<EMI ID=1.1> La présente invention concerne un système continu Amélioré pour fixer ou immobiliser des enzymes sur un support
<EMI ID=2.1>
luire dans le présent mémoire. Spécifiquement, on a constaté que, conformément à l'invention, la fixation, la liaison ou l'immobilisation des enzymes ne doit pas être attribuée à un type quelconque d'adsorbant ou de support d'une nature ionique, mais simplement à une liaison "physique" des enzymes avec le support.
En particulier, on a observé que la fixation des enzymes peut se faire avec des résines tant cationiques qu'anioniques dont la nature ionique a été détruite, aussi bien qu'avec des résines polymères macroporeuses n'ayant aucun comportement ionique, quel qu'il soit.
Bien entendu, on sait que les enzymes peuvent être fixées sur tous les types de supports semblables à des résines d'une nature ionique, ou sur des corps d'alumine dont les dimensions des pores sont déterminées selon une gamme spécifiée.
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ponsable de l'immobilisation des enzymes. Dans le second cas, les enzymes sont en quelque sorte "piégées" dans les pores du corps d'alumine (dont les dimensions ont une ouverture maximale
o
<EMI ID=4.1>
Il n'est pas évident qu'un adsorbant macroporeux ou
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rablement plus grandes, c'est-à-dire de 1000 à 90.000 A et dont la nature n'est pas ionique, adsorbe des enzymes.
On a constaté également que ces résines macroporeuses ou macroréticulaires maintiennent l'activité enzymatique beaucoup plus longtemps que d'autres supports, ce qui permet le passage de plus de volumes de lit de substrat et, par conséquent, de plus de produit. Finalement, on a encore observé que la consommation totale des enzymes est nettement plus basse.
La présente invention peut être mise en oeuvre avec une large gamme de systèmes macroporeux et plusieurs carbohydrases telles que la 8-amylase, l'a-amylase, la glucoamylase, l'amylase fongique, l'isoamylase et l'isomérase de glucose.
Seules l'isomérase de glucose, la glucoamylase et la 8-amylase sont utilisées. On notera bien entendu que l'invention peut aussi être mise en oeuvre avec d'autres enzymes du type carbohydrase et sur des substrats comprenant d'autres constituants du sucre, afin d'obtenir des produits finals dotés de caractéristiques différentes.
Exemple 1 : Essai avec une isomérase liée
Une colonne, dont le rapport du diamètre à la hauteur est de 1,8 à 1, est remplie de 250 cm3 d'une résine échangeuse d'anions faiblement basique du type du groupe fonctionnel des amines tertiaires, et ce selon un cycle dit de chlorure
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Après remplissage de la colonne, on la lave au méthanol et on la balaie avec un tampon au pH 7. La colonne est en-
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
pH 7,5 et désaérée avec de l'azote. 1,1 g d'isomérase de glucose liquide provenant du streptomyces olivochromogènes et se caractérisant par 2500 unités d'activité par ml, passe dans la colonne à une vitesse de 0,25 volume de lit par heure. Ensuite, la solution de dextrose passe immédiatement après le dépôt de l'enzyme dans la colonne.
<EMI ID=9.1>
lit par heure et à une température constante de 66[deg.]C. Le substrat a une concentration de 53%,
<EMI ID=10.1>
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
<EMI ID=13.1>
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
54%,
<EMI ID=16.1>
Cet essai démontre que l'on peut s'attendre à un bon rendement et à une bonne efficacité.
Exemple 3: Essai avec une glucoamylase
La résine utilisée est celle dénommée IRA 983 de Rohm & Haas également. La colonne est préparée de la même façon qu'aux exemples 1 et 2 , mais tamponnée au pH 4,2, au lieu de 7.
Le substrat est un hydrolysat d'amidon enzyme-enzyme d'un équivalent en dextrose de 18. La température de la colonne
<EMI ID=17.1>
volume de lit par heure, On utilise 2 g de glucoamylase se caractérisant par 180 unités d'activité par gramme. La substance sèche du substrat est de 30%. On utilise 50 cm3 de support.
<EMI ID=18.1>
On travaille à un débit constant de 0,5 volume de lit par heure et à une température constante de 60[deg.]C. La consommation d'enzyme est de 0,05% (procédé classique = ) Exemple 4: Immobilisation d'une isomérase montrant la nature
non ionique de la fixation
On utilise la résine ES 762 qui est une résine expérimentale fournie par Diaprosim, Il s'agit d'un polymère macroporeux qui n'exerce aucune activité d'échange d'ions, mais qui absorbe largement l'enzyme.
<EMI ID=19.1>
des monomères, puis une colonne de 50 cm3 est construite.
On tamponne la résine au pH 8,3 en utilisant une
<EMI ID=20.1>
circuler au débit de 0,5 volume de lit par heure.
L'enzyme utilisée est une isomérase de glucose dérivée du Streptomyces olivochromogenes et se caractérisant par
1000 unités d'activité par gramme, et ce au niveau de 1 g par
<EMI ID=21.1>
de 0,2 volume de lit par heure pendant 24 heures. Une solution de dextrose à 50% contenant 10 �<2> mole de magnésium et 10 <3> mole de cobalt passe à travers la colonne au débit de 0,4 volume de lit par heure initialement.
<EMI ID=22.1>
L'enzyme isomérase est retenue par la résine.
Exemple 5 : Immobilisation d'une glucoamylase montrant la nature
non ionique Ce la fixation
Même support que celui de l'exemple 4.
On tamponne au pH 4,2 en utilisant une solution à 1% de CH3COO Na-CH3COOH, en la faisant recirculer au débit de 0,5 volume de lit par heure.
L'enzyme est la glucoamylase liquide G990 se caractérisant par 180 unités d'activité par 4 gr, de 6990 pour 50 cm3 de support par remise en circulation de l'enzyme au débit de 0,2 volume de lit par heure pendant 24 heures. On introduit dans la colonne une maltodextrine dont l'équivalent en dextrose est
15 et dont la teneur en substance sèche est de 30%.
On travaille à 55[deg.]C.
<EMI ID=23.1>
L'enzyme glucoamylase est retenue par la résine.
<EMI ID=24.1>
non-ionique de la fixation
Même support que ceux des exemples 4 et 5 et même tampon que celui de l'exemple 5. 0,1 g par litre de cystéine
<EMI ID=25.1>
L'enzyme est la 6-amylase XP 206 en poudre de Nagase, qui est tout d'abord extraite avec de l'eau pendant 30 minutes,'puis
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
Le substrat est chelaté, avant son introduction dans la colonne, pour éliminer les ions métalliques.
<EMI ID=31.1>
Exemple 7 : Immobilisation d'une isomérase sur une résine
cationique.
La résine utilisée est la C264 de Diaprosim. Il s'agit d'un copolymère de styrène avec un groupe sulfonique. La résine n'a aucune nature anionique.
On construit une colonne de 250 cm3 et on la lave
<EMI ID=32.1>
On tamponne de la même façon qu'à l'exemple 4. Le dépôt de l'enzyme se fait en utilisant l'isomérase liquide C992 à raison de 2 g par 250 cm3 de support au débit de 0,2
<EMI ID=33.1>
On utilise une solution de dextrose à 60[deg.]C et on règle au pH 8,3 avec 10 �2 mole de magnésim et 10 �3 mole de cobalt.
La concentration du substrat correspond aux 53% d'un équivalent en dextrose enzyme-enzyme de 96.
<EMI ID=34.1>
Bien que le débit en volume de lit par heure et les rendements en lévulose soient plutôt bas, ces chiffres montrent que l'isomérase est retenue par le support.
Dans l'exemple suivant, on utilise la résine Amberlite XN 1009 (=XAD 12) fabriquée par Rohm & Haas; il s'agit d'un adsorbant macroréticulaire comprenant des groupes azote très polaires.
Exemple 8 : Fixation de la glucoamylase
L'adsorbant XN 1009 (500 cm3) est (1) lavé avec trois volumes de NaOH pour le débarrasser de la protéine et des colorants, (2) lavé de nouveau et (3) neutralisé entièrement par 2 volumes de HCl.
Après élimination par lavage de l'excès d'acide,
la résine est tamponnée avec un tampon à l'acétate au pH 4,2.
Après tamponnage, la température est portée à 60[deg.]C et l'enzyme est ajoutée comme suit :
1. Adoucissement pour équilibrer la pression osmotique en envoyant du dextrose 17,5 Bé sur la résine;
2. Dépôt d'enzyme : 900 unités de glucoamylase (G990) sont déposés en deux heures (1 volume de lit par heure).
L'enzyme est dissoute dans la solution de dextrose semblable à celle utilisée pour l'adoucissement.
3. Un hydrolysat enzyme-enzyme dont la teneur en substance sèche est 30,6% et l'équivalent en dextrose 18, est préparé. La solution à bas équivalent en dextrose et dont le pH est 4,2, est introduite dans la colonne.
Le débit est porté à 0,2 volume de lit par heure.
Les données moyennes suivantes sont enregistrées:
<EMI ID=35.1>
lit par heure 200 heures.
Le débit est ensuite réduit à 0,1 volume de lit par heure pour maintenir l'équivalent en dextrose à 96-97. Durée du débit de 0,1 volume de lit par
heure 250 heures Durée totale 450 heures
L'équivalent en dextrose ne tombe ensuite qu'à 64 et la'colonne est arrêtée.
Enzyme utilisée (total)
<EMI ID=36.1>
Consommation moyenne de l'essai discontinu: 150 unités par kg. Commentaire
<EMI ID=37.1>
XN 1009 neutralisé.
REVENDICATIONS
1.- Procédé pour conduire une réaction enzymatique consistant à mettre le substrat en contact avec une enzyme afin de le faire réagir avec ladite enzyme qui a été adsorbée par un système macroporeux, caractérisé en ce que la dimension des pores du systèmes macroporeux est suffisamment grande pour adsorber l'enzyme.
<EMI ID = 1.1> The present invention relates to an Improved continuous system for fixing or immobilizing enzymes on a support
<EMI ID = 2.1>
shine in this memo. Specifically, it has been found that, in accordance with the invention, the attachment, binding or immobilization of enzymes should not be attributed to any type of adsorbent or carrier of an ionic nature, but simply to binding. "physics" of the enzymes with the support.
In particular, it has been observed that the binding of enzymes can be done with both cationic and anionic resins, the ionic nature of which has been destroyed, as well as with macroporous polymer resins having no ionic behavior whatsoever. is.
Of course, it is known that the enzymes can be attached to all types of resin-like supports of an ionic nature, or to alumina bodies whose pore sizes are determined within a specified range.
<EMI ID = 3.1>
responsible for immobilizing enzymes. In the second case, the enzymes are somehow "trapped" in the pores of the alumina body (the dimensions of which have a maximum opening
o
<EMI ID = 4.1>
It is not obvious that a macroporous adsorbent or
<EMI ID = 5.1>
considerably larger, that is to say from 1000 to 90,000 A and whose nature is not ionic, adsorbs enzymes.
These macroporous or macroreticular resins have also been found to maintain enzyme activity much longer than other carriers, allowing the passage of more substrate bed volumes and therefore more product. Finally, it was further observed that the total consumption of enzymes is significantly lower.
The present invention can be implemented with a wide range of macroporous systems and several carbohydrases such as 8-amylase, α-amylase, glucoamylase, fungal amylase, isoamylase and glucose isomerase.
Only glucose isomerase, glucoamylase and 8-amylase are used. It will of course be noted that the invention can also be implemented with other enzymes of the carbohydrase type and on substrates comprising other constituents of sugar, in order to obtain final products endowed with different characteristics.
Example 1: Assay with a bound isomerase
A column, the diameter to height ratio of which is 1.8 to 1, is filled with 250 cm3 of a weakly basic anion exchange resin of the type of the functional group of tertiary amines, and this according to a cycle known as chloride
<EMI ID = 6.1>
After filling the column, it is washed with methanol and swept with a pH 7 buffer. The column is loaded.
<EMI ID = 7.1>
<EMI ID = 8.1>
pH 7.5 and deaerated with nitrogen. 1.1 g of liquid glucose isomerase from olivochromogenic streptomyces and characterized by 2500 activity units per ml, passes through the column at a rate of 0.25 bed volume per hour. Then, the dextrose solution passes immediately after the enzyme is deposited in the column.
<EMI ID = 9.1>
bed per hour and at a constant temperature of 66 [deg.] C. The substrate has a concentration of 53%,
<EMI ID = 10.1>
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1>
<EMI ID = 13.1>
<EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
54%,
<EMI ID = 16.1>
This test shows that one can expect a good yield and a good efficiency.
Example 3: Test with a glucoamylase
The resin used is that called IRA 983 from Rohm & Haas as well. The column is prepared in the same way as in Examples 1 and 2, but buffered to pH 4.2, instead of 7.
The substrate is an enzyme-enzyme starch hydrolyzate with a dextrose equivalent of 18. Column temperature
<EMI ID = 17.1>
bed volume per hour. 2 g of glucoamylase, characterized by 180 activity units per gram, are used. The dry substance of the substrate is 30%. 50 cm3 of support is used.
<EMI ID = 18.1>
Work is carried out at a constant flow rate of 0.5 bed volume per hour and at a constant temperature of 60 [deg.] C. The enzyme consumption is 0.05% (conventional method =) Example 4: Immobilization of an isomerase showing the nature
non-ionic fixation
The ES 762 resin is used which is an experimental resin supplied by Diaprosim. It is a macroporous polymer which does not exercise any ion exchange activity, but which largely absorbs the enzyme.
<EMI ID = 19.1>
monomers, then a 50 cc column is built.
The resin is buffered to pH 8.3 using a
<EMI ID = 20.1>
circulate at a rate of 0.5 bed volume per hour.
The enzyme used is a glucose isomerase derived from Streptomyces olivochromogenes and characterized by
1000 activity units per gram, and this at the level of 1 g per
<EMI ID = 21.1>
of 0.2 bed volume per hour for 24 hours. A 50% dextrose solution containing 10 <2> moles of magnesium and 10 <3> moles of cobalt passes through the column at the rate of 0.4 bed volume per hour initially.
<EMI ID = 22.1>
The isomerase enzyme is retained by the resin.
Example 5: Immobilization of a glucoamylase showing the nature
non-ionic Ce fixation
Same support as that of Example 4.
Buffered to pH 4.2 using a 1% solution of CH3COO Na-CH3COOH, recirculating at the rate of 0.5 bed volume per hour.
The enzyme is the liquid glucoamylase G990 characterized by 180 units of activity per 4 g, 6990 per 50 cm3 of support by recirculating the enzyme at the rate of 0.2 bed volume per hour for 24 hours. A maltodextrin is introduced into the column, the dextrose equivalent of which is
15 and the dry substance content of which is 30%.
We work at 55 [deg.] C.
<EMI ID = 23.1>
The glucoamylase enzyme is retained by the resin.
<EMI ID = 24.1>
non-ionic fixation
Same support as those of Examples 4 and 5 and same buffer as that of Example 5. 0.1 g per liter of cysteine
<EMI ID = 25.1>
The enzyme is powdered 6-amylase XP 206 from Nagase, which is first extracted with water for 30 minutes, then
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1>
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
The substrate is chelated, before its introduction into the column, to remove the metal ions.
<EMI ID = 31.1>
Example 7: Immobilization of an isomerase on a resin
cationic.
The resin used is C264 from Diaprosim. It is a copolymer of styrene with a sulfonic group. The resin has no anionic nature.
We build a 250 cm3 column and wash it
<EMI ID = 32.1>
It is buffered in the same way as in Example 4. The enzyme is deposited using liquid isomerase C992 at a rate of 2 g per 250 cm3 of support at a flow rate of 0.2.
<EMI ID = 33.1>
A solution of dextrose at 60 [deg.] C is used and adjusted to pH 8.3 with 10 2 moles of magnesim and 10 3 moles of cobalt.
The substrate concentration corresponds to 53% of an enzyme-enzyme dextrose equivalent of 96.
<EMI ID = 34.1>
Although the bed volume flow rate per hour and the levulose yields are rather low, these figures show that the isomerase is retained by the support.
In the following example, Amberlite XN 1009 resin (= XAD 12) manufactured by Rohm &Haas; it is a macroreticular adsorbent comprising very polar nitrogen groups.
Example 8: Binding of glucoamylase
The adsorbent XN 1009 (500 cm3) is (1) washed with three volumes of NaOH to remove protein and dyes, (2) washed again and (3) completely neutralized with 2 volumes of HCl.
After washing away the excess acid,
the resin is buffered with an acetate buffer at pH 4.2.
After buffering, the temperature is brought to 60 [deg.] C and the enzyme is added as follows:
1. Softening to balance the osmotic pressure by sending 17.5 Bé dextrose on the resin;
2. Enzyme deposition: 900 units of glucoamylase (G990) are deposited in two hours (1 bed volume per hour).
The enzyme is dissolved in dextrose solution similar to that used for sweetening.
3. An enzyme-enzyme hydrolyzate of which the dry substance content is 30.6% and the dextrose equivalent 18 is prepared. The low dextrose equivalent solution, the pH of which is 4.2, is introduced into the column.
The flow rate is increased to 0.2 bed volume per hour.
The following average data is recorded:
<EMI ID = 35.1>
reads per hour 200 hours.
The flow rate is then reduced to 0.1 bed volume per hour to maintain the dextrose equivalent at 96-97. Flow duration of 0.1 bed volume per
hour 250 hours Total duration 450 hours
The dextrose equivalent then drops to 64 and the column is stopped.
Enzyme used (total)
<EMI ID = 36.1>
Average consumption of the discontinuous test: 150 units per kg. Comment
<EMI ID = 37.1>
XN 1009 neutralized.
CLAIMS
1.- Process for carrying out an enzymatic reaction consisting in bringing the substrate into contact with an enzyme in order to make it react with said enzyme which has been adsorbed by a macroporous system, characterized in that the size of the pores of the macroporous system is sufficiently large to adsorb the enzyme.