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sulfates de métaux alcalins-et alcalinoterreux d'un poids moléculaire de 3000 à
6000 La présente invention concerne un procédé pour la préparation de chondroltines-sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux de grande pureté et avec des poids moléculaires de l'ordre de 3000 à 6000.
Les chondroltines-sulfates ou esters de l'acide sulfurique d'un polysaccharide composé de proportions équimolaires de N-acétyl D-galactosamine et d'acide D-glucuronique sont couramment employés dans le traitement thérapeutique ou prophylactique de l'athérosclérose et des affections rhumatismales d'origine inflammatoire et pour accélérer la guérison de plaies et de blessures faites avec un instrument tranchant.
Suivant le mode de préparation et la technique de purification utilisés, le poids moléculaire
de ces chondroltines-sulfates varie généralement entre plusieurs dizaines de miliers et plusieurs millions;
les substances employées dans les préparations pharmaceutiques possèdent normalement un poids moléculaire
de l'ordre de 20 000 à 50 000.
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sulfates sous forme de sels de métaux alcalins ou alcalino-terreux d'un poids moléculaire plus réduit sont nettement plus efficaces que les substances analo- gues d'un poids moléculaire plus élevé. Les chrondrol- tines-sulfates à bas poids moléculaire sont jusqu'à
! présent obtenus à partir des préparations du commeree par diverses techniques d'hydrolyse, mais leur degré de pureté laisse encore à désirer, et leur administration par voie intraveineuse ou parentérale peut provoquer un choc anaphylactique.
La demanderesse s'était par conséquent
fixée comme but de développer un procédé permettant
de préparer, à l'échelle industrielle, à partir de la substance brute actuellement disponible ou à partir de substances intermédiaires, des chondroltines-sulfates d'un poids moléculaire de l'ordre de 3000 à 6000 d'un degré de pureté élevé et convenant pour l'administratim par voie intraveineuse ou parentérale sans risque d'effets indésirables.
Conformément à l'invention, le procédé de préparation de sels de métaux alcalins et alcalino-terreux
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au préalable avec du kaolin et du charbon activé, à
une hydrolyse à température accrue par l'acide trichloracétique et l'acide chlorhydrique, à filtrer la solution réactionnelle après refroidissement et addition de charbon activé, à ajuster le pH du filtrat entre 5 et 6
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terreux, à séparer le sel formé après addition d'un alcool et à recristalliser le sel séparé dans un alcool aqueux.
Le mode opératoire pour la préparation d'un chondroltine-sulfate de calcium de bas poids moléculaire et d'une grande pureté à partir d'un chondroltinesulfate brut est décrit ci-après.
La solution aqueuse d'un chondroltine-sulfate brut est traitée à 5 reprises avec du kaolin, puis à
5 reprises avec du charbon activé, chaque traitement étant suivi d'une filtration ou centrifugation. Le dernier filtrat est ensuite soumis à une élution sur une colonne de résine Dowex 50W-X1 et l'éluat est concentré à pression réduite et à une température inférieure à 40[deg.]C jus-
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tine-sulfurique. A cette solution, on ajoute ensuite
de l'acide trichloracétique et de l'acide chlorhydrique en des proportions suffisantes pour obtenir une concentration 0,5 molaire en chacun de ces acides. Après un chauffage de 5 heures entre 70 et 85[deg.]C, la solution est rapidement refroidie et filtrée après addition de charbon activé. Le pH du filtrat est ensuite ajusté entre 5 et 6 par addition de carbonate de calcium, le chondroitinesulfate de calcium étant précipité par addition de 6 volumes d'éthanol aqueux à 95%. Le précipité séparé est redisses dans de l'eau, la solution aqueuse est traitée avec du charbon activé et filtrée et le sel séparé est
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Le sel de calcium ainsi préparé peut être dissous dans l'eau et de l'acide chondroltine-sulfurique libre obtenu par traitement de cette solution avec une résine Dowex 50W-X1. En concentrant un échantillon de cette solution sous vide, à une température inférieure <EMI ID=7.1>
y ajoutant du carbonate de sodium, l'additio' de
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pitation de chondroltine-sulfate de sodium, qui peut être séparé par centrifugation. Le tableau 1 ci-après résume les poids moléculaires, déterminés par voie osmométrique, et les teneurs en azote, en soufre et
en hexosamine; de chondroltines-sulfates de sodium, préparés par le procédé ci-dessus à partir de 10 échantillons différents d'acide chondroltine-sulfurique brut.
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essai au biuret et par l'essai de Lawry.
TABLEAU I
Résultats de l'analyse d'échantillons dt, chondroltine-sulfate de sodium purifié
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Le procédé suivant l'invention est illustré par l'exemple non limitatif d'un mode de mise en oeuvre ci-après.
EXEMPLE
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brut du commerce sont dissous dans 500 1 d'eau et cette solution est agitée à 5 reprises pendant 60 mn
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suivi d'une centrifugation et de l'addition de kaolin <EMI ID=13.1>
cinq reprises pendant 60 mn avec 5 kg de charbon activé, chaque traitement étant suivi d'une filtration et de l'addition de charbon frais. Le dernier filtrat, parfaitement limpide, est ensuite élué sur une colonne de résine Dowex 50W-X1, l'éluat d'un volume d'environ
3000 1 étant concentré sous un vide de 100 mm de Hg et à une température inférieure à 40[deg.]C jusqu'à un volume résiduel de 500 1.
Après addition de 40 g d'acide trichloracéti-
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solution est chauffée pendant 5 heures à 75[deg.]C, puis rapidement refroidie vers 25[deg.]C.
La solution réactionnelle est ensuite soumise à nouveau à 5 reprises à une agitation de 60 mn avec
50 kg de kaolin et à 5 reprises à une agitation de 60 mn avec 5 kg de charbon activé, de la manière décrite plus haut, chaque traitement étant suivi d'une centrifugation ou filtration.
Le pH du dernier filtrat limpide est ensuite ajusté à 5,3 par addition de 901 g de carbonate de calcium solide. En l'espace de 2 heures, on ajoute ensuite
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tation, le chondroltine-sulfate de calcium précipité est séparé par centrifugation. Les 40 kg du produit blanc sec obtenu sont dissous dans 40 1 d'eau, on y ajoute
2 kg de charbon activé, filtre la solution et dilue le
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alkali metal and alkaline earth metal sulphates with a molecular weight of 3000 to
6000 The present invention relates to a process for the preparation of alkali and alkaline earth metal chondroltinsulphates of high purity and with molecular weights of the order of 3000 to 6000.
Chondroltinsulphates or sulfuric acid esters of a polysaccharide composed of equimolar proportions of N-acetyl D-galactosamine and D-glucuronic acid are commonly used in the therapeutic or prophylactic treatment of atherosclerosis and rheumatic diseases of inflammatory origin and to accelerate the healing of wounds and wounds made with a sharp instrument.
Depending on the method of preparation and the purification technique used, the molecular weight
of these chondroltinsulphates generally varies between several tens of thousands and several millions;
substances used in pharmaceutical preparations normally have a molecular weight
of the order of 20,000 to 50,000.
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sulfates in the form of lower molecular weight alkali or alkaline earth metal salts are significantly more effective than analogues of higher molecular weight. Low molecular weight chrondrolytin sulfates are up to
! present obtained from preparations of commeree by various hydrolysis techniques, but their degree of purity still leaves much to be desired, and their intravenous or parenteral administration can cause anaphylactic shock.
The plaintiff therefore had
set as the goal of developing a process allowing
to prepare, on an industrial scale, from the crude substance currently available or from intermediates, chondroltinsulphates with a molecular weight of the order of 3000 to 6000 of a high degree of purity and suitable for intravenous or parenteral administration without risk of adverse effects.
In accordance with the invention, the process for the preparation of alkali and alkaline earth metal salts
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beforehand with kaolin and activated charcoal,
hydrolysis at increased temperature with trichloroacetic acid and hydrochloric acid, filtering the reaction solution after cooling and addition of activated charcoal, adjusting the pH of the filtrate between 5 and 6
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earth, separating the salt formed after addition of an alcohol and recrystallizing the separated salt from an aqueous alcohol.
The procedure for preparing high purity low molecular weight calcium chondroltinsulphate from crude chondroltinsulphate is described below.
The aqueous solution of a crude chondroltin sulfate is treated 5 times with kaolin, then with
5 times with activated charcoal, each treatment being followed by filtration or centrifugation. The last filtrate is then subjected to elution on a column of Dowex 50W-X1 resin and the eluate is concentrated at reduced pressure and at a temperature below 40 [deg.] C to.
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tine-sulfuric. To this solution, we then add
trichloroacetic acid and hydrochloric acid in sufficient proportions to obtain a 0.5 molar concentration of each of these acids. After heating for 5 hours between 70 and 85 [deg.] C, the solution is quickly cooled and filtered after addition of activated carbon. The pH of the filtrate is then adjusted to between 5 and 6 by adding calcium carbonate, the calcium chondroitinsulfate being precipitated by adding 6 volumes of 95% aqueous ethanol. The separated precipitate is redissolved in water, the aqueous solution is treated with activated charcoal and filtered and the separated salt is
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The calcium salt thus prepared can be dissolved in water and free chondroltin-sulfuric acid obtained by treating this solution with a Dowex 50W-X1 resin. By concentrating a sample of this solution under vacuum, at a lower temperature <EMI ID = 7.1>
adding sodium carbonate, additio 'of
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sodium chondroltin sulfate pitation, which can be separated by centrifugation. Table 1 below summarizes the molecular weights, determined osmometrically, and the nitrogen, sulfur and
in hexosamine; of sodium chondroltinsulphates, prepared by the above method from 10 different samples of crude chondroltinsulfuric acid.
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biuret test and by Lawry test.
TABLE I
Analysis of samples of purified dt, sodium chondroltin sulfate
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The method according to the invention is illustrated by the non-limiting example of an embodiment below.
EXAMPLE
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commercial crude are dissolved in 500 1 of water and this solution is stirred 5 times for 60 min
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followed by centrifugation and addition of kaolin <EMI ID = 13.1>
five times for 60 minutes with 5 kg of activated carbon, each treatment being followed by filtration and the addition of fresh carbon. The last filtrate, perfectly clear, is then eluted on a column of Dowex 50W-X1 resin, the eluate having a volume of approximately
3000 l being concentrated under a vacuum of 100 mm Hg and at a temperature below 40 [deg.] C to a residual volume of 500 l.
After addition of 40 g of trichloroaceti-
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solution is heated for 5 hours at 75 [deg.] C, then rapidly cooled to around 25 [deg.] C.
The reaction solution is then subjected again 5 times to stirring for 60 minutes with
50 kg of kaolin and 5 times with stirring for 60 minutes with 5 kg of activated charcoal, as described above, each treatment being followed by centrifugation or filtration.
The pH of the last clear filtrate is then adjusted to 5.3 by adding 901 g of solid calcium carbonate. Within 2 hours, then add
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The precipitated calcium chondroltin sulfate is separated by centrifugation. The 40 kg of the dry white product obtained are dissolved in 40 1 of water, one adds to it
2 kg of activated charcoal, filter the solution and dilute the