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La présente invention est relative à de nouveaux composés chimi- ques apparentés à la novobiocine et à la dihydronovobiocine, à des procé- dés de préparation de ces composés et à des procédés pour convertir ces composés en antibiotiques de valeur. Plus particulièrement, elle concerne
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la 7%tétrah¯ydro-34-dihydroxy-5-méthoxy-6,6-diméthyl-pyrn-2-yloxy -4- hydroxy-3-/4-hydroxy-3-(3-méthyl-2-butényl)-benzamido7 -8-méthylcoumarine9 ainsi que le dérivé dihydrogéné correspondant, dans lequel le substituant 3-méthyl-2-butényle a été remplacé par un groupe 3-méthylbutyle.
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La novobiocine ou 7-rtétrahydro-3-hydroxy..°-carbamyl-5-mêthoxy- 6,6-diméthyl-pyran-2-yloxy7-4-hydroxy-3 f4-hydroxy-3-4-hydroxy-3-(3-méthyi- 2-butényl)-benzamido7-8-méthyl-coumarine, qui peut être représentée par la formule de structure suivante :
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et la dihydronovobiocine, qui possède une structure similaire à celle de la novobiocine, mais comporte un groupe 3-méthylbutyle au lieu du groupe 3-méthyl-2-butényle dans la novobiocine constituent de nouveaux antibioti- ques précieux, qui sont actifs en ce sens qu'ils inhibent surtout la crois- sance de microorganismes à gram positif, bien qu'ils révèlent aussi une certaine activité vis-à-vis des microorganismes à gram négatif.
Les nouveaux composés suivant l'invention, à savoir la 7-tétra-
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hydro-34-dihydroxy-5-méthoxy-66-diméthylpyran-2-yloy-.-hydroxy-3-%4- hydroxy-3-(3-méthyl-2-butényl)-benzamidc 7 -8-méthylcoûmarine et le dérivé dihydrogéné correspondant, dans lequel le goupe 3-méthyl-2-butényle est rem- placé par un groupe 3-méthylbutyle diffèrent respectivement de la novobio- cine et de la dihydronovobiocine par l'absence d'un groupe carbamyle. A cau- se de cette parenté étroite avec ces composés, les nouveaux composés sont désignés ci-après sous l'appellation de "descarbamylnovobiocine" et "des- carbamyldihydronovobiocine" respectivement.
Il a été constaté à présent que la descarbamylnovobiocine se pré- sente dans certaines préparations de novobiocine. La présence de ce compo- sé dans les préparations de novobiocine a été découverte, lorsque ces pré- parations ont été soumises à une analyse chromatographique sur papier.
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Subséquemment, il a été découvert que la descarbamylnovobiocîne se formait dans des solutions alcalines de novobiocine et qu'elle peut être avantageu- sement préparée à partir de novobiocine par traitement soigné avec un al- cali dilué. Ainsi, lorsqu'une solution de novobiocine dans de l'hydroxyde de sodium 0,1N est laissée au repos à température ambiante pendant environ 4 jours, la majeure partie de la novobiocine est convertie en descarbamylnovobiocine.
De même, on a constaté qu'il y a de la descarbamyldihydronovobio- cine dans les préparations de dihydronovobiocine et la présence de ce com- posé dans ces préparations a été observée lors de l'analyse chromatographi-
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que sur papier de la dihydronovobiocine. La descar'bamyldihydronovobiocine peut être similairement préparée en soumettant de la dihydronovobiocine à
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l'action d'un alcali dilué.
Suivant une autre forme d'exécution de la présente invention, on a constaté à présent que la descarbamylnovobiocine et la descarbamyldihy- dronovobiocine peuvent être converties en novobiocine et dihydronovobiocine actives comme antibiotiques, par réaction avec des agents de carbamylation appropriés. Ainsi, lorsqu'on met de la descarbamylnovobiocine ou de la des- carbamyldihydronovobiocine en contact intime avec du chlorure de carbamyle en présence d'une base organique appropriée, il se forme respectivement de la novobiocine ou de la dihydronovobiocine, qui peut être aisément isolée et récupérée sous forme pure.
Les exemples suivants sont présentés à titre de formes d'exécution illustratives de procédés spécifiques de préparation de descarbamylnovobio-' aine et de descarbamyldihydronovobiocine et de conversion de ces substances en novobiocine et dihydronovobiocine respectivement.
EXEMPLE 1
100 g de novobiocine obtenue de la manière décrit e plus loin ont été dissous dans 300 cc d'un mélange de benzène et de méthanol (1:2) et le pH de la solution résultante a été ajusté à environ 7,4 avec une solution à 10% de méthoxyde de sodium dans du méthanol. La solution résultante a ensuite été diluée avec environ 700 cc de benzène. Par repos, le sel sodi- que de novobiocine a cristallisé dans la solution résultante et a été ré- cupéré par filtration. Le filtrat résultant a été extrait à deux reprises avec environ 1/10 de son volume d'eau et les extraits aqueux ont été con- centrés sous pression réduite jusqu'à la moitié du volume originel.
Au con- centrat on a ajouté environ 15 g d'un auxiliaire de filtration à diatomées et suffisamment d'acide chlorhydrique dilué pour ajuster le pH de la solu- tion à environ 3. Le produit précipité résultant ainsi que l'auxiliaire de filtration ont été récupérés par filtration et séchés. Le produit ainsi ob- tenu contenait environ 25% en poids de descarbamylnovobiocine. Il a été dis- sous dans 100 dcc d'acétone anhydre et filtré pour séparer l'auxiliaire de filtration. La solution résultante contenant la matière brute, consistant en environ 50% de descarbamylnovobiocine, a été chromatographiée sur 450 g d'alumine activé dans une colonne de 2 pouces de diamètre.
La colonne a en- suite été développée avec de l'acétone anhydre et 8 fractions de 300 cc chacune ont été recueillies et analysées par chromatographie sur papier. De la descarbamylnovobiocine purifiée a été obtenue en concentrant les quatre premières sections découpées jusqu'à siccité. Le produit ainsi obtenu pesait environ 6,3 g et contenait environ 80% de descarbamylnovobiobine. Ce produit fondait à 135 - 145 C.
La novobiocine employée dans le procédé décrit ci-dessus a été obtenue comme suit:
Un bouillon de fermentation contenant de la novobiocine a été chauffé à 60 C pendant 20 minutes à un pH de 7,5 - 8,0 et après refroidis- sement il a été filtré.,Le bouillon filtré a été ajusté à un pH d'environ 6,5 et extrait avec 1/5 de son volume d'acétate d'amyle dans un appareil d'extraction à contre-courant à deux étages. Les extraits à l'acétate d'amyle ont été extraits avec environ 1/3 de volume d'eau contenant suffisamment d'ammoniac pour que le pH final de l'extrait aqueux soit de 9,7 - 10,5, en utilisant un appareil d'extraction à contre-courant à deux étages.
Le même processus d'extraction par de l'acétate d'amyle et-de l'ammoniac a été répété et la solution aqueuse finale a été diluée avec du méthanol jusqu'à un rapport de solvants de 35% de méthanol et 65% d'eau et le mélange a été acidifié. Au repos, la novobiocine a cristallisé dans la solution résultante.
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EXEMPLE 2
On a dissous de la novobiocine dans de l'hydroxyde de sodium 0,1N, de façon à obtenir une solution à 2%, La solution a été laissée au repos à température ambiante pendant 96 heures. A ce moment, l'analyse chromato- graphique sur papier indiquait que plus de 75% de la novobiocine avait été
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transformée en descarbamylnovobiocine. La solution a été acidifiée jusqu'à pH 3 en agitant. Le précipité floculé de descarbamylnovobiocine brute a été filtré et séché. La purification a été effectuée en dissolvant le produit brut dans de l'acétone de façon à former une solution à 30% de matières so- lides, en séparant par filtration l'acide novobiocinique éventuel qui cris-
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tallise et en précipitant la descar'bamylnovobiocine par addition d'éther de pétrole. Le produit récupéré fondait à 130 -140 C.
Le produit présentait des maxima d'absorption à 3125A, lorsqu'il était dissous dans du NaOH aqueux
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0,1N (El% : enyiron 500), et à ,'50=' lorsqu'il était dissous dans du HC2méthagiiq aqueux 0,1N. (E17 m: environ 440). Le produit est optique- ment actif; a D = -17,7 dans CH3OH.
EXEMPLE 3.
En répétant le procédé de l'exemple 2, mais en utilisant de la dihydronovobiocine comme matière de départ, on a obtenu de la descarbamyl-
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dihyc.ronovobioain.e fondant à 142 - 143 .
EXEMPLE 4
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Environ 500 mg de descarbamyInovobiocine ont été dissous dans 5 00 de dioxane et 0,5 cc d'une solution à 205 de chlorure de carbamyle dans du dioxane a été ajouté. Le mélange a été laissé au repos à température ambi- ante pendant environ 2 heures. La novobiocine résultante a été précipitée par dilution de la solution dioxanique avec 10 volumes d'eau. La novobio- cine ainsi obtenue peut être purifiée davantage par recristallisation selon des méthodes connues dans la technique pour obtenir le produit sous forme pure.
EXEMPLE 5
En répétant le procédé de l'exemple 4 au départ de descarbamyldi-
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hydronovobiooine, on obtient de la dihydronovobiocine.
Dans les exemples décrits plus haut, la descarbamylnovobiocine et la deâcarbamyldihydronovobiooine peuvent être aisément distinguées de la novobiocine et de la dihydronovobiocine respectivement par-analyse chroma- tographique sur papier. Cette analyse peut être exécutée comme suit:
Du pàpierfiltre (Whatman n 1) est imprégné à l'aide d'alcool caprylique par immersion dans un mélange de méthanol et d'alcool caprylique et l'excès de solvant est éliminé au buvard. Une solution contenant environ 40 à 200 microgrammes de la matière à traiter est appliquée au papier, sur lequel un tampon (pH: 8,3 ; phosphate 0,1N) est admis à s'écouler.
La novo-
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biocine et la deecarbamylnovobiocine peuvent être aisément visualisées à l'aide de l'absorbanoe de lumière ultra-violette et la novobiocine est aisé- ment détectée par des méthodes bioautographiques. Avec ce système, la novo-
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biocine a un rf de 0,25 et la descarbamylrlovobiocine a une mobilité d'envi- ron 1,1 fois celle de la novobiocine, tandis que la dihydronovobiocine a une mobilité d'environ 0,6 fois celle de la novobiocine. En pratique, il s'avère avantageux de développer le chromatogramme jusqu'à ce que la novo- biocine ait parcouru environ 8/10e de la longueur de la bande de papier.
Les quantités relatives de descarbamylnovobicoine et de novobiocine ou de descarbamyldihydronovobiocine et de dihydronovobiocine sont déterminées en mesurant l'absorbance comparative du chromatogramme sur bande de papier sous
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la lumière ultra-violette, en utilisant un densitomètre approprié.
Il a été observé qu'une séparation plus grande de la descarbamyl- dihydronovobiocine et de la dihydronovobiocine est obtenue si-.le chromato- gramme sur papier est exécuté en utilisant du papier imprégné de glycérol et en laissant du chloroforme s'écouler sur la feuille.
REVENDICATIONS
1. Composés choisis dans le groupe comprenant la descarbamylno- vobiocine et la descarbamyldihydronovobiocine.
2. Descarbamylnovobiocine.
3. Descarbamyldihydronovobiocine.
4. Procédé dans lequel on fait réagir un composé du groupe com prenant la descarbamylnovobiocine et la descarbamyldihydronovobiocine avec du cholure de carbamyle, de manière à produire l'antibiotique correspondant.
5. Procédé dans lequel on fait réagir de la descarbamylnovobio- cine avec .du chlorure de carbamyle, de manière à produire de la novobiocine.
6. Procédé dans lequel on fait réagir de la descarbamyldihydro- novobiocine avec du chlorure de carbamyle, de manière à produire de la di- hydronovobiocine.
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The present invention relates to novel chemical compounds related to novobiocin and dihydronovobiocin, to processes for preparing these compounds and to methods for converting these compounds to valuable antibiotics. More particularly, it concerns
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7% tetrah¯ydro-34-dihydroxy-5-methoxy-6,6-dimethyl-pyrn-2-yloxy -4-hydroxy-3- / 4-hydroxy-3- (3-methyl-2-butenyl) - benzamido7 -8-methylcoumarin9 as well as the corresponding dihydrogen derivative, in which the 3-methyl-2-butenyl substituent has been replaced by a 3-methylbutyl group.
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Novobiocin or 7-rtetrahydro-3-hydroxy .. ° -carbamyl-5-methoxy-6,6-dimethyl-pyran-2-yloxy7-4-hydroxy-3 f4-hydroxy-3-4-hydroxy-3- ( 3-methyl-2-butenyl) -benzamido7-8-methyl-coumarin, which can be represented by the following structural formula:
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and dihydronovobiocin, which has a structure similar to novobiocin, but has a 3-methylbutyl group instead of the 3-methyl-2-butenyl group in novobiocin, are valuable new antibiotics, which are active in this sense. that they mainly inhibit the growth of gram-positive microorganisms, although they also show some activity against gram-negative microorganisms.
The new compounds according to the invention, namely 7-tetra-
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hydro-34-dihydroxy-5-methoxy-66-dimethylpyran-2-yloy -.- hydroxy-3-% 4- hydroxy-3- (3-methyl-2-butenyl) -benzamidc 7 -8-methylcoûmarin and the derivative corresponding dihydrogen, in which the 3-methyl-2-butenyl group is replaced by a 3-methylbutyl group differ from novobiocin and dihydronovobiocin, respectively, by the absence of a carbamyl group. Because of this close relationship with these compounds, the new compounds are hereinafter referred to as "descarbamylnovobiocin" and "des-carbamyldihydronovobiocin" respectively.
Descarbamylnovobiocin has now been found to be present in some novobiocin preparations. The presence of this compound in novobiocin preparations was discovered when these preparations were subjected to chromatographic analysis on paper.
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Subsequently, it was found that descarbamylnovobiocin is formed in alkaline solutions of novobiocin and that it can be advantageously prepared from novobiocin by careful treatment with dilute alkali. Thus, when a solution of novobiocin in 0.1N sodium hydroxide is allowed to stand at room temperature for about 4 days, most of the novobiocin is converted to descarbamylnovobiocin.
Likewise, it was found that there is descarbamyldihydronovobiocin in the preparations of dihydronovobiocin and the presence of this compound in these preparations was observed during the chromatographic analysis.
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than on dihydronovobiocin paper. Descar'bamyldihydronovobiocin can be similarly prepared by subjecting dihydronovobiocin to
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the action of a dilute alkali.
According to another embodiment of the present invention, it has now been found that descarbamylnovobiocin and descarbamyldihydronovobiocin can be converted into novobiocin and dihydronovobiocin active as antibiotics, by reaction with suitable carbamylating agents. Thus, when descarbamylnovobiocin or des-carbamyldihydronovobiocin is brought into intimate contact with carbamyl chloride in the presence of a suitable organic base, novobiocin or dihydronovobiocin, respectively, is formed, which can be easily isolated and recovered in pure form.
The following examples are presented by way of illustrative embodiments of specific methods of preparing descarbamylnovobio- alin and descarbamyldihydronovobiocin and converting these substances to novobiocin and dihydronovobiocin respectively.
EXAMPLE 1
100 g of novobiocin obtained as described later was dissolved in 300 cc of a mixture of benzene and methanol (1: 2) and the pH of the resulting solution was adjusted to about 7.4 with a solution. at 10% sodium methoxide in methanol. The resulting solution was then diluted with about 700 cc of benzene. On standing, the sodium salt of novobiocin crystallized from the resulting solution and was collected by filtration. The resulting filtrate was extracted twice with about 1/10 its volume of water, and the aqueous extracts were concentrated under reduced pressure to half the original volume.
To the concentrate were added about 15 g of diatomaceous earth filter aid and enough dilute hydrochloric acid to adjust the pH of the solution to about 3. The resulting precipitated product together with the filter aid were added. were collected by filtration and dried. The product thus obtained contained about 25% by weight of descarbamylnovobiocin. It was dissolved in 100 dcc of anhydrous acetone and filtered to remove the filter aid. The resulting solution containing the crude material, consisting of about 50% descarbamylnovobiocin, was chromatographed on 450 g of activated alumina in a 2 inch diameter column.
The column was then developed with anhydrous acetone and 8 fractions of 300 cc each were collected and analyzed by paper chromatography. Purified descarbamylnovobiocin was obtained by concentrating the first four cut sections to dryness. The product thus obtained weighed about 6.3 g and contained about 80% descarbamylnovobiobin. This product melted at 135 - 145 C.
The novobiocin employed in the process described above was obtained as follows:
A fermentation broth containing novobiocin was heated at 60 ° C for 20 minutes at a pH of 7.5 - 8.0 and after cooling it was filtered. The filtered broth was adjusted to a pH of about 6.5 and extracted with 1/5 its volume of amyl acetate in a two-stage countercurrent extraction apparatus. The amyl acetate extracts were extracted with about 1/3 volume of water containing enough ammonia so that the final pH of the aqueous extract was 9.7 - 10.5, using a two-stage counter-current extraction apparatus.
The same extraction process with amyl acetate and ammonia was repeated and the final aqueous solution was diluted with methanol to a solvent ratio of 35% methanol and 65% d. water and the mixture was acidified. On standing, the novobiocin crystallized from the resulting solution.
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EXAMPLE 2
Novobiocin was dissolved in 0.1N sodium hydroxide, so as to obtain a 2% solution. The solution was allowed to stand at room temperature for 96 hours. At this time, chromatographic paper analysis indicated that more than 75% of the novobiocin had been
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transformed into descarbamylnovobiocin. The solution was acidified to pH 3 with stirring. The flocculated precipitate of crude descarbamylnovobiocin was filtered and dried. Purification was carried out by dissolving the crude product in acetone to form a 30% solids solution, filtering off any novobiocinic acid which crystallized.
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tallizes and precipitates descar'bamylnovobiocin by adding petroleum ether. The recovered product melted at 130-140 C.
The product exhibited absorption maxima at 3125A, when dissolved in aqueous NaOH
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0.1N (E1%: about 500), and at, '50 = 'when dissolved in 0.1N aqueous HCl methagiiq. (E17 m: around 440). The product is optically active; a D = -17.7 in CH3OH.
EXAMPLE 3.
By repeating the process of Example 2, but using dihydronovobiocin as a starting material, descarbamyl-
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dihyc.ronovobioain.e melting at 142 - 143.
EXAMPLE 4
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About 500 mg of descarbamyInovobiocin was dissolved in 500 dioxane and 0.5 cc of a 205 solution of carbamyl chloride in dioxane was added. The mixture was allowed to stand at room temperature for about 2 hours. The resulting novobiocin was precipitated by diluting the dioxane solution with 10 volumes of water. The novobiocin thus obtained can be further purified by recrystallization according to methods known in the art to obtain the product in pure form.
EXAMPLE 5
By repeating the process of Example 4 starting from descarbamyldi-
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hydronovobiooine, dihydronovobiocin is obtained.
In the examples described above, descarbamylnovobiocin and deâcarbamyldihydronovobiooine can be easily distinguished from novobiocin and dihydronovobiocin respectively by chromatographic analysis on paper. This analysis can be performed as follows:
Pàpierfiltre (Whatman No. 1) is impregnated with caprylic alcohol by immersion in a mixture of methanol and caprylic alcohol and the excess solvent is removed with a blotter. A solution containing about 40 to 200 micrograms of the material to be treated is applied to the paper, onto which a buffer (pH: 8.3; 0.1N phosphate) is allowed to flow.
The novo-
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biocin and deecarbamylnovobiocin can be easily visualized using ultraviolet light absorbanine and novobiocin is readily detected by bioautographic methods. With this system, the novo-
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biocin has an rf of 0.25 and descarbamylrlovobiocin has a mobility of about 1.1 times that of novobiocin, while dihydronovobiocin has a mobility of about 0.6 times that of novobiocin. In practice, it is advantageous to develop the chromatogram until the novobiocin has traveled about 8 / 10th of the length of the paper web.
The relative amounts of descarbamylnovobicoin and novobiocin or descarbamyldihydronovobiocin and dihydronovobiocin are determined by measuring the comparative absorbance from the paper strip chromatogram under
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ultraviolet light, using an appropriate densitometer.
It has been observed that greater separation of descarbamyldihydronovobiocin and dihydronovobiocin is achieved if the paper chromatogram is performed using paper impregnated with glycerol and allowing chloroform to flow over the sheet. .
CLAIMS
1. Compounds selected from the group consisting of descarbamylnovobiocin and descarbamyldihydronovobiocin.
2. Descarbamylnovobiocin.
3. Descarbamyldihydronovobiocin.
4. A method in which a compound from the group consisting of descarbamylnovobiocin and descarbamyldihydronovobiocin is reacted with carbamyl cholide, so as to produce the corresponding antibiotic.
5. A process in which descarbamylnovobiocin is reacted with carbamyl chloride to produce novobiocin.
6. A process in which descarbamyldihydro-novobiocin is reacted with carbamyl chloride to produce di-hydronovobiocin.
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