【発明の詳細な説明】
α，α−トレハラーゼの製造法
技術分野
本発明は、食品産業、製薬及び生化学において重要な原料又は中間体である二
糖α，α−トレハラーゼの製造法に関する。
技術背景
α，α−トレハラーゼは、天然物質、中でも、中東の国々において現在、増殖
されている、USAの南西部に起因するセラギネラレプドフィラ（Selaginella lep
idophyla）の広い選択からの単離により得られる。現在、その二糖の最とも適切
な源は、パン用酵母であり、中でもその良好な入手能力、低価格及びα，α−ト
レハラーゼの比較的高い含有率のためである。
パン用酵母からのα，α−トレハラーゼの単離は、1936年最初にすでに記載さ
れており（K.Myrback，B.Ortenblad： Biochem.t.288，329（1936））、そして
その変性された形は現在まで、α，α−トレハラーゼの調製のために使用されて
いる（Z.C.Stewart，N.K.Richtmyer，C.S.Hudson：Ｊ.Am.Chem.Soc.72，2059（1
950））。
中でもそれらの産業用途を制限する、それらの方法の実質的な欠点は、酵母の
濃エタノール抽出物への硫酸亜鉛の水溶液の添加、続く水酸化バリウムの溶液に
抗スルフェートアニオンの沈殿による除タンパク質方法にある。この除タンパク
質の方法は生成物の精製に対して高い要求を必要として、ここで必要とされる高
純度は医薬及び栄養用途のためである。この方法はまた、相当量の固体無機廃棄
物（この液体化は投資に対して高い財政上の要求を有し）、エネル
ギー及び原料を生成する。
発明の開示
上記の欠点は、本発明に従ってのα，α−トレハラーゼの生成方法により回避
され、ここで近代的な膜工程に基づく方法は高品質の生成物、低い投資費用、低
い環境への負荷、入手しやすい原料及び比較的高い収率により示される。
本発明の目的は、パン用酵母からの単離による結晶性α，α−トレハラーゼの
生成方法であり、この方法は濃度7096体積％のエタノールによるパン用酵母の抽
出、濾過による固形部分の除去の後、その得られた抽出物の２〜30重量％のα，
α−トレハラーゼの含有率への真空濃縮、及び500よりも高い分子質量の分離限
界を有する限外濾過膜を通しての限外濾過及び所望には、0.05〜５μｍ、好まし
くは0.05〜0.15μｍの範囲の平均孔直径を有するマイクロ濾過膜を通しての続く
マイクロ濾過から成る続く膜濾過工程から成り、ここで前記得られた透明な液体
が、活性炭による脱色の後、Ｈ+サイクルでのイオン交換体及びOH-サイクルでの
続くイオン交換体と接触され、そして得られた脱イオン化された溶液が40〜85重
量％の濃度への真空下での蒸発され、そしてα，α−トレハラーゼ１部当たり0.
5〜1.5部の量でのエタノールの添加の後に結晶化するα，α−トレハラーゼが単
離され、そしてくり返しての脱イオン化の後、エタノールから再結晶化されるこ
とを特徴とする。
本発明のもう１つの目的は、連続した限外濾過が、500よりも高い分子質量の
分離限界を有する限外濾過膜を通して実施され、そして所望には、続くマイクロ
濾過が0.05〜５μｍ、好ましくは0.05〜0.15μｍの範囲の平均孔直径を有するマ
イクロ濾過膜を通して実施される事実にある。
本発明に従って実施される方法においては、カチオン交換体としての強酸のス
ルホ基を有するスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー及びアニオン交換体とし
ての第４ジメチルヒドロキシエチル−アンモニウム交換基を有するスチレン−ジ
ビニルベンゼンコポリマーの使用が好都合である。
本発明の方法は、パン用酵母が２−プロパノールにより変性された96％エタノ
ールにより周囲温度で抽出され、抽出された酵母が濾過され、そしてエタノール
が真空蒸留により濾液から除去されるような手段により実現され得る。10〜40重
量％のα，α−トレハラーゼを有するその得られたエタノール水溶液が500より
も高い分子質量の分離限界を有する限外濾過膜を通しての限外濾過にゆだねられ
、又はまず、0.05〜５μｍの範囲の平均孔直径を有するマイクロ濾過膜を通して
のマイクロ濾過及び次に、500よりも高い分子質量の分離限外を有する限外濾過
膜を通しての限外濾過にゆだねられ得る。活性炭による脱色の後、その透明な水
溶液が、カチオン交換体及びアニオン交換体のカラム上で脱イオン化され、そし
て50〜70重量％のα，α−トレハラーゼ濃度の水性シロップに真空蒸発器におい
て濃縮される。α，α−トレハラーゼ１部当たり約１部の量でシロップにエタノ
ールを添加した後、二糖が通常の又は低められた温度で結晶化する。結晶性α，
α−トレハラーゼが、濾過により単離され、そして減圧下で40〜60℃で乾燥せし
められる。99重量％よりも高い純度の結晶性α，α−トレハラーゼが生成される
場合、その粗性物質は、脱イオン化が類似する手段で実現した後、エタノールか
ら再結晶化されるべきである。
本発明の方法は高品質のα，α−トレハラーゼの満足する収率での獲得を可能
にし、従って医薬又は食品へのそのさらなる直接的な使用を可能にする。特にエ
ルゴステロールの単離のためにさらに利
用され得る抽出された酵母の他に、重要な廃棄物は生成されず、これは、この技
法がα，α−トレハラーゼの現在使用される生成技法よりも環境に対して実質的
に低い衝撃を有することを意味する。この事実は、本発明のより低い投資及び操
作費用において陽性の効果を有する。
実施例
例１
パン用酵母（1000ｇ）を、６％の２−プロパノールにより変性された96％エタ
ノール3000mlにより、45分間、周囲温度での集中的な撹拌下で抽出する。上清液
を濾過し、そして濾過ケークをエタノール250mlにより洗浄し、そしてさらに、
エルゴステロールの単離のために使用される。得られる濾液を真空蒸発器（20mm
Hg、60℃の浴温度）において400mlの体積に濃縮し、そして濾過された液体の効
果的な撹拌及び0.12μｍの平均孔直径を有するマイクロ濾過膜Synpor（R）を備
えた、450mlの容量の濾過セル中に移す。過剰圧の0.08MPaを濾過された液体及び
膜上に圧力シリンダーから導入される窒素により付与し、そして380mlの濾液を
濾過する。この濾液を、20，000の分子質量の分離限界を有するポリスルホンか
らの限外濾過膜を備えた前記と同じセルにおいて限外濾過にゆだねる。この操作
において、濾過された液体及び膜上での過剰圧は0.25MPaであり、そして濾液360
mlを得る。
透明な水溶液（360ml）を、活性炭10ｇの添加により脱色し、次に濾過し、そ
して濾液を、Ｈ+サイクルでの300mlのWofatit KPSのカラム及び0H-サイクルでの
215ml のWofatit SBKのカラムにより脱イオン化する。イオン交換体を水1500ml
により洗浄し、そして組合された溶液を真空下（20mmHg）で蒸発し、71重量％の
α，α−ト
レハラーゼを含む水性シロップを得る。エタノール50mlの添加の後、周囲温度で
16時間、結晶化を進める。結晶性α，α−トレハラーゼを、カラス濾過器Ｇ−２
での濾過により単離し、濾過ケークをエタノール50mlにより洗浄し、そして真空
下（50℃、15mmHg）で乾燥し、97.1％の純度の結晶性α，α−トレハラーゼ31.5
ｇを得る。追加の2.7ｇの結晶性生成物を、母液を濃縮し、そして上記条件下で
の結晶化により得る。
例２
乾燥されたパン用酵母（250ｇ）を、脱イオン水580mlと共に実験温度で混合し
、次にペーストを、７％の２−プロパノールにより変性された96％エタノール20
00mlにより30分間抽出する。その懸濁液を濾過し、そして濾過ケークを、２−プ
ロパノールにより変性された70％エタノール2150mlにより洗浄する。得られた濾
液を真空蒸発器（20mmHg、60℃の浴温度）において400mlの体積に濃縮し、膜上
で濾過された液体の連続した流れを有し、そして5000の分子質量の分離限界を有
する酢酸セルロースからの限外濾過を有する、450mlの容量の濾過セル中にトラ
ンスファーする。過剰圧0.2MPaを濾過された液体上に付与し、そして濾過された
溶液350mlを集め、活性炭13ｇにより脱色し、これを次に、濾過し、そしてＨ+サ
イクルでの280ml のWofatit KPSのカラム上で及びOH+サイクルでの250mlのWofat
it SBKのカラム（脱イオン化された溶液のｐＨは4.2である）上で脱イオン化す
る。濾過によりアニオン交換体を除去し、そして水900mlにより両イオン交換体
を洗浄した後、前記組合された溶液を、真空下で蒸発し、79重量％のα，α−ト
レハラーゼの濃度を有する水性シロップを得る。結晶化を、80mlのエタノールの
添加の後、５℃で12時間進行せしめる。濾過及びその濾過ケークの40mlのエタノ
ールによる洗浄は純度98.2％の粗α，α−トレハラーゼ42.1ｇ
を得、これを周囲温度で乾燥せしめる。追加の3.2ｇの生成物を、母液の濃縮及
び上記条件下で行なわれた結晶化により得る。
粗結晶性α，α−トレハラーゼ（45.3ｇ）を、40℃で脱イオン水1900mlに溶解
し、そして脱イオン化を、Ｈ+サイクルでの５mlのWofatit KPSを含むカラム及び
0H-サイクルでの10mlのWofatit SBKを含むカラム上で行なう。その得られる脱イ
オン溶液を真空下で（20mmHg）蒸発し、68重量％のα，α−トレハラーゼ濃度を
有する水性シロップを得る。５％の２−プロパノールにより変性された96％エタ
ノール40mlの添加の後、結晶化を５℃で10時間進める。結晶性α，α−トレハラ
ーゼを、濾過により単離する。濾過ケークをエタノール25mlにより洗浄し、そし
て真空下（50℃、15mmHg）で乾燥し、99.7％の純度のα，α−トレハラーゼ41.4
ｇを得る。
産業への適用
本発明の方法により生成された二糖α，α−トレハラーゼは医薬、食品産業及
び生化学研究において重要な原料又は中間体である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a disaccharide α, α-trehalase which is an important raw material or an intermediate in the food industry, pharmaceuticals and biochemistry. Technical background α, α-trehalase is isolated from a wide selection of natural substances, among them, Seraginella lep idophyla, which is currently propagated in countries in the Middle East due to the southwestern part of the USA. Is obtained by Presently, the most suitable source of the disaccharide is baker's yeast, among others due to its good availability, low cost and relatively high content of α, α-trehalase. The isolation of α, α-trehalase from baker's yeast was first described in 1936 (K. Myrback, B. Ortenblad: Biochem.t.288,329 (1936)) and its modifications. The form has been used to date for the preparation of α, α-trehalase (ZCStewart, NKRichtmyer, CSHudson: J. Am. Chem. Soc. 72, 2059 (1950)). Among them, limiting their industrial application, the substantial drawbacks of those methods are the deproteinization by addition of aqueous solution of zinc sulphate to concentrated ethanol extract of yeast, followed by precipitation of antisulfate anion in solution of barium hydroxide. On the way. This deproteinization method requires high demands on the purification of the product, the high purity required here being for pharmaceutical and nutritional applications. The process also produces a significant amount of solid inorganic waste (this liquefaction has a high financial demand for investment), energy and raw materials. DISCLOSURE OF THE INVENTION The above-mentioned drawbacks are avoided by the method for producing α, α-trehalase according to the present invention, wherein the method based on modern membrane processes produces high quality products, low investment costs, low environmental load. , With readily available raw materials and relatively high yields. The object of the present invention is a method for producing crystalline α, α-trehalase by isolation from baker's yeast, which comprises extraction of baker's yeast with ethanol at a concentration of 7096% by volume and removal of solid portions by filtration. Afterwards, vacuum concentration of the resulting extract to a content of α, α-trehalase of 2 to 30% by weight, and ultrafiltration through an ultrafiltration membrane having a separation limit of molecular mass higher than 500 and Desirably, it comprises a subsequent membrane filtration step consisting of a subsequent microfiltration through a microfiltration membrane having an average pore diameter in the range of 0.05-5 μm, preferably 0.05-0.15 μm, wherein the obtained clear liquid is After decolorization with activated carbon, it is contacted with an ion exchanger in the H + cycle and a subsequent ion exchanger in the OH − cycle, and the resulting deionized solution is under vacuum to a concentration of 40-85% by weight. Is evaporated And α, α-trehalase, which crystallizes after addition of ethanol in an amount of 0.5-1.5 parts per part of α, α-trehalase, was isolated and recrystallized from ethanol after repeated deionization. It is characterized by being converted. Another object of the invention is that the continuous ultrafiltration is carried out through an ultrafiltration membrane having a separation limit of molecular mass higher than 500, and if desired, the subsequent microfiltration is 0.05 to 5 μm, preferably In the fact that it is carried out through a microfiltration membrane with an average pore diameter in the range of 0.05 to 0.15 μm. Use of a styrene-divinylbenzene copolymer having a sulfo group of a strong acid as a cation exchanger and a styrene-divinylbenzene copolymer having a quaternary dimethylhydroxyethyl-ammonium exchange group as an anion exchanger in the process carried out according to the invention. Is convenient. The process of the invention is carried out by such means that the baker's yeast is extracted at ambient temperature with 96% ethanol denatured with 2-propanol, the extracted yeast is filtered and the ethanol is removed from the filtrate by vacuum distillation. Can be realized. The resulting aqueous ethanol solution having 10-40% by weight of α, α-trehalase is subjected to ultrafiltration through an ultrafiltration membrane having a separation limit of molecular mass higher than 500, or first 0.05-5 μm. It can be subjected to microfiltration through a microfiltration membrane with an average pore diameter in the range of and then ultrafiltration through an ultrafiltration membrane with a separation ultra of molecular mass higher than 500. After decolorization with activated charcoal, the clear aqueous solution is deionized on a column of cation and anion exchangers and concentrated in a vacuum evaporator to an aqueous syrup with an α, α-trehalase concentration of 50-70% by weight. It After adding ethanol to the syrup in an amount of about 1 part per part of α, α-trehalase, the disaccharide crystallizes at normal or reduced temperatures. Crystalline α, α-trehalase is isolated by filtration and dried under reduced pressure at 40-60 ° C. If more than 99% by weight of crystalline α, α-trehalase is produced, the crude material should be recrystallized from ethanol after deionization is achieved by a similar means. The process according to the invention allows the obtaining of high-quality α, α-trehalase in satisfactory yields and thus its further direct use in medicine or food. In addition to the extracted yeast, which in particular can be further utilized for the isolation of ergosterol, no significant waste is produced, which means that this technique is more than the currently used production technique for α, α-trehalase. It has a substantially low impact on the environment. This fact has a positive effect on the lower investment and operating costs of the present invention. Example 1 Baker's yeast (1000 g) is extracted with 3000 ml of 96% ethanol denatured with 6% 2-propanol for 45 minutes under intensive stirring at ambient temperature. The supernatant is filtered and the filter cake is washed with 250 ml of ethanol and further used for the isolation of ergosterol. The filtrate obtained is concentrated in a vacuum evaporator (20 mm Hg, 60 ° C. bath temperature) to a volume of 400 ml, and effective stirring of the filtered liquid and a microfiltration membrane Synpor (R with a mean pore diameter of 0.12 μm. ) In a filter cell with a volume of 450 ml. An overpressure of 0.08 MPa is applied by means of nitrogen introduced from a pressure cylinder onto the filtered liquid and the membrane and 380 ml of filtrate are filtered. The filtrate is subjected to ultrafiltration in the same cell as above with an ultrafiltration membrane from polysulfone having a separation limit of 20,000 molecular mass. In this operation, the overpressure on the filtered liquid and the membrane is 0.25 MPa and 360 ml of filtrate are obtained. The clear aqueous solution (360 ml) was decolorized by the addition of 10 g of activated charcoal, then filtered and the filtrate was decanted by a column of 300 ml Wofatit KPS at H + cycle and 215 ml Wofatit SBK column at 0H - cycle. Ionize. The ion exchanger is washed with 1500 ml of water and the combined solution is evaporated under vacuum (20 mmHg) to give an aqueous syrup containing 71% by weight α, α-trehalase. Crystallization proceeds for 16 hours at ambient temperature after addition of 50 ml of ethanol. Crystalline α, α-trehalase was isolated by filtration on a crow filter G-2, the filter cake was washed with 50 ml of ethanol and dried under vacuum (50 ° C., 15 mmHg) to give 97.1% pure crystals. 31.5 g of sex α, α-trehalase are obtained. An additional 2.7 g of crystalline product is obtained by concentrating the mother liquor and crystallizing under the above conditions. Example 2 Dried baker's yeast (250 g) is mixed with 580 ml deionized water at the experimental temperature and the paste is then extracted for 30 minutes with 2000 ml 96% ethanol modified with 7% 2-propanol. The suspension is filtered and the filter cake is washed with 2150 ml 70% ethanol denatured with 2-propanol. The filtrate obtained is concentrated in a vacuum evaporator (20 mmHg, bath temperature 60 ° C.) to a volume of 400 ml, has a continuous flow of filtered liquid over the membrane and has a separation limit of 5000 molecular mass. Transfer into a 450 ml volume filter cell with ultrafiltration from cellulose acetate. An overpressure of 0.2 MPa was applied on the filtered liquid, and 350 ml of the filtered solution were collected, decolorized with 13 g of activated carbon, which was then filtered and on a column of 280 ml Wofatit KPS on an H + cycle. And deionized on a column of 250 ml Wofat it SBK at OH + cycle (pH of deionized solution is 4.2). After removing the anion exchanger by filtration and washing both ion exchangers with 900 ml of water, the combined solution is evaporated under vacuum, an aqueous syrup having a concentration of α, α-trehalase of 79% by weight. To get Crystallization is allowed to proceed for 12 hours at 5 ° C. after addition of 80 ml of ethanol. Filtration and washing of the filter cake with 40 ml of ethanol gives 42.1 g of crude α, α-trehalase with a purity of 98.2%, which is dried at ambient temperature. An additional 3.2 g of product is obtained by concentrating the mother liquor and crystallizing under the above conditions. The crude crystalline α, α-trehalase (45.3 g) was dissolved in 1900 ml deionized water at 40 ° C. and the deionization was carried out on a column containing 5 ml Wofatit KPS in the H + cycle and 10 ml in the 0H − cycle. Perform on a column containing Wofatit SBK. The resulting deionized solution is evaporated under vacuum (20 mmHg) to give an aqueous syrup having an α, α-trehalase concentration of 68% by weight. After addition of 40 ml of 96% ethanol modified with 5% 2-propanol, crystallization is allowed to proceed for 10 hours at 5 ° C. Crystalline α, α-trehalase is isolated by filtration. The filter cake is washed with 25 ml of ethanol and dried under vacuum (50 ° C., 15 mmHg) to give 41.4 g of 99.7% pure α, α-trehalase. Industrial Application The disaccharide α, α-trehalase produced by the method of the present invention is an important raw material or intermediate in the pharmaceutical, food industry and biochemical research.
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フロントページの続き
(72)発明者 プルフリーク，ヤロスラフ
チェコ共和国，162 00 プラハ ６，ナ
ーム プジェド バテリエミ １
(72)発明者 ヤノウシェク，フラディミール
チェコ共和国，100 00 プラハ 10，ス
ルシュティカ 18
(72)発明者 スハウアー，ヤン
チェコ共和国，140 00 プラハ ４，ポ
ドヤボリンスカー 1597
(72)発明者 ストゥフリーク，イージ
チェコ共和国，273 02 ツフロビツェ,
ツフロビツェ―スルビー 29─────────────────────────────────────────────────── ───
Continued front page
(72) Inventor Puru Freak, Yaroslav
Czech Republic, 162 00 Prague 6, Na
Ms Pudjed Batteriemi 1
(72) Inventor Janowshek, Hradimir
Czech Republic, 100 00 Prague 10, Su
Rustika 18
(72) Inventor Schauer, Yang
Czech Republic, 140 00 Prague 4, Po
Doyabolinska 1597
(72) Inventor Stufreak, Easi
Czech Republic, 273 02 Zflovice,
Tslovice-Slubi 29