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La présente invention se rapporte à des perfectionnements à la préparation de sels d'héparine et se propose de fournir un procédé d'éli- mination des impuretés colorées qu'ils contiennent.
On suppose que l'héparine est un mélange d'esters polysulfuriques de la mucoïtine; elle constitue un agent anti-coagulant très précieux, très utilisé en clinique. L'héparine libre est de nature acide et est générale- ment isolée sous forme sous forme de sel de métal alcalin, par exemple de sel de sodium. L'héparine est généralement fournie en médecine sous for- me de solution du sel de sodium, qui est de couleur jaunâtre ou brune. On a éprouvé depuis longtemps le besoin d'éliminer cette coloration et l'on a effectué des recherches pour établir un procédé de traitement des sels d'héparine qui permit d'obtenir un produit donnant une solution incolore.
La demanderesse a découvert que l'on peut éliminer rapidement et efficacement les impuretés colorées des sels d'héparine sans perte sensible d'activité par le procédé ci-après. L'héparine peut être isolée des tissus pulmonaires des animaux par les procédés d'extraction et de purification. bien connus. Ces procédés donnent un produit final sous forme d'une poudre blanc sale ou beige.
Le procédé selon l'invention consiste à dissoudre dans l'eau le produit coloré (dont l'activité est normalement de l'ordre de
100 u./mg.) de manière à obtenir une solution contenant environ 5000 u./cc. et à traiter la solution ainsi obtenue à une température élevée, de pré- férence environ 80 C, et à un pH de préférence compris entre 8,0 et 8,5 au moyen d'une solution d'un 1 de l'acide permanganique. Le sel d'acide permanga- nique utilisé est déterminé en partie par la nature du cation que l'on dé- sire voir figurer dans le sel d'héparine finalement obtenu. On prépare nor- malement l'héparine sous forme de son sel de sodium, de sorte que c'est normalement le permanganate de sodium auquel on fera appel dans le procé- dé ci-dessus.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée à l'usage du sel de sodium de l'acide permanganique.
La quantité de permanganate nécessaire pour effectuer la décolora- tion varie avec le lot particulier de sel d'héparine préparé à décolorer.
On peut déterminer avec précision la quantité à utiliseren traitant desparties ali- quotes de chaque lot de sel d'héparine au moyen de quantités croissantes de solution de permanganate jusqu'à détermination de la quantité de per- manganate juste suffisante pour effectuer la décoloration dans les condi- tions ci-dessus décrites. On a trouvé que, d'une manière générale, la quan- tité à utiliser dans le cas du permanganate de sodium est d'environ une molécule-gramme pour décolorer 100 millions d'unités de sel d'héparine.
La durée pendant laquelle on doit laisser la réaction se poursui- vre varie avec la nature du lot particulier de sel d'héparine soumis au traitement, mais on a trouvé que dans les conditions exposées ici, la dé- coloration de la solution de sel d'héparine est terminée en 15 à 30 minu- tes après l'addition de la solution permanganique. La perte d'activité d' héparine éprouvée au cours de ce temps est faible ou nulle.
La gamme de pH dans laquelle on effectue la réaction est critique.
Si le pH est nettement inférieur à 8,0 la décoloration du sel d'héparine ne se fait que difficilement ou ne se fait pas du tout et si le pH est net- tement supérieur à 8,5, la décoloration est accompagnée d'une perte pronon- cée d'héparine par suite de dégradationo On a trouvé qu'il était préféra- ble d'effectuer la réaction dans des conditions telles que le pH initial du mélange réactionnel soit compris entre 8,0 et 8,5.
La température à laquelle la réaction est effectuée est égalementim- portante.On à constaté que si la réaction se fait à la température ambiante, le bioxyde de manganèse formé se dépose sous forme de très fines particules
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extrêmement difficiles à séparer par filtration. En fait le bioxyde de man- ganèse peut être déposé sous forme colloïdale et peut être si difficile à éliminer qu'il pollue le sel d'héparine isolé.
Si, toutefois,la réaction est effectuée à une température élevée, le bioxyde de manganèse se dépose sous forme granulaire et est aisément enlevé du produit. On a trouvé que la réaction est effectuée le plus com- modément à une température d'environ 80 C, mais il est bien entendu que la présente invention n'est pas limitée à l'usage de cette température ré- actionnelle particulière.
Quand la décoloration de la solution de sel d'héparine a été ef- fectuée de la manière décrite ci-dessus,le bioxyde de manganèse mis en liberté est isolé par filtration et le sel d'héparine solide est recueilli au sein du filtrat par les procédés bien connus. C'est ainsi par exemple que le filtrat aqueux peut être versé dans un excès d'alcool, ce qui pro- voque la précipitation du sel d'héparine sous forme d'un solide blanc que l'on peut recueillir et sécher.
Ainsi, l' invention a pour objet un procédé d'élimination des impuretés colorées d'un sel d'héparine y remarquable notamment en ce qu'il comporte la mise en réaction d'une solution aqueuse d'un sel d'héparine à un pH com- pris entre 8,0 et 8,5 à une température élevée, de préférence environ 800 C., avec une solution aqueuse d'un sel d'acide permanganique, dont le cation est de préférence identique au cation du sel d'héparine que l'on doit fi- nalement isoler, en quantité telle que définie ci-dessus.
La décoloration de l'héparine de la manière décrite ci-dessus ef- fectue en même temps une élimination partielle des substances pyrogènes.
Pour en assurer l'élimination complète, il est nécessaire de soumettre la matière à un autre traitement qui peut être effectué par les procédés con- nus, tels que le traitement sur charbon de bois activé ou la filtration sur couche de cellulose. On peut également effectuer l'élimi&ation des subs- tances pyrogènes par le procédé décrit dans la demande de brevet déposée =ce jour sous le N 421.488 par la demanderesse pour "Procédé d'élimination des substances pyrogènes d'une solution d'un sel d'héparine".
L'exemple suivant, qui n'est pas limitatif, illustre l'invention.
EXEMPLE
On dissout 300 g. d'héparine (à l'état de sel de sodium) d'une ac- tivité de 100 u./mg. dans 4 litres d'eau distillée et on filtre la solution sur une couche de .kieselguhr, qu'on lave ensuite à plusieurs reprises au moyen de faibles portions (100 ce,) d'eau distillée. On règle le volume du mélange du filtrat et des liqueurs de lavage à 6 litres par addition d'eau distillée et on chauffe rapidement la solution à 80 C. On règle le pH de la solution chaude à 8,0 - 8,5 par addition d'une solution 5 N d'hydroxy- de de sodium et on ajoute en agitant énergiquement 100 cc. d'une solution à 40 % en poids/volume de permanganate de sodium. On laisse la solution réactionnelle reposer pendant trente minutes en maintenant la température à 80 C.
On refroidit le produit à environ 40 C, et on isole le bioxyde de manganèse qui se sépare par filtration sur lit de kieselguhr. On met en suspension la couche de kieselguhr dans 1 litre d'eau distillée et on chauf- fe à 80 C., le pH étant réglé à 8,0 - 8,5 si nécessaire. On refroidit la suspension à 40 C et on filtre, le lit filtrant étant lavé au moyen de deux portions de 250 cc. chacune d'eau distillée. On mélange le filtrat avec- celui provenant de la masse réactionnelle principale et on ajuste la solution à pH 6,5. On ajoute à la solution suffisamment de chlorure de so- dium pour produire une concentration de 1% dans la solution finale. On cla-
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rifie la solution ainsi obtenue par filtration et on verse le filtrat en a- gitant dans quatre fois son volume d'alcool à 95 %.
On isole le solide qui se sépare par filtration et on le sèche sous vide à 35 C. On obtient ain- si de l'héparine (sous forme de sel sodique) à l'état de poudre blanche d'une activité d'environ 100 u./mg.
Bien entendu l'invention n'est pas limttée au mode de mise en oeu- vre décrit qui n'a été donné qu'à titre d'exemple.
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The present invention relates to improvements in the preparation of heparin salts and sets out to provide a process for removing the colored impurities which they contain.
It is assumed that heparin is a mixture of polysulfuric esters of mucoiitin; it is a very valuable anti-coagulant agent, widely used in the clinic. Free heparin is acidic in nature and is generally isolated as an alkali metal salt, for example sodium salt. Heparin is usually supplied medicinally as a solution of the sodium salt, which is yellowish or brown in color. The need to remove this coloring has long been recognized and research has been carried out to establish a method of treating heparin salts which results in a product giving a colorless solution.
The Applicant has discovered that the colored impurities can be quickly and efficiently removed from heparin salts without substantial loss of activity by the process below. Heparin can be isolated from the lung tissue of animals by the methods of extraction and purification. well known. These processes give a final product in the form of a dirty white or beige powder.
The process according to the invention consists in dissolving the colored product in water (the activity of which is normally of the order of
100 u./mg.) So as to obtain a solution containing approximately 5000 u./cc. and treating the solution thus obtained at an elevated temperature, preferably about 80 ° C., and at a pH preferably between 8.0 and 8.5 with a solution of one 1 of permanganic acid. . The permanganic acid salt used is determined in part by the nature of the cation which is desired to appear in the heparin salt finally obtained. Heparin is normally prepared as its sodium salt, so it is normally the sodium permanganate which will be employed in the above process.
Of course, the invention is not limited to the use of the sodium salt of permanganic acid.
The amount of permanganate required to effect the decolorization varies with the particular lot of heparin salt prepared to be decolorized.
The exact amount to be used can be determined by treating the aliquots of each batch of heparin salt with increasing amounts of permanganate solution until the amount of permanganate just sufficient to effect decoloration in the cells is determined. conditions described above. It has been found that, in general, the amount to be used in the case of sodium permanganate is about one gram molecule to decolorize 100 million units of heparin salt.
The length of time the reaction must be allowed to proceed will vary with the nature of the particular batch of heparin salt being treated, but it has been found that under the conditions set forth herein, the discoloration of the salt solution is heparin is complete within 15-30 minutes after addition of the permanganic solution. There is little or no loss of heparin activity experienced during this time.
The pH range in which the reaction is carried out is critical.
If the pH is much lower than 8.0 the discoloration of the heparin salt is difficult or not at all and if the pH is much higher than 8.5, the discoloration is accompanied by a pronounced loss of heparin due to degradation. It has been found to be preferable to carry out the reaction under conditions such that the initial pH of the reaction mixture is between 8.0 and 8.5.
The temperature at which the reaction is carried out is also important. It has been found that if the reaction takes place at room temperature, the manganese dioxide formed settles down in the form of very fine particles.
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extremely difficult to separate by filtration. In fact, manganese dioxide can be deposited in colloidal form and can be so difficult to remove that it pollutes the isolated heparin salt.
If, however, the reaction is carried out at an elevated temperature, the manganese dioxide settles in granular form and is easily removed from the product. It has been found that the reaction is most conveniently carried out at a temperature of about 80 ° C., but it will be understood that the present invention is not limited to the use of this particular reaction temperature.
When the decoloration of the heparin salt solution has been carried out as described above, the released manganese dioxide is isolated by filtration and the solid heparin salt is collected within the filtrate by the particles. well known methods. Thus, for example, the aqueous filtrate can be poured into an excess of alcohol, which causes the heparin salt to precipitate in the form of a white solid which can be collected and dried.
Thus, the subject of the invention is a process for removing colored impurities from a heparin salt therein, which is remarkable in particular in that it comprises the reaction of an aqueous solution of a heparin salt with a. pH between 8.0 and 8.5 at an elevated temperature, preferably about 800 ° C., with an aqueous solution of a salt of permanganic acid, the cation of which is preferably identical to the cation of the salt of. heparin which must finally be isolated, in an amount as defined above.
Decoloration of heparin as described above simultaneously effects partial removal of pyrogens.
To ensure complete removal, it is necessary to subject the material to further treatment which can be carried out by known methods, such as activated charcoal treatment or cellulose layer filtration. It is also possible to carry out the elimination of pyrogenic substances by the process described in the patent application filed today under No. 421,488 by the applicant for "Process for the elimination of pyrogenic substances from a solution of a salt of 'heparin'.
The following example, which is not limiting, illustrates the invention.
EXAMPLE
300 g are dissolved. heparin (as sodium salt) with an activity of 100 u./mg. in 4 liters of distilled water and the solution is filtered through a layer of .kieselguhr, which is then washed several times with small portions (100 cc) of distilled water. The volume of the mixture of the filtrate and the washings is adjusted to 6 liters by the addition of distilled water and the solution is quickly heated to 80 ° C. The pH of the hot solution is adjusted to 8.0 - 8.5 by the addition. of 5 N sodium hydroxide solution and added with vigorous stirring 100 cc. a 40% w / v solution of sodium permanganate. The reaction solution is allowed to stand for thirty minutes while maintaining the temperature at 80 ° C.
The product is cooled to about 40 ° C., and the manganese dioxide which separates out by filtration on a kieselguhr bed is isolated. The kieselguhr layer is suspended in 1 liter of distilled water and heated to 80 ° C., the pH being adjusted to 8.0-8.5 if necessary. The suspension is cooled to 40 ° C. and filtered, the filter bed being washed with two 250 cc portions. each of distilled water. The filtrate is mixed with that from the main reaction mass and the solution is adjusted to pH 6.5. Sufficient sodium chloride is added to the solution to produce a 1% concentration in the final solution. We cla-
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The solution thus obtained is filtered off and the filtrate is poured with stirring into four times its volume of 95% alcohol.
The solid which separates is isolated by filtration and dried under vacuum at 35 ° C. This gives heparin (as sodium salt) in the form of a white powder with an activity of about 100. u./mg.
Of course, the invention is not limited to the mode of implementation described which has been given only by way of example.