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*y<Mtt POUR objet te NOUVELLE OOt1'OSX!':totf A BA8S D3 ï'$'lM'19 o 0 0
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La présente invention est relative à de nouvelle compositions pharmaceutiques contenant de la protamine.
Le terme "protamine" est un terme générique utilisé pour désigner une catégorie de protéines à bas poids moléou'- laire dérivant principalement de sperme et de laitances de poissions* son poids moléculaire est omcpris entre 2000 et 8000 et on a trouvé que cette substnce posédait une pro- portion inhaibuellemtn élevée de restes arginine qui, com- portant un groupe guanidine libre, font que la protéine eet fortement basique.Otent ainsi que, par exemple, dans la salmine du saumon, plus de 80% de sa teneur en azote se trou- ve Mous form d'arginine, et que la clupéine du hareng poses- de dralment u pourcentage élevé d'arginine.
Parmi les au- tres protmaines il faut citer l'iridine, la truttine, la for ane, la laoustrine et la aturine, dont les sources natilles et les propriétés sont décrites dans une étude de K. Félix (Advanoos in Protein Chmeistry 1960, 15 1-56) La base libre est une huile qui est peu soluble dans l'eau et ses sels, tels que le sulfate par exemple, sont également peu solublos, bien que la présence d'acide augmente leur solu- bilité, à pH 30 par exemple.
Telle qu'isolée du sperme de foison, la protamine base se trouve généralement sous forme d'une huile contenant environ 50% d'eau, substance qu'on dé- signe généralement par l'expression "huile de protamine"
La protamine possède des propriétés anticoagulantes douces mais est surtout précieuse comme antidote de l'héparine qui est un composé puissamment anticoagulant.D'une façon générale, on l'administre lorsqu'on a donné une dose trop
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élevée d'héparine, et on l'injecte habituellement par vole intraveineuse sous forme de solution aqueuse à 1-2% A cause de la solubilité difficile des sels de protamine, Ion solu tions de ces sels, à pH neutre,
sont instables et ont tendance à se séparer par précipitation. En conséquence, les solution* de sulfate de protamine utilisées pour injection sont à pH 3,0 ("injection Protaminae Sulphatis b.P.C") Naturellemet ces solutions acides provoquent une forte douleur si on les injecte par voie intramusculaire ou sous-cutanée$ et leur administration est virtuellement limitée à la voie intravei- neuse.
La demander.!.. a maintenant trouvé qu'il était possible de préparer des solutions niables à activité pre mini que à des pH bien supérieurs à 3,0 4 des valeurs de 5,0 par exemple, ou môme plus élevées, s'il y a présence complexe formaldéhyde-bisulfite u sulfoxylate dans la sola tien. A des concentrations relativement faibles,à 5% par exemple, ces solutions sont stables (c'est-à-drie que la 'pro. tamine n'a pas tendance à se séparer de la solution) Même à pH neutre ou alcalin, mais à des concentrations plus élevas de 10 à 20 par exemple, il est préférable que le pH soit de 5,0 environ.
Toutefois, la protamine ne semble pas subir une formation de composé avec le complexe de formaldéhyde* Ces compositions sont nettement plue appropriées à 1'injec- tion que les solutions acides précédemment utilisées
La demanderesse a également trouvé qu'on pouvait obtenir des solutions encore plus stables, contenant de la protamine, si on chauffe les solutions protamine/forsmdéhyde de/bisulfite ou sulfoxatle à un pH alcalin.
Les solutions ainsi obtenues sont stables à pH neutre ou môme alcalin, al u'à pH acide, même à les concentrations en protamine aussi élevées que 20 et lorsqu'on chauffe à 37 C par exemple, on
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peut obtenir des concentrations de l'ordre de 40%
Bien que 1'invention ne doive pas être limitée par des considérations d'ordre théorique, la demanderesse pense que le complexe de formaldéhyde réagit avec des groupes amino libres présents dans les groupes guanidine pour former
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des dérives de sulfite de zdmthy,éne ou de sulfoxylate de n...m6thyln.,
les produits protaminés obtenue par le stade de chauffage décrit ci-dessus possèdent des propriétés qui va rient légèrement selon le degré auquel on a fait réagir le complexe de formaldéhyde avec les groupes amlno libres. D'une façon générale, ils sont beaucoup moins toxiques que les pro tamines ou leurs sels, des essais sur sourie indiquant une
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DL 50 de l'ordre de 2 g/kg de poids corporel. ln vitro ils présentent peu de l'activité des protamines mais, il vvt semblent régénérer la protéine libre car leur activité est tout aussi élevée.
Toutefois, la vitesse de régénération est lente et les nouvelles substances selon l'invention semblent servir de préparations-dépôts de protamine,
L'invention a pour objet des solutions injectables aqueuses à activité protaminique, à stabilité améliorée, comprenant de la protamine et/ou l'un de ses sels physiologie
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quement aoceptablao formés prtr addition avec dos acides, en association ou en combinaison avec un complexe formaldéhyde'- bisulfite et/ou formaldéhyde-sulfoxylate< Parmi les sels de protamine on citera, par exemple', les halohydrates, le brorahydrate, le phosphate, le nitrate, lia citrate, le turtrate et le plus courant, le sulfate* A titre d'exemples de bisulfites ou de sulfoxylate présents dans les complexes de formaldéhyde précités,
on peut citer les bisulfites ou les sulfoxylate de métaux jazz câline, par exemple les sels de sodium ou de potasaiua!< On
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peut également utiliser des mélanges de bisulfite ét de sul foxylate.
La concentration en protamine des solutions simples selon l'invention, contenant de la protamine non combina peut être supérieure à 3% en poids, et est limitée par la solubilité à une concentration inférieure à 20% environ. Des solutions contenant de 5 à 10% sont particulièrement utile* lorsqu'il faut injecter de fortes doses de potmine Le rapport entre complexe de formaldéhyde, et protamine, dana ces solutions simples, est avantageusement supérieur à 1/1 et, de préférence, égal à 3/2 ou plus, des rapporte plus fai bles ayant tendance à produire une stabilisation incomplète, tandis que des rapports sensiblement plus élevés nécessitent une concentration inutilement élevée en complexe de formaldéhy de.
four une solution de protamine à 10% il y a avantageu- sèment présence d'au moins 15% environ de complexe de formai- déhyde. Les concentrations et quantités de protmaine idi quées dans la présente demande sont exprimées en quantité équivalente de protamine base, que la protamine soit ou non sous forme de sel ou en combinaison avec le complexe de for maldéhyde *
Les solutions simplet haute concentration, comme indiqué ci-dessuss sont, de préférence, à pH 5,0 environ et, d'une façon générale, le pH de la solution est compris entre 5,0 et 8.0 Si on le désire, il peut y avoir présence de sels physiologiquement acceptables tels que le chlorure de sodium,
etc.*.
Dans les solutions selon l'invention qui oontien- nent la protamine et le complexe de formaldéhyde sous forme combinée, le rapport entre complexe de formaldéhyde et prota- mine peut être aussi faible que 1/1,5 mais, de préférence, est plus élevé, de 1/1,25 par exemple.
L'invention vise également des compositions destinées
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à être dissoutes dans l'oau pour forcer des solutions stables à activité protaminique, comprenant de la protamine et/ou un de ses Héla phsioqiemetn acceptables en association ou en combinaison avec un complexe formaldéhyde/bisulfite et/ou formaldéhydes/slufoalte Dans oea compositions, le rapport entre complexe et protamine doit) de préférence, être situé dans les limites spécifiées ci-dessus. Le composé formé entre la protamine et le complexe peut être isolé soue forme soldie à pitrtir des soultions décrites ci-dessus, par précipi- tation par exemple, et constitue encore une caractéristique de l'invention.
Une telle substance n'a pas été précédemment décrite dans la littérature et sa toxicité très réduite ainsi que, son absence d'activité in vtro indiquent clairement qu'il y a formation d'un composé vrai bien que, la protamine dont elle provient ayant elle-même uno composition variable,la nouvelle su 'tance ne soit pas bien caractérisée physiquement .
L'invention vise également un procédé de prépara tion des solutions selon l'invention, procédé selon lequel or deissout dans de l'eau de la protamine et/ou un de ses mêle physiologiquement acceptables formés par addition aveo des acides et un complexe formaldéhyde-'bisulfite ou formaldéhyde- sulfoxylate, pour obtenir, soit directement, soit par chauf- fage à un pH alcalin, une solution à activité protaminique ayant une stabilité perfectionnée*Les rapports entre con stituants sont, de préférence, ceux prescrits ci-dessus.
Lorsqu'on chauffe les solutions pour former le com posé indiqué entre la protamine et le complexe de formaldéhy- de, il est préférable que la température de réaction soit supérieure à 40 C et, avantageusement, de 90 à 100 0,. De pré- férence, le pH est supérieur à 2,5 et, meux encore, supérieur à 10,5 bien qu'à des pH supérieurs à 13 il puisse se produire une certaine destruction de substance et qu'on préfère des
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pH inférieure z 12. le temps de réaction sote de prdtdtenoup compris entre 1 et 20 heures et, pour des résultat opt1ml. on trouve qu'il varie avec le pH et avec le rapport entre complexe de fovmlddhyde et protamine.
D'une façon générale, le temps de réaction nécessaire pour donner de bons résul- fats est d'autant plus court que le pH ou ledit rapport sont plus élevée*
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Les propriétés du produit de r6aot1on varient lege*. rement selon le degré de la réaction, ofeut-à-dîre) selon le degré d'incorporation de groupes contenant du soufre dans la moléoule;
d'une façon générale, l'augmentation du rapport entre complexe de formalddhyde et protéine, du temps do rés
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tion, de la température et du pH ont toutes tonlanos à fui augmenter la teneur en soufre du produi" [j.1 " et, par ocn* quent, la stabilité des solutions injectables ainsi obtenu- La solution résultante ".eut être préparée aux fir-s d'injection par stérilisation, par exemple par filtration pour éliminer les bactéries, etc.,, ou par traitement à la chaleur, dans un autoclave par exemple. On peut ajuster le pH entre les valeurs de 5 et 8 par exemple par addition d'un acide, par exemple d'un acide minéral tel que l'acide ohlor- hydrique, l'acide sulfurique, etc...
On peut recueillir le composé à partir des solu- tions aqueuses, par exemple par précipitation, par addition d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool
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comme l'l6thanol. Les exemples suivants sont donnés à titre d' 111u8- tration de 'invention.
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On dissout 500 g de sulfate de protamine du oommer- oe, provenant du oaumon, dans 5 litres de sérum isotonique. On amène le milieu rdactionnel 4 pH 10,0 à l'aide de soude
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caustique, puis on -chauffe la solution à 70 C on filtre le précipité brun qui s'est force, On traite le filtrat par l'acide chlorhydrique dilué jusqu'à pH 7,6, puis on le filtre à nouveau. Une huile se empare au bout de 4-5 jours de repos à une température de 4 C On déoante le liquide surnageant. et on le jette.
On lave l'huile résiduelle, constituée par de la protamine base, avec du sérum isotnique glace, on laisse à nouveau précipiter par repos au froid, et on re- cueille le précipite* On recommence ce même processus. A l'aide d'une solution aqueuse à 15% de formaldéhyde-bisulfite de sodium, on amène à 250 ml 50 g de la protamine base ainsi obtenue, qui contient un peu d'eau associée. On amène le pH de la solution à 5,0 pur addition d'une quantité suffisante d'acide chlorhydrique dilué. La solution est tout à lait sta ble aux températures ordinaires et on la filtre sur un filtre bactériologique, et on en remplit des ampoules.
Démette façon, on obtient une solution contenant N total - 2,26% poids/vol, correspondant à une solution à 10% de sulfate de protamine Elle est apyrogène chez les lapins à une dose de 20 mg par kilo de poids corporel et sa toxicité, par administration intraveineuse à des sourie correspond à une DL50 de 54 mg de protamine par kilo de poids corporel.
On trouve que le produit neutralise l'activité anticoagulante de l'héparine; in vitroen utilisant du plasma de mouton et, à cet égard) son activité est égale, poids pour poids à celle de sulfate de protamine du commerce En outre, il neutralise 1'effet de 1 'héparine sur le temps du coagulation des souris, et dune ce but, on peut l'administrer par la voie ijntramusculai re montrant ainsi en môme temps qu'il se produit une absorp- tion de la protamine lorsqu'on la donne sous cette forme.
EXEMPLE 5
On dissout 5 g de l'huile de protamine obtenue à
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partir de sulfate de protamine du oommer6<t oomme à lt#X#Mpl* 1, dans une quantité suffisante de solution aqueuse à 20% poide/vol de formalddliyde sultoxylate de sodium pour obtenir un volume final de 25 m1 La solution ainsi obtenue, une fois le pH amené à 5 par addition de quelques gouttes d'acide ohlorhydrique dilue, reste stable à température ambiante
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SXBMPIiE..5. .
On chauffe 500 g d'huile de protamine provenant de sperme d' saumon (oalînë) avec une solution de 200 g de formalddliyde-bïuulfïte de sodium dans 500 ml d'eau, sur un bain*-marie bouillant g pendant 16 heure après avoir amend le pH du milieu r6aotionnel h 10," aved de la coude caustique Après refroidissement on neutralise là solution jusqu'à 7#4 par addition dtaaîde Chlorhydrique dilué on l'amen à ua volume de 2500 ml à l'aide d'eau distillée on la clatitle par filtration et on la stérilise, après en avoir rempli dez récipients appropriée, à 1'autoclave sous une pression de vapeur d'eau de 0,7 kg/om2, pendant 30 minutes* A 1' analyse ,
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on trouve que la teneur en azote cet de 2#2e* oe qui corres- pond à une solution de protamine à 1000 De$ échantillons et montrent apyrogènes chez le lapin à une dose équivalent à 20 mg de protamine par kg de poids corporel et, dans des
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essais chez des souris, on trouve que la DL 50 est d'environ 2000 mg de protamine par kilo.
On traite la solution finale avec deux parties en
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volume d'éthanolp de façon à faire précipiter une gomme qui, après séparation et trituration avec une quantité supplémen- taire d'êthanole donne un produit solide. On le filtre, on le lave à l'éthanol, et on le séche sous vide sur P 2051 et on obtient une substance solide contenant 16p8% de N et 10980 de S
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On procède comme à l'exemple 1, avec des rapporta croissante entre complexe de formaldéhyde et protamine et on indique au tableau ci-dessous les teneurs en N et en S trouvées à l'analyse des produits ainsi obtenus.
Dans chaque
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caa, on chauffe 5 6 d'huile de protaminel pendant deux heu- rets, avec 25 ml d'eau contenant la quantité nécesuaire de ' formaldéhyde-biaulfite de sodium.
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!l .bcI1.l.J, 1 L -:11 Huile de Formald6hyde- N0 B$ protntaine b1Iult1te. sodium 1 1. l fl j :1 1 nnn.i nn,l| 5 g <8 11,S 5 g 4g 12, ia,5>( 10,7* 13*su 5 s 5 g lOt7% z.¯¯.. 13,6 On chauffe 5 g d'huile de protamine provenant de
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opéras ?e saumon pendant deux heures, dans une solution ' préparée à partir de 2 g de formaldéhyde eulfoxylate de 80- dium dans 20 ml d'eau et amenée à un pH de 1110, Après refrol- dissement, on ajuste le pH de la solution à 'T;4, à l'aide d'acide chlorhydrique dilué, on amène le volume à 25 rai et on filtre la solution. On obtient ainsi le produit sous forme d'une solution stable.
On dissout 500 g de sulfate de olupéine dans 4500 ml de sérum physiologique. On amène le pH de la solution à 10,7 à l'aide de soude caustique et, après avoir élevé la
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température à 7000p on filtre le liquide pendant qu'il est encore chaud, de façon à séparer un précipité brun. On amène
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le pll du filtrat à'7,6 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué.
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On laisse reposer à 4 C pendant trois jours, et il se sépare une huile. en sépare le liquide surnageant par dé- cantation, puis on agite l'huile avec 4,5 litres d'une solu- tion à 1,8% de chlorure de sodium puis on laisse déganter au repos à 4 C;
on dissout 50 g de l'huile ainsi obtenue ( N 12,2%) dans une solution aquese à 15% de formaldéhyde-bisul'' fite de sodium, de façon à obtenir un volume final de ml On amène le pH de la solution à 5,0 à l'aide d'acide ohlorhy- drique dilué, On remplit aseptiquement des ampoules de 5 ml avec la solution ( N @ 2,10%), chacune contenant 500 mg de protamine base, la solution ayant des propriétés biologiques sensiblement identiques à celles du produit obtenu à l'exemple 1 ci-dessus.
EXEMPLE 7
On dissout 1000 g de olupéine base aqueuse (N 13,3) dans 4 litres d'eau contenant 400 g de formaldéhyde- bisulfite de sodium. On amène le ph de la solution à 10,15 à l'aide de soude caustique puis on chauffe le mélange à 70*0 pendant 18 heures. Après refroidissement, on abaisse le pH du liquide à 7,35 à l'aide d'acide ohlorhydrique dilué, et on amène le volume de la solution à 4560 ml avec de l'eau dis tillée. Après filtration stérile, on remplit des ampoules avec la solution. On chauffe ensuite celles-ci pendant 30 minutes, sous une pression de vapeur d'eau de 0,7 kg cm2 On analyse le produit, et on trouve qu'il contient 2,6y5 de N.
On procède à des casais de toxicité chez les sourie, ot on trouve que la DL50 du produit est de l'ordre de 1500 kg/kg de poids corporel, le dosage étant exprimé en protaine Dans des essais d'apyrogénioité sur les lapins, la substance est satisfaisante à une dose dont la valeur correspond à 20 mg de protamine par kilo de poids corporel.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux
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modes de mise en oeuvre décrite qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemples
REVENCDCIATIONS
1 Solutions aqueuses injectables à activité pro taminique & stabilité améliorée, caractérisées en ce qu'elle comprennent de la protamine et/ou un de ses sels physiologie quement acceptables formée par addition avec des acides, en association ou en combinaison avec un complexe formaldéhyde- bisulfite et/ou formaldéhyde-sulfoxylate.
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The present invention relates to novel pharmaceutical compositions containing protamine.
The term "protamine" is a generic term used to denote a class of low molecular weight proteins derived mainly from sperm and fish milt * its molecular weight is omitted between 2000 and 8000 and this substance has been found to have a high inhaibuellemtn proportion of arginine residues which, including a free guanidine group, cause the protein to be strongly basic. As well as, for example, in salmon salmine, more than 80% of its nitrogen content is found soft form of arginine, and that herring clupeine drastically poses a high percentage of arginine.
Among the other protmaines we must mention iridine, truttin, for ane, laoustrin and aturine, whose natural sources and properties are described in a study by K. Félix (Advanoos in Protein Chmeistry 1960, 15 1-56) The free base is an oil which is sparingly soluble in water and its salts, such as sulphate for example, are also sparingly soluble, although the presence of acid increases their solubility at pH 30 for example.
As isolated from abundant sperm, protamine base is generally found in the form of an oil containing about 50% water, a substance generally referred to as "protamine oil".
Protamine has mild anticoagulant properties but is especially valuable as an antidote to heparin which is a powerful anticoagulant compound. Generally, it is administered when too much has been given.
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high heparin, and is usually injected intravenously as a 1-2% aqueous solution. Due to the difficult solubility of protamine salts, solutions of these salts at neutral pH,
are unstable and tend to separate by precipitation. Consequently, the protamine sulphate solutions * used for injection are at pH 3.0 ("Protaminae Sulphatis bPC injection") Naturally these acid solutions cause severe pain if injected intramuscularly or subcutaneously and their administration. is virtually limited to the intravenous route.
The applicant has now found that it is possible to prepare negiable solutions with pre mini- mum activity only at pH values well above 3.0 4, values of 5.0 for example, or even higher, s'. there is a formaldehyde-bisulfite u sulfoxylate complex in the sola tian. At relatively low concentrations, at 5% for example, these solutions are stable (i.e. pro. Tamine does not tend to separate from solution) even at neutral or alkaline pH, but at higher concentrations of 10 to 20 for example, it is preferable that the pH is about 5.0.
However, protamine does not appear to undergo compound formation with the formaldehyde complex. These compositions are markedly more suitable for injection than the acid solutions previously used.
The Applicant has also found that even more stable solutions containing protamine can be obtained if the protamine / bisulfite or sulfoxatl solutions are heated to an alkaline pH.
The solutions thus obtained are stable at neutral or even alkaline pH, al u 'at acidic pH, even at protamine concentrations as high as 20 and when heated to 37 C for example, one
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can obtain concentrations of around 40%
Although the invention should not be limited by theoretical considerations, applicants believe that the formaldehyde complex reacts with free amino groups present in the guanidine groups to form.
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derivatives of zdmthy sulfite, ene or n ... methyln sulfoxylate.,
the protaminants obtained by the heating step described above possess properties which vary slightly depending on the degree to which the formaldehyde complex has been reacted with the free amino groups. In general, they are much less toxic than procamins or their salts, mouse tests indicating a
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LD 50 of the order of 2 g / kg of body weight. In vitro, they show little protamine activity, but they seem to regenerate the free protein because their activity is just as high.
However, the regeneration rate is slow and the new substances according to the invention seem to serve as protamine depot preparations,
The subject of the invention is aqueous injectable solutions with protamine activity, with improved stability, comprising protamine and / or one of its salts physiology
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cally aoceptablao formed by addition with acids, in association or in combination with a formaldehyde'-bisulphite and / or formaldehyde-sulphoxylate complex <Among the protamine salts we may mention, for example ', the hydrohalides, the brorahydrate, the phosphate, the nitrate, citrate, turtrate and the most common, sulfate * As examples of bisulfites or sulfoxylate present in the aforementioned formaldehyde complexes,
we can cite bisulphites or sulphoxylates of cuddly jazz metals, for example sodium or potassium salts!
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can also use mixtures of bisulfite and sulfoxylate.
The protamine concentration of the simple solutions according to the invention containing uncombined protamine can be greater than 3% by weight, and is limited by the solubility to a concentration of less than approximately 20%. Solutions containing from 5 to 10% are particularly useful * when it is necessary to inject large doses of potmine The ratio between formaldehyde complex and protamine, in these simple solutions, is advantageously greater than 1/1 and, preferably, equal to at 3/2 or more, lower ratios tend to produce incomplete stabilization, while significantly higher ratios require an unnecessarily high concentration of formaldehyde complex.
In a 10% protamine solution there is advantageously the presence of at least about 15% of formaldehyde complex. The concentrations and amounts of protmaine idi cated in the present application are expressed as an equivalent amount of protamine base, whether or not the protamine is in the form of a salt or in combination with the complex of for maldehyde *
Single high concentration solutions as indicated above are preferably at about pH 5.0 and generally the pH of the solution is between 5.0 and 8.0. If desired, it can be. have the presence of physiologically acceptable salts such as sodium chloride,
etc. *.
In solutions according to the invention which contain protamine and the formaldehyde complex in combined form, the ratio of formaldehyde complex to protamine may be as low as 1 / 1.5 but, preferably, is higher. , of 1 / 1.25 for example.
The invention also relates to compositions intended
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to be dissolved in water to force stable solutions with protaminic activity, comprising protamine and / or one of its acceptable Hela phsioqiemetn in association or in combination with a formaldehyde / bisulfite and / or formaldehydes / slufoalte complex In oea compositions, the ratio between complex and protamine should preferably be within the limits specified above. The compound formed between the protamine and the complex can be isolated in the form of the reactions described above, by precipitation for example, and still constitutes a feature of the invention.
Such a substance has not been previously described in the literature and its very reduced toxicity as well as its absence of intro activity clearly indicate that there is formation of a true compound although, the protamine from which it comes having itself a variable composition, the new su 'tance is not well characterized physically.
The invention also relates to a process for preparing the solutions according to the invention, a process according to which or deissout in water protamine and / or one of its physiologically acceptable mixtures formed by the addition of acids and a formaldehyde complex. Bisulfite or formaldehyde sulfoxylate, to obtain, either directly or by heating to alkaline pH, a solution with protaminic activity having improved stability. The ratios between constituents are preferably those prescribed above.
When the solutions are heated to form the indicated compound between protamine and the formaldehyde complex, it is preferable that the reaction temperature is above 40 ° C. and, preferably, 90 to 100 ° C. Preferably, the pH is greater than 2.5 and even more greater than 10.5 although at pH greater than 13 some destruction of substance may occur and more preferred.
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pH less than 12. the reaction time is prdtdtenoup between 1 and 20 hours and, for optimal results. it is found to vary with pH and with the ratio of fovmlddhyde complex to protamine.
In general, the reaction time necessary to give good results is shorter as the pH or said ratio is higher *
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The properties of the reaction product vary slightly. depending on the degree of the reaction, ofeut-to-dîre) depending on the degree of incorporation of sulfur-containing groups in the moléoule;
in general, the increase in the ratio between formaldehyde complex and protein, the time of res
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tion, temperature and pH all have tonlanos to increase the sulfur content of the product "[j.1" and, therefore, the stability of the injectable solutions thus obtained. The resulting solution ". can be prepared at injection fir-s by sterilization, for example by filtration to remove bacteria, etc. ,, or by heat treatment, in an autoclave for example. The pH can be adjusted between the values of 5 and 8, for example by addition of an acid, for example a mineral acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, etc.
The compound can be recovered from aqueous solutions, for example by precipitation, by addition of a water-miscible organic solvent such as an alcohol.
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such as ethanol. The following examples are given by way of embodiment of the invention.
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500 g of egg protamine sulfate from salmon is dissolved in 5 liters of isotonic serum. The reaction medium is brought to pH 10.0 using sodium hydroxide
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caustic, then the solution is -heated to 70 ° C., the brown precipitate which has become strong is filtered off, the filtrate is treated with dilute hydrochloric acid to pH 7.6, then it is filtered again. An oil seizes after standing for 4-5 days at a temperature of 4 ° C. The supernatant liquid is deoiled. and we throw it away.
The residual oil, consisting of protamine base, is washed with ice-isotnic serum, again allowed to precipitate by standing in the cold, and the precipitate is collected. This same process is repeated. Using a 15% aqueous solution of sodium formaldehyde bisulphite, 50 g of the protamine base thus obtained are brought to 250 ml, which contains a little associated water. The pH of the solution is brought to 5.0 pure addition of a sufficient quantity of dilute hydrochloric acid. The solution is completely stable at ordinary temperatures and is filtered through a bacteriological filter, and filled into ampoules.
In this way, we obtain a solution containing total N - 2.26% w / v, corresponding to a 10% solution of protamine sulfate.It is pyrogen-free in rabbits at a dose of 20 mg per kilogram of body weight and its toxicity , by intravenous administration to mice corresponds to an LD50 of 54 mg of protamine per kilogram of body weight.
The product is found to neutralize the anticoagulant activity of heparin; in vitro using sheep plasma and, in this regard) its activity is equal, weight for weight, to that of commercial protamine sulfate In addition, it neutralizes the effect of heparin on the coagulation time of mice, and For this purpose, it can be administered by the intramuscular route thus showing at the same time that absorption of protamine occurs when given in this form.
EXAMPLE 5
5 g of the protamine oil obtained are dissolved in
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starting from protamine sulphate from oommer6 <t oomme to lt # X # Mpl * 1, in a sufficient quantity of aqueous solution at 20% weight / vol of sodium formaldehyde sultoxylate to obtain a final volume of 25 ml. once the pH has been brought to 5 by adding a few drops of dilute hydrochloric acid, remains stable at room temperature
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500 g of protamine oil from salmon sperm (oalin) are heated with a solution of 200 g of sodium formaldehyde-sululfite in 500 ml of water, on a boiling water bath for 16 hours after having change the pH of the reaction medium to 10 hours, with the caustic bend. After cooling, the solution is neutralized to 7 # 4 by addition of dilute hydrochloric acid and brought to a volume of 2500 ml using distilled water it is filtered off and sterilized, after filling it into suitable containers, by autoclaving under a vapor pressure of 0.7 kg / m 2 for 30 minutes.
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it was found that the nitrogen content of 2 # 2e * oe which corresponds to a protamine solution in 1000 samples and shows pyrogen-free in rabbits at a dose equivalent to 20 mg of protamine per kg of body weight and, in
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In tests in mice, the LD 50 was found to be approximately 2000 mg of protamine per kilogram.
We treat the final solution with two parts in
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volume of ethanol so as to precipitate a gum which, after separation and trituration with an additional quantity of ethanol, gives a solid product. It is filtered, washed with ethanol, and dried under vacuum over P 2051 to give a solid substance containing 16p8% N and 10980 S
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The procedure is as in Example 1, with increasing ratios between formaldehyde complex and protamine, and the N and S contents found on analysis of the products thus obtained are indicated in the table below.
In each
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In this case, 5 6 protaminel oil is heated for two hours with 25 ml of water containing the necessary amount of sodium formaldehyde-biaulfite.
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! l .bcI1.l.J, 1 L -: 11 Formaldehyde oil- N0 B $ protntaine b1Iult1te. sodium 1 1. l fl j: 1 1 nnn.i nn, l | 5 g <8 11, S 5 g 4g 12, ia, 5> (10.7 * 13 * su 5 s 5 g lOt7% z.¯¯ .. 13.6 5 g of protamine oil from
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salmon operated for two hours, in a solution prepared from 2 g of formaldehyde eulfoxylate 80dium in 20 ml of water and brought to a pH of 1110. After cooling, the pH of the mixture is adjusted. T4 solution, using dilute hydrochloric acid, bring the volume to 25 rai and filter the solution. The product is thus obtained in the form of a stable solution.
500 g of olupeine sulphate are dissolved in 4500 ml of physiological serum. The pH of the solution is brought to 10.7 using caustic soda and, after having raised the
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temperature at 7000p the liquid is filtered while it is still hot, so as to separate a brown precipitate. We bring
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pll of the filtrate to 7.6 with dilute hydrochloric acid.
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It is left to stand at 4 ° C. for three days, and an oil separates out. the supernatant liquid is separated from it by decantation, then the oil is stirred with 4.5 liters of a 1.8% solution of sodium chloride and then allowed to degant on standing at 4 ° C;
50 g of the oil thus obtained (N 12.2%) are dissolved in a 15% aqueous solution of formaldehyde-sodium bisul '' fite, so as to obtain a final volume of ml. The pH of the solution is brought up to 5.0 using dilute hydrochloric acid, 5 ml ampoules are aseptically filled with the solution (N @ 2.10%), each containing 500 mg protamine base, the solution having biological properties. substantially identical to those of the product obtained in Example 1 above.
EXAMPLE 7
1000 g of aqueous base olupeine (N 13.3) are dissolved in 4 liters of water containing 400 g of formaldehyde-sodium bisulfite. The pH of the solution is brought to 10.15 using caustic soda and the mixture is then heated to 70 ° 0 for 18 hours. After cooling, the pH of the liquid is lowered to 7.35 using dilute hydrochloric acid, and the volume of the solution is brought to 4560 ml with distilled water. After sterile filtration, ampoules are filled with the solution. These are then heated for 30 minutes, under a water vapor pressure of 0.7 kg cm2. The product is analyzed, and it is found that it contains 2.65 of N.
Toxicity studies were carried out in mice, ot the LD50 of the product was found to be of the order of 1500 kg / kg of body weight, the dosage being expressed as protaine In pyrogenicity tests on rabbits, the substance is satisfactory at a dose the value of which corresponds to 20 mg of protamine per kilogram of body weight.
Of course, the invention is not limited to
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embodiments described which have been given only as examples
CLAIMS
1 Injectable aqueous solutions with pro taminic activity & improved stability, characterized in that they comprise protamine and / or one of its physiologically acceptable salts formed by addition with acids, in association or in combination with a formaldehyde-bisulfite complex and / or formaldehyde-sulfoxylate.