BE544152A

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Publication number: BE544152A
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Description


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   La présente invention est relative à la fongici- ' dine antibiotique antifongique (Nystatine). Plus particuliè- rement, l'invention concerne des procédés perfectionnes pour la préparation de fongicieine(Nystatine) cristallisée. 



   La   fongicidine   antibiotique (Nystatine) et son procédé de préparation au départ de   Streptomyces     nouresei   sont décrits dans la demande de brevet   U. S. A.   n  208.978 déposée le 12 janvier 1951. Voir également l'article de   Hazen   
E.L. et   Brovm   R intitulé   "Fongicidine,   un antibiotique pro- duit par un actinomycète du sol" et publié dans Proc. Soc. 
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  Expl . Biol. Med. 76:93 ( l9Sj et l'article de Brown Il, Hazen et Mason A #'e;,L. /"intitulé "Effet de la foigicidine(Nystatine) chez les souris injectées à l'aide de mélanges mortels d'Aunomycine et de Candida   Albicans"   et publié dans Science   Il'7 :   609 (1953). L'antibiotique sera désigne ci-après par le seul mot "Nystatine" . 



   Des   concentrais   bruts de nystatine peuvent être prépares en extrayant la matte mycéliale avec plusieurs portions de méthanol, puis en soumettant la solution métha-   nolique à   une précipitation fractionnée à l'aide d'acétate   d'éthyle,   en lavant le précipité avec une solution de 0,85% de NaC1, en le   redissolvant   dans du méthanol et en effectuant une précipitation fractionnée au moyen   d'éther.   Voir la de- mande de brevet U.S.A. n  208.798 précitée. De faibles ren- dements en matière cristalline active peuvent être obtenues à partir des concentrats bruts résultants par répartition entre le butanol et une solution saline et par précipitation partielle dans le méthanol.

   De la nystatine cristallisée de haute pureté a été obtenue par répartition ou distribution de concentrais de nystatine partiellement purifiés dans un 

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 système biphacque   obtenu   en mélangemant du n-butanol, du méthanol, de l'eau et de l'hexane et en   laissant   ce systè- me expose à   uns   évaporation à   l'air,   jusqu'à ce ou'une ré- colte de cristaux soit accueillie à l'interface entre les deux couches du système. Voir Dutcher, James D et autres, Antibiotics Animal 1953-1954, pages   191-194,   Médical Ency- clopedia   Inc,   New-York, N.Y. 



   Les procédés décrits ci-dessus produisent de la nystatine cristalline, mais ces nrocédés ne donnent pas sa- tisfaction à cause de la présence d'impuretés ou parce que leurs rendements sont faibles. Ces procédés présentent éga- lement   1/ inconvénient   d'être relativement difficiles à con-   @   trôler et ne sont pas du type voulu pour une production com- merciale à grande échelle . ' 
Les recherches effectuées par la demanderesse" dans ce domaine ont permis de découvrir que de la nystatine cristallisée peut être   aisément   préparée par le procédé dé- crit plus loin. 



    EXEMPLE I. -    
10 gr d'une matière .partiellement purifiée conte- nant 1000 unités mgr de nystatine ont été empâtés avec 50 cc d'un mélange à 50% d'isopropanol et d'eau. La suspen- sion résultante a été amenée à un pH de 6 par addition de 20% de H2SO4 et chauffée à 45 C pendant cinq minutes. Le mé- lange a alors été filtré, en sorte qu'on a obtenu un résidu insoluble (I)et un filtrat de teinte foncée (II). Le résidu (I) titrant 1600 unités/mgr   contenait 75;-;'   de l'activité. 



  Bien que ces stades   opératoires   aient donné lieu à une certai-' ne perte d'activité, la plupart des impuretés indésirables, qui entravaient la cristallisation de la nystatine, ont été éliminées et sont restées dans le filtrat (II). 

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   Le résidu (I) a été mis.ensuspension dans 35 ce d'une solution méthanolique à   5%   de chlorure de calcium et la suspension a été agitée pendant 30 minutes. Le mélange a été filtré, en sorte qu'on a obtenu, d'une part, un solide inactif blanc (III) et, d'autre part, une solution jaune (IV) contenant tout le principe actif. Le filtrat   (IV)   a été chauffé à 40 C et 10 ce d'eau ont été ajoutés. La solution résultante a été laissée au repos à température ambiante pen- dant une heure et il s'est formé un précipité jaune (V) ayant une activité d'environ 650 unités/mgr.

   Le précipité (V) a été séparé par filtration et le filtrat (VI) a été chauffé à 40 C et clarifié avec une petite portion d'isopropanol .La solution a été rendue trouble par addition de 10 cc d'eau et laissée au repos à température ambiante* Cette solution a donné une matière cristalline jaune   (VII) ayant   une activité de 3500   unités/mgr .   La matière cristalline (VII) a été sépa- rée par filtration et le filtrat résultant (VIII) a de nouvea été chauffé jusqu'à 40 C et rendu trouble par addition de 5 cc d'eau. En laissant au repos, on a obtenu une seconde récolte.de matière cristalline (IX) qui n'était pas aussi jaune que la première matière cristalline   (VII),   mais qui avait sensiblement la même activité. Les matières cristal- lines (VII et IX) se sont révélées similaires.

   Le diagramme suivant illustre le procédé décrit ' ci-dessus . 

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  Concentrât de nystatine.- 
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 Le rendement global du procédé décrit ci-dessus (VII + IX) est d'environ   65%. En   pratique, ce procédé stest révélé être le meilleur pour obtenir une matière cristallisée à activité exceptionnellement élevée . 

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   Dans le procédé décrit ci-dessus, l'addition de chlorure de calcium dans du méthanol au résidu   (I)donne   lieu à la formation d'un complexe nystatine..   CaCl2.   Ce com- plexe est soluble dans le méthanol et peut être avantageuse- ment utilisé pour la préparation de nystatine cristallisée de pureté et activité élevées. Le complexe   nystatine-CaCl2   ' se dissocie dans l'eau, en donnant la matière cristalline désirée (VII et IX). 



   Dans les stades initiaux utilisés pour la prépara- tion du résidu (I), on ne doit utiliser qu'une petite quan- tité du mélange eau-isopropanol ( ou savant organique simi- laire miscible   à l'eau),  par exemple une quantité juste suf- fisante pour la mise en suspension et la formation d'une pâte de la nystatine brute ou partiellement purifiée. L'emploi de quantités excessives 'du mélange eau-solvant organique par rapport à celle requise pour former une pâte donne lieu à la pertes de quantités excessives de nystatine dans le filtrat (II), La quantité optimum de solvant organique miscible à l'eau, de même que la quantité optimum de mélange eau-solvant organique à employer avec un concentrât particulier de nysta- tine brute ou partiellement purifiée peuvent être déterminées par un essai expérimental préalable. 



   Aulieu de chlorure de calcium, on peut utiliser, pour dissoudre le résidu (I) dans du méthanol, n'importe quel sel soluble dans le méthanol, les sels de métaux bivalents et, en particulier, les sels des métaux alcalinoèterreux, tels que le nitrate de calcium, le chlorure de magnésium, le nitrate de magnésium, le nitrate de baryum, ainsi que leurs bromures et iodures, étant généralement préférés. D'autres sels solubles dans le méthanol, tels que les acétates, bromu- res et iodures de sodium et de potassium, peuvent cependant 

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 être utilisés ,pour solubiliser la nystatine dans le metha- nol. Les sels solubles dans le méthanol sont également solu- bles dans le méthanol aqueux. 



   Les complexes nystatine-sel sont préparés, de pré- férence, en faisant réagir des quantités sensiblement équi-   @     uoléculaires   de nystatine avec le sel soluble dans le métha- nol, au sein de méthanol anhydre. Comme indiqué plus haut, les complexes se dissicient en présence d'eau en donnant un précipité de nystatine, le sel restant en solution.   La     com-   plexe peut, toutefois, être aisément obtenu par évaporation du méthanol ou par addition d'un solvant organique, tel que' l'acétone, l'acétate d'éthyle et analogues à la solution mé-   thanolique,   de façon à précipiter le complexe nystaine-sel. 



   L'exemple suivant est donné à titre illustratif. 



   EXEMPLE   II.-   
Un échantillon de 5 gr de nystatine cristallisée (3450 u/mg) a été dissous dans 75 cc d'une solution métha- nolique à 1% de chlorure de calcium. Après filtration, pour éliminer les impuretés qui pourraient être présentes,   5 'volu-   mes d'acétone ont été ajoutés   lentement   au filtrat. Le préci- pité qui s'est formé a été séparé par filtration, lavé'à fond      à l'acétone et séché. Un rendement de 75-80% en complexe nys-      tatine-chlorure de calcium a été obtenu.

   Pour une purifica- tion ultérieure, le complexe de chlorure calcique préparé comme ci-dessus a été dissous dans une solution méthanolique à 0,2% de chlorure de calcium (lgr/15 cc), la solution a été filtrée et le complexe a été précipité par addition-de 5 volu- mes d'acétone. Le produit a été séparé par filtration, lavé à fond à l'aide d'acétone anhydre et séché. 



   Quelques propriétés du complexe nystatine-chlorure 

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 de calcium résultant" , préparé de la manière décrite plus   haut,   sont les   suivantes :   
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 Point de fusion : d"6compo:3ition Bioessai : 310U u/mf.;l' Analyse élémentaire 
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<tb> C <SEP> = <SEP> 52,19%
<tb> 
<tb> H <SEP> 7,28%
<tb> 
<tb> N <SEP> = <SEP> 1,39%
<tb> 
 
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 Ga - 3, YOÍ' 
 EMI7.5 
 
<tb> C1 <SEP> - <SEP> 6,71%
<tb> 
 
Ce produit correspond à une molécule de chlorure de calcium par molécule de nystatine . 



   Equivalent neutre : 1031 par titration à l'aide d'acide. 



   Sa rotation spécifique, son spectre d'absorption ultra-violet et son spectre d'absorption infra-rouge sont identiques à ceux de la nystatine, compte tenu du poids   mole--   culaire accru dû à l'addition de la molécule de chlorure de calcium. 



   Solubilité : très   bonne   solubilité dans le méthanol 
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 et la dïrnéth,yl.for mamide certaine solubilité dans 1 t éthanow l'isoprro->panol, le propanol, le butanol et le propylène glycol; solubilité faible dans autres solvants organiques communs; dissociation dans l'eau. 



   D'une   manière   similaire, d'autres complexes nysta- tine-sel peuvent être préparés, en remplaçant le chlorure de calcium par d'autres sels solubles dans le méthanol. Comme exemples illustratifs de tels autres complexes, on peut. citer ;ceux de nystatine avec du   chlorure   de   magnésium,   du   nitrate   de baryum, de l'acétate de sodium, du bromure de potassium, etc...Bien qu'utiles comme   moyens     pour   obtenir de la   nysta-   tine de haute pureté, les complexes peuvent également être 

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 employés, dans les cas où l'on désire   'obtenir   des   agent;   ou compositions antifongiques caractérisés par une certaine ac- tivité nystatinique.

   Pour l'usage interne, les sels contenus dans le complexe de nystatine doivent être choisis parmi les sels solubles dans le méthanol sensiblement non toxiques, le complexe formé avec le chlorure de calcium étant un des pré- férés. 



   Au cours des recherches effectuées, on a découvert qu'une nystatine plus aisément soluble et de plus grande solubilité peut être obtenue par précipitation de nystatine dans une solution d'un complexe nystatine-sel dans du métha- nol, à condition que le pH de la solution méthanolique soit ajusté à environ 4,5-6 avant addition d'eau.

   En général, ce procédé implique la dissolution de nystatine titrant par exemple environ 1000 à 2500 u/mgr dans une solution méthano- lique d'un sel soluble dans le méthanol, l'ajustement du pH de la solution résultante de complexe nystatine-(sel à envi- ron   4,5-6   par addition d'une matière acide, la filtration de la solution acide de façon à éliminer l'éventuelle matière insoluble , et l'addition d'une quantité suffisante d'eau au filtrat pour décomposer ou dissocier le complexe et pré- cipiter la nystatine, qui est ensuite empâtée avec de l'eau et lyophilisée.   On   peut utiliser n'importe quelle matière aci- de (par exemple des acides inorganiques et organiques) solu- ble à la fois dans le méthanol et dans l'eau pour ajuster le pH de la solution méthanolique.

   Ordinairement, l'emploi d'a- cides minéraux, tels que HC1, est généralement préféré pour ajuster le pH à environ 5. La nystatine produite par ce procé- dé est plus aisément soluble et de solubilité plus grande'dans      des solvants ,tels que éthanol,  propanols,     propylène-glycol, '   etc... Ces caractéristiques sont particulièrement importantes, 

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 car olloa permute ut uicômcnt d'obtenir der. C;OIlCClltl'o'J1..,i.ún:; 01L'vtJu:J de nystatine dans ces solvants et dans des uolvants similaires, y compris des TMC7¯Illlj''C:..i aqueux de ces solvants, y tels nue de l'éthanol aqueux à 70/., du propauol à '7u/ et du propylène-glycol à 30o. 'exemple suivant est donne- à seul titre illustratif. 



   EXEMPLE 111.- 
On prépare une solution de 2% de   chlorure   de cal- ciun dans du méthanol (poids/volume). Un dissout de la   nysta-   tine dans la solution de chlorure de calcium, en utilisant 15 litres dé solution, par .kilo de nystatine, et on ajuste le pH de la solution résultante à environ   5,0 +   0,2 par addition d'un mélange   1:1 d'acide   chlorhydrique et de méthanol. On agite pendant environ 4   heure s.   On ajoute 1/4 de volume d'eau (sur la base du volume de solution) en l'espace d'une demie-heure, en agitant constamment et en maintenant le pH à environ 5.

   On agite pendant 30   minutessupplémentaires.   On ajoute un adju- vant de filtration (diatomées),tel que Hyflo, en utilisant   0,4   kilo d'adjuvant de filtration par kilo de nystatine.   On   agite le mélange résultant et on le filtre. On lave le gâ- teau du filtre avec d.u méthanol à 75% en utilisant 4 litres xe méthanol à 75% par kilo de nystatine. On combine les eaux de lavage au filtrat. Un ajoute rapidement 2 volumes d'eau 
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 (sur la base du volume du filtrat).à ce filtrat, tout en agi,. tant. On sépare la matière solide résultante (nystatine) par centrifugation. On   empâte   dans de l'eau distillée en utili- sant 10 litres d'eau par kilogramme de nystatine humide. On broie dans un moulin, tel qu'un moulin d'Epenbach, pour réduire les morceaux.

   On congèle et on sèche sous   bide.   



   Bien que ce procédé donne lieu à une perte d'un peu de nystatine, il constitue un moyen aisé pour obtenir, avec de bons rendements, de la nystatine très active et sensible- 

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 ment pure présentant les caractéristiques de solubilité désirées notées plus haut. 



   Pour une définition des termes "unité" et   "u./mgr'   de nystatine", tels qu'utilisés dans le présent mémoire,    voir Gold, William ; Stander, Herbert ; Pansy, Félix E.,      "Assay   Methods for Nystatin", Antibiotics Annual 1953-1954, pages   195-198,

Claims

REVENDICATIONS.- 1.- Procédé de préparation de nystatine cristalli- sée fortement active, comprenant les stades selon lesquels on mélange de la nystatine partiellement purifiée à un sel solu- ble dans le méthanol, au sein de méthanol, on sépare la matiè- re non dissoute de la solution résultante contenant de la nys- tatine sous forme d'un complexe nystatine-sel, on dissocie le complexe par additoon d'eau à la solution méthanolique, et on récupère la nystatine précipitée résultante du méthanol aqueux.

2.- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le sel est un sel de métal alcalino-terreux soluble dans le méthanol.

3a- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le sel soluble dans le méthanol est du chlorure de calcium.

4.- Procédé de préparation de nystatine cristalli- sée fortement active, comprenant les stades selon lesquels on dissout de la nystatine partiellement purifiée dans un milieu constitué de méthanol et d'un sel soluble dans le mé- thanol et on précipite la nystatine par addition d'eau à la . solution méthanolique' 5.- Procédé suivant la revendication 4, dans lequel le sel est un sel de métal alcalino-terreux soluble dans le méthanol.

6.- Procédé suivant la revendication 4, 'dans lequel le sel est du chlorure de calcium.

7.- Procédé de préparation de nystatine cristallisée fortement active, comprenant les stades selon lesquels on fait réagir de la nystatine partiellement purifiée avec un sel soluble dans le méthanol, au sein de méthanol, de maniè- re à former un complexe nystatine-sel soluble dans le métha- nol. <Desc/Clms Page number 12>

8.- Procédé suivant la revendication 7, dans lequel le sel est un sel soluble dans le méthanol d'un métal alcali- no-terreux.

9.- Procédé suivant la revendication 7, dans lequel le sel est dn chlorure de calcium.

10.- Complexe nystatine-sel soluble dans le méthanol, ce complexe étant caractérisé en ce qu'il est soluble dans le méthanol et se dissocie en solution méthanolique par addition d'eau.

11.- Complexe nystatine-sel de métal alcalino- terreux soluble dans le méthanol suivant la revendication 10.

12,.- Complexe nystatine-chlorure de calcium.

13. - Procédé de préparation de nystatine fortement active à solubilité améliorée, dans lequel on dissout de la nystatine dans'une solution méthanolique d'un sel soluble dans le méthanol. on ajuste le pH de la solution résultante à environ 4,5-6 et on précipite la nystatine par addition d'eau à la solution méthanolique acide.

14.- Procédé suivant la revendication 13, dans le- quel le sel soluble dans le méthanol est du chlorure de calci- um.

15,- Procédé suivant la revendication 13, dans lequel le sel soluble dans'le méthanol est du chlorure de calcium et le pH est ajusté à environ 5'.

16.- Procédé de préparation de nystatine cristalli- sée fortement active, dans lequel on met de la nystatine par- tiellement purifiée en suspension dans une petite quantité d'un mélange isopropanol-eau, on filtre la suspension résultan te, on met le résidu en suspension dans une solution méthano- lique d'un sel soluble dans le méthanol, on filtre la solu- tion résultante @@@tenant la nystatine sous forme d'un com - EMI12.1 plexe n7Statir, #- lubU dHns le méthanol, on ajoute <Desc/Clms Page number 13> fisamment d'eau au filtrat pour dissocier le complexe et on récupère le précipité de nystatine cristallisée obtenu.

, 17.- Procédé de préparation de nystatine cristalli- sée fortement active, dans lequel on met de la nystatine bru- te et impure en suspension dans une petite quantité d'un mé- lange à 50% environ' d'isopropanol et d'eau, on ajoute suffi- samment d'acide pour ramener à environ 6 le pH de la suspension résultante,on dissout le résidu dans une solution méthanoli- que de' chlorure de calcium, on filtre la solution contenant le complexe nystatine-chlorure de calcium résultant, on ajoute suffisamment d'eau à la .solution du complexe nystatine- chlorure de calcium pour rendre la solution trouble et on recueille la nystatine cristallisée précipitée.