせられる。
本発明の化合物で特定の患者を治療する際、投薬ユニット中に他の薬学的に活
性な成分を含有させることができる。
微生物
本発明の化合物を得るために使用される微生物は、米国特許第4,597,968号（
本明細書中において参考として援用される）に記載されるMicromonospora Carbo
nacea var Africanaの変異株である。この変異株を得る方法は、本出願において
記載される通りである。Micromonospora Carbonacea var Africanaの変異株は、
以下のように調製される。まず、親株SCC 1413を、N-ニトロソグアニジン(NTG)
変異誘発に供し、培養物の90％以上を死滅させた。1,500の生菌単離物（Survivi
ng isolation）を、S．aureusおよびE．coli.に対する増大した生物学的活性に
ついて試験した。単一コロニー単離物を、10mLの発芽培地を含む試験管中で発芽
させ、そして旋回振盪器にて250 r.p.mで、30℃、48時間、振盪した。2.5mLの種
を、50mLの発酵培地を含む250mLのエーレンマイヤーフラスコに移し、そして旋
回振盪器にて250 r.p.m.で、30℃、96時間インキュベートすることにより、発酵
研究を開始した。SCC 1631を、S．aureusおよびE．coli.に対するその改善され
た生物活性に基づいて、13-384複合体の改善されたプロデューサーであると同定
した。
SCC 1756株を、SCC 1631のNTG変異により単離し、次いで、エバニノマイシン
（ニトロアナログおよびニトロソアナログの複合体）150μg/mLを含む寒天プレ
ート上で単離物を選別した。SCC 2146株を、SCC 1756のNTG変異誘発によって得
た。高レベルのエバニノマイシン（ニトロアナログおよびニトロソアナログの複
合体）上でのSCC 1631のNTG変異誘発された株を単離すること以外は、両方の変
異研究のためプロトコルは上記の通りであった。２つの変異研究の内の後者では
、発酵ブロスを、酢酸エチルで抽出し、そして濃縮物を、Whatman LKGDF薄層プ
レート上で、クロロホルム：メタノール（9:1）からなる溶媒系中でクロマトグ
ラフにかけ、次いで、S．aureusおよびE．coli.に対してバイオオートグラフィ
ーにかけて、抗生物質複合体の全ての成分の生成物を確認した。エバニノマイシ
ン（ニトロアナログおよびニトロソアナログの複合体）の増加した力価を理解す
るために、Shimadzu CS-930 TLCプレートスキャナーを用い、そしてHPLCを用い
てより多く生成した抽出物を定量することにより、薄層プレートを試験した。エ
バニノマイシンのニトロアナログおよびニトロソアナログの和として、合わせた
力価を定義した。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
New orthosomycin from Microlonospora Carbonacea
Summary of the Invention
Compounds A, B, C, D, E, F, G, H and J were converted to the microorganism Micromonospora
Isolated from fermentation broth of Carbonacea var Africana (designated SCC 2146)
did. These compounds have been identified as orthosomycin
. These compounds are antimicrobial agents. The culture-derived component (Compound A) is the most potent
Has been found to be an effective antimicrobial agent.
The present invention provides novel antimicrobial compounds A, B, C, D, E, F, G, H, and J,
And to the preparation thereof, and to compositions comprising such compounds. Book
The invention also relates to fermentation broths of the microorganism Micromonospora Carbonacea var Africana,
And Micromonospora Carbonacea var Africana.
And relating to that component part.
The present invention relates to the microorganism Micromonospora Carbonacea var Africana. The present invention
Another aspect of controlled submerged aerobic
condition) until the target composition with substantial antibiotic activity is produced
PH and temperature with an assimilable source of carbon and nitrogen
Micromonospora Carbonacea var Africana strain in an aqueous nutrient medium with controlled degree
, Which is produced by culturing E. coli. Of the culture of the present invention.
The main ingredients are described in US Pat. No. 4,597,968, which is incorporated herein by reference.
Antibiotic 13-384, component 1. (Other major components of the culture
Min is the corresponding nitroso analog. However, the present invention is described below.
As such, claim other compounds in the culture.
The invention also relates to the group consisting of compounds A, B, C, D, E, F, G, H, and J
An effective amount of one or more compounds selected from the group consisting of:
And an antibiotic composition comprising a rearrangement. The present invention also provides a method of treating a bacterial infection.
In this method, the method comprises compounds A, B, C, D, E, F, G, H, and J.
Administering an antibiotic effective amount of one or more compounds selected from the group consisting of:
Description of the drawings
FIGS. 1, 2, 4, 5, 6, 7, and 8 show compounds A, B, E, F,
It is a proton NMR spectrum of G, H, and J. FIG. 3 shows compounds C and D
3 is a proton NMR spectrum of a mixture of the above.
Detailed description of the invention
Microbial fermentation
1 mL of frozen culture of Micromonospora carbonacea subsp.
The suspension was transferred to a 300 mL Erlenmeyer shake flask containing 100 mL of ground solution. Medium composition (
g / L) were as follows: beef extract (Difco) 3, Tryptone (Difco) 5
, Cerelose (CPC, 2001) 1, Potato dextrin (Avebe, WPD-650) 24,
Yeast extract (Universal, Taston) 5, Calcium carbonate (Pfizer, Albaglos) 1
, And silicone antifoam (Union Carbide, SAG-471, 30% suspension) 0.3 mL / L.
Incubate the flask at 30 ° C for 48 hours with vigorous shaking (300 rpm, 1 inch
Stroke), and 30 mL of the culture is placed in a 6 × 2 L flask (each in the same seed culture).
Ground containing 500 mL). After 48 hours of incubation as above, culture
An inoculated fermenter containing 3 L of the nutrient for the further 24 hours of cultivation containing 300 L of the same medium
(Inoculation fermenter). Finally, the contents of the inoculated fermenter are produced
The medium was transferred to a larger fermenter containing 10,000 L. The composition (g / L) of the production medium is as follows
As follows: yeast extract 5, meat peptone (Marcor, type PS) 6
, Cerelose 22, corn steep powder (Marcor) 2, potato
Modextrin 60, Boiling linseed oil (Kleenstrip) 4, Calcium carbonate 4, Coco chloride
Baltic 6HTwoO (Mallinckrodt) 0.002, silicone defoamer 0.5 mL / L. 50 dissolved oxygen
120 hours at 36 ° C. under aeration and vigorous stirring, while maintaining% to 100% saturation
Fermented for ~ 140 hours. 80 standard cubic feet to 240 standard cubic feet per minute
The fermentation was carried out for about 120 to 130 hours using an air flow of
Isolation
The fermentation broth was cooled to about 25 ° C. Transfer half the fermentation broth to another container,
The pH was adjusted to 10.5 with 2N NaOH. 300L XAD-7 resin
(Rohm & Haas non-functional acrylic ester polymer adsorbent) into the fermentation broth
And stirred vigorously for 0.5 hour. Reduce pH to 9.25 and vigorously for 3.5 hours
Stirred well. The pH was further reduced to 7.00 and the resin was screened by screening.
Separated from Wash with tap water and remove resin from both broth and mycelium.
(Free). The remaining half of the fermentation broth is prepared in a similar manner
Processed.
Approximately 300 L of adsorbed resin is transferred to a tapered 500 L column containing 100 L of deionized water.
Page. The resin was washed upflow. Aqueous level
vel) is dropped onto the resin bed, and the resin is flowed down (dow) using 900 L of deionized water.
nflow). Antibiotic is treated with 900 L of ethyl acetate (p.
Washed in advance with 140 L of 0.1 M sodium phosphate monobasic buffer adjusted to H8) to 10 L
The column was charged at / min to elute from the resin downflow. Dissolution
Effluent was collected in 150L-200L cuts. Antibiotic complex containing cut
0.1M sodium phosphate adjusted to pH 8 with sodium hydroxide
Extraction was performed using 140 L of monobasic buffer, followed by extraction with 2 × 60 L of deionized water. Residual
The ethyl acetate layer is brought to the initial volume at a temperature below 30 ° C. by azeotropic distillation of water
Concentrated in vacuo to one tenth of the volume (about 50 mL). Concentrate into 100 L heptane (2 volumes)
And precipitated in. Filter the precipitate and vacuum using nitrogen bleed
Dry in an oven at about 25 ° C. and allow 5.2 kg to 5.5 kg of crude material (2.6 kg to 3.1 kg of antibiotic
Substance complex).
Oxidation
10 kg to 11 kg of the crude antibiotic complex and the nitroso component of the antibiotic 13-384 complex
Dissolve in 80/20 ethyl acetate-acetone (10 volumes) with vigorous stirring to oxidize.
Let it go. 2 kg of sodium bicarbonate and vanadyl acetylacetonate (acetyace
tonate) 50 g of catalyst were added. While maintaining the temperature between 25 ° C and 30 ° C,
5.5 L of hydrogen oxide (3M solution in 2,2,4-trimethylpentane) is added over 0.5 hour.
It was added very well. The progress of oxidation is monitored by HPLC (high pressure liquid chromatography).
I knew it. If necessary, add further catalyst and complete the reaction
Vigorous stirring of the reaction mixture was continued until
First purification
About 2.5 kg of the crude oxidized material is dissolved in 9 L of ethyl acetate, and
Bare irregularities in pills (solvent can also be 80/20 ethyl acetate / heptane)
10 feet x 1 foot diameter packed with 70 kg of regular silica gel (70 μm to 250 μm)
At the top of the column. The column is 35 pounds per square inch gauge,
Elution was carried out with isopropyl acetate at a flow rate of 5 L / min to 7 L / min. Fractions 1, 2,
And 3 were collected as 200L cuts. Antibiotic components are analyzed by HPLC and TLC
Was monitored. The solvent used for TLC chromatography was 9: 1 methylene chloride
-Methyl alcohol. Combine fractions 5-11 rich in major antibiotic components,
Then, at a temperature lower than 30 ° C., the solution was concentrated in vacuo to about 6 L. With vigorous stirring
The major cut was isolated by adding the concentrate to 2 volumes of heptane.
. Filter the precipitate and use a nitrogen bleed in a vacuum oven at about 25 ° C.
And dried to give 1.2 kg of product. Headcut fractions 3 and 4 rich in impurities
Was treated in a similar manner to give 0.4 kg of product. Tail cut fraction 1 rich in impurities
2-15 were processed in a similar manner to give 0.2 kg of product.
Further purification of antibiotic conjugate
Purification was achieved by a two-step chromatography procedure. Obtained in the first purification
Head cut (ID 33285-104-2) and tail cut (ID 33285-104-1)
Both, first, medium pressure using diol-bonded silica gel (40-63μ, random medium)
Chromatography was performed under medium presure conditions. column
At a flow rate of 30 ml / min to 50 ml / min under nitrogen gas.TwoClTwo: Heptane: MeOH
Equilibration was performed using a (60: 40: 2 v / v / v) ternary mixture.
After sample application, 2.4 L to 2.8 L of the mobile phase was collected and discarded. Then the mobile phase
Conditioned and collected fractions based on diol column bed volume. Then, a new
Fractions, and collect peaks based on UV signal monitoring at 265 nm.
While performing, remove the half-sample on PVA-Sil (polyvinyl alcohol functionalized silica gel).
(Semi-preparative) Purified using high pressure liquid chromatography. Individual results
The mobile phase was fine-tuned for purification of the minute (see Scheme 1).
Example 1
5 g of the enriched tail cut (ID 33285-104-1)TwoClTwo: MeOH (96: 4 v / v
) Dissolve in 20 mL and pre-contain in glass column (600 x 50 mm, 1.18 L)
Pre-conditioned diol-bound silica (40-63)
μ, irregular medium) 200 g (about 400 mL). Diol color before sample application
The conditioning process consists of 1 L of MeOH followed by the first mobile phase CH.TwoClTwo: Heptane
: MeOH (60: 40: 2 v / v / v) through 1.2 L. After sample application
After adjusting the mobile phase ratio to 75: 25: 2, 2.4 L of mobile phase was collected and an additional 8 L
Was maintained. The individual fractions were obtained and analyzed under the following isocratic conditions by analytical HPLC.
The presence of minor components was assessed by: PVA-Sil, 5μ, 15cm x 4.6mm CHTwoClTwo: MeOH
(98: 2) / 20 minutes. Complex 1 contains a new component (compound A (which is an antibiotic 13-384,
200 mg of material containing 15% less polar than component 1) were obtained. Complex 1
30 mg to 40 mg CHTwoClTwo: MeOH (96: 4 v / v) dissolved in 0.5 ml and CHTwo
ClTwo: Semi-preparative PVA-Sil column equilibrated with MeOH (97.5: 2.5 v / v) (250 × 20
mm) was further purified by injection on 12 minutes to 1 depending on the flow rate of 12 mL / min
Within the elution time window of 4.2 minutes, 5 mg of the desired substance is obtained
Was. After 4 additional injections, a total of 24 mg of compound A (> 98% pure)
I got
Complex 2 (100 mg) was added to CHTwoClTwo: Heptane: MeOH (78: 20: 2 v / v / v) solvent system
Was further purified using the same semi-preparative HPLC conditions as above except that was used as the mobile phase.
did. Two pure components (Compound E (1.5 mg) and Compound F (9.5 mg)) were obtained.
Was. However, the first component (2.4 mg), based on the analysis of the spectral data,
It was identified as a mixture of two components (Compound C and Compound D).
Example 2
5g of enriched headcut (ID 33285-104-2)TwoClTwo: MeOH (96: 4 v
/ v) Dissolve in 25 mL and apply to 200 g of regenerated diol-bound silica gel column.
Gave. The regeneration step was through MeOH, followed by the first mobile phase CH.TwoClTwo: Heptane: MeOH
(60: 40: 2 v / v / v). After sample application, mobile phase 2.8L
Was collected and the eluate was discarded. Adjust the mobile phase to 75: 25: 2 (v / v / v) and
And collected 400 mL fractions. Based on analytical HPLC, four fractions were pooled as complex 3.
And rotary evaporator to obtain 360 mg of a yellowish powder.
Was. (The rest of the fractions were pooled as complex 4.) H of complex 3 on PVA-Sil
PLC analysis showed two peaks with an earlier efflux time than Compound A. Sorting
Optimization studies for chromatography show that n-butyl chloride: MeOH
A binary solvent system was selected, thereby providing a third solution.
The existence of the entity was revealed. Then, about 40 mg to 45 mg of complex 3
CHTwoClTwo: MeOH (96: 4 v / v) dissolved in 1.0 mL and n-butyl chloride: M
Injection on a semi-preparative PVA-Sil column (250 x 20 mm) equilibrated with eOH (93: 7 v / v)
did. The flow rate was 15 mL / min and UV detection was performed at 265 mn. Collect the three ingredients
Was. The first two components (9.5 mg and 11.5 mg) are unstable and can be identified
Did not. Only the third component (39 mg) was identified as Compound B.
Complex 4 (61 mg) was prepared using different mobile phase CH.TwoClTwo: Use MeOH (97.5: 2.5 v / v)
Other conditions were the same as above, but further purified by a modified semi-preparative HPLC method
. From this complex, the three pure components (Compound G (6.1 mg), Compound H (8.7 mg)
And compound J (27.5 mg).
Physicochemical properties
All compounds were obtained as white powders after removal of the solvent. This compound is
Tanol, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, acetone, and chloroform
Soluble in diethyl ether, dichloromethane, and 1-chlorobutane
Partially soluble; insoluble in hexane, petroleum ether, and water
It is soluble. The physicochemical properties and spectroscopic data of these compounds of the invention are tabulated.
Put together in 1.
Structure determination of the compound of the present invention
The structure of the compound is determined by spectroscopic data (ultraviolet (UV), infrared (IR),
(FAB-MS), proton and carbon-13 nuclear magnetic resonance (1H and13C NMR) method)
Elucidated based on the analysis. These compounds are used as new evaninomycins (ever
ninomicin) related antibiotics. Of two important orthoesters1 Three
The C NMR data is listed in Table 1. Of individual compounds11 H NMR spectral data
1 to 8 respectively. Some important proton and carbon assignments are
Attached proton test (APT), 2D nuclear Overhauser effect
Spectroscopy (NOESY), heteronuclear multiple bond correl
ation) (HMBC) and heteronuclear multiquantum coherence (HMQC) experiments
The antibiotics granted in U.S. Pat. No. 4,597,968 (13-384-component-1,
Ninomycin) as a reference standard by direct comparison with the spectral data,
Achieved.
Example 1
For elucidating the structure of Compound A for analyzing mass spectrometry data and NMR spectrum data
More achieved. The FAB mass spectrum data is based on the reference sample (13-384-component-1,
Nomycin) as compared to an increase in the molecular weight of 34 amu. Trichloro-containing molecule a
On clusters were observed in the FAB mass spectrum. Both observations indicate that
The presence of a third chlorine atom in the product A was clarified. Aromatic esthetic on the right side of the molecule
The binding of these extra chlorine atoms to the base fragment (13-384-component-
1, evaninomycin) based on a secondary fragmentation analysis
Specified. (Illustration 1). However, the mass spectrum data shows that
The exact position of the chlorine atom cannot be determined. The position of this chlorine in C-58
R spectrum data (proton-60 and methylproton-62 in NOESY experiment)
Strong correlation and binding between proton-60 and methyl carbon-62 in HMBC experiments
(Indicating Connectivity). Therefore, the structure of compound A
The structure was determined as shown in FIG. By using the same method,
Are also elucidated and are shown in FIG. Figure showing compounds C and H
Shown in Solution 3. Compound J has an orthoester functional group as shown in Diagram 4 below.
Characterized as a relatively small disaccharide linked to the bicyclic aromatic ester moiety via
It should be noted that it was attached.
★Evaninomycin is an antibiotic 1 as disclosed in U.S. Pat.No. 4,597,968.
3-384, component-1.
The capital letters in italics are identical to the rings in the compounds of the invention.
The structures of compounds C and H are shown below.
The structure of Compound J is shown in Diagram 4 below.
Biological properties of the compounds of the invention
Small amounts of components were tested for activity based on the agar disk diffusion protocol
. Each component, CHTwoClTwo: Dissolved in MeOH (95: 5 v / v) at 1 mg / mL and mixed with the same medium (vehic
le) diluted 10-fold. 20 microliters of each concentration is transferred to a standard 8 mm paper
Transferred to a disc and allowed to air dry for 30 minutes. Each set of discs was loaded into two pH (7/8
), Place on agar inoculated with Staphylococcus aureus and incubate overnight at 35 ° C.
Incubated. The size of the zone of inhibition is
And in millimeters. The results are tabulated below:
As used herein, NT means not tested.
The potency of Compound A, approximately equal to evaninomycin, was further increased at 4-fold dilution
Recorded.
The antibiotic activity of the compounds of the invention in vivo may be demonstrated by subcutaneous administration to mice
.
The present invention relates to a pharmaceutically acceptable composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
And one or more selected from the group consisting of A, B, C, D, E, F, G, H and J
And the above compounds).
Thus, the antibiotic can be administered with any suitable pharmaceutical carrier.
And may be administered orally, parenterally, or topically in various formulations. Oral
For administration, the antibiotics of the present invention may be in the form of tablets, capsules, elixirs, etc.
Key
Can be combined. Tablets and capsules may contain excipients such as starch or lactose
The liquid form may contain coloring or flavoring. Topical preparations
Ointment, hydrophobic or hydrophilic ointment, or aqueous or non-aqueous emulsion
May be in the form of an application. Typical carriers for such formulations are water,
Oils, greases, polyesters, and polyols. Parenteral formulations (eg
For example, injectable dosage forms) are usually liquids, such as solutions or suspensions,
Typical carriers are distilled water or saline solution.
The dose administered in any particular dosage form will depend on various factors, such as
Characteristics of the species used, the susceptibility of the infected microorganism to antibiotics, and the infection
Stage and severity). Generally, the dosage administered will be daily.
About 1.0 mg to about 25 mg / kg body weight; in divided doses, the particular dosage
At the discretion of the elderly.
In treating certain patients with a compound of the present invention, other pharmaceutically active agents may be present in the dosage unit.
Sexual components can be contained.
Microorganism
The microorganisms used to obtain the compounds of the present invention are described in U.S. Pat. No. 4,597,968 (
Micromonospora Carbo, described in US Pat.
It is a mutant of nacea var Africana. The method for obtaining this mutant is described in the present application.
As described. The mutant strain of Micromonospora Carbonacea var Africana is
It is prepared as follows. First, the parent strain SCC 1413 was converted to N-nitrosoguanidine (NTG).
Subjected to mutagenesis, more than 90% of the culture was killed. 1,500 live bacterial isolates (Survivi
ng isolation). aureus and E. increased biological activity against E. coli
Was tested. Single colony isolates germinate in tubes containing 10 mL germination medium
And shaken on a rotary shaker at 250 rpm at 30 ° C. for 48 hours. 2.5mL seed
To a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of fermentation medium and swirl.
Fermentation by incubating at 30 ° C for 96 hours at 250 r.p.m.
Research has begun. SCC 1631, S.P. aureus and E. its improved against E. coli.
Identified as an improved producer of 13-384 complex based on biological activity
did.
The SCC 1756 strain was isolated by the NTG mutation of SCC 1631 and then evaninomycin
(Complex of nitro and nitroso analogs) Agar plates containing 150 μg / mL
The isolate was selected on a plate. SCC 2146 strain obtained by NTG mutagenesis of SCC 1756
Was. High levels of evaninomycin (a mixture of nitro and nitroso analogs)
Except for the isolation of the NTG mutagenized strain of SCC 1631
The protocol was as described above for the different studies. In the latter of the two mutation studies
, The fermentation broth is extracted with ethyl acetate, and the concentrate is washed with a Whatman LKGDF thin layer plate.
Chromatography in a solvent system consisting of chloroform: methanol (9: 1)
Rough, then S. aureus and E. bioautography for E. coli
To confirm the products of all the components of the antibiotic conjugate. Evaninomaishi
The increased titer of nitros (complex of nitro and nitroso analogs)
Using a Shimadzu CS-930 TLC plate scanner and using HPLC
The thin plate was tested by quantifying the extract that produced more. D
Combined as the sum of the nitro and nitroso analogs of vaninomycin
Titer was defined.
【手続補正書】
【提出日】１９９８年６月３日
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
[Procedure amendment] [Date of submission] June 3, 1998 [Content of amendment] [Fig. 1] FIG. 2 FIG. 3 FIG. 4 FIG. 5 FIG. 6 FIG. 7 FIG. 8
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
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，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，
ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ジェンキンズ，ジョン ケイ.
アメリカ合衆国 ニュージャージー
07928，チャットハム，ラファイエット
アベニュー 106
(72)発明者 ペイテル，メイヘッシュ ジー.
アメリカ合衆国 ニュージャージー
07044，ベロナ，ブレントウッド ドライ
ブ 42────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S
Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD
, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA
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GE, HU, IL, IS, JP, KG, KR, KZ, L
C, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN
, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI,
SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UZ, VN
(72) Inventor Jenkins, John Kay.
United States New Jersey
07928, Chatham, Lafayette
Avenue 106
(72) Inventor Peytel, Mayhesh G.
United States New Jersey
07044, Verona, Brentwood Dry
Step 42