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Procédé d'extraction et de purification d'une hormone pancréatique agissant sur les centres respiratoires.
La présente addition a pour objet un procédé d'extraction et de purification d'une hormone pancréatique agissant sur les centres respiratoires consistant en trois modes opératoires dont le premier permet l'extraction de l'hormone active sur les centres respiratoires contenue dans le pancréas de boeuf, mais comme en même temps l'insuline et la vagotonine se trouvent extraites avec l'hormone recherchée, le second mode opératoire est destiné à éliminer de l'extrait brut contenant l'hormone recherchée toute la vagotonine et, en même temps, la plus
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grande partie de l'insuline;
le troisième mode opératoire est celui qui permet d'éliminer complètement les dernières traces 'd'insuline et certaines impuretés constituées en particulier par une substance hyperglycémianteg, suivant le brevet princi- pal.
Conformément à l'addition, dans le troisième mode opératoire on procède d'abord à un fractionnement à l'alcool de l'extrait pancréatique obtenu dans les deux modes opératoire: précédents et dialysé; puis on procède ensuite à un fraction- nement au chlorure de lithium de la partie active isolée par le traitement alcoolique., l'extrait étant finalement séché à l'alcool éther et sous vide...
Suivant une autre particularité de l'addition, l'ex- trait obtenu est traité de façon à éliminer l'insuline res- tante en utilisant'la propriété que possède cette dernière de former un complexe irréversible avec le ferrocyanure de potas- sium dans certaines conditions de concentration et de pH.
On donne ci-après, à titre d'exemple non limitatif, une description du procédé.
Après avoir tiré l'extrait brut correspondant à plu- sieurs tonnes de pancréas et séparé de cet extrait la plus grande partie de la vagotonine ainsi que la plus grande partie de l'insuline décelable par électrophorèse, et également la plus grande,partie de substance hyperglycémiante, on procède à un fractionnement à l'alcool de l'extrait pancréatique obtenu précédemment.
L'extrait est dissous dans sept fois son poids d'eau, le pH étant ajusté aux environs de 6, et on met la solution en dialyse pendant quatre heures. Cette opération étant terminée, le liquide reçoit un volume d'alcool éthylique absolu, tel que le titre alcoolique firl soit compris entre 15 et 20 , le pH étant ajusté à 4,7. Cette opération doit être exécutée à très basse température aux environs de -5 C et l'addition
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d'alcool doit se faire par très petite quantité avec une agi- tation constante.
Le précipité qui se forme est éliminé par centrifugation
Le liquide limpide recueilli est amené au voisinage de la neutrà lité par de la soude à. 50% et versé dans 10 volumes d'alcool absolu refroidi à -500. On recueille le précipité par centrifu- gation, on le sèche à l'alcool éther et sous vide.
En partant de 100 grammes d'extrait, on aboutit ainsi à 35 gramme s environ.,
L'extrait pancréatique ainsi obtenu subit ensuite un fractionnement au sel Il'est alors remis'en solution dans 10 fois'son poids d'eau. Le pHest ajusté à 3,45;la solution est refroidie à. 0 c et reçoit un demi-volume,d'une solution à
50% de chlorure de. lithium'. Le précipita formé est élimina par centrifugation âpres une demi-heure de repos.
Le liquide recueilli est ajusté à un pH égal à 2,7, puis le précipité .est laissé au repos pendant une demi-heure avant d'être centrifugé, redissous dans le minimum d'alcool à 60 ; cette solution neutralisée est pricipitée par 10 volumes d'alcool absolu. Le précipité recueilli par centrifugation est séché à l'alcool éther et sous vide. On obtient ainsi 15 à 20 grammes d'extrait actif sur les centres respiratoires à raison de 20 à 40 unités par milligramme. Cet extrait ne contient plus du tout de substance hyperglycémiante, mais il contient encore des traces d'insuline nettement décelables par l'étude de la glycémie chez le chien avant et après injection du produit.
Pour obtenir un extrait pur, on procède à l'élimination de ces traces d'insuline en utilisant la propriété que possède cette dernière,de former un complexe irréversible avec le ferrocyanure de potassium dans certaines conditions de concen- tration et de pH.
L'extrait pancréatique obtenu dans le mode opératoire précédent (15 à 20 grammes) est dissous dans une solution
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2 pour 1000 de ferrocyanure de potassium. Il faut 28 cm3 de cette solution par gramme d'extrait à purifier.
On commence à dissoudre la substance dans le quart du volume de solution à employer et on. ajuste le pH entre 3,8 et 4. Après dix minutes de repos, on ajoute le reste de la solution de ferrocyanure de potassium en trois additions suc- cessives de volume égal en séparant chaque addition par un temps de repos de dix minutes et en conservant le pH entre 3,8 et 4.
On laisse .le précipité se déposer pendant deux. heures
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à 0"C et on le sépare par centrifugation.
Le liquide limpide recueilli est acidifié par l'acide
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chlorhyirique 3N ,, jusqu'à pff c 2,8 Au cours de cette opéra- tion, on élimine par centrifugatibn les précipités qui peuvent se former. Le liquide aC,idifié ,refr9:1di 0 0 reçoit un demi- volume de solution à 50% de; chlorure de' lithium. On laisse ..
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reposer pendant trente minutes '0 0 et on recëuille le ,.. , , intr;' ,:e1ï on recéue précipité par centrifugation. 1 est dissous dans le minimum d'alcool à 60 la solution est amenée à la neutralité et versée dans' 10 volumes d'alcool absolu. Le précipité centri- fugé est séché à l'alcool éther et sous vidé.
On obtient 8 à. 10 grammes d'un extrait actif sur les centres respiratoires à raison de 100 à 200 unités par milli- gramme. Cet extrait n'a aucune activité sur le parasympathique, aucune action hyperglycémiante, aucune action, hypoglycémiante.
L'électrophorèse montre que la substance est appauvrie en impuretés et que la partie active s'est enrichie.
Diverses modifications peuvent d'ailleurs être appor- tées aux modes opératoires du procédé d'extraction et de purification de l'hormone pancréatique agissant sur les centres respiratoires sans sortir du cadre de l'addition.
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Process for the extraction and purification of a pancreatic hormone acting on the respiratory centers.
The present addition relates to a process for the extraction and purification of a pancreatic hormone acting on the respiratory centers consisting of three operating modes, the first of which allows the extraction of the hormone active on the respiratory centers contained in the pancreas of beef, but since at the same time insulin and vagotonin are extracted with the desired hormone, the second procedure is intended to eliminate from the crude extract containing the desired hormone all the vagotonin and, at the same time, the more
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much of insulin;
the third operating mode is that which makes it possible to completely eliminate the last traces of insulin and certain impurities constituted in particular by a hyperglycemic substance, according to the main patent.
In accordance with the addition, in the third procedure, the pancreatic extract obtained in the two procedures: preceding and dialyzed; then a fractionation with lithium chloride of the active part isolated by the alcoholic treatment is carried out, the extract being finally dried with alcohol ether and under vacuum ...
According to another feature of the addition, the extract obtained is treated so as to eliminate the remaining insulin by using the property which the latter possesses of forming an irreversible complex with potassium ferrocyanide in certain cases. concentration and pH conditions.
A description of the process is given below by way of nonlimiting example.
After having taken the crude extract corresponding to several tons of pancreas and separated from this extract the greater part of the vagotonin as well as the greater part of the insulin detectable by electrophoresis, and also the greater part of the substance hyperglycemic, one proceeds to an alcohol fractionation of the pancreatic extract obtained previously.
The extract is dissolved in seven times its weight of water, the pH being adjusted to around 6, and the solution is dialyzed for four hours. This operation being completed, the liquid receives a volume of absolute ethyl alcohol, such that the alcoholic strength firl is between 15 and 20, the pH being adjusted to 4.7. This operation must be carried out at a very low temperature around -5 C and the addition
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alcohol should be done in very small quantities with constant agitation.
The precipitate which forms is removed by centrifugation
The clear liquid collected is brought to the neighborhood of neutral by sodium hydroxide. 50% and poured into 10 volumes of absolute alcohol cooled to -500. The precipitate is collected by centrifugation, dried with alcohol ether and in vacuo.
Starting with 100 grams of extract, this results in approximately 35 grams.
The pancreatic extract thus obtained then undergoes fractionation with salt. It is then redissolved in 10 times its weight of water. The pH is adjusted to 3.45; the solution is cooled to. 0 c and receives half a volume, from one solution to
50% chloride. lithium'. The precipitate formed is removed by centrifugation after standing for half an hour.
The liquid collected is adjusted to a pH equal to 2.7, then the precipitate is left to stand for half an hour before being centrifuged, redissolved in the minimum of alcohol at 60; this neutralized solution is pricipitée by 10 volumes of absolute alcohol. The precipitate collected by centrifugation is dried with alcohol ether and under vacuum. We thus obtain 15 to 20 grams of active extract on the respiratory centers at a rate of 20 to 40 units per milligram. This extract no longer contains any hyperglycaemic substance, but it still contains traces of insulin clearly detectable by the study of blood sugar in dogs before and after injection of the product.
In order to obtain a pure extract, these traces of insulin are removed by using the property which the latter possesses of forming an irreversible complex with potassium ferrocyanide under certain conditions of concentration and of pH.
The pancreatic extract obtained in the previous procedure (15 to 20 grams) is dissolved in a solution
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2 per 1000 of potassium ferrocyanide. 28 cm3 of this solution are needed per gram of extract to be purified.
We start to dissolve the substance in a quarter of the volume of solution to be used and we. adjust the pH to between 3.8 and 4. After standing for ten minutes, the remainder of the potassium ferrocyanide solution is added in three successive additions of equal volume, each addition being separated by a ten minute standing time and keeping the pH between 3.8 and 4.
The precipitate is allowed to settle for two. hours
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at 0 ° C and separated by centrifugation.
The clear liquid collected is acidified by the acid
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3N hydrochloric acid up to pff c 2.8 During this operation, any precipitates which may form are removed by centrifugation. The liquid aC, idified, refr9: 1di 0 0 receives half a volume of 50% solution of; lithium chloride. We let ..
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stand for thirty minutes '0 0 and we collect the, ..,, intr;' The precipitate is obtained by centrifugation. 1 is dissolved in the minimum of 60 alcohol, the solution is brought to neutrality and poured into 10 volumes of absolute alcohol. The centrifuged precipitate is dried with alcohol ether and under vacuum.
We get 8 to. 10 grams of an extract active on the respiratory centers at a rate of 100 to 200 units per milligram. This extract has no activity on the parasympathetic, no hyperglycemic action, no hypoglycemic action.
Electrophoresis shows that the substance is depleted in impurities and that the active part has become enriched.
Various modifications can moreover be made to the operating modes of the process for the extraction and purification of pancreatic hormone acting on the respiratory centers without departing from the scope of the addition.