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La présente invention a pour objet un procédé d'extraction et de purification composé d'un ensemble de modes opératoires aboutissant à l'obtention d'une hormone pancréatique agissant sur les centres respiratoi- res, cette hormone pancréatique étant totalement exempte d'insuline et de vagotonine, cette dernière étant une hormone pancréatique agissant sur le parasympathique.
Le procédé conforme à la présente invention consiste essentiel- lement en trois opérations de préparation.
Dans le premier mode opératoire, on procède à l'extraction de l'hormone active sur les centres respiratoires, contenue dans le pancréas de boeuf. En même temps que cette hormone se trouvent extraites l'insuline et la vagotonine.
Dans le deuxième mode-opératoire, on-élimine de l'extrait brut, obtenu précédemment, toute la vagotonine et en même temps une partie de l' insuline.
Le troisième mode opératoire consiste à éliminer totalement les dernières traces d'insuline et certaines impuretés, en particulier une sub- stance hyperglycémiante.
Pour illustrer l'invention, on donne ci-après un exemple non limitatif du procédé d'extraction et de purification de l'hormone pancréatique.
Le premier mode opératoire, consistant à obtenir un extrait brut, peut être réalisé suivant trois méthodes.
Dans la première méthode, on fait macérer pendant vingt-quatre heures des pancréas de boeuf prélevés dès l'abattage de l'animal et finement hachés dans un liquide extractif composé d'alcool éthylique à 95 et d'acide chlorhydrique de densité égale à 1,18 à raison de onze ou'douze cm3 d'acide par litre d'alcool. On emploie 1,5 litre de liquide par kg. de pancréas, ce qui donne à la macération un titre alcoolique voisin de 50 et un pH compris entre 3 et 4. -
Après essorage et pressage de la macération, les jus alcooliques acides reçoivent une solution d'acétate de soude à 50%, en quantité suffisante pour obtenir un début de floculation. Il faut environ un à quatre cm3 d'acétate de soude par litre et le pH doit se situer aux environs de 5. Après quelques heures de repos, on filtre sur toile.
Les liquides limpides sont ensuite concentrés au 1/15 de leur volume initial par distillation dans le vide sans dépasser la température de 20 C.
Le liquide concentré, refroidi à 0 C reçoit 1/10 de son volume de chloroforme refroidi à 0 C et après agitation on laisse une nuit au repos, à basse température. On recueille par siphonnage la couche surnageante. On ajoute le pH de ce liquide à 2,5 et on sature de chlorure de sodium. Le précipité recueilli par centrifugation est déshydraté à l'alcool et séché dans le vide.
Un deuxième mode d'extraction consiste à traiter le pancréas de boeuf congelé à -30 C, dès l'abattage de l'animal, dans-des appareils à séchage à froid par le vide. Les pancréas-desséchés sont pulvérisés, dégraissés par épuisement au trichloréthylène. La poudre de pancréas est stabilisée à l'acétone. Elle est mise ensuite à macérer pendant douze à dix-huit heures dans cinq fois son poids d'eau refroidie à 2 G. Le pH de la solution est amené à 5. Le liquide après essorage de la macération est ajusté- à un pH 4.
On laisse au repos une ou deux heures et on centrifuge le précipité formé.
Le liquide recueilli par centrifugation reçoit une solution d'acétate de soude à 50% en quantité suffisante pour obtenir un début de floculation, qu' on laisse se poursuivre pendant quelques heures. Le pH est aux environs de 5. Lorsque le précipité commence à se déposer, on filtre sur toile. Le liquide est amené à un pH égal à 2,5 par l'acide chlorhydrique et saturé de
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chlorure de ..)d-'¯'..JI!o Le précipite qui se forme est centrifugée déshydrate à l'alcool absolu et sèche dans le vide.
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Un troisième procède consiste à recueillir, au cours de la préparation 1"5i-nz-.uline E, partir de pancréas de boeuf, les eaux-mères qui pro- viennent- de la réparation de l'insuline à son point isoélectrique dans les liquides dextraction du pancréas. Le pH de ces eaux-mères est ajusté à 2,5 et on le sature par le chlorure de sodium. Le précipité recueilli est séché à 1=alcool et dans le vide..
La substance pancréatique obtenue par l'un de ces modes d'extraction est alors soumise aux opérations de purification qui éliminent to-
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talement-la vagotoni==e et l'insuline qu'on peut mettre en évidence dans 1' extrait par les tests approprias.
Les -cests bzclog.ci:xes que l'on utilise pour le contrôle de l'é- puration progressive de l'hormone recherchée, permettent de déterminer l'augmentation d'activité respiratoire de l'extrait et la disparition totale d'
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activité sur le parasympathique; en même temps l'slectrophorse permet de voir si l'insuline disparaît progressivement au cours de la purification.
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On élimine de même les autres impuretés protéidiques.
L'activité respiratoire se mesure au moyen du test décrit cidessous qui se pratique sur des cobayes non anesthésiés et non soumis à con-
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tenticn. 0n E"¯1= inhaler un mélange d'air et de Ga2 contenant des doses progres5i.i?ne--; croissantes de C02a La dose de C02 qui provoque une augmentation de l ç ampli :::1:.::'-:::l thoracique, phénomène enregistrable graphiquement, est celle pour laquelle est atteint le seuil d7ex---i+-ab4Llî+v3 des centres respira- toires.
Apres injection aux cobayes de l'extrait pancréatique purifié
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contenant 1?1;crmc;e re:;;pi:1.:aoire, l'augmentation de l'ampliation thoracique apparaît pour des doses moindres de CO2 dans le mélange inhalé, mettant en évidence un accroissement de l'excitabilité chimique des centres respiratoi- res.
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Au C0ï.r;:' de la purification de l'extrait pancréatique, on peut suivre l'er.:::-ichis$êmei1-: de ¯.e dernier en hormone respiratoire, car il faut des poids dG plaiz. en pl').2 fubles d'extrait pour augmenter l'excitabilité des centres -:éspL##.tc.5,-ei. On peut ainsi titrer avec une très grande préci- -*ii# 1"aeiJm ,7es extrait.? pancréatiques sur l'excitabilité chimique des oestres respiratoires L"3.c.tivi't sur le parasympathique est mise en évidence par le test rlu réflexe ac;ï.--cardïw: 4e chez le lapin non anesthésié.
L'être expérimentale et statistique ayant montré qu'il suffisait de 5 gamma par kg. de lapin, en injection sous-cu--tan3e. de vagotonine hautement purifiée, pour obtenir un accroissement important et durable de 1"effet cardio-modérateur ':(n:3G:.tif à la compression des globes oculaires, il est ainsi, par cette m2ï:.hoc1e, de vérifier qu'une quantité donnée d'extrait pancréatique contient moins de 5 gamma d'hormone vagotonisante.
On a constaté rue dans certaines conditions :'le concentration et de pH, le'3 .5e1::. de métaux lourds précipitent la vago'tc1ir-e des solutions r1' exti-aits pSLcr iati;ue6 Dans ce procédé, on a choisi comme sel de chlorure de zinc. 1.l'C fait agir sur ine solution assez diluée d'extrait pancréatique brat 1?cù il p:'2ciplte la vagotonine. La quantité de chlorure de zinc a employer pour 21iIIllner totalement la vagotonine peut varier avec les extraits bruts à purifier- On détermine donc, pour un lot important d'extrait pancréatique brut, les quantité différentes de chlorure de zinc à partir d'échantil- long prélevés sur le l@t d'extrait pancréatique brut.
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Le deuxième mode opératoire du procédé consiste donc à détermi- ner d'abord les quantités de sels nécessaires, puis ensuite on procède à la purification du lot total. Pour ce faire, on prélève un échantillon cor- respondant à 50 kg. de pancréas, on lui fait subir les opérations de puri- 5 fication décrites ci-après en employant, par exemple, un cm3 de solution à
20% de chlorure de zinc.
On pratique alors le test du réflexe oculo-cardiaque.
Si, par injection au lapin du produit obtenu, à raison de 50 mg. par kg. d'animal, on observe encore une augmentation de la réflectivité pa- o rasympathique, on en déduit que toute la vagotonite n'a pas été éliminée.
On recommence donc la purification sur d'autres échantillons de même poids en augmentant la quantité de solution de chlorure de zinc à 20% de 2 ou 3 dixièmes de centimètre cube jusqu'à obtension d'un produit purifié totalement inactif sur le parasympathique.
5 Cette recherche par essais successifs de la quantité de chloru- re de zinc minimum nécessaire à l'élimination totale de la vagotonine est indispensable car on risque, en utilisant d'emblée une forte quantité de chlorure de zinc, qui évidemment précipiterait toute la vagotonine, d'entraî- ner, avec cette dernière, une partie ou même la totalité de l'hormone respiO ratoire qu'on veut isoler.
On donne ci-après un exemple numérique permettant de purifier un lot d'extrait brut correspondant à plusieurs tonnes de pancréas. Il est entendu que les quantités de sels de aine employées dans cette purification ne sont valables que pour le lot d'extrait pancréatique considéré.
300 g. d'extrait'brut sont dissous dans 900 cm3 d'eau. Le pH de la solution est amené, soit par de la soude, soit par de l'acide chlorhydri- que ( qui sont les seuls agents alcalins ou acides employés au cours de la purification) aux environs de 6. La solution est mise en dialyse pendant une nuit à la température de 15 C environ, l'expérience ayant montré que les ) dialyses à basse température ne permettent pas l'élimination de certaines substances à action anti-respiratoire ou toxique.
La solution privée de sels est filtrée,le volume est complété à
4 litres par de'l'eau distillée et le pH est ajusté à 5. On ajoute 9 cm3 de solution de chlorure de zinc à 20%. On laisse reposer 1/2 heure à 15 C, l' ; opération s'étant avérée inefficace à basse température. On remonte le pH vers la neutralité jusqu'à apparition d'un précipité. On laisse reposer pen- dant deux heures à 15 C. Le précipité formé, qui contient la vagotonine sous forme de complexe vagotonine-zinc, est séparé par centrifugation.
La solution est amenée-à un pH égal à 2,6 et reçoit du chlorure 0 de sodium à saturation en agitant pour faciliter la dissolution du sel. Le précipité qui se forme est centrifugé après deux heures de repos à très basse température, inférieure à 0 C.
Les culots de centrifugation sont dissous dans 300 cm3 d'eau; la solution est amenée à un pH voisin de 6 et soumise à une dialyse pendant ; une nuit à 15 C environ.
Le liquide privé de sels est amené progressivement à un pH égal à 2,6 en observant s'il y a formation de trouble ou de floculat à un pH compris entre 5-et 4,7, cas dans lequel il faut éliminer les insolubles formés.
Lorsque le pH est ramené à 2,6 la solution refroidie à 0 C reçoit 1/2 volume ) de solution de chlorure de lithium à 50% refroidie à 0 C. On laisse reposer au froid pendant deux heures. Le précipité formé est recueilli par centrifu- gation, dissous ensuite dans le minimum d'alcool à 70 ; la solution alcooli- que est amenée à un pH égal à 6 environ et versée dans 10 volumes d'alcool absolu refroidi à 0 C. le précipité recueilli par centrifugation est séché dans le vide .
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L'extrait purifié obtenu, qui est de l'ordre de 30 à 35 go pour 350 kg. de pancréas traités, ne doit plus contenir de vagotonine, mais il peut encore contenir de l'insuline décelable par électrophorèse et une substance hyperglycémiante.. Son activité sur les centres respiratoires, qui est déterminée par le test au. CO2 star le cobaye, est de l'ordre de 10 unités respiratoires par milligramme d'extrait.
On procède ensuite au troisième mode opératoire consistant à éliminer les dernières traces d'insuline en même temps que les autres impuretés présentes en faible quantité.
On dissout 1-'extrait purifié dans 10 fois son poids d'eau. On ajuste le pH de la solution à 5. On élimine par centrifugation tout trouble ou floculat se formant apres quelques heures de repos au froid. Le pH de la solution, qui est égal à 5, est maintenu puis on dilue progressivement par de l'eau jusqu'à formation d'un trouble ou floculat que l'on sépare par cen- trifugation. Si par dilution jusqu'au triple de son volume initial,il ne se produit rien, on ajuste le pH de la solution à 4,7. On élimine le trouble ou le floculat qui se ferme avec le repos au froid; ce trouble ou floculat est constitué par la substance hyperglycémiante.
La solution privée de tous les insolubles, compris entre un pH égal à 5 et un pH égal à 4,7 est mise en dialyse pendant cinq heures à 15 C. kprès dialyse et nouvelle vérification d'absence d'insoluble à ur- pH égal à 4,7 et un pH égal à 5 (insoluble qu'on élimine par centrifugation dans le cas oû il se produit)la solution ajustée à un pH égal à 4,7 re- çoit 15% de son volume dalcool absolu. Le précipité formé est séparé par centrifugation. Le liquide limpide est versé dans un mélange de 5 volumes d'alcool absolu et 3 volumes d'éther, refroidi à 0 C. Le précipité recueilli par centrifugaticn est séché dans le vide.
Ce précipité sec est redissous dans 10 fois son poids d'eau. On élimine tout insoluble se formant dans la zone de pH comprise entre 4,7 et 5,5. On dilue au double du volume et on élimine encore tout insoluble entre un pH de 4,7 et 5,5.
Le liquide refroidi à 0 C reçoit la moitié de son volume d'une solution de chlorure de lithium à 50% refroidie à 0 C, après avoir ajusté le pH à 2,7.
Le précipité est centrifugé après deux heures de repos au froid.
Il est dissous dans le minimum d'alcool à 70 refroidi à 0 C. La solution est amenée à un pH égal à 6 et est versée dans 10 volumes d'alcool absolu refroidi à 0 C. Le précipité centrifugé est séché dans le vide
On redissout ce précipité dans 10 fois son poids d'eau. Le pH de la solution est amené aux environs de 6. On met en dialyse pendant trois ou quatre heures. La solution privée'de sels est versée dans 10 volumes d'alcool absolu refroidi à 0 C. Le précipité centrifugé est trituré dans une nouvelle quantité d'alcool absolu refroidi, recentrifugé et séché dans le vide.
Par pulvérisation on obtient une poudre blanche à raison de 5 centigrammes par kg. de pancréas traité.
Les tests d'activité et de pureté pratiqués sur cet extrait purifié révèlent la présence d'une activité respiratoire de l'ordre de 10 unités au moins par 0 mg. 5 de produit, l'absence totale de vagotonine, d'insuline ainsi que de substance hyperglycémiante.
Diverses autres modifications peuvent d'ailleurs être apportées aux modes opératoires du procédé d'extraction et de purification de l'hormone pancréatique agissant sur les centres respiratoires, sans sortir du cadre de l'invention.
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The present invention relates to an extraction and purification process composed of a set of procedures leading to the production of a pancreatic hormone acting on the respiratory centers, this pancreatic hormone being completely free of insulin and vagotonin, the latter being a pancreatic hormone acting on the parasympathetic.
The process according to the present invention consists essentially of three preparation steps.
In the first mode of operation, one proceeds to the extraction of the active hormone on the respiratory centers, contained in the pancreas of beef. At the same time as this hormone are extracted insulin and vagotonin.
In the second procedure, all of the vagotonin and at the same time part of the insulin are removed from the crude extract obtained previously.
The third operating mode consists in completely eliminating the last traces of insulin and certain impurities, in particular a hyperglycemic substance.
To illustrate the invention, a non-limiting example of the process for the extraction and purification of pancreatic hormone is given below.
The first procedure, consisting in obtaining a crude extract, can be carried out according to three methods.
In the first method, beef pancreas taken from the slaughter of the animal and finely chopped in an extracting liquid composed of 95 ethyl alcohol and hydrochloric acid with a density of 1 are macerated for twenty-four hours. , 18 at the rate of eleven or twelve cm3 of acid per liter of alcohol. 1.5 liters of liquid are used per kg. of pancreas, which gives the maceration an alcoholic strength close to 50 and a pH between 3 and 4. -
After draining and pressing the maceration, the acidic alcoholic juices receive a 50% sodium acetate solution, in sufficient quantity to obtain the start of flocculation. It takes about one to four cm3 of sodium acetate per liter and the pH should be around 5. After standing for a few hours, filtered through cloth.
The clear liquids are then concentrated to 1/15 of their initial volume by vacuum distillation without exceeding the temperature of 20 C.
The concentrated liquid, cooled to 0 C receives 1/10 of its volume of chloroform cooled to 0 C and after stirring, the mixture is left to stand overnight at low temperature. The supernatant layer is collected by siphoning. Add the pH of this liquid to 2.5 and saturate with sodium chloride. The precipitate collected by centrifugation is dehydrated with alcohol and dried in vacuo.
A second method of extraction consists of treating the beef pancreas frozen at -30 ° C., as soon as the animal is slaughtered, in devices with cold vacuum drying. The desiccated pancreas are pulverized, degreased by exhaustion with trichlorethylene. Pancreas powder is stabilized with acetone. It is then left to macerate for twelve to eighteen hours in five times its weight of water cooled to 2 G. The pH of the solution is brought to 5. The liquid after filtering off the maceration is adjusted to a pH of 4 .
The mixture is left to stand for one or two hours and the precipitate formed is centrifuged.
The liquid collected by centrifugation receives a 50% sodium acetate solution in an amount sufficient to obtain the start of flocculation, which is allowed to continue for a few hours. The pH is around 5. When the precipitate begins to settle, it is filtered through a cloth. The liquid is brought to a pH equal to 2.5 by hydrochloric acid and saturated with
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..) d-'¯ '.. JI! o The precipitate which forms is centrifuged, dehydrated in absolute alcohol and dried in vacuum.
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A third procedure consists in collecting, during the preparation 1 "5i-nz-.ulin E, from beef pancreas, the mother liquors which come from the repair of insulin at its isoelectric point in the cells. pancreatic extraction liquids The pH of these mother liquors is adjusted to 2.5 and saturated with sodium chloride The precipitate collected is dried at 1 = alcohol and in vacuo.
The pancreatic substance obtained by one of these extraction methods is then subjected to purification operations which eliminate all
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talement-the vagotoni == e and the insulin that can be demonstrated in the extract by the appropriate tests.
The bzclog.ci:xes -cests which are used for the control of the progressive purification of the desired hormone, make it possible to determine the increase in respiratory activity of the extract and the total disappearance of
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activity on the parasympathetic; at the same time the electrophorse allows to see if the insulin gradually disappears during the purification.
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The other protein impurities are also removed.
Respiratory activity is measured by means of the test described below which is carried out on guinea pigs not anesthetized and not subjected to con-
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tenticn. 0n E "¯1 = inhale a mixture of air and Ga2 containing progressive doses of C02a The dose of C02 which causes an increase in the amp ::: 1:. :: ' - ::: l thoracic, a graphically recordable phenomenon, is that for which the threshold d7ex --- i + -ab4Llî + v3 of the respiratory centers is reached.
After injection into guinea pigs of purified pancreatic extract
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containing 1? 1; crmc; e re: ;; pi: 1.: aoire, the increase in thoracic amplification appears for lower doses of CO2 in the inhaled mixture, showing an increase in the chemical excitability of respiratory centers.
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At the C0ï.r ;: 'of the purification of the pancreatic extract, one can follow the er. ::: - ichis $ êmei1-: ¯.e last in respiratory hormone, because it takes weights dG plaiz. in pl '). 2 fubles of extract to increase the excitability of the centers -: éspL ##. tc.5, -ei. It is thus possible to titrate with a very high precision - * ii # 1 "aeiJm, 7th extract.? Pancreatic on the chemical excitability of respiratory esters L" 3.c.tivi't on the parasympathetic is demonstrated by the test rlu reflex ac; ï .-- cardïw: 4th in the non-anesthetized rabbit.
The experimental and statistical being having shown that 5 gamma per kg was sufficient. rabbit, by subculturing injection. of highly purified vagotonin, in order to obtain a significant and lasting increase in the "cardio-moderating effect": (n: 3G: .tif the compression of the eyeballs, it is thus, by this m2ï: .hoc1e, to verify that ' a given amount of pancreatic extract contains less than 5 gamma of vagotonizing hormone.
We found rue under certain conditions: 'the concentration and pH, the'3 .5e1 ::. heavy metals precipitate the vapor from the solutions extracted from pSLcriati; ue6 In this process, the zinc chloride salt was chosen. 1. It acts on a rather dilute solution of brat 1 pancreatic extract where it p: '2 increases the vagotonin. The quantity of zinc chloride to be employed to completely 21iIIllner the vagotonin can vary with the crude extracts to be purified. The different quantities of zinc chloride are therefore determined for a large batch of crude pancreatic extract from the long sample. taken from the l @ t of crude pancreatic extract.
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The second operating mode of the process therefore consists in first determining the quantities of salts required, then the purification of the total batch is carried out. To do this, a sample corresponding to 50 kg is taken. pancreas, it is subjected to the purification procedures described below using, for example, one cc of
20% zinc chloride.
The oculo-cardiac reflex test is then performed.
If, by injection into the rabbit of the product obtained, at a rate of 50 mg. per kg. animal, we still observe an increase in parasympathetic reflectivity, we deduce that all the vagotonitis has not been eliminated.
The purification is therefore repeated on other samples of the same weight by increasing the quantity of 20% zinc chloride solution by 2 or 3 tenths of a cubic centimeter until a purified product is obtained which is totally inactive on the parasympathetic.
5 This search by successive tests for the minimum quantity of zinc chloride necessary for the total elimination of vagotonin is essential because there is a risk, by using a large quantity of zinc chloride from the outset, which would obviously precipitate all the vagotonin. , to entrain, with the latter, part or even all of the respiratory hormone that we want to isolate.
A numerical example is given below which makes it possible to purify a batch of crude extract corresponding to several tonnes of pancreas. It is understood that the amounts of groin salts used in this purification are only valid for the batch of pancreatic extract considered.
300 g. of raw extract are dissolved in 900 cm3 of water. The pH of the solution is brought, either by sodium hydroxide or by hydrochloric acid (which are the only alkaline or acidic agents employed during the purification) to around 6. The solution is put into dialysis. overnight at a temperature of approximately 15 ° C., experience having shown that low temperature dialysis does not allow the elimination of certain substances with anti-respiratory or toxic action.
The solution deprived of salts is filtered, the volume is made up to
4 liters per distilled water and the pH is adjusted to 5. 9 cm3 of 20% zinc chloride solution are added. It is left to stand for 1/2 hour at 15 C, the; operation proved ineffective at low temperature. The pH is raised towards neutrality until a precipitate appears. It is left to stand for two hours at 15 ° C. The precipitate formed, which contains the vagotonin in the form of a vagotonin-zinc complex, is separated by centrifugation.
The solution is brought to a pH equal to 2.6 and receives sodium chloride 0 to saturation with stirring to facilitate dissolution of the salt. The precipitate which forms is centrifuged after standing for two hours at a very low temperature, below 0 C.
The centrifugation pellets are dissolved in 300 cm3 of water; the solution is brought to a pH close to 6 and subjected to dialysis during; one night at about 15 C.
The liquid deprived of salts is gradually brought to a pH equal to 2.6, observing whether there is formation of cloudiness or flocculate at a pH of between 5 and 4.7, in which case it is necessary to eliminate the insolubles formed. .
When the pH is brought back to 2.6, the solution cooled to 0 C receives 1/2 volume) of 50% lithium chloride solution cooled to 0 C. It is left to stand in the cold for two hours. The precipitate formed is collected by centrifugation, then dissolved in a minimum of 70% alcohol; the alcoholic solution is brought to a pH equal to approximately 6 and poured into 10 volumes of absolute alcohol cooled to 0 ° C. the precipitate collected by centrifugation is dried in vacuo.
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The purified extract obtained, which is of the order of 30 to 35 GB for 350 kg. pancreas treated, must no longer contain vagotonin, but it may still contain insulin detectable by electrophoresis and a hyperglycemic substance. Its activity on the respiratory centers, which is determined by the test. CO2 star the guinea pig, is of the order of 10 respiratory units per milligram of extract.
The third procedure is then carried out, consisting in removing the last traces of insulin at the same time as the other impurities present in small quantities.
The purified extract is dissolved in 10 times its weight of water. The pH of the solution is adjusted to 5. Any cloudiness or flocculate forming after standing in the cold for a few hours is removed by centrifugation. The pH of the solution, which is equal to 5, is maintained and then gradually diluted with water until a cloudiness or flocculate forms which is separated by centrifugation. If by dilution to three times its initial volume, nothing occurs, the pH of the solution is adjusted to 4.7. The cloudiness or flocculate which closes with standing in the cold is eliminated; this cloudiness or flocculate consists of the hyperglycemic substance.
The solution deprived of all insolubles, between a pH equal to 5 and a pH equal to 4.7 is put into dialysis for five hours at 15 ° C. after dialysis and new verification of the absence of insoluble matter at equal pH. at 4.7 and a pH equal to 5 (insoluble which is removed by centrifugation if it occurs), the solution adjusted to a pH equal to 4.7 receives 15% of its volume of absolute alcohol. The precipitate formed is separated by centrifugation. The clear liquid is poured into a mixture of 5 volumes of absolute alcohol and 3 volumes of ether, cooled to 0 ° C. The precipitate collected by centrifugation is dried in vacuo.
This dry precipitate is redissolved in 10 times its weight of water. Any insoluble material forming in the pH region between 4.7 and 5.5 is removed. Dilute to double the volume and further remove any insoluble matter between a pH of 4.7 and 5.5.
The liquid cooled to 0 C receives half of its volume of a 50% lithium chloride solution cooled to 0 C, after adjusting the pH to 2.7.
The precipitate is centrifuged after two hours of standing in the cold.
It is dissolved in a minimum of 70 alcohol cooled to 0 C. The solution is brought to a pH equal to 6 and is poured into 10 volumes of absolute alcohol cooled to 0 C. The centrifuged precipitate is dried in vacuum.
This precipitate is redissolved in 10 times its weight of water. The pH of the solution is brought to around 6. Dialysis is carried out for three or four hours. The solution deprived of salts is poured into 10 volumes of absolute alcohol cooled to 0 ° C. The centrifuged precipitate is triturated in a new quantity of cooled absolute alcohol, recentrifuged and dried in vacuo.
By spraying, a white powder is obtained at a rate of 5 centigrams per kg. pancreas treated.
The activity and purity tests carried out on this purified extract reveal the presence of a respiratory activity of the order of at least 10 units per 0 mg. 5 of product, the total absence of vagotonin, insulin and hyperglycemic substance.
Various other modifications can moreover be made to the operating methods of the method for extracting and purifying the pancreatic hormone acting on the respiratory centers, without departing from the scope of the invention.