<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de substances de protection contre les champignons et les bactéries, à partir de tubercules d'or, chidées de préférence à partir de l'Orchis militaris L. sous forme pure,.
EMI1.1
On sait qù'*'il se forme des substances de protection, lorsqu'on infecte des tubercules d'orchidées avec des champignons du groupe(desê:rrAize,par exemple avec du Rhizoctania repens Bern. (cf. Gaumann et autres, 'TPhytopatholo- gische Zeitschrift 17 (1950) page., 36 et suivantes).
La présente invention est relative à un procédé permettant d'obtenir c; ces substances-.actives sous forme pure, ledit procédé étant.caractérisé par le
EMI1.2
fait qu'on extrait avec des solvants organiques des tubercules d'orchidées infec- tés avec du Rhizoctonia repens Bern. et incubés qu'on élimine le solvant organi- que de l'extrait, qu'on extrait le résidu avec un solvant non miscible à l'eau .
EMI1.3
et qu'on isole de l'extrait les substances caractérisâèS1H plus en détail ci-après et dénommées ' orhinol"a substance A et substance B.
Les tubercules d'¯oichidées utlisés comme matière de départ ,sont, de préférence, deux du genre de l'Orchis militaris L, en outre, les tubercules de l' Orchis Morio L. ou du Loroglossum hiricinum L. Rich sont particulièrement appro- ' priés. Ces tubercules sont avantageusement purifiés et désinfectés avant l'ense- menoement; par exemple avec une solution diluée dé sublimé, avec une solution alcoolique de chloramine ou avec une solution aqueuse de chlorure de chaux, puis coupés,, par exemple, en rondelles. On place les morceaux des tubercules dans un récipient stérile et ajoute au tout, également dans des conditions stériles,' le champignon Rhizoctonia rebens Bern. le mieux sous la forme d'une suspension des spores.
Les tubercules infectés sont alors incubés à une température de 20 à
EMI1.4
35 C de préférence à 27 C, jusqu'à ce que le champignon se développe bien et qu'il se forme un mycélium abondant, A cet effet, 10 à 14 jours environ sont nécessai- rasa Le substraeum des spores se coilbre pendant ce temps en brun-foncé. Après 1' incubation il est extrait avec des solvants organiques, le cas échéant avec-addition d'eau. Comme solvants orgpniques, on peut utiliser aussi bien ceux qui
EMI1.5
so-iit miscibles à l'eau, comme les alcools, par exemple B méthanol ou l'éthanol, des cétones inférieures, par exemple l'acétone, des glycols et leurs éthers, par exemple le propylène-glycol, le méthyl-cellosolve ou le dle,xann.e9que ceux qui ne sont pas miscibles à l'eau, comme le benzène, l'éther, l'acétate d'éthyle ou 'le chloroforme.
De préférence, l'extraction est effectuée en deux stades. Pour-
EMI1.6
le premier stade, on utilise l'un des solvants organiques miscibles â l'eau qui ont été indiqués, ce qui fait qu'il se produit en plus une déshydratation..Si c'est nécessaire, on effectue l'extraction à plusieurs reprises avec le même solvant, la matière à extraire étant encore entre-temps avantageusement réduite en petits morceaux. Pour le second,stade d'extraction, on utilise l'un des solvants non miscibles à l'eau qui ont été indiqués. Le cas échéant, on peut encore, entre
EMI1.7
les deux stades d'extraction intercaler un autre stade où l'ontpav!aille avec un mélange des solvants du premier et du second stade.
Après avoir réuni des extraits on les évapore à sec, avantageusement sous vide'; après y avoir éventuellement ajouté de l'eau, on extrait le résidu à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau, comme l'acétate d'éthyle, l'éther, etc. L'isolement des substances agissant contre les champignons indiquées ci-dessus peut être effectuée par exemple 'comme suit : Un extrait obtenu par exemple à l'acétate d'éthyle est lavé avec des alcalis, par exemple avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium. Les substances solubles dans les alcalis ne présentent qu'une activité minime.
L'activité principale se trou.
EMI1.8
ve dans la fraction restant dans la solution ofgqnàµgu 2
Pour séparer le produit actif, cette fraction est débarrassée du sol- vant et dirigée à la température ambiante avec un solvant aromatique comme le ben-
EMI1.9
zène ou le toluène, de préférence avec du benzène. Il reste a1o¯rs une fraction'faible ment active, insoluble dans le benzène, tandis que la fraction soluble dans le benzène possède presque la totalité de l'activité.
De]la fraction benzénique on peut séparer les composants actifs de di-
<Desc/Clms Page number 2>
verses manières, par exemple par répartition entre deux phases non miscibles entre elles, ou par adsorption. Il s'avère avantageux de procéder à une réparti- tion chromatographique, de préférence sur de l'oxyde d'aluminium. Si l'on utilise
EMI2.1
par exemple dans ce cas, pour l'él1!ttion, du benzène, de l'éther ou un mélange .. de méthanol et d'acide acétique glacial, on obtient alors les fractions principa- les suivantes qui présentent à peu près la même activité;
A) Un premier éluat benzénique est une huile dont on peut séparer' les composants par distillation sous un vide poussé, dans un tube à boules.
Com- me substance la plus volatile, on obtient, à une température de bain allant jusqu'
EMI2.2
à 85 C, de la counanine, tandis que la majeure partie (75%) passe à 135 Ce Cette fraction moyenne est unitaire comme le montre la chromatographie;elle est dési- gnée dans ce qui suit sous le nom de substance.Ao.
C'est une huile jaunâtre; !aBàlyse, on distille à nouveau cette préparation à 1350C, sous un vide poussé, avec un tube à boules-: elle présente alors un pouvoir rotatoire spéci- fique taB = + 1,75,Q (c = 2 dans l'alcool). trouvé : C 76,81 ; 76,63; H 11,13; 11,2o,â Le spectre infra-rouge présente entre autres des bandes à 2940¯?m 2870 em7 ; 1 1735 c1 ' 1622 cm , 1587 am, 1 1573 c1 ' 1473 cm1 , 1377 c1 13553m 1285cm" ntl5 !!1-Í 1122 Eï -1 1102 cm , 1077 cm , 1058 cm , 1038 cm , 845 cm , 830 cm , 783 cm , 729 cm . La bande observée à 1735 cm indique la - présence d'une cétone aliphatique, d'une lactone aliphatique ou d'un ester alipha-' tique. Un minime résidu ne peut pas être distillé sans se décomposer et est moins actif contre les champignons.
B) Un second éluat benzénique qui cristallise en majeure partie. Après l'avoir recristallisé à plusieurs reprises, par exemple dans un mélange de ben- zène et de cyclohexane, ou dans un mélange de méthanol et d'eau, et après l'avoir chromatographié, on obtient un cristallisât' pur, unitaire, auquel on donne
EMI2.3
le nom d'orohinol. L'orchinol forme des prismes incolores fondant à 1270 et peut être sublimé sous un vide poussé (à 16000)sans se décomposer.
Les analy-
EMI2.4
ses conduisent à la formule brute CE0o C16H16O3 calculé :C 74,97 H 6,29 0 18,74% trouvé : C 74,69;74,83 H 6,34 0 18,65 18,74% poids moléculaire : calculé :256 trouvé s 233
EMI2.5
calculé : 2(0)cl 24,22%; 1 cEtr 0,39%; 1 ( C CH3 5,87% trouvé : " 23,29%; " 0,41%, " 0,00% Il y a deux groupes méthoxyles, pas de groupe C-CH3, un atome d'hydrogène actif et
EMI2.6
un groupe hydroxyle. Cette substance est optiquement inactive dans le benzène et dans le méthanol.
Le spectre infra-rouge pris dans le bromure de potassium présen- te entre autres des bandes à 3.20 cm , 2950 cm , 2y45 am* . 1910 cm , z82 cm , 1500 cm 1, 1485 cm-1' 1450 cffi-1' 1365 cm 1, 1342 cffi-1' 1316 cm 13 1295 cm-1' 1270 cm-1, 1245 cm 1, 1222 cm 1, 1203 cm¯1 , 1171 , 11580m , 1116 cm , 1082 cm1 , 1056 1f , iG32cm , 995m , 927 cm , 866 cm , 842 cm 832 em , 813 am- 746 cm , 731 cm , 720 cm On en déduit la présence d'un hydroxyle fortement associé (3420 cm-1) ainsi que d'un système aromatique (1610 et 1500 cm ). Le spectre ultra-violet
EMI2.7
de la substance dissoute dans 1méthanol présente des maxima à z2 mp (± =26700) el 280 up ( = 2TOO).
L'orchinol forme facilement et quantitativement des esters au groupe hydroxyle, par exemple un dérivié 0-aaé#ylé et un dérivé 0-p-bromobenzoyl L'acétylation de l'orchiftol effectuée dans de la pyridine avec de l'anhydride acétique à 20 fournit, avec un rendement quantitatif, le 0-acétyl-orchinol; ce composé cristallise dans un mélange de méthanol et d'eau en aiguilles fondant à 84
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
C 8H 804 calculé C 72,46 H: 6,08 2 OCH3 20,80% poids 298 1 3 18 4 mol. trouvé :
C 72,01 H 6,10 2 OCH3 20,42% il 300 ,
EMI3.2
Le spectre infra-roris dans 1? bromure de potassium, présente-ces:'a3d.ës¯x . par exemple à 29q.5mm , 2840 cm" , 1767 -9m' , 1602 yé , 1572¯rm y 1502 cm 1467 cm-1' 1437'cm- 1416 cm 1, 1370 cm-1, 1347 om-1, 1325 cm 1' 1294 cm¯1 ,.. 1280 cm-1' 1260 cm-1" 1205 cm 1, 1159 c!::1 1121 tj1 1080 cm, 5 lo¯y 6 cm e 1031 cm1 , 1013 cm1 , 1001 tj1 , 957 GIÀ, 940 tj1 927 cm ,888 cm1 , -1 871 em j 838 cm , 817 om , 760 cm , 760 cm- , 747 cm , 739 cm , 660 cm .
A partir d'orchinol et de chlorure de p-bromobenzoyle dans de la pyridine 20 , on obtient le 0-pbromobenzo-ylorchinol.
Après recristallisation dans le méthanol, ce composé fond à 139 .
EMI3.3
C23H1904Br calculé : C 62,88 H 4,36% ,. trouvé : C 62,65 H 4,74%
EMI3.4
Par méthylàtion, par exemple avec du sulfate de diméthyle, on obtient l'éther méthy- lique de l'orchinol présentant un point de fusion (corrigé) à 83 - 86 .
EMI3.5
c17H 18 03 calculé : C 75,53 H 6,71% trouvé : C 75,37 H 6,87%
Les lessives-mères de la cristallisation de l'orchinol présentent: encore une certaine activité.
Pour déceler 1 t orchinot par chromatographie sur papier, on utilise un papier Whatman N 1 On apporte sur les bandes de papier une prise d'essai de la solution benzénique et utilise comme éluant un mélange de méthanol et d' eau (1:1). Pour le développement, on arrose le papier séché, d'abord avec une solution éthanolique à 0,1% de chlorimide de dichloroquinone, puis avec une solutioi aqueuse sàturée de borax. Après- séchage, ltordhinol apparaît sous la forme d'une tache gris-vert à une valeur de Rf de 0,56. Pour que la tache apparaisse d'une
EMI3.6
façon nette, la prise d'essai chromatographique doit renfermer au moins-10 'Y d'orchinol.
C) Un éluat éthéré qui, après une nouvelle chromatographie (sur de
EMI3.7
l'oxyde d'aluminium dl-aobivité II), fournit en faible rendement unefractiqn ciis' talline de la même activité, désignée ci-après par substance B. Elle ne peut @ pas être sublimée sous un vide poussé sans se décomposer et peut être purifiée par recristallisation, par exemple au moyen de méthanol et d'eau. Elle présenté'-' un point de fusion à 113 et est optiquement inactive. Son spectre infra-rouge, pris dans le bromure de potassium, présente entre autres des bandes à 3400 cm ,.
EMI3.8
3140 cm7l, 1910 cm 1617 cm-1' 1600 cm 1, 1520 cm-,, 1460 cm 1, 1389 cm¯'1' ,:,';"., 1357 cm 1 1322 cm- , 1293¯fa , 12401cm , 122f cm 9 174 cm , 1110 cm , . -" 995 om , 942 om , 836 em , 800 cm , 750 cm , 715 cm . On en déduit l'existence d'une bande OH et vraisemblablement d'un système aromati.que (1600 et 1520 cm ). Le spectre ultra-violet de cette substance dissoute
EMI3.9
dans de l'éthanol présente des maxima à 278 m (= 1700) et à 226 mjti (=9240)7 Le poids moléculaire, déterminé dans le camphre, est de 141.
L'analyse élémentai- re fournit ;
C 70,32%
H 6,90%
D) Un éluat obtenu avec un mélange de méthanol et d'acide acétique
EMI3.10
glacial (,]0 ô 1
L'isolement de l'orchinol peut aussi être effectué de la façon suivante.- L'extrait mentionné ci-dessus, obtenu à l'acétate d'éthyle et traité par des alcalis; est évaporé, et le résidu est extrait à l'éther. On extrait ensuite la solution
<Desc/Clms Page number 4>
éthérée avec une solution aqueuse d'un hydroxyde de métal alcalin, comme l'hydro- xyde de sodium. La solution alcaline est ensuite acidifiée et extraite avec un solvant non miscible à l'eau, comme l'éther.
En évaporant la solution éthérée, ch obtient l'orchinol caractérisé ci-dessus.La solution éthérée lavée avec un hydroxyde de métal alcalin renferme les substances A et B décrites ci-dessus,
Les substances décrites sont actives aussi bien contre les champignons que contre les bactéries.
L'orchinol présente, par exemple, les acitivités suivantes Si l'on utilise comme méthode d'examen in vitro des séries de dilution (par puissance de dix) dans une solution nutritive d Sabouraud, on détermine alors une concentration de 10 à 50 [gamma]d'orchinol par cm , au bout de 14 jours,,un effet fongistatique vis-à-vis de l'Epidermophyton floccosum, du Trichophyton inter- digitale Pristley, de l'Endomyces albicans et du Microsporum Audouini. Dans le test des zones d'inhibition avec une solution à 50/00 d'orchinol, on peut, en utilisant des petits disques de papier filtre d'un dimaètre de 8 mm, relever vis-à-vis de certaines organismes-témoins, les zones inhibitantes suivantes :
Candida vulgasis 18 mm, Saccharomyces cerevisiae 12 mm, Bao. subtilis 15 mm, Micrococcus pyogenes, var. aureus 14 mm. L'orchinol empêche en outre la garmi- nation des spores de divers champignons. Si l'on utilise comme méthode d'examen une série de dilution, on détermine alors que la germination des spores de Rhizoctonia repens est abaissée à 50 % pour une concentration de 70 [gamma]cm -et pour Alternaria tenuis est abaissée à 50% pour une concentration de 100 [gamma]/ cm2.
Les substances de protection obtenues conformément,¯au procédé, notammeni toutefois l'orchinol, ou des mélanges correspondants, peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques ren- fermant les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmace.- tique, organique ou inorganique, appropriée pourune application entérale, parenté- rale ou topique. Pour la formation de cette matière de support, on envisage les substances ne réagissant pas sur les nouveaux composés, par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, la stéarate de magénsium, le talc , des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline, la chôlestérine ou d'autres excipients connus.
Ces préparations pharmaceutiques peuvent, par exemple,se présenter à l'état de comprimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires, ou sous forme liquide à l'état de solu- tions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substancesauxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émulsifiants.
Elles peuvent aussi ren- fermer encore d'autres substances thérapeutiquement précieuses
L'invention concerne également à titre de produits industriels nouveaux les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigra- des.
Exemple 1.
On place pendant minutest dans une solution de sublimé à 0,1% 10 kg deitubercu- les d'orchis militaris L. lavés à l'eau, puis les lave avec de l'eau distillée stérile. On coupe les tubercules en rondelles dans des conditions stériles, les place"dans des conditions stériles dans des ballons "Glaxo" jusqu'à ce que ces derniers soient remplis au tiers, puis les énsemence avec une suspension de spores de Rhizoctonia repens Bern. Ces ballons sont incubés pendant 10 à 14 jours à 27 ; le champignon se développe bien et forme un mycélium blanc, tandis que le substrat des tubercules est coloré en brun-foncé. Après l'incubation, on place les rondel- les de tubercules dans de l'éthanol à 96 % et; laisse reposer pendant 24 heures à la température ambiante, puis décante l'éthanol.
Les rondelles sont alors mé- caniquement broyées et extraites à la température ambiante pendant 3 jours chaque
<Desc/Clms Page number 5>
fois, d'abord avec de l'éthanol puis à deux reprises ther (2:1), puis finalement à l'éther, les solvants étant chaque fois séparés par décantattion.
Les extraits obtenus à l'alcool et à 1(éther sont réunis, puis concen- trés à 40 sous vide jusqu'à ce qu'il commence à se séparer une huile brune. On dilue le concentrat ainsicbbtenu avec le même volume d'eau et l'extrait à trois reprises avec de l'acétate d'éthyle, la totalité de l'activité contre les, cham- pignons passant dans la phase organique..On réunit les extraits obtenus au moyen d'acétate d'éthyle et, tout en refroidissant à la glace, les- extraits à trois reprises avec chaque fois une solution binormale de bicarbonate de potas- sium, avec une solution binormale de carbonate de sodiumetune solution binormale d'hydroxyde de sodium, les lave à l'eau, les sèche sur du sulfate de sodium et les évapore à sec sous vide à 35 .
On digère le résidu à trois reprises avec du benzène froid, ce qui permet de séparer les constituants inactifs insolubles.
La fraction soluble dans le benzène pèse 9,4 g et renferme et la majeure partie de l'activité.
En acidifiantlles extraits mentionnés ci-dessus, obtenus respective-. ment au bicarbonate de potassium, au carbonate de sodium et à l'hydroxyde de so- dium, et en procédant à une extraction, on obtient les constituants acides correspondants qui pèsent respectivement 6,0 g 4,2 g et 5,2 g et renferment aus- si une partie de l'activité contre les champignons.
On dissout dans du benzène 2 g de la fraction obtenue qui est soluble dans le benzène et chromatographie sur 75 g d'oxyde d'aluminium (activi- té IV suivant Brockmann), en éluant avec du benzène, de léther et finalement avec un mélange de méthanol et d'acide acétique glacial (30:1). On obtient qua- tre.fractions principales qui possèdent toutes une activité contre.les champi- gnons,
Fraction A, éluat benzénique huileux, 0,54 g Fraction B, éluat benzénique partiellement cristallisé, 0,55 g Fraction C, éluat éthéré partiellement cristallisé, 0,40 g Fraction D, éluat obtenu avec le mélange de méthanol et d'acide acétique gla- cial (30:1) 0,40 g Avec un tube à boules,, on distille sous un vide poussé 0,36 g de la fraction A.
On obtient alors trois fractions : a) A une température de bain allant jusqu'à 85 , une huile incolore qui cris- tallise par refroidissement. Après pecristallisation dans de l'éther de pétrole, ce composé fond à 67 et est identique à la coumarine. b) A une température de bain de 135 , la substance A sous la forme d'une huile jaunâtre présentant un pouvoir rotatoire spécifique (a) = + 1,75 (c = 2 dans l'éthanol). Anal;se : C 76,81 %, H 11,13%./Elle possède une activité contre les champignons. c) Un résidu de distillation présentant encore une certaine activité contre les champignons.
On recristallise 0,40 g de la fraction B d'abord dans un mélange de benzène et de cyclohexane et ensuite dans un mélange de méthanol et d'eau'., Ltorchinol actif contre les champignons est alors obtenu sous la forme de prismes incolores qui fondent à 127 et qui, sous un vide poussé, subliment à 160 sans se décomposer (a)D = ¯ 0 (c = 3 dans le benzène ou le méthanol). Les données fournies par mi- oro-analyse conduisent à la formule C16H16O3, avec deux groupes méthoxy et un atome d'hydrogène actif. Dans le spectre infra-rouge, on peut avoir des bandes à 3420 cm (groupe OH associé) et à 161a et 1500 cm-1 (système aromatique).
Les lessives-mères présentent encore'une certaine activité contre les champignons.
Lorsqu'on le traite avec de la pyridine et de l'anhydride acétique à
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
20 , l'orchinol forme un mono-acétate C A 0 qui fond à 8q. et forme des ai- guilles incolores par cristallisation i;8 1,8 au moyen de méthanol et d'eau.
Lorsqu'on fait àgir du chlorure de p-bromobenzoyle sur de l'crchinol dans de la pyridine à 20 , on obtient le 0-p-bromobenzoyl-orohinol C23H1904Br qui fond à 139 (dans le méthanol).
L'éther méthylique de l'orchinol est obtenu comme suit
EMI6.2
Sur un bain-marie, on délaye avec peu d'eau 340mg d'orchino3. de ma- nière à obtenir une bouillie. En ajoutant quelques ),,gouttes d'une solution tétra- normale d'hydroxyde de potassium et du sulfàte de diméthyle-,la bouillie se liqué- fie,après quoi on ajoute à nouveau à chaud, en agitant vigoureusement, alterna- tivement un peu dune solution tétranormale d'hydroxyde de potassium et du sul-
EMI6.3
fate de dimêthyle.La solution qui est toujours alcaline est maintenue encore pendant 45 minutes à 80 , puis on la laisse refroidir. On extrait le mélange avec du benzène, lave le benzène à l'eau et évapore. Le résidu brunâtre cris- tallise. On chromatàgraphie ce produit sur de l'oxyde d'aluminium II, avec du benzène comme agent d'élution.
Fins cristaux blancs. Point de fusion 83-86 (corrig Rendement 298 mg (83%). C17H18O3.
Calculé : C 75,53 H 6,71%.
Trouvé : C 75,37 H 8,87%.
EMI6.4
Dans le spectre infra-rouge;9.1Ienco:;fre de ce que l'on constate pour l'orchinol, on n'observe pas de bande à 3400 cm .
On chromatographie sur 17 gr d'oxyde d'aluminium (activité II) 0,30 g de la fraction C. On élue avec un mélange de méthanol et de chloroforme (1:1) une fraction active vis-à-vis des champignons, à savoir la substance B, qui, dans un mélange de méthànol et d'eau cristallise en aiguilles fondant à 1130Analyse : C 70,32% H 6,90%.
Pour examiner la sensibilité des substances actives vis-à-vis des acides, des bases et de températures plus élevées, on dissout chaque fois 100 mg de la fraction soluble dans le benzène, dans de l'acide chlorhydrique hinormal et
EMI6.5
une solution binormale d.! hßdrbds+de^.odiumb lOei= dèJxnbt.,lc. Abrii:âvaisassé reposer rdàt'.°,h.arèsë,--l,'empéat.rè:a.mbiantè¯i.l'at.râ.vêiicèà-v'i ,1iè)"cham- pigncans éte.it more :ple4meme.tcnservêe On fait bouillir pendant une heure à reflux, dans 5 cm3 de dioxanne, 100 autres mg de la fraction soluble dans le benzène, sans que l'activité soit détruite.
Si l'on extrait directement, suivant les indications ci-dessus, 10 kg de tubercules d'Orchis militaris L. sans infection préalable et sans incubation, on obtient alors des extraits qui ne sont pas actifs.
Les substances de protection obtenues suivant le procédé ci-dessus, de préférence l'orchinol, peuvent aussi être utilisées comme agents de protection des plantes contre les champignons.
Exemple 2.
L'extrait obtenu à l'acétate d'éthyle mentionné dans l'exemple ci-dessus, est lavé avec des alcalis, séché et évaporé. Le résidu est extrait à l'éther et bien malaxé. La-solution éthérée obtenue est extraie à trois reprises avec une solution binormale d'hydroxyde de sodium. On acidifie la solution al- caline et extrait à l'éther. En évaporant la solution éthérée après l'avoir séchée, on obtient l'orchinol avec un bon rendement.
La solution éthérée, lavée avec une solution d'un hydroxyde de métal alcalin, renferme les substances A et B décrites ci-dessus.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to a process for obtaining protective substances against fungi and bacteria, from gold tubers, preferably chidated from Orchis militaris L. in pure form.
EMI1.1
We know that protective substances are formed when orchid tubers are infected with fungi of the group (desê: rrAize, for example with Rhizoctania repens Bern. (Cf. Gaumann et al., 'TPhytopatholo - gische Zeitschrift 17 (1950) page., 36 and following).
The present invention relates to a process making it possible to obtain c; these substances-.actives in pure form, said process being.characterized by the
EMI1.2
causes the tubers of orchids infected with Rhizoctonia repens Bern to be extracted with organic solvents. and incubated that the organic solvent is removed from the extract, the residue is extracted with a water immiscible solvent.
EMI1.3
and isolating from the extract the substances characterized in more detail below and called 'orhinol' a substance A and substance B.
The oichid tubers used as starting material are preferably two of the genus of Orchis militaris L, furthermore the tubers of Orchis Morio L. or Loroglossum hiricinum L. Rich are particularly suitable. 'requested. These tubers are advantageously purified and disinfected before inoculation; for example with a dilute solution of sublimated, with an alcoholic solution of chloramine or with an aqueous solution of chloride of lime, then cut, for example, in rings. The pieces of the tubers are placed in a sterile container and added to the whole, also under sterile conditions, the fungus Rhizoctonia rebens Bern. best in the form of a suspension of the spores.
Infected tubers are then incubated at a temperature of 20 to
EMI1.4
35 C preferably at 27 C, until the fungus grows well and an abundant mycelium is formed. For this purpose approximately 10 to 14 days are required. The spore substraeum will collect during this time in dark brown. After the incubation it is extracted with organic solvents, optionally with the addition of water. As organic solvents, it is also possible to use those which
EMI1.5
so-iit miscible with water, such as alcohols, for example B methanol or ethanol, lower ketones, for example acetone, glycols and their ethers, for example propylene glycol, methyl cellosolve or dle, xann.e9que those which are not miscible with water, such as benzene, ether, ethyl acetate or 'chloroform.
Preferably, the extraction is carried out in two stages. For-
EMI1.6
In the first stage, one of the indicated water-miscible organic solvents is used, which additionally causes dehydration. If necessary, the extraction is carried out several times with the same solvent, the material to be extracted being advantageously reduced in the meantime to small pieces. For the second, extraction stage, one of the water-immiscible solvents which have been indicated is used. If necessary, we can still, between
EMI1.7
the two stages of extraction interpose another stage where the ontpav! goes with a mixture of the solvents of the first and the second stage.
After having combined the extracts, they are evaporated to dryness, advantageously under vacuum; after having optionally added water thereto, the residue is extracted with a solvent immiscible with water, such as ethyl acetate, ether, etc. The isolation of the substances acting against the fungi indicated above can be carried out for example as follows: An extract obtained, for example, with ethyl acetate is washed with alkalis, for example with a dilute solution of sodium hydroxide. sodium. Substances soluble in alkalis show only minimal activity.
The main activity is missing.
EMI1.8
ve in the fraction remaining in the solution ofgqnàµgu 2
To separate the active product, this fraction is freed from the solvent and brought to room temperature with an aromatic solvent such as ben-
EMI1.9
zene or toluene, preferably with benzene. A weakly active fraction, insoluble in benzene, remains, while the soluble fraction in benzene has almost all of the activity.
The active components of di- can be separated from the benzene fraction.
<Desc / Clms Page number 2>
verses manners, for example by distribution between two phases immiscible with one another, or by adsorption. It turns out to be advantageous to carry out a chromatographic distribution, preferably on aluminum oxide. If we use
EMI2.1
for example in this case, for the el1! ttion, benzene, ether or a mixture of methanol and glacial acetic acid, one then obtains the following main fractions which present approximately the same activity;
A) A first benzene eluate is an oil the components of which can be separated by distillation under high vacuum in a ball tube.
As the most volatile substance, at a bath temperature of up to
EMI2.2
at 85 C, counanine, while the major part (75%) increases to 135 Ce This average fraction is unitary as shown by chromatography and is hereinafter referred to as substance.Ao.
It is a yellowish oil; ! aBàlyse, this preparation is distilled again at 1350C, under a high vacuum, with a ball tube: it then has a specific optical rotation taB = + 1.75, Q (c = 2 in alcohol) . found: C 76.81; 76.63; H 11.13; 11.2o, â The infra-red spectrum shows among others bands at 2940¯? M 2870 em7; 1 1735 c1 '1622 cm, 1587 am, 1 1573 c1' 1473 cm1, 1377 c1 13553m 1285cm "ntl5 !! 1-Í 1122 Eï -1 1102 cm, 1077 cm, 1058 cm, 1038 cm, 845 cm, 830 cm, 783 cm, 729 cm. The band observed at 1735 cm indicates the presence of an aliphatic ketone, an aliphatic lactone or an aliphatic ester. A small residue cannot be distilled without decomposing and is less active against fungi.
B) A second benzene eluate which crystallizes for the most part. After having recrystallized it several times, for example from a mixture of benzene and cyclohexane, or from a mixture of methanol and water, and after having chromatographed it, a pure, unitary crystallization is obtained in which We give
EMI2.3
the name orohinol. Orchinol forms colorless prisms melting at 1270 and can be sublimated under high vacuum (at 16000) without decomposing.
Analy-
EMI2.4
its lead to the crude formula CE0o C16H16O3 calculated: C 74.97 H 6.29 0 18.74% found: C 74.69; 74.83 H 6.34 0 18.65 18.74% molecular weight: calculated: 256 found s 233
EMI2.5
calculated: 2 (0) cl 24.22%; 1 cEtr 0.39%; 1 (C CH3 5.87% found: "23.29%;" 0.41%, "0.00% There are two methoxyl groups, no C-CH3 group, one active hydrogen atom and
EMI2.6
a hydroxyl group. This substance is optically inactive in benzene and in methanol.
The infrared spectrum taken in potassium bromide shows, among other things, bands at 3.20 cm, 2950 cm, 2y45 am *. 1910 cm, z82 cm, 1500 cm 1, 1485 cm-1 '1450 cffi-1' 1365 cm 1, 1342 cffi-1 '1316 cm 13 1295 cm-1' 1270 cm-1, 1245 cm 1, 1222 cm 1, 1203 cm¯1, 1171, 11580m, 1116 cm, 1082 cm1, 1056 1f, iG32cm, 995m, 927 cm, 866 cm, 842 cm 832 em, 813 am- 746 cm, 731 cm, 720 cm We deduce the presence of 'a strongly associated hydroxyl (3420 cm-1) as well as an aromatic system (1610 and 1500 cm). The ultra-violet spectrum
EMI2.7
of the substance dissolved in 1 methanol shows maxima at z2 mp (± = 26700) and 280 up (= 2TOO).
Orchinol readily and quantitatively forms esters at the hydroxyl group, for example 0-aaé # yl derivative and 0-p-bromobenzoyl derivative Acetylation of orchiftol carried out in pyridine with 20 acetic anhydride provides, in quantitative yield, 0-acetyl-orchinol; this compound crystallizes in a mixture of methanol and water in needles melting at 84
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
C 8H 804 calculated C 72.46 H: 6.08 2 OCH3 20.80% weight 298 1 3 18 4 mol. find :
C 72.01 H 6.10 2 OCH3 20.42% il 300,
EMI3.2
The infrared spectrum in 1? potassium bromide, have these: 'a3d.ës¯x. for example at 29q.5mm, 2840 cm ", 1767 -9m ', 1602 yé, 1572¯rm y 1502 cm 1467 cm-1' 1437'cm- 1416 cm 1, 1370 cm-1, 1347 om-1, 1325 cm 1 '1294 cm¯1, .. 1280 cm-1' 1260 cm-1 "1205 cm 1, 1159 c! :: 1 1121 tj1 1080 cm, 5 lōy 6 cm e 1031 cm1, 1013 cm1, 1001 tj1, 957 GIÀ, 940 tj1 927 cm, 888 cm1, -1 871 em j 838 cm, 817 om, 760 cm, 760 cm-, 747 cm, 739 cm, 660 cm.
From orchinol and p-bromobenzoyl chloride in pyridine 20, 0-pbromobenzo-ylorchinol is obtained.
After recrystallization from methanol, this compound melts at 139.
EMI3.3
C23H1904Br Calculated: C 62.88 H 4.36%,. found: C 62.65 H 4.74%
EMI3.4
Methylation, for example with dimethyl sulphate, gives the methyl ether of orchinol with a melting point (corrected) of 83-86.
EMI3.5
c17H 18 03 Calculated: C 75.53 H 6.71% Found: C 75.37 H 6.87%
The mother liquors for the crystallization of orchinol still have a certain activity.
To detect 1 t orchinot by chromatography on paper, a Whatman N 1 paper is used. A test portion of the benzene solution is placed on the paper strips and a mixture of methanol and water (1: 1) is used as eluent. . For development, the dried paper is sprinkled, first with a 0.1% ethanolic solution of dichloroquinone chlorimide, then with an aqueous solution saturated with borax. After drying, ordhinol appears as a gray-green spot at an Rf value of 0.56. So that the stain appears from a
EMI3.6
Clearly, the chromatographic test portion must contain at least-10% orchinol.
C) An ethereal eluate which, after a new chromatography (on
EMI3.7
aluminum oxide (aobivity II), provides in low yield a crystalline fraction of the same activity, hereinafter referred to as substance B. It cannot be sublimated in a high vacuum without decomposing and can be purified by recrystallization, for example with methanol and water. It exhibits a melting point of 113 and is optically inactive. Its infra-red spectrum, taken in potassium bromide, shows among others bands at 3400 cm,.
EMI3.8
3140 cm7l, 1910 cm 1617 cm-1 '1600 cm 1, 1520 cm- ,, 1460 cm 1, 1389 cm¯'1',:, '; "., 1357 cm 1 1322 cm-, 1293¯fa, 12401cm, 122f cm 9 174 cm, 1110 cm,. - "995 om, 942 om, 836 em, 800 cm, 750 cm, 715 cm. We deduce the existence of an OH band and probably of an aromati.que system (1600 and 1520 cm). The ultraviolet spectrum of this dissolved substance
EMI3.9
in ethanol shows maximums at 278 m (= 1700) and 226 mjti (= 9240) 7 The molecular weight, determined in camphor, is 141.
Elementary analysis provides;
C 70.32%
H 6.90%
D) An eluate obtained with a mixture of methanol and acetic acid
EMI3.10
glacial (,] 0 ô 1
The isolation of orchinol can also be carried out as follows: The extract mentioned above, obtained with ethyl acetate and treated with alkalis; is evaporated, and the residue is extracted with ether. The solution is then extracted
<Desc / Clms Page number 4>
ethereal with an aqueous solution of an alkali metal hydroxide, such as sodium hydroxide. The alkaline solution is then acidified and extracted with a water-immiscible solvent, such as ether.
By evaporating the ethereal solution, ch obtains the orchinol characterized above.The ethereal solution washed with an alkali metal hydroxide contains the substances A and B described above,
The substances described are active against both fungi and bacteria.
Orchinol has, for example, the following acitivities If one uses as an in vitro examination method dilution series (by power of ten) in a Sabouraud nutrient solution, then a concentration of 10 to 50 [ gamma] of orchinol per cm, after 14 days, a fungistatic effect against Epidermophyton floccosum, Trichophyton inter-digitale Pristley, Endomyces albicans and Microsporum Audouini. In the test of the zones of inhibition with a 50/00 solution of orchinol, it is possible, by using small discs of filter paper with a diameter of 8 mm, to note with respect to certain control organisms, the following inhibiting zones:
Candida vulgasis 18 mm, Saccharomyces cerevisiae 12 mm, Bao. subtilis 15 mm, Micrococcus pyogenes, var. aureus 14 mm. Orchinol further inhibits the garmination of the spores of various fungi. If a dilution series is used as an examination method, it is then determined that the germination of Rhizoctonia repens spores is reduced to 50% for a concentration of 70 [gamma] cm - and for Alternaria tenuis is reduced to 50% for a concentration of 100 [gamma] / cm2.
The protective substances obtained in accordance with the process, including however orchinol, or corresponding mixtures, can be used as medicaments, for example in the form of pharmaceutical preparations containing the compounds indicated in admixture with a pharmace carrier material. Tick, organic or inorganic, suitable for enteral, parenteral or topical application. For the formation of this carrier material, substances which do not react with the new compounds, for example gelatin, lactose, starch, magensium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gums, polyalkylene glycols, petroleum jelly, chloresterin or other known excipients.
These pharmaceutical preparations may, for example, be presented in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories, or in liquid form in the form of solutions, suspensions or preparations. emulsions. Where appropriate, they are sterilized and / or contain auxiliary substances such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers.
They may also contain other therapeutically valuable substances.
The invention also relates, as new industrial products, to the compounds obtained by carrying out the process defined above.
The invention is described in more detail in the non-limiting examples which follow, in which the temperatures are indicated in degrees centigrade.
Example 1.
10 kg of orchis militaris L. tubercles, washed with water, are placed in a 0.1% sublimate solution for minutes, and then washed with sterile distilled water. The tubers are cut into rings under sterile conditions, placed "under sterile conditions in" Glaxo "flasks until the latter are one-third full, and then seeded with a suspension of Rhizoctonia repens Bern spores. balloons are incubated for 10-14 days at 27; the fungus grows well and forms a white mycelium, while the tuber substrate is stained dark brown. After incubation, the tuber rings are placed in 96% ethanol and; let stand for 24 hours at room temperature, then decant the ethanol.
The rings are then mechanically crushed and extracted at room temperature for 3 days each.
<Desc / Clms Page number 5>
times, first with ethanol then twice ther (2: 1), then finally with ether, the solvents being separated each time by decantation.
The alcohol and 1 (ether) extracts obtained are combined, then concentrated at 40 under vacuum until a brown oil begins to separate. The concentrate thus obtained is diluted with the same volume of water. and extract three times with ethyl acetate, all of the activity against fungi passing into the organic phase. The extracts obtained are combined with ethyl acetate and, while cooling in ice, the extracts three times each time with a binormal solution of potassium bicarbonate, with a binormal solution of sodium carbonate and a binormal solution of sodium hydroxide, washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness under vacuum at 35.
The residue is digested three times with cold benzene to separate the insoluble inactive constituents.
The fraction soluble in benzene weighs 9.4 g and contains and most of the activity.
By acidifying the extracts mentioned above, obtained respectively. with potassium bicarbonate, sodium carbonate and sodium hydroxide, and by carrying out an extraction, the corresponding acid constituents are obtained which weigh respectively 6.0 g 4.2 g and 5.2 g and also contain some of the activity against fungi.
2 g of the fraction obtained, which is soluble in benzene, are dissolved in benzene and chromatographed on 75 g of aluminum oxide (activity IV according to Brockmann), eluting with benzene, ether and finally with a mixture. methanol and glacial acetic acid (30: 1). We obtain four main fractions which all have an activity against fungi,
Fraction A, oily benzene eluate, 0.54 g Fraction B, partially crystallized benzene eluate, 0.55 g Fraction C, partially crystallized ethereal eluate, 0.40 g Fraction D, eluate obtained with the mixture of methanol and acetic acid Ice (30: 1) 0.40 g With a ball tube, 0.36 g of fraction A. is distilled under a high vacuum.
Three fractions are then obtained: a) At a bath temperature of up to 85, a colorless oil which crystallizes on cooling. After crystallization from petroleum ether, this compound melts at 67 and is identical to coumarin. b) At a bath temperature of 135, substance A in the form of a yellowish oil exhibiting a specific optical rotation (a) = + 1.75 (c = 2 in ethanol). Anal; sc: C 76.81%, H 11.13%. / It has activity against fungi. c) A distillation residue still showing some activity against fungi.
0.40 g of fraction B is recrystallized first from a mixture of benzene and cyclohexane and then from a mixture of methanol and water. Ltorchinol active against fungi is then obtained in the form of colorless prisms which melt at 127 and which, under a high vacuum, sublimate at 160 without decomposing (a) D = ¯ 0 (c = 3 in benzene or methanol). The data provided by mid-analysis lead to the formula C16H16O3, with two methoxy groups and one active hydrogen atom. In the infra-red spectrum, we can have bands at 3420 cm (associated OH group) and at 161a and 1500 cm-1 (aromatic system).
The mother liquors still show some activity against fungi.
When treated with pyridine and acetic anhydride to
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
20, orchinol forms a monoacetate C A 0 which melts at 8q. and forms colorless needles upon crystallization of 1.8.8 from methanol and water.
When p-bromobenzoyl chloride is made to act on crchinol in pyridine at 20, 0-p-bromobenzoyl-orohinol C23H1904Br is obtained which melts at 139 (in methanol).
Orchinol methyl ether is obtained as follows
EMI6.2
On a water bath, we dilute with little water 340 mg of orchino3. so as to obtain a porridge. By adding a few), drops of a tetra- normal solution of potassium hydroxide and dimethyl sulphate, the slurry liquefies, after which it is added again hot, with vigorous stirring, alterna- tively a little of a tetranormal solution of potassium hydroxide and sul-
EMI6.3
Dimethyl fate The solution which is still alkaline is kept for another 45 minutes at 80, then allowed to cool. The mixture is extracted with benzene, the benzene washed with water and evaporated. The brownish residue crystallizes. This product is chromatographed on aluminum II oxide, with benzene as the eluting agent.
Fine white crystals. Melting point 83-86 (corrected Yield 298 mg (83%). C17H18O3.
Calculated: C 75.53 H 6.71%.
Found: C 75.37H 8.87%.
EMI6.4
In the infra-red spectrum; 9.1Ienco:; fre from what we see for orchinol, we do not observe a band at 3400 cm.
Chromatography on 17 g of aluminum oxide (activity II) 0.30 g of fraction C. Elution is carried out with a mixture of methanol and chloroform (1: 1), a fraction active with respect to fungi, namely substance B, which, in a mixture of methanol and water, crystallizes in needles, melting at 1130 Analysis: C 70.32% H 6.90%.
To examine the sensitivity of the active substances to acids, bases and higher temperatures, each time 100 mg of the fraction soluble in benzene, in normal hydrochloric acid is dissolved and
EMI6.5
a binormal solution d.! hßdrbds + de ^ .odiumb lOei = dèJxnbt., lc. Abrii: âvaisassé to rest rdàt '. °, h.arèsë, - l,' empéat.rè: a.mbiantè¯i.l'at.râ.vêiicèà-v'i, 1iè) "cham- pigncans ete.it more : ple4meme.tcnservêe 100 mg of the fraction soluble in benzene are boiled for one hour at reflux, in 5 cm3 of dioxane, without the activity being destroyed.
If 10 kg of Orchis militaris L. tubers are directly extracted, according to the above indications, without prior infection and without incubation, then extracts are obtained which are not active.
The protective substances obtained according to the above process, preferably orchinol, can also be used as plant protection agents against fungi.
Example 2.
The extract obtained with ethyl acetate mentioned in the example above is washed with alkalis, dried and evaporated. The residue is extracted with ether and mixed well. The ethereal solution obtained is extracted three times with a binormal solution of sodium hydroxide. The alkaline solution is acidified and extracted with ether. By evaporating the ethereal solution after having dried it, orchinol is obtained with a good yield.
The ethereal solution, washed with a solution of an alkali metal hydroxide, contains substances A and B described above.