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Publication number: BE628615A
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Description


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  La présente invention a   trait &   des compositions conte- 
 EMI1.1 
 nant de la 5-tluoro-cytosine, à un procédé pour leur prépara- tion et à leur utilisation pour influencer les parasites fon- giques. En particulier, cette invention trait 4 l'utilisation 
 EMI1.2 
 de -fluora-oytosinA pour combattre certains ohampigonons pathogène pour l'homme, les animaux et les plantes. 



  C'est un r4%tt connu que ""rt.!n1:4 n"rnrH.H1 df la t'1uoropyrimidine, v compris la 5-tluoro-oytoeine, exercent une action inhibitrice sur la croissance de certaines bactéries. Or, il a maintenant été trouvé que la 5-f7.uaxo-oytasine était également très efficace comme inhibiteur de croissance sur certaines classes de champignons. Le terme de " champignons" , ainsi qu'il est employé dans cette   spécification,   comprend aussi bien les levures que les champignons microscopiques. Il est   trs   sur- 
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 prenant que la 5'fluoro-cytosine possède une activité antifongique. 



  Ainsi, par exemple, on a trouvé que la 5-tliioro-cytosine était active contre les organismes causant la moniliaaee elle est spécialement efficace contre Candida a7.biaana,erpae causant une infection   aiguë   ou subaigüe dans la bouche ou la gorge, la peau, les ongles, le vagin, les bronches, les poumons ou le système intestinal.

   En outre, la   5-fluoro-cytosine   est efficace comme Inhibiteur de la croissance par exemple des espaces   aspergilli   et   penicillla,   notamment de l'Aspergillus niger, l'agent d'altérations causant de considérables déchets et/ou détériorations des aliments, ouirs. textiles, peinture, papier, etc., ainsi que contre d'autres agents d'altérations, tels qu'      

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 Aspergillus flavua, Pénicillium digitatuni et Pénicillium oitri'' num. En plus, la 5-fluoro-oytosine possède une action inhibitrioe sur la croissance des levures.telles que Saccharomyces coreviniae et Rhodotorula rubra. 



  Le seul fait que la 5-rluoro-oYtosine possède une action antifongique est déjà surprenant; mais encore plus remarquable est son large champ d'action antifongique. Par exemple, on a trouve 
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 que la 5-fluoro-oytosîne était au moins dix fois plus active in vitro contre Candida albioans que le 5-tluoro-uracile, tout en étant vingt fois moins toxique pour la souris et le chien. 



   Ainsi, l'invention a trait à l'utilisation de la   5-fluoro-   oytosine comme agent antifongique, à l'utilisation de préparations contenant nette substance pour combattre les infections générali- 
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 sées ex Candida a.biaaxzs et a une composition contenant la 5-fluccv- cytosine comme substance active. 



   L'activité in vitro de la 5-fluoro-oytosine a été éprouvée par l'essai de diffusion sur plaque de   gélose comme   pour les essais de pénicilline. Ce procédé est décrit par   Donald     C.Grove   et William A. Randall, dans Assay Methods of Antibiotios, publiés 
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 par Médical Encyclopédie Ino., New York,N.Y., 1955, pages 2 à 16. Dans le présent cas, on a utilisé pour l'inoculation des ohampignonsetnmpas des bactéries. Les zones d'inhibition de la   5-fluoro-oytosine   ont été de 20 mm de diamètre, ou davantage contre   Paeoilomyoes   varioti et Pénicillium   digitatum à   une concentration de 0,1 mg/ml.

   En plus, la sensibilité des   ohampi-   

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 gnons à la 5-fluoro-cytosine est   extrêmement   grande lorsqu'on utilise une gélose semi-synthétique en lieu et place de la gélose avec azote organique. Ainsi, à une concentration de 0,01   mg/ml   de solution, on a observé des zones d'inhibition de 20 à 37 mm de diamètre contre Candida   albioans,   Saccharomyces   oerevisiae,     Paecilomyces     varioti   et Pénicillium digitatum. Des concentrations de 1 mg/ml de 5-fluoro-cytosine produisirent, dans la gélose semi- synthétique, des zones d'inhibition de 45 à 60 mm de diamètre contre Penicillium   citrinum,   Aspergillus   flavus   et Aspergillus niger.

   Dans la table suivante, 11 est donné une comparaison entre l'activité antifongique de la   5-fluoro-cytosine   et de l'agent antifongique connu sous la dénomination commune de nystatine, qui est un antibiotique polyénique produit par Streptomyces noursei, Streptomyces aureus et d'autres   e&p&oes   de Strepto- myoes. 



  Spectre antifongique invitro de la 5-fluoro-cytosine et la nvstatine : 
Tous les organismes examinés ont été   cultivéssur   un milieu semi-synthétique de gélose enrichie de vitamines, de sels et d'hydrolysat de caséine à un pH de 5,5. Ce milieu a été préparé   @   la manière suivante: 10 mg de pyridoxine, 10 mg de thiamine, 1000 mg d'inositol, 100 mg de pantothénate de calcium, 0,32 mg de d-biotine et 100 mg d'acide nicotinique sont ajoutés à une quantité suffisante d'eau pour obtenir une solution vita- minée de 1 litre.

   Dans un autre récipient, 200 g de dextrose (anhydre), 2,2   g   de KH2PO2. 1,7 g de chlorure de potassium, 

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 0,5 g de CaC12.2H2O, 0,5 g de MgSO4.7H2O,   0,01   g de FeCL3.6H2O et 0,01 g de MnSO4.H2O sont ajoutés à la quantité suffisante d'eau pour obtenir 1 litre de solution de sucre et de sels. On pré- pare d'autre part une solution-tampon de citrate en ajoutant 90,0 g de citrate de sodium et 20,0 g d'acide citrique à une quantité suffisante d'eau pour donner 1 litre de solution. Le milieu désiré est préparé en mélangeant 25 ml de cette solution vitaminée, 250 ml de la solution sucre/sels susdite, 50 ml de la solution-tampon, 40 ml d'une solution d'hydrolysat de caséine et 15 g de gélose dans une quantité d'eau suffisante pour donner 1 litre de solution.

   La solution   d'hydrolyeat   de caséine sus- dite est obtenue en ajoutant 100 g de "Sheffield N-Z aminé   A "   à une quantité suffisante d'eau pour un volume total de 1 litre. 



  Le   'Sheffield   N-Z amine A" est un hydrolysat de caséine pré- paré et vendu par la Sheffield Chemical Company, qui est une branche de la National Dairy Products Company, Norwich, New . 



  York. Le milieu a été stérilisé 10 minutes à l'autoclave. 



   Les cultures désignées dans la table suivante par les numéros 1, 3 et 4 ont été maintenues 18 heures à 35 . Les autres cultures furent maintenues à 28  pendant un temps suffisant pout permettre une croissance suffisante de chaque organisme (1-3   Jurs).   

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<tb> 



  Diamètre <SEP> des <SEP> zones <SEP> d'inhibition
<tb> 
<tb> 
<tb> en <SEP> mm
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> oonoentration <SEP> mg/ml <SEP> de
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Nos. <SEP> Organismes <SEP> d'essai <SEP> . <SEP> nystatine <SEP> 5-fluoro-cytosine
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2,0 <SEP> 0,1 <SEP> 0,02 <SEP> 0,004
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Saccharomyces <SEP> cere-
<tb> 
<tb> visiae <SEP> . <SEP> 22 <SEP> 38 <SEP> 29 <SEP> 23
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2 <SEP> Rhodotorula <SEP> rubra <SEP> 37 <SEP> 45 <SEP> 32 <SEP> 20
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3 <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 27 <SEP> 13
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 4 <SEP> Paeilomyces <SEP> varioti.

   <SEP> 31 <SEP> 35 <SEP> 27 <SEP> 19
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5 <SEP> Pénicillium <SEP> citrinum <SEP> 25 <SEP> 46 <SEP> 32 <SEP> 18
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6 <SEP> Aspergillus <SEP> flavus <SEP> 24 <SEP> 52 <SEP> 36 <SEP> 22
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7 <SEP> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 27 <SEP> 49 <SEP> 42 <SEP> 23
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8 <SEP> Pénicillium <SEP> digitatum <SEP> 33 <SEP> ' <SEP> 47 <SEP> 27 <SEP> 18
<tb> 
<tb> 
<tb> (à <SEP> 0,125
<tb> 
<tb> mg/ml)
<tb> 
 
Comme on peut le voir, la   5-fluoro-cytosine   est bien plus efficace que la nystatine (parfois de 30 à 500 fois). De plus, l'addition de 20 % de sang humain à la solution de 5-fluoro-cy- tosine n'a pas provoqué de diminution notable de son activité contre Candida   albioans.   



   Comme on peut le voir par   l'exemple     1     ci-après,   la   5-fluor@@ytosine   est efficace, in vivo, contre les infections fongiques généralisées, telles que les infections par Candida albicans. Ses propriétés antifongiques, couplées avec sa basse      toxicité, font que cette substance est extrêmement bient appro- priée au traitement d'infections fongiques chez l'homme, les animaux et les plantes. En plus, les propriétés de la   5-fluoro-   cytosine la rendent utile pour le traitement des agents d'al- térationscausant les déchets   industriels   et/ou la détérioration des aliments. 



    @   

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Pour l'application pharmaceutique la 5-fluoro-cytosine peut être utilisée seule,ou elle peut être transformée en solutions ou suspensions au moyen des véhicules pharmaceutiques liquides appropriés, tels que l'eau ou l'alcool. En général, de telles solutions ou suspensions contiendront au moins env.   0,1   en poids de 5-fluoro-cytosine. Cependant, sous les conditions normales, des solutions ou suspensions ayant une plus grande teneur en   5-fluoro-oytosine   seront de loin plus utiles. Les solutions et suspensions de 5-fluoro-oytosine peuvent être administrées oralement ou, également, par injections, par exemple par vole intraveineuse,   sousoutanée   ou intrapéritonéale.

   De plus, la   5-fluoro-oytosine   peut être transformée en forme de présentation orale solide, telle que capsules de gélatine dure, comprimés, etc., au moyen des adjuvants usuels, y compris les agents de remplissage, tels que le oopréoipité d'hydroxyde d' aluminium et de carbonate de calcium, le phosphate   dioalcique   ou le lactose; les agents de désintégration, tels que l'amidon de   mais;   et les lubrifiants, tels que le talc, le stéarate de   calais   La quantité de 5-fluoro-cytosine utilisée peut varier dans de très larges limites suivant les adjuvants utilisés. En général, la concentration maximum permise dans une forme de présentation solide sera déterminée uniquement par les considérations tech- niques.

   Ainsi, lorsqu'on prépare par exemple des comprimés, on n'utilisera que la quantité d'adjuvants nécessaire pour obtenir, après compression, des comprimés répondant aux spécifications. 



   Lorsque la 5-fluoro-oytosine est destinée à être utilisée pour préserver les aliments ou dans l'agriculture, elle peut   @   être dissoute ou mise en suspension dans un solvant approprié, 

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 et cette solution ou suspension peut être vaporisa sur   les   aliments ou les plantes à protéger. Lorsque la 5-fluoro-cytosine est destinée à protéger des produits industriels, la substance u peut être utilisée telle quelle, ou en suspension ou dissolution dans un véhicule adéquat, par exemple lorsqu'il s'agit de pein- ture. Pour le traitement de cuirs, textiles, papier, etc., la 5-fluoro-cytosine pourrait très avantageusement être appliquée, sous forme de solution ou suspension, par vaporisation ou trem- page. 



   Exemple 1 
On prépare des solutions aqueuses contenant la 5-fluoro-   oytosine   en concentrations diverses. Chaque solution est pré- parée en ajoutant la substance à l'eau et remuant à la tempé- rature ambiante. On prépare ainsi quatre solutions contenant, par 1,0 ml d'eau, 1 mg, 2 mg, 4 mg ou 10 mg de 5-fluoro-cytosine. 



   L'efficacité de ces solution dontre les infections géné- ralisées a été éprouvée chez la souris blanche. Les infections les ont été provoquée, chez les animaux comme suit: la couche obtenue après   24   heures de culture de Candida   albicans   en   mi@@'eu   incliné à base de gélose, selon Sabouraud, a été dé- tachée de la surface au moyen de 5 ml de solution salée. La suspension est centrifugée (100 t/m) pendant 3 minutes afin que les paquets de cellules se déposent au fond du tube, tandis que les cellules individuelles restent dans la solution surnageante, 

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 Cette dernière est décantée et le nombre de cellules par ml est déterminé suivant la méthode utilisée pour compter les leucocytes (U. S.

   War Department Technical Manual, Methods for Laboratory Technicians, Octobre 17,   3941,   page   14-18).  La sus- pension est alors diluée afin d'obtenir 100,000 cellules de Candida   albicans   par ml. 



   Afin de provoquer l'infection reproduotible des souris, on leur injecte intramusculairement, le matin et l'après-midi de la veille de l'infection, 0,1 ml de suspension à 1% de cor- tisone en solution salée. Le jour de l'infection, les animaux re- çoivent 0,1 ml de la même suspension le matin, suivie d'une in- jection intraveineuse de 0,5 ml de la suspension de 100,000 cellules de Candida albicans par ml etl'après-midi, d'une quatrième administration de cortisone. Les cinquième et sixième injections de cortisone sont données le jour suivant, une fois le matin, une fois l'après-midi. 



   Le traitement à la 5-fluoro-cytosine a débuté au Jour de l'infection et a duré 21   Jours.   Comme critères pour   l'évaluation   de l'activité antifongique, on a utilisé des cultures négatives de tissu rénal. 



   Les animaux de contrôle infectés   intraveineusement   avec Candida   albicans   succombèrent entre le septième et le quator-   zième   Jour après l'infection. Les reins ont donné sur la gé- lose de Sabouraud des cultures positives. 

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   La table 2   ci-après   démontre les résultats obtenus lorsque des souris, qui ont été infectées   intraveineusement   avec 50,000 cellules de Candida   albioans,   sont traitées par voie intrapéritonéale et orale avec une solution aqueuse de 
5-fluoro-cytosine. Dans le cas de la dose de 100   mg/kg,   deux groupes d'animaux reçurent, le premier par vole orale, l'autre par voie intrapéritonéale, 1.0 ml d'une solution aqueuse con- tenant 2 mg de   5-fluoro-cytosine   par ml chaque jour. Dans le cas de la dose intrapéritonéale de 50 mg/kg, on injecta aux animaux chaque jour 1,0 ml d'une solution aqueuse contenant 1,0 mg de   5-fluoro-cytosine   par ml.

   Dans le cas de la dose orale de 200 mg/kg, les animaux reçurent quotidiennement 1,0 ml d'une solution aqueuse contenant 4 mg de   5-fluoro-cytosine   par ml. 



  Et finalement dans le cas de la dose orale de 500 mg/kg, les animaux reçurent quotidiennement 1,0 ml d'une solution aqueuse contenant 10 mg de 5-fluoro-cytosine par ml. 



   Les résultats obtenus furent les suivants: 
Table 2 activité de la 5-fluoro-cytosine contre les infections par Candida   albicans  chez la sourisblanche 

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 EMI10.1 
 
<tb> cultures <SEP> de <SEP> reins
<tb> 
<tb> dose <SEP> nombre <SEP> nombre <SEP> nombre <SEP> CDso
<tb> 
<tb> mg/kg <SEP> voie <SEP> d'animaux <SEP> négat. <SEP> posit. <SEP> mg/kg
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> ip. <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 50 <SEP> 9 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 87 <SEP> ip.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  500 <SEP> p.o. <SEP> 19 <SEP> 10 <SEP> 9
<tb> 
<tb> 
<tb> 200 <SEP> 9 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 9 <SEP> 5 <SEP> 302 <SEP> p.o.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> contrôles <SEP> - <SEP> 39 <SEP> 3 <SEP> 36
<tb> 
 
Ainsi qu'il ressort de la table ci-dessus, on obtient un effet appréciable lorsque les animaux sont traités avec la so- lution de 5-fluoro-cytosine par injection intrapéritonéale et par voie orale. 



   Exemple 2 
On prépare un comprimé contenant la 5-fluoro-oytosine comme suit: 
42,8 parties en poids de lactose, 41,8 parties en poids de phosphate   dioaloique   et 10,0 parties en poids de   5-fluoro-   oytosine sont intimement mélangés. Dans un autre récipient, on prépare une pâte aqueuse contenant 10,0   %   en poids d'amidon   gélatinisé   (l'amidon gélatinisé utilisé est un produit vendu par Corn Products Refining Company, New York, sous le nom de   "Amijel   Powder"). Ensuite, 3,0 parties en poids de la pâte ainsi obtenue sont ajoutés et mélangés avec le mélange obtenu précédemment afin d'obtenir un granulé.

   Le granulé est ensuite concassé, puis les fines particules ainsi obtenues sont   séchées   à une température d'env.   38-45 .   Le produit séché est ensuite concassé et on en fait des comprimés de 6,3 mm de diamètre. 

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   Exemple 3 
On prépare un mélange de 10,0 parties en poids de 5-fluoro-   oytosine,   88,0 parties en poids de lactose et 2,0 parties en poids de stéarate de calcium. Le mélange est concassé, puis la poudre finement divisée   sert   à préparer des comprimés de 6,3 mm de diamètre. 



   Exemple 4 
On prépare d'abord un granulé en mélangeant   27,5   parties en poids d'amidon de mais, 4,5 parties en poids d'amidon de mais prégélatinisé et 68,0 parties en poids de lactose. Ensuite, on mélange 88,0 parties en poids de ce granulé avec 10,0 parties en poids de 5-fluoro-cytosine et 2,0 parties en poids de stéarate de calcium. Le mélange est finalement concassé et transformé en comprimés de 6,3 mm de diamètre.

Claims

Revendications EMI12.1 1. Une f'MtpoMit.tn pouf oombattro leii ohompignonw micro.

1. caractérisé on ce qukme contient la 5-fluoro-oytosine eoop1quee, <.'l.I.raot6ride tITI qu oontient 5-fluoJ'o-oytoa1ne comme agent antifongique, 2- Uns. composition suivant la revendication 1, caracté- risée en ce qu'elle contient de la 5-fluoro-cytosine et un support.

3. Une composition suivant les revendications 1 ou 2, pour application pharmaceutique, caractérisée en ce que le support est une substance pharmaoeutiquement acceptable.

4. Une composition pharmaceutique pour combattre les infections par Candida albicans, caractérisée en ce qu'elle EMI12.2 contient la 5-P,uara-eytosine et un support pharmaceutiquement acceptable.

5. Une composition suivant les revendications 1 1 4, caractérisée en ce que le support est un liquide. EMI12.3

6. Une eom,asition suivant les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le support est une substance bolide.

7. Un procédé pour la préparation de compositions pharmaceutiques, caractérisé en ce que la 5-fluoro-cytosine est mise en formes pharmaceutiquement acceptables au moyen des excipients usuels en pharmacie. <Desc/Clms Page number 13>

8. Un procédé suivant la revendication 7, caractérisé EMI13.1 en ce que la 5"'rluoro...oytoatno est m61An6t'1 aven un adjuvant pharmaceutique et la m61tHl". oiitenu .,f1t.. mia ri forme do préssen* tation pharmaceutique appropriée.

9. Une méthode pour combattre les champignons Micro- scopiques, caractérisée en ce qu'on traite les champignons EMI13.2 avec une composition oontenant la 5-fluoro-OYtosine, 10. Une méthode pour combattre les infections par Candida albicans, caractérisée en ce que les champignons causant de telles infections sont traités avec une composition pharmaceutique contenant la 5-fluoro-cytosine dans un support pharmaceutiquement acceptable.

11. Une méthode suivant la revendication 10, caractérisée en ce qu'on utilise comme support un milieu aqueux.