Procédé de production d'une composition de peptides de bas
poids moléculaire et agent nutritif la contenant.
La présente invention concerne un procédé de
production d'une composition de protéines ou de peptides
de bas poids moléculaire principalement à base de dipeptides et de tripeptides, de même qu'un agent nutritif à
administrer par voie orale ou entérique comprenant la composition de peptides de bas poids moléculaire ainsi produite.
Jusqu'à présent, spécialement dans l'industrie alimentaire, les peptides et aminoacides ont été obtenus
par hydrolyse enzymatique de matières protéiques. Néanmoins,
ces opérations se sont limitées à l'hydrolyse enzymatique
des matières protéiques pour leur solubilisation et à la
conversion des matières protéiques en polymères inférieurs (d'un poids moléculaire supérieur à quelques milliers)
exploitables pour l'alimentation. La nature des produits protéolytiques a retenu l'attention, mais il n'en est pas de même de leur poids moléculaire.
Les recherches de la Demanderesse à propos de la digestion et de l'absorption du produit d'hydrolyse enzymatique d'une matière protéique a fait ressortir
(1) que la réduction du. poids moléculaire moyen à 1500 sinon moins et de préférence à 700 sinon moins, (2) que
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laire de 2000 ou davantage et de préférence de 1000 ou
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
sinon moins,c'est-à-dire la production d'une composition de peptides de bas poids moléculaire principalement à
base de dipeptides et de tripeptides, offrent un certain nombre d'avantages énumérés ci-après.
(1) Cette composition de peptides de bas poids moléculaire diffère par l'absorption entérique des matières protéiques et mélanges d'aminoacides contenant les mêmes aminoacides constitutifs. Le taux d'absorption total de l'azote est plus élevé et l'antagonisme d'absorption entre les aminoacides est réduit au minimum.
(2) La composition constitue une source d'azote efficace
en raison d'un meilleur bilan azoté.
(3) Le gain de poids est remarquablement; accru.
(4) Le taux de cholestérol sanguin est abaissé.
Les produits peptidiques classiques ont un degré de protéolyse faible ou bien ont une teneur extrêmemt élevée en aminoacides libres. En d'autres termes, en raison de
la diversité du degré de protéolyse, ils contiennent depuis des peptides d'un poids moléculaire de quelques dizaines de milliers jusqu'à des aminoacides libres. Certains pronuits dit un poids moléculaire moyen supérieur à quelques
<EMI ID=4.1>
acides libres.
La Demanderesse a découvert que lorsqu'elle
est utilisée comme agent nutritif, une composition de peptides limitée dans un intervalle étroit de poids moléculaire est plus efficace pour la digestion et l'absorption et aussi pour l'alimentation physiologique que les produits ha-
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mélanges de peptides ayant un spectre de poids moléculaire large ou les mélanges d'aminoacides. La composition de
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nutritif conforme à l'invention est principalement à base de dipeptides et de tripeptides et contient 20% en poids sinon moins de peptides d'un poids moléculaire de 700 ou
<EMI ID=7.1>
la composition étant produite par ajustement du poids moléculaire de la matière protéique de départ comme spécifié ci-dessus.
Récemment, il a été admis que les dipeptides
et tripeptides sont aisément absorbés par voie entérique. La Demanderesse a pour la première fois confirmé cette hypothèse par des expériences in vivo sur un mélange de ces peptides,comme décrit plus en détail ci-après.
La Demanderesse a découvert également que bien que les mélanges d'aminoacides libres tendent à une absorption inégale en raison d'un antagonisme ou d'une réduction de solubilité, les peptides de bas poids moléculaire échappent à cette inégalité d'absorption. Par conséquent, les compositions de peptides de bas poids moléculaire décrites ci-dessus constituent des sources protéiques préférées pour un agent nutritif.
<EMI ID=8.1>
aux peptides de bas poids moléculaire qui présentent l'utilité apparente mentionnée ci-dessus, aucun procédé efficace pour les produire n'avait été mis au point jusqu'à présent.
L'invention a dès lors pour premier but de procurer un procédé de production d'une composition de peptides de bas poids moléculaire principalement à base
de dipeptides et de trip eptides,c'est-à-dire ayant un poids moléculaire moyen d'environ 400, et une teneur en aminoacides
<EMI ID=9.1>
L'invention a aussi pour but de procurer un procédé de production d'une composition de peptides de bas poids moléculaire telle que spécifiée ci-dessus à partir d'une matière première protéique d'origine appropriée quelconque,avec un rendement élevé.
L'invention a de plus pour but de procurer un procédé de production d'une composition de peptides de bas poids moléculaire dans laquelle l'antagonisme d'absorption des aminoacides est réduit au minimum et la teneur en aminoacides libres est abaissée.
L'invention a pour second but de procurer-
un agent nutritif comprenant une composition de peptides de bas poids moléculaire principalement à base de dipep-
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efficace du fait qu'il manifeste une réduction de l'antagonisme d'absorption des aminoacides, une augmentation de la solubilité, une augmentation du taux d'absorption total de l'azote et une amélioration du bilan azoté.
L'invention a en outre pour but de procurer un agent nutritif contenant des peptides de bas poids mo-
<EMI ID=11.1> <EMI ID=12.1>
cholestérol sanguin -
L'invention a également pour but de procurer un agent nutritif dans lequel la matière protéique est hydrolysée en peptides de bas poids moléculaire facilement absorbables qui sont typiquement des dipeptides et tripeptides de sorte que l'agent peut être administré non seulement comme agent nutritif à usage oral permettant une alimentation aisée,mais également comme agent nutritif à usage entérique introduit directement dans l'estomac des patients affaiblis.
Suivant son premier aspect, l'invention a pour. objet un procédé de production d'une composition de peptides de bas poids moléculaire, caractérisé en ce qu'on disperse une matière première protéique d'origine appropriée quelcon-
<EMI ID=13.1>
on ajuste le pH de la dispersion à une valeur de 1 à 4 à l'aide d'un acide, on ajoute au moins deux protéases acides simultanément ou successivement à la dispersion et on laisse la protéolyse enzymatique progresser pendant 8 à 72 heures
à une température de 25 à 60[deg.]C, de manière à produire une
<EMI ID=14.1>
lement à base de dipeptides et de tripeptides tout en supprimant la formation d'aminoacides libres.
L'invention a en outre pour objet un procédé de production d'une composition de peptides de bas poids moléculaire tel que les teneurs en aminoacides libres et
en peptides ayant un poids moléculaire d'au moins 700 dans le produit de protéolyse enzymatique soient chacune de 20% sinon moins.
Suivant un second aspect, l'invention a pour objet un agent nutritif comprenant une composition de pep-tides de bas poids moléculaire principalement à base de
<EMI ID=15.1>
obtenue par protéolyse d'une matière première protéique avec suppression de la formation des aminoacides libres.
Suivant une forme de réalisation préférée de l'invention, les teneurs en aminoacides libres et en peptides d'un poids moléculaire d'au moins 700 sont chacune
<EMI ID=16.1>
enzymatique. La composition de peptides de bas poids moléculaire de l'agent nutritif peut contenir en outre un
ou plusieurs aminoacides nécessaires,si la chose est désirée.
On ne trouve dans la littérature aucune discussion des peptides de bas poids moléculaire formés principalement de dipeptides et de tripeptides qui offrent les nombreux avantages au'on peut déduire des résultats expérimentaux
<EMI ID=17.1>
duire de tels peptides de bas poids moléculaire à partir d'une matière première protéique d'origine appropriée quelconque, la Demanderesse a mis les faits suivants en évidence
(voir tableau V).
(1) Bien que la pepsine ait le pouvoir solubilisant le plus élevé parmi les protéases, il est difficile d'abaisser le poids moléculaire moyen à 1000 sinon moins au moyen de pepsine parce que l'hydrolyse d'une matière protéique par la pepsine ne progresse plus aisément après qu'un poids moléculaire déterminé a été atteint.
(2) Les protéases neutres ont une activité protéolytique plus faible que celle des protéases acides et seule la pronase peut abaisser le poids moléculaire moyen d'un produit protéolytique à 1000 sinon moins. Toutefois, comme la pronase consiste en un mélange de protéases,
elle produit des aminoacides libres avec une abondance <EMI ID=18.1>
500.
(3) Les protéases acides ont la meilleure activité protéolytique et parmi ces protéases, la Molsine (fabriquée et
<EMI ID=19.1>
<EMI ID=20.1>
entre autres sont particulièrement efficaces pour réduire jusqu'au minimum la formation des aminoacides libres.
(4) Aucune des protéases actuellement disponibles ne permet d'abaisser le poids moléculaire jusqu'à la fabile valeur désirée lorsqu'elle est utilisée seule. L'examen des réactions de protéolyse au moyen de différentes combinaisons de protéases a montré que les combinaisons de protéases
<EMI ID=21.1>
efficaces pour abaisser le poids moléculaire à une valeur aussi basse qu'on le désire et pour abaisser la teneur en aminoacides libres.
L'invention est davantage illustrée sans être limitée par les exemples suivants et est susceptible de différentes variantes et modifications sans sortir de son. cadre. Par exemple,les protéases utilisées peuvent être choisies parmi les protéases d'origine fongique et oactérienne comme les protéases de Ehizopus, d'Aspergillus,
de Pénicillium et de Bacillus. La papaïne et la bromélaine, qui sont d'origine végétale,sont efficaces aussi. De plus, certaines protéases spéciales,comme les carboxypeptidases
<EMI ID=22.1>
ou amino- di- ou tripeptidases,peuvent évidemment être utilisées aussi.
EXEMPLE 1 -
On dissout 50 g de blanc d'oeuf séché (d'une teneur <EMI ID=23.1>
ajuste le pH de la solution résultante à 3 avec de l'acide chlorhydrique aqueux, on ajuste simultanément à la solution 1 g de Molsine et 1 g de Sanprose-F et on exécute la réaction
<EMI ID=24.1>
à pH 3. Au terme de la réaction, on chauffe la solution
à 100[deg.]C pendant 10 minutes pour désactiver les protéases, puis on la soumet à la séparation centrifuge à 3000 tours par minute (1500 g) pendant 10 minutes. On sépare les insolubles et on lyophilise le liquide surnageant. Ce produit est obtenu avec un rendement de 93,2% sur la base de la matière première protéique et a un poids moléculaire moyen
<EMI ID=25.1>
plus de 88% en poids, il a un poids moléculaire de moins
de 700. Il convient de noter que les substances ayant un poids moléculaire de moins de 700 ne peuvent être identifiées par filtration sur gel. La teneur en aminoacides libres du produit est de 8,5% en poids.
<EMI ID=26.1>
On répète le mode opératoire de l'exemple l,mais en ajoutant d'abord 1 g de Molsine et 8 heures plus tard 1 g de Sanprose -F et en exécutant la réaction pendant encore
10 heures. Le produit résultant est obtenu avec un rendement de 93,9% et a un poids moléculaire moyen de 350 et une teneur en aminoacides libres de 8,1%. Sa filtration sur gel indique que pour plus de 90%, il a un poids moléculaire de moins de 700.
EXEMPLE 3 -
On répète le mode opératoire de l'exemple 1, mais en ajoutant simultanément 1 g de pepsine et 1 g de Molsine. Le produit est obtenu avec un rendement de 96,1% et a un poids moléculaire moyen de 510 et une teneur en <EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
de moins de 700.
EXEMPLE 4 -
On répète le mode opératoire de l'exemple l,mais en ajoutant d'abord 1 g de pepsine et après 6 heures 1 g de Molsine et en exécutant la réaction pendant encore 10 heures.
Le produit résultant est obtenu avec un rendement de 98,3% et a un poids moléculaire moyen de 550 et une teneur en
<EMI ID=29.1>
indique que pour plus de 83%,il a un poids moléculaire de moins de 700.
EXEMPLE 5 -
On répète le mode opératoire de l'exemple l,mais en ajoutant simultanément 1 g de pepsine et 1 g de Sanprose-F.
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
<EMI ID=32.1>
que pour plus de 90%,il a un poids moléculaire de moins de
700.
EXEMPLE 6 -
On répète le mode opératoire de l'exemple l,mais en ajoutant d'abord 1 g de pepsine et après 6 heures 1 g de Sanprose-F et en exécutant la réaction pendant encore
10 heures. Le produit résultant est obtenu avec,un rendement de 96% et a un poids moléculaire moyen de 410 et une teneur en aminoacides libres de 9,2% en poids. Sa filtra-
<EMI ID=33.1>
moléculaire de moins de 700.
EXEMPLE 7 -
On répète le mode opératoire de l'exemple l,mais en ajoutant d'abord 0,25 g de pepsine, après 3 heures 1 g <EMI ID=34.1>
On exécute la réaction pendant encore 10 heures, après quoi on poursuit le traitement comme dans l'exemple 1. Le produit résultant est obtenu avec un rendement de 95% et
a un poids moléculaire moyen de 370 et une teneur en aminoacides libres de 11,3% en poids. Sa filtration sur gel indique que pour plus de 93%, il a un poids moléculaire de moins de 700.
Dans les exemples ci-dessus, les produits sont évalués comme précisé ci-après.
(1) Rendement en produit
Quantité d'azote dans le produit
<EMI ID=35.1>
Quantité d'azote dans la matière première
Le dosage de l'azote est effectué suivant Ejeldahl.
(2) Poids moléculaire moyen d'un produit
(Nombre molaire de radicaux Poids moléculaire moyen des amino par g de produit
<EMI ID=36.1>
la matière première protéique) Nombre molaire de radicaux \
<EMI ID=37.1>
drolyse complète de 1 g de
produit L'analyse quantitative des radicaux amino est effectuée au moyen d'acide trinitrobenzènesulfonique: L'hydrolyse complète du produis est une hydrolyse dans l'acide chlorhydrique 6N à 110[deg.]C pendant 2� heures.
(3) Teneur en aminoacides libres.
On ajoute du carbonate basique de cuivre à une solution du produit pour former avec les aminoacides et les peptides des complexes de cuivre qui sont adsorbés sur une résine échangeuse d'anions sur laquelle on fait passer une solution tampon à l'aciae borique 0,05M pour éluer les aminoacides libres qu'on soumet tour à tour à l'analyse. quantitative au moyen d'un analyseur automatique d'aminoacides. Il convient de noter que l'analyse quantitative <EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
parce que les aminoacides à caractère acide ne sont pas élues par la solution tampon à l'acide borique. Une analyse quantitative précise est possible parce que les peptides sont sans influence sur les aminoacides à caractère acide
à leur position de séparation dans l'analyseur d'aminoacides .
<EMI ID=40.1>
<EMI ID=41.1>
<EMI ID=42.1>
ayant le poids moléculaire fractionnaire minimal.
Bien qu'on ait utilisé le blanc d'oeuf comme matière première protéique dans les exemples ci-dessus, d'autres matières premières protéiques conviennent aussi, par exemple la caséine, le soya, le gluten de froment, la farine de poisson, les chlorelles, les protéines de levure etc. de même que des matières de nature protéique enrichies en aminoacides spécifiques par la réaction à la plastéine. En particulier, lorsque des peptides de bas poids moléculaire sont utilisés dans différents agents nutritifs, le blanc d'oeuf convient le mieux en raison de la nature des aminoacides qui le composent. On dissout la matière première protéique dans de l'eau jusqu'à une concentration en substrat de 5 à 20% poids/volume. Les concentrations plus faibles ne conviennent pas en pratique et les concentrations plus élevées rendent la solution extrêmement visqueuse.
On ajoute les protéases en quantité suffisante pour atteindre le degré désiré de protéolyse,c'est-à-dire d'au moins 1% en poids et de préférence de 2 à 5% en poids, sur base
du Eubstrat. La durée de réaction dépend de la concentration en substrat, de la quantité de protéase, de la tempéra-ture de réaction etc. La réaction doit être achevée avant que les peptides résultants aient été hydrolysés en aminoacides. La température de réaction dépend de la température optimale de la protéase utilisée en particulier. L'acide utilisé aux fins de l'invention peut être un acide fort
ou un acide faible.
A titre de comparaison avec la protéolyse au moyen de la combinaison de deux protéases telle qu'elle
est exécutée dans les exemples conformes à l'invention,
le tableau V ci-après rassemble les résultats de la protéolyse à l'aide d'une protéase unique.
TABLEAU V
<EMI ID=43.1>
La comparaison entre les résultats des exemples et ceux du tableau V révèle que le procédé de l'invention assure la production d'une composition de peptides de bas poids moléculaire avec un rendement élevé à partir de diverses sources protéiques, que la composition est principalement à base de dipeptides et de tripeptides ou de peptides ayant un poids moléculaire de l'ordre de 500 sinon
<EMI ID=44.1> poids sinon moins,de sorte que l'antagonisme d'absorption des aminoacides est affaibli,et que la teneur en peptides de poids moléculaire relativement élevé supérieur à 700 est de 20% sinon moins.
La composition de peptides de bas poids moléculaire principalement à base de dipeptides et de tripeptides utilisée dans l'agent nutritif conforme à l'invention est décrite en détail avec référence particulière à son efficacité et sa préparation.
Du fait que les peptides amenés à un bas poids moléculaire tombant dans un intervalle limité conforme
à l'invention n'avaient jusqu'à présent pas retenu l'attention, aucun procédé pour les préparer n'avait été mis au point. La Demanderesse a mis au point un procédé pour
<EMI ID=45.1>
élevés une composition de peptides de bas poids moléculaire imposé, comme illustré dans les exemples ci-dessus et suivants.
Exemple de fabrication
On dissout la matière première protéique dans
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
d'un acide. On ajoute deux protéases quelconques choisies
<EMI ID=48.1>
ment ou successivement au substrat, chacune en une quantité
<EMI ID=49.1>
pendant 20 à 30 heures. Après désàctivation des protéases, on soumet la solution de réaction à la séparation centrifuge et on évapore le liquide surnageant à siccité. Le produit,obtenu avec un rendement fort élevé sur base de
la matière première protéique, a un poids moléculaire moyen
<EMI ID=50.1> d'un poids moléculaire de 700 ou davantage. Il convient de noter que la matière première protéique utilisée peut comprendre non seulement des matières protéiques d'origine animale, végétale ou microbienne,mais également des matières de nature protéique enrichies en aminoacides spécifiques par la réaction à la plastéine.
La composition de peptides de bas poids moléculaire ainsi obtenue sert de source de protéines ou d'azote dans un agent nutritif conforme à l'invention. Pour démontrer l'efficacité d'un tel agent nutritif, on prépare conformément aux indications du tableau I des aliments contenant une source d'azote formée des mêmes aminoacides constitutifs.
TABLEAU I
<EMI ID=51.1>
Au tableau I, les sources d'azote ont les compo- sitions suivantes:
<EMI ID=52.1>
B ... II composition de peptides ayant un poids molécu-
<EMI ID=53.1> <EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
On donne pendant deux semaines ces aliments à des rats de souche Vistar groupés par 10. Les résultats sont rassemblés au tableau II.
TABLEAU II
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
tient du gain de poids par la consommation d'aliment pour chacune des compositions II, III et IV rapporté au quotient de la composition I pris comme unité. Les résultats du tableau II prouvent que l'aliment contenant la composition de peptides de bas poids moléculaire II principalement à base de dipeptides et de tripeptides est hautement efficace sous
<EMI ID=61.1>
(1) La rétention d'azote in vivo est supérieure d'au moins
<EMI ID=62.1>
dique protéolytique classique) est baucoupp plus élevée que pour l'aliment III (mélange d'aminoacides).
(2) Du fait que l'utilisation de l'azote in vivo est élevée, comme indiqué en (1), le rendement alimentaire de l'aliment II est supérieur d'au moins 20% à celui des autres. En d'autres termes, l'aliment II facilite la croissance et assure un gain de poids sensible.
(3) Le taux de cholestérol sérique observé avec l'aliment II est exceptionnellement bas. L'aliment II est à considérer comme efficace pour faire baisser le taux de cholestérol sanguin.
Une expérience d'absorption in vivo exécutée à l'aide de différentes sources d'azote permet de mettre l'origine de ces différences en évidence.
Pour l'illustration, on introduit par gavage une seule source d'azote dans l'estomac de chacun de cinq rats de souche Wistar qui ont jeûné pendant 24 heures. Ensuite, on saigne les rats à la veine porte et on détermine la concentration en aminoacides dans une prise
de sang pour apprécier l'allure initiale d'augmentation de la teneur en aminoacides du sang. Les sources d'azote sont les sources d'azote I, II, III et IV utilisées pour la préparation des aliments ci-dessus et ayant la même constitution en aminoacides. Les résultats,explicités sous la forme de la valeur moyenne pour les cinq rats,sont rassemblés aux tableaux III et IV. Le tableau III indique l'allure moyenne d'absorption de chaque aminoacide jusqu'à atteindre la valeur maximale. Le tableau IV indique le profil d'absorption des aminoacides des échantillons I à IV en comparaison de la constitution en aminoacides des échantillons administrés.
TABLEAU III
unité: /uM/minute
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
Comme il ressort des résultats rassemblés aux tableaux III et IV, la composition de peptides de bas poids moléculaire utilisée dans l'agent nutritif conforme à l'invention exerce les effets suivants.
(I) La composition de peptides II conforme à l'invention est absorbée plus rapidement que la matière protéique
<EMI ID=66.1> sorption des aminoacides et davantage de solubilité que le mélange d'aminoacides III. La composition de peptides II est plus aisément absorbée que le produit protéolytique IV de type classique et atteint une vitesse d'absorption initiale environ 1,5 à 2,5 lois aussi élevée que celle
de ce dernier produit,pour ce qui est des différents aminoacides et des aminoacides totaux. Il est à supposer que cette différence de vitesse d'absorption est attribuable
à l'antagonisme d'absorption des aminoacides dans le cas
du mélange des aminoacides, à la différence de voie d'absorption dans le cas de la composition peptidique classique et au spectre de poids moléculaire étalé et à la voie d'absorption différente dans le cas de la matière protéique de blanc d'oeuf. Il est évident que la composition de peptides de bas poids moléculaire conforme à l'invention est absorbée plus rapidement parce que les peptides sont de bas poids moléculaire et parce que l'antagonisme d'absorption des aminoacides est atténué. Par conséquent, l'absorption totale d'azote augmente, le rendement alimentaire et le gain de poids s'améliorent et le taux de cholestérol sérique diminue, comme déjà indiqué.
(2) Il est désirable que l'absorption des aminoacides
se rapproche du profil de constitution en aminoacides X
de chaque agent nutritif administré. Le tableau IV montre que la matière protéique de blanc d'oeuf I et le mélange d'aminoacides III s'écartent beaucoup de la constitution initiale en aminoacides en particulier pour Phe, Tyr et
<EMI ID=67.1>
présente un profil d'absorption des aminoacides qui est à peu près le profil idéal,ce qui assure une absorption bien équilibrée.
Les résultats expérimentaux ci-dessus démontrent à l'évidence qu'une composition de peptides de bas poids moléculaire principalement à base de dipeptides et de tripeptides offrant les nombreux avantages énumérés peut constituer une source d'azote ou de protéine très efficace pour un agent nutritif.
Conformément à l'invention, cette composition de peptides de bas poids moléculaire est produite par hydrolyse enzymatique d'une matière première protéique appropriée quelconque. Du fait que la composition ainsi obtenue ne peut comprendre d'autres aminoacides que ceux existant dans la matière première, le blanc d'oeuf constitue la matière première préférée en raison de sa constitution en aminoaci des. Certaines matières premières conduisent à
des compositions de peptides de bas poids mol éculaire dont la constitution en aminoacides s'écarte de la constitution idéale en aminoacides. De préférence, en fonction de l'application envisagée pour la composition de peptides de bas poids moléculaire, une matière première appropriée peut être choisie ou bien les aminoacides essentiels désirés peuvent être ajoutés à la composition de peptides
avant que celle-ci soit incorporée à un agent nutritif.
Par exemple, si la composition de peptides obtenue manque
<EMI ID=68.1>
nature d'une matière première particulière, ces amincacides essentiels peuvent être ajoutés en complément. Lorsqu'un aminoacide particulier est nécessaire pour le traitement d'un patient, il peut être ajouté à la composition de peptides obtenue. La constitution en aminoacides de
la composition de peptides peut être ajustée à volonté de la sorte.
Il entre dans le cadre de l'invention que la teneur en aminoacides libres soit limitée à environ 20% <EMI ID=69.1>
gique tenant à l'absorption plus rapide de la composition de peptideset pour réduire au minimum l'antagonisme d'absorption des aminoacides. La teneur en peptides de poids moléculaire relativement élevé à savoir supérieur à 700,doit être limitée à 20% en poids sinon à une valeur plus faible pour empêcher que l'absorption initiale ralentisse.
L'agent nutritif conforme à l'invention peut trouver de nombreuses applications. Il peut être considéré comme agent nutritif par voie orale ou comme agent nutritif par voie entérique à administrer directement dans l'estomac ou l'intestin en mélange ou non avec un autre agent nutritif approprié.. Lorsque la saveur de l'agent nutritif doit entrer en ligne de compte, il peut être mélangé avec tout additif convenant à cette fin. Comme l'agent nutritif conforme à l'invention a des propriétés d'absorption remarquables différentes de celles des protéines et des aminoacides, il est hautement efficace pour l'alimentation des patients cachectiques ou de constitution faible et des enfants. L'amélioration du rendement alimentaire et la réduction du taux de cholestérol suggèrent que l'agent nutritif de l'invention convient également pour les gens d'âge moyen.
Pour l'alimentation d'un patient avant ou après une opération, l'agent
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cace que les agents nutritifs classiques tels que les mélanges d'aminoacides et produits d'hydrolyse de protéines solubilisées.
<EMI ID=71.1> peptides de bas poids moléculaire, caractérisé en ce qu'on disperse une matière première protéique d'origine appropriée quelconque dans de l'eau en une concentration de 5 à 20%
en poids, on ajuste le pH de la dispersion à une valeur de
1 à 4 à l'aide d'un acide, on ajoute au moins deux protéases acides simultanément ou successivement à la dispersion et on laisse la protéolyse enzymatique progresser pendant 8 à
72 heures à une température de 25 à 60[deg.]C pour obtenir une composition de peptides de bas poids moléculaire principalement à base de dipeptides et de tripeptides tout en supprimant la formation des aminoacides libres.
2 - Procédé de production d'une composition de
Method for producing a low peptide composition
molecular weight and nutrient containing it.
The present invention relates to a method of
production of a protein or peptide composition
low molecular weight mainly based on dipeptides and tripeptides, as well as a nutrient to
administer orally or enterally comprising the low molecular weight peptide composition thus produced.
So far, especially in the food industry, peptides and amino acids have been obtained
by enzymatic hydrolysis of proteinaceous materials. However,
these operations were limited to enzymatic hydrolysis
proteinaceous materials for their solubilization and for
conversion of proteinaceous materials into lower polymers (with a molecular weight greater than a few thousand)
usable for food. The nature of the proteolytic products has received attention, but it is not the same for their molecular weight.
The Applicant's research on the digestion and absorption of the enzymatic hydrolysis product of a protein material has revealed
(1) that the reduction of. average molecular weight at 1500 if not less and preferably at 700 if not less, (2) than
<EMI ID = 1.1>
area of 2000 or more and preferably 1000 or
<EMI ID = 2.1>
<EMI ID = 3.1>
if not less, i.e. the production of a composition of low molecular weight peptides mainly at
based on dipeptides and tripeptides, offer a number of advantages listed below.
(1) This composition of low molecular weight peptides differs in the enteric absorption of proteinaceous materials and mixtures of amino acids containing the same constituent amino acids. The total nitrogen absorption rate is higher and the absorption antagonism between amino acids is minimized.
(2) The composition constitutes an effective source of nitrogen
due to a better nitrogen balance.
(3) The weight gain is remarkably; increased.
(4) The blood cholesterol level is lowered.
Conventional peptide products have a low degree of proteolysis or have an extremely high content of free amino acids. In other words, due to
the diversity of the degree of proteolysis, they contain from peptides with a molecular weight of a few tens of thousands to free amino acids. Some pronounced says an average molecular weight higher than a few
<EMI ID = 4.1>
free acids.
The Applicant has discovered that when
is used as a nutrient, a composition of peptides limited in a narrow range of molecular weight is more effective for digestion and absorption and also for physiological food than the products ha-
<EMI ID = 5.1>
mixtures of peptides having a broad molecular weight spectrum or mixtures of amino acids. The composition of
<EMI ID = 6.1>
nutritive according to the invention is mainly based on dipeptides and tripeptides and contains 20% by weight if not less of peptides with a molecular weight of 700 or
<EMI ID = 7.1>
the composition being produced by adjusting the molecular weight of the starting protein material as specified above.
Recently, it has been accepted that dipeptides
and tripeptides are easily absorbed enterically. The Applicant has for the first time confirmed this hypothesis by in vivo experiments on a mixture of these peptides, as described in more detail below.
We have also discovered that although mixtures of free amino acids tend to be unevenly absorbed due to antagonism or reduced solubility, low molecular weight peptides escape this unevenness of absorption. Therefore, the low molecular weight peptide compositions described above are preferred protein sources for a nutrient.
<EMI ID = 8.1>
low molecular weight peptides which have the apparent utility mentioned above, no efficient process for producing them has been developed so far.
The first object of the invention is therefore to provide a process for producing a composition of low molecular weight peptides mainly based on
of dipeptides and trip eptides, that is to say having an average molecular weight of about 400, and an amino acid content
<EMI ID = 9.1>
The invention also aims to provide a process for the production of a composition of low molecular weight peptides as specified above from a protein raw material of any suitable origin, with a high yield.
A further object of the invention is to provide a process for producing a low molecular weight peptide composition in which the amino acid absorption antagonism is minimized and the content of free amino acids is lowered.
A second object of the invention is to provide
a nutrient comprising a composition of low molecular weight peptides mainly based on dipep-
<EMI ID = 10.1>
effective because it manifests a reduction in the amino acid absorption antagonism, an increase in solubility, an increase in the total nitrogen absorption rate and an improvement in the nitrogen balance.
The invention further aims to provide a nutritive agent containing low-weight peptides.
<EMI ID = 11.1> <EMI ID = 12.1>
blood cholesterol -
Another object of the invention is to provide a nutrient in which the protein material is hydrolyzed into low absorbable low molecular weight peptides which are typically dipeptides and tripeptides so that the agent can be administered not only as a nutrient for use oral allowing easy feeding, but also as a nutritive agent for enteric use introduced directly into the stomach of weakened patients.
According to its first aspect, the invention has for. subject a process for producing a composition of low molecular weight peptides, characterized in that a protein raw material of any suitable origin is dispersed
<EMI ID = 13.1>
the pH of the dispersion is adjusted to a value of 1 to 4 using an acid, at least two acid proteases are added simultaneously or successively to the dispersion and the enzyme proteolysis is allowed to progress for 8 to 72 hours
at a temperature of 25 to 60 [deg.] C, so as to produce a
<EMI ID = 14.1>
based on dipeptides and tripeptides while suppressing the formation of free amino acids.
The invention further relates to a process for producing a composition of low molecular weight peptides such as the contents of free amino acids and
in peptides having a molecular weight of at least 700 in the enzymatic proteolysis product are each 20% if not less.
According to a second aspect, the subject of the invention is a nutritive agent comprising a composition of low molecular weight pep-tides mainly based on
<EMI ID = 15.1>
obtained by proteolysis of a protein raw material with suppression of the formation of free amino acids.
According to a preferred embodiment of the invention, the contents of free amino acids and peptides with a molecular weight of at least 700 are each
<EMI ID = 16.1>
enzymatic. The low molecular weight peptide composition of the nutrient may further contain a
or more amino acids required, if desired.
There is no discussion in the literature of low molecular weight peptides formed mainly of dipeptides and tripeptides which offer the many advantages which can be deduced from experimental results.
<EMI ID = 17.1>
to coat such low molecular weight peptides from a protein raw material of any suitable origin, the Applicant has highlighted the following facts
(see table V).
(1) Although pepsin has the highest solubilizing power among proteases, it is difficult to lower the average molecular weight to 1000 if not less with pepsin because hydrolysis of a protein material by pepsin does not progresses more easily after a given molecular weight has been reached.
(2) Neutral proteases have a lower proteolytic activity than that of acid proteases and only pronase can lower the average molecular weight of a proteolytic product to 1000 if not less. However, since pronase is a mixture of proteases,
it produces free amino acids with an abundance <EMI ID = 18.1>
500.
(3) Acid proteases have the best proteolytic activity and among these proteases, Molsine (manufactured and
<EMI ID = 19.1>
<EMI ID = 20.1>
among others are particularly effective in minimizing the formation of free amino acids.
(4) None of the proteases currently available can lower the molecular weight to the desired fabile value when used alone. Examination of proteolysis reactions using different combinations of proteases has shown that combinations of proteases
<EMI ID = 21.1>
effective in lowering molecular weight to as low as desired and in lowering the content of free amino acids.
The invention is further illustrated without being limited by the following examples and is susceptible to different variants and modifications without departing from the sound. frame. For example, the proteases used can be chosen from the proteases of fungal and oacterial origin such as the proteases of Ehizopus, of Aspergillus,
of Penicillium and Bacillus. Papain and bromelain, which are of plant origin, are also effective. In addition, some special proteases, such as carboxypeptidases
<EMI ID = 22.1>
or amino-di- or tripeptidases, can obviously also be used.
EXAMPLE 1 -
50 g of dried egg white are dissolved (with a content <EMI ID = 23.1>
adjust the pH of the resulting solution to 3 with aqueous hydrochloric acid, adjust simultaneously to the solution 1 g of Molsine and 1 g of Sanprose-F and carry out the reaction
<EMI ID = 24.1>
at pH 3. At the end of the reaction, the solution is heated
at 100 [deg.] C for 10 minutes to deactivate the proteases, then it is subjected to centrifugal separation at 3000 revolutions per minute (1500 g) for 10 minutes. The insolubles are separated and the supernatant liquid is lyophilized. This product is obtained with a yield of 93.2% based on the protein raw material and has an average molecular weight
<EMI ID = 25.1>
more than 88% by weight, it has a molecular weight of less
700. It should be noted that substances with a molecular weight of less than 700 cannot be identified by gel filtration. The content of free amino acids in the product is 8.5% by weight.
<EMI ID = 26.1>
The procedure of Example 1 is repeated, but first adding 1 g of Molsine and 8 hours later 1 g of Sanprose -F and carrying out the reaction for a further
10 hours. The resulting product is obtained with a yield of 93.9% and has an average molecular weight of 350 and a content of free amino acids of 8.1%. Its gel filtration indicates that for more than 90%, it has a molecular weight of less than 700.
EXAMPLE 3 -
The procedure of Example 1 is repeated, but simultaneously adding 1 g of pepsin and 1 g of Molsine. The product is obtained with a yield of 96.1% and has an average molecular weight of 510 and a content of <EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1>
less than 700.
EXAMPLE 4 -
The procedure of Example 1 is repeated, but first adding 1 g of pepsin and after 6 hours 1 g of Molsine and carrying out the reaction for a further 10 hours.
The resulting product is obtained with a yield of 98.3% and has an average molecular weight of 550 and a content of
<EMI ID = 29.1>
indicates that for more than 83%, it has a molecular weight of less than 700.
EXAMPLE 5 -
The procedure of Example 1 is repeated, but simultaneously adding 1 g of pepsin and 1 g of Sanprose-F.
<EMI ID = 30.1>
<EMI ID = 31.1>
<EMI ID = 32.1>
that for more than 90%, it has a molecular weight of less than
700.
EXAMPLE 6 -
The procedure of Example 1 is repeated, but first adding 1 g of pepsin and after 6 hours 1 g of Sanprose-F and carrying out the reaction for a further
10 hours. The resulting product is obtained with a yield of 96% and has an average molecular weight of 410 and a free amino acid content of 9.2% by weight. Its filter
<EMI ID = 33.1>
molecular of less than 700.
EXAMPLE 7 -
The procedure of Example 1 is repeated, but first adding 0.25 g of pepsin, after 3 hours 1 g <EMI ID = 34.1>
The reaction is carried out for a further 10 hours, after which the treatment is continued as in Example 1. The resulting product is obtained with a yield of 95% and
has an average molecular weight of 370 and a free amino acid content of 11.3% by weight. Its gel filtration indicates that for more than 93%, it has a molecular weight of less than 700.
In the examples above, the products are evaluated as specified below.
(1) Product yield
Amount of nitrogen in the product
<EMI ID = 35.1>
Quantity of nitrogen in the raw material
The nitrogen determination is carried out according to Ejeldahl.
(2) Average molecular weight of a product
(Molar number of radicals Average molecular weight of amino per g of product
<EMI ID = 36.1>
protein raw material) Molar number of radicals \
<EMI ID = 37.1>
complete drolysis of 1 g of
product Quantitative analysis of the amino radicals is carried out using trinitrobenzenesulfonic acid: The complete hydrolysis of the product is a hydrolysis in 6N hydrochloric acid at 110 [deg.] C for 2 # hours.
(3) Content of free amino acids.
Basic copper carbonate is added to a solution of the product to form, with amino acids and peptides, copper complexes which are adsorbed on an anion exchange resin over which a 0.05M boric acid buffer solution is passed. to elute the free amino acids which are subjected in turn to analysis. quantitative using an automatic amino acid analyzer. It should be noted that the quantitative analysis <EMI ID = 38.1>
<EMI ID = 39.1>
because the acidic amino acids are not eluted by the boric acid buffer solution. Precise quantitative analysis is possible because peptides have no influence on acidic amino acids
at their separation position in the amino acid analyzer.
<EMI ID = 40.1>
<EMI ID = 41.1>
<EMI ID = 42.1>
having the minimum fractional molecular weight.
Although egg white was used as the protein raw material in the examples above, other protein raw materials are also suitable, for example casein, soy, wheat gluten, fishmeal, chlorella, yeast protein etc. as well as proteinaceous materials enriched in specific amino acids by the reaction to plasteine. In particular, when low molecular weight peptides are used in different nutrients, egg white is best suited due to the nature of the amino acids that make it up. The protein raw material is dissolved in water to a substrate concentration of 5 to 20% w / v. The lower concentrations are not suitable in practice and the higher concentrations make the solution extremely viscous.
Proteases are added in an amount sufficient to achieve the desired degree of proteolysis, i.e. at least 1% by weight and preferably 2 to 5% by weight, based
of Eubstrate. The reaction time depends on the substrate concentration, the amount of protease, the reaction temperature etc. The reaction must be completed before the resulting peptides have been hydrolyzed to amino acids. The reaction temperature depends on the optimal temperature of the protease used in particular. The acid used for the purposes of the invention may be a strong acid
or a weak acid.
For comparison with proteolysis using the combination of two proteases as it
is carried out in the examples according to the invention,
Table V below collates the results of the proteolysis using a single protease.
TABLE V
<EMI ID = 43.1>
The comparison between the results of the examples and those of Table V reveals that the process of the invention ensures the production of a composition of low molecular weight peptides with a high yield from various protein sources, that the composition is mainly base of dipeptides and tripeptides or peptides having a molecular weight of the order of 500 otherwise
<EMI ID = 44.1> weight if not less, so that the amino acid absorption antagonism is weakened, and the content of relatively high molecular weight peptides greater than 700 is 20% if not less.
The composition of low molecular weight peptides mainly based on dipeptides and tripeptides used in the nutrient agent according to the invention is described in detail with particular reference to its effectiveness and its preparation.
Because the peptides brought to a low molecular weight falling within a limited conforming range
the invention had so far received no attention, no process for preparing them had been developed. The Applicant has developed a method for
<EMI ID = 45.1>
a composition of peptides of low molecular weight imposed, as illustrated in the examples above and following.
Manufacturing example
The protein raw material is dissolved in
<EMI ID = 46.1>
<EMI ID = 47.1>
of an acid. Any two selected proteases are added
<EMI ID = 48.1>
or successively to the substrate, each in a quantity
<EMI ID = 49.1>
for 20 to 30 hours. After deactivation of the proteases, the reaction solution is subjected to centrifugal separation and the supernatant liquid is evaporated to dryness. The product, obtained with a very high yield based on
the protein raw material, has an average molecular weight
<EMI ID = 50.1> with a molecular weight of 700 or more. It should be noted that the protein raw material used can comprise not only protein materials of animal, plant or microbial origin, but also materials of a protein nature enriched in specific amino acids by the reaction to plasteine.
The composition of low molecular weight peptides thus obtained serves as a source of protein or nitrogen in a nutritive agent according to the invention. To demonstrate the effectiveness of such a nutrient, food containing a source of nitrogen formed from the same constituent amino acids is prepared in accordance with the indications in Table I.
TABLE I
<EMI ID = 51.1>
In Table I, the nitrogen sources have the following compositions:
<EMI ID = 52.1>
B ... II composition of peptides having a molecular weight
<EMI ID = 53.1> <EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
<EMI ID = 56.1>
<EMI ID = 57.1>
<EMI ID = 58.1>
These feeds are given for two weeks to Vistar strain rats grouped by 10. The results are collated in Table II.
TABLE II
<EMI ID = 59.1>
<EMI ID = 60.1>
is due to the weight gain by the consumption of food for each of compositions II, III and IV relative to the quotient of composition I taken as a unit. The results of Table II prove that the food containing the composition of low molecular weight peptides II mainly based on dipeptides and tripeptides is highly effective under
<EMI ID = 61.1>
(1) Nitrogen retention in vivo is at least higher
<EMI ID = 62.1>
classic proteolytic content) is much higher than for food III (mixture of amino acids).
(2) Because the use of nitrogen in vivo is high, as indicated in (1), the food yield of food II is at least 20% higher than that of the others. In other words, food II facilitates growth and ensures significant weight gain.
(3) The serum cholesterol level observed with food II is exceptionally low. Food II is to be considered effective in lowering blood cholesterol levels.
An in vivo absorption experiment carried out using different sources of nitrogen makes it possible to highlight the origin of these differences.
For illustration, a single source of nitrogen is introduced by gavage into the stomach of each of five Wistar rats who fasted for 24 hours. Next, the rats are bled in the portal vein and the concentration of amino acids in a dose is determined.
of blood to assess the initial rate of increase in the amino acid content of the blood. The nitrogen sources are the nitrogen sources I, II, III and IV used for the preparation of the above foods and having the same amino acid constitution. The results, explained in the form of the mean value for the five rats, are collated in Tables III and IV. Table III indicates the average rate of absorption of each amino acid until the maximum value is reached. Table IV shows the amino acid absorption profile of samples I to IV in comparison with the amino acid constitution of the administered samples.
TABLE III
unit: / µM / minute
<EMI ID = 63.1>
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
As can be seen from the results collated in Tables III and IV, the composition of low molecular weight peptides used in the nutrient agent according to the invention has the following effects.
(I) The composition of peptides II according to the invention is absorbed faster than the protein material
<EMI ID = 66.1> sorption of amino acids and more solubility than the mixture of amino acids III. The composition of peptides II is more easily absorbed than the conventional proteolytic product IV and reaches an initial absorption rate approximately 1.5 to 2.5 laws as high as that
of the latter product, with respect to the different amino acids and total amino acids. Presumably this difference in absorption rate is attributable
to the amino acid absorption antagonism in the case
of the amino acid mixture, unlike the absorption pathway in the case of the conventional peptide composition and with a spread molecular weight spectrum and a different absorption pathway in the case of the egg white protein material. It is obvious that the composition of low molecular weight peptides according to the invention is absorbed more quickly because the peptides are of low molecular weight and because the absorption antagonism of amino acids is attenuated. As a result, total nitrogen uptake increases, food yield and weight gain improve, and serum cholesterol levels decrease, as already noted.
(2) It is desirable that the absorption of amino acids
approximates the amino acid constitution profile X
of each nutrient administered. Table IV shows that the egg white protein material I and the mixture of amino acids III differ greatly from the initial amino acid constitution, in particular for Phe, Tyr and
<EMI ID = 67.1>
has an amino acid absorption profile which is about the ideal profile, which ensures a well-balanced absorption.
The above experimental results clearly demonstrate that a composition of low molecular weight peptides mainly based on dipeptides and tripeptides offering the many advantages listed can constitute a very effective source of nitrogen or protein for a nutritive agent. .
According to the invention, this composition of low molecular weight peptides is produced by enzymatic hydrolysis of any suitable protein raw material. Because the composition thus obtained cannot comprise other amino acids than those existing in the raw material, egg white constitutes the preferred raw material because of its amino acid composition. Certain raw materials lead to
low molecular weight peptide compositions whose amino acid constitution deviates from the ideal amino acid constitution. Preferably, depending on the application envisaged for the composition of low molecular weight peptides, an appropriate raw material can be chosen or else the desired essential amino acids can be added to the peptide composition.
before it is incorporated into a nutrient.
For example, if the composition of peptides obtained is missing
<EMI ID = 68.1>
nature of a particular raw material, these essential amino acids can be added as a supplement. When a particular amino acid is required for the treatment of a patient, it can be added to the resulting peptide composition. The amino acid constitution of
the composition of peptides can be adjusted as desired.
It is within the scope of the invention that the content of free amino acids is limited to around 20% <EMI ID = 69.1>
This is due to the faster absorption of the peptide composition and to minimize the absorption antagonism of the amino acids. The content of peptides of relatively high molecular weight, ie greater than 700, must be limited to 20% by weight if not to a lower value to prevent the initial absorption from slowing down.
The nutritive agent according to the invention can find numerous applications. It can be considered as an oral nutritive agent or as an enteric nutritive agent to be administered directly to the stomach or intestine, mixed or not with another suitable nutritive agent. When the flavor of the nutritive agent must enter ultimately, it can be mixed with any additive suitable for this purpose. As the nutritive agent according to the invention has remarkable absorption properties different from those of proteins and amino acids, it is highly effective for the nutrition of cachectic or weak-constitution patients and children. The improvement in food yield and the reduction in cholesterol levels suggest that the nutrient of the invention is also suitable for middle-aged people.
For feeding a patient before or after an operation, the agent
<EMI ID = 70.1>
cace than conventional nutrients such as mixtures of amino acids and hydrolysis products of solubilized proteins.
<EMI ID = 71.1> low molecular weight peptides, characterized in that a protein raw material of any suitable origin is dispersed in water in a concentration of 5 to 20%
by weight, the pH of the dispersion is adjusted to a value of
1 to 4 using an acid, at least two acid proteases are added simultaneously or successively to the dispersion and the enzymatic proteolysis is allowed to progress for 8 to
72 hours at a temperature of 25 to 60 [deg.] C to obtain a composition of low molecular weight peptides mainly based on dipeptides and tripeptides while suppressing the formation of free amino acids.
2 - Process for producing a composition of