BAYER AKTIENGESELLSCHAFT
L'invention concerne un procédé pour la purification à l'échelle industrielle d'inhibiteurs de la kallikréine et de la trypsine à partir de solutions aqueuses de ceux-ci, pour obtenir un produit à usage thérapeutique injectable directement, même à doses élevées, par exemple
par perfusion intraveineuse lente.
Des procédés pour l'extraction et la purification de ces inhibiteurs sont par exemple décrits dans les brevets allemands No 950.959 ; 954.284 ; 956.097 ;
1.011.576 ; 1.014.288 ; 1.148.352 au nom de Farbenfabriken Bayer A.G. et dans le brevet français No 1.566.777 déposé le 15 mars 1968 au nom de la demanderesse.
Dans le passé, la purification de l'inhibiteur de la kallikréine et de la trypsine, extrait d'organes d'animaux, jusqu'à un degré de pureté acceptable aux fins thérapeutiques, était effectuée au moyen de résines échangeuses d'ions appropriées, ou à l'aide de réactifs spécifi-
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tannique, avec formation de complexes suivie d'une scission. Ces procédés impliquaient des opérations longues et relativement laborieuses, surtout du fait de la nécessité d'opérations successives de séparation,
Or, on a découvert que cet inhibiteur est soluble à un pH neutre ou légèrement acide, compris entre 5,5 et 7, dans des solutions pratiquement saturées de sels minéraux, par exemple, de chlorure de sodium et qu'on peut le faire précipiter quantitativement à partir de ces solutions, à la température ambiantr, par abaissement du pH jusqu'à des valeurs comprises entre 1 et 3.
Le procédé selon l'invention pour la purification d'inhibiteurs de la kallikréine et de la trypsine, mis en oeuvre à la température ambiante, comprend les opérations suivantes :
a) addition à la solution aqueuse de l'inhibiteur brut, à un pH compris entre 5,5 et 7 et sous agitation d'un sel inorganique, jusqu'à un degré de saturation compris entre
80 % et 100 % ; b) filtration ; c) déplacement du pH du liquide de filtration jusqu'à une valeur comprise entre 1 et 3, par addition d'un aciie minéral, ce qui produit une précipitation quantitative
de l'inhibiteur ; d) filtration et récupération de l'inhibiteur ainsi précipité e) mise en suspension à la concentration voulue dans un véhicule aqueux rendu bactériostatique par un agent de conservation approprié et dissolution par neutralisation ;
et f) filtration stérilisante.
Le liquide de filtration obtenu constitue la solution d'inhibiteur qui se prête à une utilisation thérapeutique.
Il est important de noter que le produit obtenu est caractérisé par l'absence de substances susceptibles de provoquer des réactions allergiques et un choc anaphylactique, ainsi que de substances pyrogènes. En outre, il y a lieu de noter que le produit obtenu est parfaitement incolore, notamment si l'on répète le traitement de solubilisation et de précipitation ultérieure du principe actif, et que l'on peut préparer avec ce produit des solutions aqueuses en toutes concentrations voulues. Le rendement quantitatif du produit est très élevé, pratiquement supérieur à 80 % par rapport à l'activité initiale, même à la suite de précipitations répétées, avec un degré de pureté supérieur à dix fois environ la pureté du produit de départ.
On comprendra mieux le procédé faisant l'objet
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Exemple
Une soluticn aqueuse d'inhibiteur de la kallikréine, contenant 23 000 KIU/ml , avec une pureté de
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BAYER AKTIENGESELLSCHAFT
The invention relates to a process for the purification on an industrial scale of inhibitors of kallikrein and of trypsin from aqueous solutions thereof, to obtain a product for therapeutic use which can be injected directly, even at high doses, by example
by slow intravenous infusion.
Methods for the extraction and purification of these inhibitors are, for example, described in German Patent Nos. 950,959; 954,284; 956,097;
1,011,576; 1,014,288; 1,148,352 in the name of Farbenfabriken Bayer A.G. and in French patent No. 1,566,777 filed on March 15, 1968 in the name of the applicant.
In the past, the purification of the inhibitor of kallikrein and trypsin, extracted from animal organs, to a degree of purity acceptable for therapeutic purposes, was carried out by means of suitable ion exchange resins, or using specific reagents
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tannic, with formation of complexes followed by a split. These processes involved long and relatively laborious operations, especially because of the need for successive separation operations,
However, it has been discovered that this inhibitor is soluble at a neutral or slightly acidic pH, between 5.5 and 7, in solutions practically saturated with inorganic salts, for example, sodium chloride and that it can be precipitated. quantitatively from these solutions, at room temperature, by lowering the pH to values between 1 and 3.
The process according to the invention for the purification of inhibitors of kallikrein and of trypsin, carried out at room temperature, comprises the following operations:
a) addition to the aqueous solution of the crude inhibitor, at a pH of between 5.5 and 7 and with stirring of an inorganic salt, to a degree of saturation of between
80% and 100%; b) filtration; c) shifting the pH of the filtration liquid to a value between 1 and 3, by addition of a mineral steel, which produces a quantitative precipitation
inhibitor; d) filtration and recovery of the inhibitor thus precipitated; e) suspension at the desired concentration in an aqueous vehicle made bacteriostatic with an appropriate preservative and dissolution by neutralization;
and f) sterilizing filtration.
The filtration liquid obtained constitutes the inhibitor solution which lends itself to therapeutic use.
It is important to note that the product obtained is characterized by the absence of substances capable of causing allergic reactions and anaphylactic shock, as well as pyrogenic substances. In addition, it should be noted that the product obtained is perfectly colorless, in particular if the solubilization and subsequent precipitation treatment of the active principle is repeated, and that aqueous solutions can be prepared with this product in all desired concentrations. The quantitative yield of the product is very high, practically greater than 80% with respect to the initial activity, even following repeated precipitation, with a degree of purity greater than approximately ten times the purity of the starting product.
We will better understand the process being
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Example
An aqueous solution of kallikrein inhibitor, containing 23,000 KIU / ml, with a purity of
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