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PERFECTIONNEMENTS A DES AGENTS THERAPEUTIQUES ET A LEUR PREPARATION.
La présente invention est relative à des compositions et des composés biologiquement actifs. Elle concerne, en particulier, des mélanges et des produits de réaction formés de streptomycine et de composés à ba- se d'isonicotinyl-hydrazine (isoniazide)o
La streptomycine s'est révélée être un puissant agent antagonis- te pour les mycobactéries. On a également constaté que l'isonicotinyl-hydra- zine (également appelée "isoniazinde") et certains composés chimiquement appa- rentés, tels que son dérivé isopropylique, possèdent aussi une telle activité.
Toutefois,ces matières tendent à produire certaines réactions toxiques, lors d'une administration prolongée ou lors de l'administration de doses particu- lièrement élevéeso Dans le cas de la streptomycine, le système nerveux peut être affecté, pendant un traitement prolongé. D'un autre côté, si des doses élevées d'isonicotinyl-hydrazine sont administrées,, il se produit fréquemment des spasmes, ou convulsions, de l'hyperréflexie, etc...
uh facteur spécia- lement désavantageux réside dans le fait que chacun'de ces types de composés peut donner lieu à la formation de microorganismes résistants,
On a constaté à présent que des compositions formées d'un anti- biotique à base de streptomycine et d9isoniazide possèdent une activité par- ticulièrement efficace contre les mycobactéries et présentent, lorsqu'elles sont utilisées de manière convenable, des avantages définis et inattendus, par rapport aux résultats obtenus par remploi de l'un ou 1-'autre des compo- sés individuels.¯ Dans le présent mémoire, l'expression "antibiotique à base de streptomycine" désigne non seulement 1'antibiotique de base, mais égale- ment ses sels, tels que sulfate, chlorhydrate, sel double de chlorure calci- que, etc...
ainsi que les dérivés, tels que la dihydrostreptomycine, dont Inactivité est comparable à celle de l'antibiotique. Le terme "isoniazide", tel qu'il est employé,dans le présent mémoire, englobe également les sels de ce produit, tels que acétate, sulfate, chlorhydrate, etc... de même que la base.
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On a constaté que les compositions contenant d'environ o,5 à envi- ron 2 moles d'isoniazide par mole de streptomycine conviennent particulièrement aux buts décrits plus haut. Ces matières peuvent être mélangées l'une à l'autre sous la forme de poudres ou de solides cristallins et le produit peut alors être dissous ou mis en suspension dans un milieu approprié pour l'administra- tion par la voie buccale ou par les voies parentérales. La voie parentérale est la plus favorable,car l'absorption de composés du type de la streptomy- cine par le tractus intestinal n'est pas suffisamment élevée pour donner une teneur généralement acceptable de l'antibiotique dans le sang, pour la théra- peutique de la tuberculose. Divers milieux injectables stériles peuvent être utilisés pour les présentes compositions.
Parmi ces milieux, on peut citer non seulement l'eau distillée, les solutions salines et les solutions de glucose, mais également des milieux non aqueux, tels que l'huile de sésame, etc.. En général, on a constaté que la dose journalière convenable pour un adulte est celle d'une composi- tion contenant 1 gramme de streptomycine comme base. Il peut être souhai- table d'administrer la composition moins fréquemment que journellement, mais ceci peut être déterminé par l'état du patient, par la gravité de l'infec- tion, etc...
On a constaté également que certaine nouve aux composés chimiques peuvent être préparés par la réaction d'isonicotinyl-hydrazine ou d'un déri- vé actif de ce composé avec de la streptomycine, un de ses sels ou une autre forme biologiquement active possédant un groupe aldéhydique disponible pour la réaction. Le groupe aldéhydique de la molécule de streptomycine se combi- ne à un des atomes d'azote hydraziniques de la molécule d'isoniazide de ma- nière à former une nouvelle classe de produits de condensation, qui sont ob- tenus avec un bon rendement. Ces produits peuvent être obtenus sous forme de bases ou de sels avec un ou plusieurs acides inorganiques ou organiques différents. La forme basique peut subséquemment être convertie en un sel ou un produit initial du type sel peut subséquemment être, si on le désire, transformé en la base libre.
Ainsi, on peut préparer le sulfate, le chlor- hydrate, le phosphate et d'autres sels de cette nature. De plus, on peut obtenir des sels contenant diverses proportions d'un ou plusieurs acides.
Ainsi, on peut préparer des composés contenant une molécule de la base ainsi que trois équivalents d'acide sulfurique. Un trichlorhydrate ou un chlorhy- drate comportant une plus faible proportion de cet acide inorganique peut être obtenu.
Les composés solides, qui peuvent être obtenus par le procédé suivant la présente invention, possèdent des avantages très marquants par rapport à d'autres agents antituberculeux. Ces composés sont stables.
Ils ont une composition très définie et constituent une matière antituber- culeuse hautement active en quantités contrôlées. De plus, les produits solides, en particulier sous forme cristalline, possèdent des avantages -marquants, en ce qui concerne la facilité avec laquelle on peut en prépa- rer des solutions à administrer par la voie parentérale. Ainsi, si on pré- pare un mélange de sulfate de streptomycine et d'isoniazide en proportions moléculaires, on constate qu'un tel mélange se dissout lentement. Si une solution claire n'est pas obtenue avant d'aspirer la matière dans une serin- gue hypodermique, l'aiguille hypodermique risque de se boucher ou bien de grosses particules solides risquent d'être injectées dans le muscle, où elles peuvent provoquer de l'irritation.
Par contre. les produits de la présente invention, tels que le sulfate de streptomycylidène-isonicotinyl-hydrazine, sont beaucoup plus aisément solubles dans l'eau. Lors de l'addition du di- luant au composé cristallin solide, une solution claire et facile à adminis- trer se forme en très peu de temps et avec un minimum d'agitation. Ceci est des plus avantageux pour les médecins et autres personnes, qui doivent exécuter des nombres élevés d'injections à des patients tuberculeux, par exemple dans les hôpitaux.
Par ailleurs, les composés solides, en particu- lier sous forme cristalline, semblent posséder une meilleure stabilité que celle que possèdent les mélanges des deux composants utilisés pour la prépa- ration des composéso
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Les composés cristallins, préparés par le présent procédé, possè- dent un degré de pureté élevée Ainsi, ces produits peuvent être préparés au départ de streptomycine possèdant un moindre degré de pureté et, par cris- tallisation des nouveaux composés, il se forme un produit de pureté accrue .dans une mesure appréciable. Ainsi, les produits de la présente Invention possè- dent une valeur importante, comme moyens grâce auxquels la streptomycine peut être purifiée et isolée sous la forme de dérivés nouveaux et précieux.
Des solutions brutes de streptomycine, obtenues par divers stades de purifica- tion préliminaires, tels que adsorption sur carbone et élution, adsorption
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sur produits d-96change ionique et élution, peuvent être concentrées jusqu'à présenter la teneur voulue en streptomycine, par exemple par concentration sous vide. La solution peut alors être traitée par le procédé suivant la pré- sente inventionde manière à former les nouveaux composés sous forme solide purifiée, souvent sous forme cristalline. Ainsi, le procédé suivant la pré- sente invention peut être utilisé pour transformer le sel double de chlorure calcique du chlorhydrate de streptomycine (qui est utilisé industriellement comme intermédiaire dans la purification de l'antibiotique) en.streptomy-
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cylidène-isonïcotinyl-bydrazine sous forme hautement purifiée.
Ceci supprime plusieurs stades opératoires du procédé, qui sont par ailleurs nécessaires.
Le composé solide purifié peut être retransformé en sels de streptomycine sim- ples, par exemple en sulfate, si on le désire.
Le produit primaire, préparé selon la présente invention, est
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connu sous la dénomination de "streptomycylidène-isonicotinyl-hydrazine" et cet- te expression sera employée, dans le présent mémoire, pour désigner non seule- ment la base, mais également les divers sels, qui peuvent être formés à par- tir de ce produit. Ces produits peuvent être préparés à partir de strepto-
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mycine ou de divers sels de streptomycine, avec de l'ïson.cotinyl-hydrazine ou ses divers sels. Les termes "streptomycine!! et "isonicotinyl-hydrazine" sont utilisés, dans la présente description et dans les revendications ci-an- nexées, pour désigner l'une ou l'autre de ces diverses formes actives au dé- rivés, sauf indication contraire.
La préparation des produits suivant la présente invention peut se faire, soit dans des systèmes aqueux, soit dans divers solvants organi- ques, c'est-à-dire dans des solvants, dans lesquels les réactifs sont au moins partiellement solubles et qui ne réagissent pas avec ces réactifs ou avec les produits de la réaction. Le solvant doit également être raisonna- blement volatil ou soluble dans un solvant volatil, de façon à pouvoir¯être éliminé du produit. Parmi les solvants, les alcools aliphatiques inférieurs,
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c'est-à-- dire les alcools contenant de 1 à 4 atomes de carbone dans leurs chal- nes droites, conviennent particulièrement. Si les produits de la présente in- vention sont préparés dans 1'eau, il est souhaitable d'utiliser des concen- trations assez élevées des réactifs.
On a constaté qu'un état d'équilibre
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existe entre la streptomycine ou ses sels, l9ïsonicotïnyl-hydrazïne ou ses sels et la streptomycy7ïdèneïson.cotinylmhydrazïne ou ses sels en solution aqueu- se. Les proportions des deux réactifs et du produit dépendent de la concen- tration de ces matières, de la température du mélange,de la proportion des réactifs l'un par rapport à l'autre et d'autres"facteurso En général, plus la concentration des réactifs est élevée, plus il se forme de streptomycyli-
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dène-lsoniootinyl-hydrazine. En général, on préfère utiliser des proportions sensiblement équimoléculaires d'isoniazide et de streptomycine, à une concen- tration totale dans Peau d'au moins 20 % en poids, afin de former une quanti- té appréciable du produit de réaction.
Des concentrations plus élevées peu- vent être souhaitables dans la préparation à grande échelle des produits.
Non seulement, on peut utiliser de l'eau comme milieu de réaction, mais on peut aussi employer un mélange d'eau et de solvants organiques inertes,
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miscibles à l'eau, tels que méthanol, éthanol, isopropanol, etc. Des solvants réactifs, tels que 19acétone, sont exclus, car ils tendraient à se condenser avec 1'isoniazide ou à retarder la formation des nouveaux produits suivant
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l9invntiono
On préfère opérer la condensation dans des conditions légèrement acides à basiques. Le pH du mélange réactionnel doit être d'au moins 5 environ et ne doit pas excéder 10,5. Pendant la réaction, on peut appliquer de la cha-
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leur pour accélérer la condensation des deux molécule s. Une température comprise entre 30 et 1000 C environ est satisfaisante.
Un chauffage pro- longé du produit m'est pas souhaitable, bien que ces composés soient très stables.
Lorsqu'un solvant organique est employé comme milieu de réaction, il convient de conduire la réaction dans des conditiors telles que l'eau, qui se forme comme sous-produit de la condensation, soit chassée par distilla- tion du mélange réactionnel. Cette mesure contribue à accélérer la forma- tion d'un pourcentage élevé du produit de condensation désiré. Le produit peut exister sous forme hydratée, sous forme d'une base de Schiff, ou sous forme d'un mélange de ces deux types. Si on emploie un alcool aliphatique inférieur, comme solvant pour la réaction, l'eau peut être chassée par dis- tillation avec une partie du solvant, en chauffant le mélange réactionnel dans un appareil approprié. Ou bien, un solvant, capable d'entraîner de grandes quantités d'eau pendant sa distillation, peut être ajouté au mélange réactionnel.
Le benzène, le toluène et le xylène constituent des exemples d'un tel solvant.
Lorsqu'on emploie de 1-'eau ou un mélange d'eau et d'un solvant organique pour le présent procédé, l'équilibre est atteint à température am- biante, en un temps relativement court. En général, dans des solutions plus diluées, cet équilibre est atteint au bout de 3 heures environ au maximum.
Des températures¯élevées peuvent être appliquées pour que. l'équilibre soit atteint plus rapidement en milieu aqueux ou dans des solvants. Si un solvant, tel que le méthanol, est utilisé à la température de reflux, l'équilibre est atteint en une demie-heure au moins. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour suivre le déroulement de la réaction, notamment la mesure du spectre d'ab- sorption en ultra-violet ou l'isolement du produit formé à partir d'échantil- lons du mélange réactionnel, prélevés à des intervalles-réguliers.
Dans les systèmes aqueux, la présence de concentrations élevées en isoniazide et en streptomycine contribue à la formation du produit de con- densation. Un excès de l'un ou l'autre réactif par rapport à la proportion moléculaire provoquera un déplacement de l'équilibre vers la formation du com- posé. Etant donné que l'isoniazide est un produit moins coûteux que l'anti- biotique, il peut être préférable d'utiliser un excès d'isoniazide. En exé- cutant le procédé dans des conditions propres à permettre la séparation du pro- duit decondensation solide, l'équilibre est déplacé et une plus grande quan- tité de produit est formée. De cette manière, il est possible de convertir sensiblement une proportion moléculaire entière de chacun des réactifs, en pro- duit de condensation.
Le produit, qui se sépare, possède généralement une pureté supérieure à celle de la streptomycine employée pour la réaction et le produit solide présente une valeur appréciable,, à cause de sa plus grande stabilisé, de sa pureté, de la facilité avec laquelle il est soluble dans l'eau et de la proportion constante d'agent antituberculeux actif y contenu.
Le produit formé pendant ces réactions peut être isolé de diver- ses manières. Si on emploie un alcool aliphatique inférieur comme milieu de réaction, des sels, tels que le chlorhydrate, du nouveau composé se séparent, à condition qu'on fasse usage d'une solution suffisamment concentrée. Ceci peut être facilité par l'application d'une faible température, par exemple d'environ 0 C, lorsque la réaction est terminée. Ou bien, un sel du produit de réaction, possèdant une faible solubilité dans le milieu réactionnel, peut être formé et séparé de la solution; ainsi, le sulfate est relativement peu soluble dans le méthanol et peut aisément être séparé de ce milieu par addi- tion d'un sulfate soluble dans le méthanol, tel que le sulfate de triéthylami- ne, au mélange réactionnel.
D'autres solvants peuvent être utilisés à cette fin. Si la réaction est conduite en solution aqueuse, l'eau peut être élimi- née, par exemple par séchage à partir de l'état gelé, ou bien un non+.solvant pour le produit formé peut être ajouté au mélange réactionnel, de manière à pré- cipiter le produit. Ainsi, si une solution aqueuse concentrée de sulfate de streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine est préparée, l'addition de méthanol provoquera la séparation du produit. Ces sels peuvent souvent être obtenus sous forme cristalline.
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On a constaté que les composés décrits dans le présent mémoire conviennent particulièrement pour inhiber la croissance de mycobactéries.
Ces composés possèdent une activité et des propriétés, qui ne pouvaient être déduites de l'activité et des propriétés connues des matières à partir des- quelles ils sont préparés, à savoir la streptomycine et l'isonicotinyl-hydra- zinea En premier lieu, on a constaté que des microorganismes devenus résis- tants à la streptomycine ou à l'isonicotinyl-hydrazine n'offrent plus la même résistance au* composés de la présente invention, En second lieu, les compo- .sés, qui ont été décrits dans le présent mémoire, constituent des agents par- ticulièrement appropriés pour l'inhibition des mycobactéries.
Les composés peuvent être administrés par la voie buccale, sous forme de tablettes, de cap- dules, d'élixirs ou de solutions de types divers, ou par injection, soit par la voie intramusculaire, soit par la voie sous-cutanée. Le sulfate de strep- tomyclidène-isonicotinyl-hydrazine présente un intérêt particulier et peut être mis en flacons sous forme stérile et sèche. L'addition d'eau stérile pro- cure une solution aisément injectable pour le traitement de la tuberculose.
L'emploi de composés contenant l'équivalent d'un gramme de streptomycine, par jour, pour un adulte s'est avéré satisfaisant. Les doses appropriées peu- vent être déterminées par un minimum d'expérimentation sur le sujet particu- lier à traiter. En général, des doses journalières de 5 à 30 mg. environ par kg de poids du sujet doivent être administrées.
En particulier, les compositions suivant la présente invention fournissent un procédé très commode pour le traitement de la tuberculose, grâce au fait que des proportions déterminées et exactes de streptomycine et d'isoniazide sont combinées sous une forme simple, appropriée et facile à administrer, fournissant avec chaque gramme de streptomycine (dose journa- lière habituelle) une proportion d'isoniazide, dont 2'activité est comparable à celle que l'on recommande souvent, lorsque ce médicament est utilisé seul.
En plus de l'action thérapeutique accrue et du retardement de l'apparition de souches résistances de mycobactéries, il se produit une perte minime du sens de Inouïe. Des essais cliniques ont montré que les compositions sui- vant la présente invention conviennent, dans une mesure appréciable, pour le traitement de la tuberculose.
Les exemples suivants ne sont donnés qu'à titre d'illustration et ne doivent pas être considérés comme les seules formes d'exécution de l'in- vention. -Il va de soi que l'invention n'est limitée que par la portée des revendications terminant le présent mémoire.
EXEMPLE 1.
Un mélange de 15 gr. de chlorhydrate de streptomycine et de 3,0 gr d'isonicotinyl-hydrazine dans 100 cc de méthanol est chauffé sous reflux pendant 4 1/2 heures. Le mélange est alors laissé au repos pendant 2 1/2 jours à température ambiante. Le mélange de couleur ambre est filtré et le filtrat est dilué jusqu'à un volume de 150 cc à l'aide de méthanol Un chromatogramme sur papier de la solution révèle la présence du chlorhy- drate désiré de streptomycylidène-isonicotinyl-hydrazine. La solution est placée dans une glacière et des cristaux du produit se séparent lentement de la solution. Le produit présente certaines différences par rapport à la streptomycine ou à l'isonicotinyl-hydrazine, dans le spectre infra-rouge, en particulier à 6,4 u.
Le produit fond en se décomposant à environ 215 C et se révèle biologiquement actif. .
Analyse calculé pour C27H47N10012C13:
C = 40,0%; H = 5,85% N = 17,29%; Cl = 13, 13%. trouvé C = 40,01 % H = 5,90%; N = 17,19%;
C1 = 13, 09%.
EXEMPLE II.
Un mélange de 20 gr de chlorhydrate de streptomycine et de 32 gr d'isonicotinyl-hydrazine dans 350 cc de méthanol sec est chauffé au bain-marie à 70 - 75 C, pendant 1 heure. Le mélange est refroidi et l'excès d'isonico-
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tinyl-hydrazine est filtrée Le filtrat est traité par une solution méthanoli- que de sulfate de triéthylamine. Le produit désiré, à savoir le sulfate de streptomycylidène-isonicotinyl-hydrazine, précipite. Il est filtré, lavé au méthanol et séché dans un dessicateur sur chlorure de calcium. L'activité microbiologique de ce composé, titrée après hydrolyse préliminaire, en utili- sant du Klebsiella pneumoniae, dans un essai turbidimétrique, est d'environ 600 - 630 meg/mg.
L'analyse révèle qu'il s'agit bien du produit désiré.
EXEMPLE III.
Des solutions aqueuses sont préparées à partir de sulfate de streptomycine et d'isoniazide contenant diverses concentrations de ces réac- tifs. Les solutions sont laissées au repos à température ambiante et sont analysées à des intervalles périodiques, afin de déterminer si 1'équilibre a été atteint. Le tableau suivant indique la concentration en streptomycyli- dène-isonicotinyl-hydrazine, qui devrait être atteinte, si la réaction était terminée. Dans la seconde colonne de ce tableau figure le degré d'avancement de la réaction, c'est-à-dire le degré d'achèvement atteint à l'équilibre. On notera qu'à une concentration calculée pour fournir un gramme de streptomycy- lidène-isonicotinyl-hydrazine, par 100 cc de solution, la réaction est ache- vée à raison de 78 %.
En d'autres termes, 0,78 gr du composé se sont formés et le restant des réactifs est présent dans la solution sous forme de sulfate de streptomycine libre et d'isoniazide libre. Si une partie du produit for- mé est séparée de la solution, une quantité supplémentaire des matières de départ entrera en réaction, jusqu'à ce que l'équilibre soit rétabli, sensible- ment au même niveau. Ce tableau indique que, même en utilisant des solutions très diluées, notamment des solutions d'un gramme par 100 ce, la réaction a progressé relativement loin dans le sens de la formation du nouveau composé, au moment où est atteint l'équilibre.
Il est évidemment plus pratique d'uti- liser des concentrations appréciablement plus élevées, lors de la préparation du produit sur une grande échelle, étant donné que le point d'équilibre se trouve plus loin dans le sens de la formation du produit plutôt que des réac- tifs et que l'équilibre est atteint en un temps beaucoup plus court.
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Concentration <SEP> calculée <SEP> de <SEP> % <SEP> de <SEP> SIH <SEP> formée <SEP> à
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<tb> SIH <SEP> * <SEP> Réaction <SEP> terminée <SEP> l'équilibre <SEP> . <SEP>
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1,000 <SEP> g/100 <SEP> ml. <SEP> 78
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<tb> 0,500 <SEP> 70
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<tb>
<tb> 0,2500 <SEP> 59
<tb>
<tb>
<tb> 0,100 <SEP> 50
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<tb>
<tb> 0,050 <SEP> 41
<tb>
<tb>
<tb> 0,025 <SEP> 27
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* Streptomycylidène-isonicotinyl-hydrazene.
La constante d'équilibre calculée dans cet essai, est de l'ordre de 1400.
EXEMPLE IV.
On dissout le sel double de chlorure de calcium et de trichlorhy- drate de streptomycine dans 160 cc d'eau contenant 8,5 gr. d'isoniazide. Le mélange est laissé au repos à température ambiante pendant une 1/2 heure.
85 cc d'une solution de sulfate de triéthylamine dans du méthanol (1,98 molai- re en ions sulfate et à un pH de 5) sont ajoutés en agitant. Une partie du calcium précipite sous forme de sulfate de calcium. La précipitation du sul- fate de calcium est achevée, par l'addition graduelle de 255 cc de méthanol, en l'espace d'une heure. Le mélange est agité pendant toute l'addition. Le sulfate de calcium précipité est filtré, lavé avec une petite quantité d'un mélange de 2 Volumes de solution méthanolique de sulfate de triéthylamine, 2 volumes d'eau et 3 volumes de méthanol. Le filtrat est traité avec 100 cc supplémentaires de méthanol ou avec une quantité supplémentaire de cet alcool,
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pour qu'un léger trouble sa forme dans la solution.
Le mélange est laissé au repos à température ambiante pendant plusieurs heures, de manière à amor- cer la formation de cristaux, 2 litres de méthanol sont alors ajoutés gra- duellement en agitant et le sesquisulfate cristallin blanc du produit est filtrée lavé au méthanol et séché sous vide. On obtient un rendement de
36 gr (75%). Ce produit fond en se décomposant à environ 230 C.
Analyse calculé pour : C27H44N10012.3/2H2SO4:
C = 38,25%; H = 5559%; N = 16e52%; S = 5,67%. trouvé s C = 38,04%; H = 5,74%, N = 16,22%
S = 5,63 %.
Il est à noter que les sels cristallins de streptomycylidène- isonicotinyl-hydrazine, en particulier le sulfate et le chlorhydrate, cons- tituent des formes très utiles de l'agent chimiothérapeutique. Ces sels peuvent 8tre obtenus sous forme cristalline à pureté élevée et constituent des agents antituberculeux très efficaces, permettant le traitement de la maladie à l'aide d'une matière de composition constante et d'efficacité con- nue.
EXEMPLE V.
De la streptomycine est récupérée par adsorption sur une résine d'échange ionique du type acide carboxylique, en effectuant l'élution au moyen d'acide chlorhydrique dilué. La solution chlorhydrique est concentrée et Peau est remplacée par du méthanol. La matière insoluble est filtrée et le concentrat méthanolique brut de chlorhydrate de streptomycine est en- suite évaporé jusqu'à siccité. 21,3 gr du produit brut (490 mcg/mg) sont chauffés dans 150 cc de méthanol. 4,26 gr de charbon décolorant sont ajou- tés et la solution est agitée pendant une demi-heure avant filtration. La solution filtrée est traitée avec 3 gr d'isoniazide et le mélange est chauf- fé au reflux pendant 20 minutes.
La solution est refroidie, ensemencée avec une petite quantité de cristaux de chlorhydrate de streptomycylidène-isonico- tinyl-hydrazine et le mélange est laissé au repos, pendant une nuit, à tempé- rature ambiante. Le lendemain matin, le produit cristallin est filtré, lavé et séché. Il pèse 7,49 gr. Le produit est beaucoup plus pur, sur une base pondérale, que le chlorhydrate de streptomycine brut utilisé pour sa prépara- tiono
EXEMPLE VI.
Un bouillon de fermentation de streptomycine est filtré et l'an- tibiotique est adsorbé sur une résine d'échange ionique du type acide carbo- xylique. Le chlorhydrate de streptomycine est élue au moyen d'acide chlorhy- drique dilué et, après ajustement du pH, la solution est séchée par pulvéri- sationo 110,6 gr de cette matière, titrant 230 mcg/mg., sont agités dans 200 cc de méthanol bouillant. Le mélange est refroidi et le sel inorganique insoluble est filtré. La solution méthanolique est concentrée jusque à la moitié de son volume et une nouvelle fraction de sel précipité est filtrée.
6,0 gr d'isoniazide sont ajoutés à la solution de streptomycine et 8,5 g de charbon décolorant sont ajoutés. Après agitation du mélange pendant une de- mi-heure, ce mélange est filtré, ensemencé avec des cristaux de chlorhydrate de streptomycylidène-isonicotinyl-hydrazine et emmagasiné dans une glacière.
On obtient une première récolte de produit cristallin pesant 14,6 gr. Ce produit présente une pureté beaucoup plus élevée que la streptomycine brute, à partir de laquelle il a été préparé.
Les exemples suivants sont relatifs à la formation de mélanges ou de compositions, plutôt qu'à la formation de produits de réaction.
EXEMPLE VII.
100 gr. de sulfate de streptomycine stérile, sous forme sèche et finement divisée, sont mélangés à 50 gr d'isoniazide stérile dans un récipient agité de manière appropriée. Le mélange est malaxé vigoureuse- ment, de manière à obtenir un produit uniforme. La composition est mise
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dans de petits flacons en verre, dans des conditions stériles. Les flacons sent bouchés et scellés. Chaque flacon contient l'équivalent de 1,0 gr de streptomycine base. L'administration journalière du contenu d'un flacon de la composition à des adultes, sous la forme d'une solution aqueuse sté- rile, s'est révélée être très satisfaisante pour'le traitement de la tuber- culo se.
EXEMPLE VIII.
200 gr. de dihydrostreptomycine, sous forme de sulfate cristal- lin stérile, sont mélangés à 50 gr d'isoniazide stérile. Le mélange est malaxé dans un appareil stérile, jusqu'à obtenir un produit finement divisé et complètement uniforme. Des portions de la matière obtenue sont placées, dans des conditions stériles, dans de petits flacons en verre. Les flacons sont bouchés et scellés. L'utilisation de ce produit par injection intramus- culaire, après l'addition d'eau, s'est révélée hautement efficace dans le traitement de la tuberculose.
REVENDICATIONS.
1. - Procédé, dans lequel on condense, au sein d'un solvant, de la streptomycine et de l'isonicotinyl-hydrazine et on sépare le produit de condensation sous forme solide.
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IMPROVEMENTS TO THERAPEUTIC AGENTS AND THEIR PREPARATION.
The present invention relates to biologically active compositions and compounds. In particular, it relates to mixtures and reaction products formed from streptomycin and compounds based on isonicotinyl-hydrazine (isoniazid) o
Streptomycin has been shown to be a potent antagonist for mycobacteria. It has also been found that isonicotinyl hydrazine (also called "isoniazind") and certain chemically related compounds, such as its isopropyl derivative, also possess such activity.
However, these materials tend to produce certain toxic reactions, upon prolonged administration or upon administration of particularly high doses. In the case of streptomycin, the nervous system may be affected during prolonged treatment. On the other hand, if high doses of isonicotinyl hydrazine are administered, spasms, or convulsions, hyperreflexia, etc. frequently occur.
A particularly disadvantageous factor is that each of these types of compounds can give rise to the formation of resistant microorganisms,
It has now been found that compositions of an antibiotic based on streptomycin and d9isoniazid possess particularly effective activity against mycobacteria and, when properly used, exhibit definite and unexpected advantages, such as: With respect to the results obtained by re-employing one or the other of the individual compounds. In the present specification, the expression "streptomycin-based antibiotic" refers not only to the basic antibiotic, but also to the basic antibiotic. its salts, such as sulphate, hydrochloride, double salt of calcium chloride, etc.
as well as derivatives, such as dihydrostreptomycin, whose inactivity is comparable to that of the antibiotic. The term "isoniazid" as used herein also encompasses salts of this product such as acetate, sulfate, hydrochloride, etc., as well as the base.
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Compositions containing from about 0.5 to about 2 moles of isoniazid per mole of streptomycin have been found to be particularly suitable for the purposes described above. These materials can be mixed together in the form of powders or crystalline solids and the product can then be dissolved or suspended in a medium suitable for buccal or intravenous administration. parenteral. The parenteral route is the most favorable because the absorption of streptomycin-like compounds from the intestinal tract is not sufficiently high to give a generally acceptable level of the antibiotic in the blood for therapeutics. tuberculosis. A variety of sterile injectable media can be used for the present compositions.
Among these media, there may be mentioned not only distilled water, saline solutions and glucose solutions, but also non-aqueous media, such as sesame oil, etc. In general, it has been found that the dose suitable daily for an adult is that of a composition containing 1 gram of streptomycin as a base. It may be desirable to administer the composition less frequently than daily, but this may be determined by the condition of the patient, the severity of the infection, etc.
It has also been found that some new chemical compounds can be prepared by the reaction of isonicotinyl-hydrazine or an active derivative of this compound with streptomycin, a salt thereof or another biologically active form having a group. aldehyde available for reaction. The aldehyde group of the streptomycin molecule combines with one of the hydrazine nitrogen atoms of the isoniazid molecule to form a new class of condensation products, which are obtained in good yield. These products can be obtained in the form of bases or of salts with one or more different inorganic or organic acids. The basic form can subsequently be converted to a salt, or an initial salt-like product can subsequently be converted to the free base, if desired.
Thus, the sulfate, hydrochloride, phosphate and other salts of this nature can be prepared. In addition, it is possible to obtain salts containing various proportions of one or more acids.
Thus, one can prepare compounds containing one molecule of the base as well as three equivalents of sulfuric acid. A trihydrochloride or a hydrochloride comprising a smaller proportion of this inorganic acid can be obtained.
The solid compounds which can be obtained by the process according to the present invention have very marked advantages over other anti-tuberculosis agents. These compounds are stable.
They have a very defined composition and constitute a highly active anti-tuberculosis material in controlled amounts. In addition, solid products, particularly in crystalline form, have significant advantages with regard to the ease with which solutions can be prepared for parenteral administration. Thus, if a mixture of streptomycin sulfate and isoniazid is prepared in molecular proportions, it is found that such a mixture dissolves slowly. If a clear solution is not obtained before drawing the material into a hypodermic syringe, the hypodermic needle may become blocked or large solid particles may be injected into the muscle, where they may cause muscle damage. irritation.
On the other hand. the products of the present invention, such as streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine sulfate, are much more readily soluble in water. On addition of the diluent to the solid crystalline compound, a clear and easy to administer solution will form in a very short time and with a minimum of agitation. This is most beneficial for physicians and others who have to perform high numbers of injections to tuberculosis patients, for example in hospitals.
On the other hand, the solid compounds, in particular in crystalline form, seem to possess a better stability than that possessed by the mixtures of the two components used for the preparation of the compounds.
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The crystalline compounds, prepared by the present process, have a high degree of purity. Thus, these products can be prepared from streptomycin having a lower degree of purity and, by crystallization of the new compounds, a product is formed. of increased purity to an appreciable extent. Thus, the products of the present invention are of great value as a means by which streptomycin can be purified and isolated in the form of new and valuable derivatives.
Crude solutions of streptomycin, obtained by various preliminary purification stages, such as carbon adsorption and elution, adsorption
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on ionic exchange and elution products, can be concentrated until the desired streptomycin content is present, for example by concentration in vacuo. The solution can then be treated by the process according to the present invention so as to form the new compounds in purified solid form, often in crystalline form. Thus, the process according to the present invention can be used to convert the calcium chloride double salt of streptomycin hydrochloride (which is used industrially as an intermediate in the purification of the antibiotic) into. Streptomy-
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cylidene-isonicotinyl-bydrazine in highly purified form.
This eliminates several operating stages of the process, which are otherwise necessary.
The purified solid compound can be converted back to simple streptomycin salts, eg, sulfate, if desired.
The primary product, prepared according to the present invention, is
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known under the name of "streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine" and this expression will be used, in the present specification, to designate not only the base, but also the various salts, which can be formed therefrom. product. These products can be prepared from strepto-
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mycin or various salts of streptomycin, with ison, cotinyl-hydrazine or its various salts. The terms "streptomycin !! and" isonicotinyl-hydrazine "are used, in the present description and in the appended claims, to denote any of these various derivative active forms, unless otherwise indicated. opposite.
The preparation of the products according to the present invention can be carried out either in aqueous systems or in various organic solvents, that is to say in solvents, in which the reactants are at least partially soluble and which do not react. not with these reagents or with the products of the reaction. The solvent should also be reasonably volatile or soluble in a volatile solvent, so that it can be removed from the product. Among the solvents, lower aliphatic alcohols,
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that is to say alcohols containing from 1 to 4 carbon atoms in their straight chains, are particularly suitable. If the products of the present invention are prepared in water, it is desirable to use fairly high concentrations of the reactants.
It was found that a state of equilibrium
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exists between streptomycin or its salts, l9sonicotinyl-hydrazine or its salts and streptomycy7ideneïson.cotinylmhydrazine or its salts in aqueous solution. The proportions of the two reactants and the product depend on the concentration of these materials, the temperature of the mixture, the ratio of the reactants to each other and other "factors. In general, the higher the concentration. of reagents, the more streptomycyli-
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dene-lsoniootinyl-hydrazine. In general, it is preferred to use substantially equimolecular proportions of isoniazid and streptomycin, at a total concentration in water of at least 20% by weight, in order to form an appreciable amount of the reaction product.
Higher concentrations may be desirable in the large scale preparation of the products.
Not only can water be used as the reaction medium, but a mixture of water and inert organic solvents can also be used,
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miscible with water, such as methanol, ethanol, isopropanol, etc. Reactive solvents, such as acetone, are excluded, as they would tend to condense with isoniazid or delay the formation of new products following.
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l9invntiono
It is preferred to carry out the condensation under slightly acidic to basic conditions. The pH of the reaction mixture should be at least about 5 and should not exceed 10.5. During the reaction, cha-
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their to accelerate the condensation of the two molecules. A temperature of between 30 and 1000 C approximately is satisfactory.
Prolonged heating of the product is undesirable to me, although these compounds are very stable.
When an organic solvent is employed as the reaction medium, the reaction should be carried out under conditions such as water, which forms as a by-product of the condensation, is distilled off from the reaction mixture. This measure helps to accelerate the formation of a high percentage of the desired condensation product. The product can exist in hydrated form, in the form of a Schiff's base, or in the form of a mixture of these two types. If a lower aliphatic alcohol is employed as the solvent for the reaction, the water can be distilled off with part of the solvent, heating the reaction mixture in a suitable apparatus. Or, a solvent, capable of entraining large amounts of water during its distillation, can be added to the reaction mixture.
Examples of such a solvent are benzene, toluene and xylene.
When water or a mixture of water and an organic solvent is employed for the present process, equilibrium is reached at room temperature in a relatively short time. In general, in more dilute solutions, this equilibrium is reached after about 3 hours at most.
High temperatures can be applied for that. equilibrium is reached more quickly in aqueous medium or in solvents. If a solvent, such as methanol, is used at reflux temperature, equilibrium is reached in at least half an hour. Various methods can be used to follow the progress of the reaction, including measuring the absorption spectrum in ultraviolet light or isolating the product formed from samples of the reaction mixture taken at intervals. regular.
In aqueous systems, the presence of high concentrations of isoniazid and streptomycin contributes to the formation of the condensation product. An excess of either reactant over the molecular proportion will cause the equilibrium to shift towards compound formation. Since isoniazid is less expensive than the antibiotic, it may be preferable to use an excess of isoniazid. By carrying out the process under conditions such as to allow the separation of the solid condensate product, the equilibrium is shifted and more product is formed. In this way, it is possible to convert substantially an entire molecular proportion of each of the reactants into the condensation product.
The product which separates generally has a higher purity than the streptomycin used for the reaction and the solid product is of appreciable value because of its greater stabilization, its purity, the ease with which it is processed. soluble in water and the constant proportion of active anti-tuberculosis agent contained therein.
The product formed during these reactions can be isolated in a number of ways. If a lower aliphatic alcohol is used as the reaction medium, salts, such as the hydrochloride, of the new compound will separate, provided a sufficiently concentrated solution is used. This can be facilitated by applying a low temperature, for example about 0 C, when the reaction is complete. Or, a salt of the reaction product, having low solubility in the reaction medium, can be formed and separated from the solution; thus, the sulfate is relatively sparingly soluble in methanol and can easily be separated from this medium by adding a methanol soluble sulfate, such as triethylamine sulfate, to the reaction mixture.
Other solvents can be used for this purpose. If the reaction is carried out in aqueous solution, the water can be removed, for example by drying from the frozen state, or a non-solvent for the product formed can be added to the reaction mixture, so that precipitate the product. Thus, if a concentrated aqueous solution of streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine sulfate is prepared, the addition of methanol will cause the product to separate. These salts can often be obtained in crystalline form.
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It has been found that the compounds described herein are particularly suitable for inhibiting the growth of mycobacteria.
These compounds possess activity and properties, which could not be deduced from the activity and known properties of the materials from which they are prepared, namely streptomycin and isonicotinyl-hydrazine. has found that microorganisms which have become resistant to streptomycin or isonicotinyl hydrazine no longer exhibit the same resistance to the compounds of the present invention. Secondly, the compounds, which have been described in the herein, are particularly suitable agents for the inhibition of mycobacteria.
The compounds may be administered by the buccal route, in the form of tablets, capsules, elixirs or solutions of various types, or by injection, either intramuscularly or subcutaneously. Of particular interest is streptomyclidene-isonicotinyl-hydrazine sulfate and can be bottled in sterile and dry form. Addition of sterile water provides an easily injectable solution for the treatment of tuberculosis.
The use of compounds containing the equivalent of one gram of streptomycin, per day, for an adult has been found to be satisfactory. Appropriate doses can be determined with a minimum of experimentation on the particular subject to be treated. In general, daily doses of 5 to 30 mg. approximately per kg of the subject's weight should be administered.
In particular, the compositions according to the present invention provide a very convenient method for the treatment of tuberculosis, owing to the fact that determined and exact proportions of streptomycin and isoniazid are combined in a simple, suitable and easy to administer form, providing with each gram of streptomycin (usual daily dose) a proportion of isoniazid, the activity of which is comparable to that which is often recommended when this drug is used alone.
In addition to the increased therapeutic action and the delay in the appearance of resistant strains of mycobacteria, there is minimal loss of Inouïe sense. Clinical trials have shown that the compositions according to the present invention are to an appreciable extent suitable for the treatment of tuberculosis.
The following examples are given by way of illustration only and should not be regarded as the only embodiments of the invention. -It goes without saying that the invention is limited only by the scope of the claims ending this memory.
EXAMPLE 1.
A mixture of 15 gr. of streptomycin hydrochloride and 3.0 g of isonicotinyl-hydrazine in 100 cc of methanol is heated under reflux for 4 1/2 hours. The mixture is then left to stand for 2 1/2 days at room temperature. The amber colored mixture is filtered and the filtrate is diluted to a volume of 150 cc with methanol. A paper chromatogram of the solution reveals the presence of the desired streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine hydrochloride. The solution is placed in a cooler and crystals of the product slowly separate from the solution. The product has certain differences compared to streptomycin or isonicotinyl-hydrazine, in the infra-red spectrum, in particular at 6.4 u.
The product melts and decomposes at about 215 C and is shown to be biologically active. .
Analysis calculated for C27H47N10012C13:
C, 40.0%; H = 5.85% N = 17.29%; Cl = 13.13%. found C = 40.01% H = 5.90%; N, 17.19%;
C1 = 13.09%.
EXAMPLE II.
A mixture of 20 g of streptomycin hydrochloride and 32 g of isonicotinyl-hydrazine in 350 cc of dry methanol is heated in a water bath at 70-75 C for 1 hour. The mixture is cooled and the excess of isonico-
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tinyl-hydrazine is filtered. The filtrate is treated with a methanolic solution of triethylamine sulfate. The desired product, namely streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine sulfate, precipitates. It is filtered, washed with methanol and dried in a desiccator over calcium chloride. The microbiological activity of this compound, assayed after preliminary hydrolysis, using Klebsiella pneumoniae, in a turbidimetric test, is about 600-630 meg / mg.
Analysis reveals that this is indeed the desired product.
EXAMPLE III.
Aqueous solutions are prepared from streptomycin and isoniazid sulfate containing various concentrations of these reagents. The solutions are allowed to stand at room temperature and are analyzed at periodic intervals to determine if equilibrium has been reached. The following table indicates the concentration of streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine, which should be reached, if the reaction was terminated. The second column of this table shows the degree of progress of the reaction, that is to say the degree of completion reached at equilibrium. It will be appreciated that at a concentration calculated to provide one gram of streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine per 100 cc of solution, the reaction is complete at 78%.
In other words, 0.78 g of the compound have formed and the remainder of the reagents are present in the solution as free streptomycin sulfate and free isoniazid. If some of the product formed is separated from the solution, more of the starting materials will react, until equilibrium is reestablished, at substantially the same level. This table indicates that, even using very dilute solutions, especially solutions of one gram per 100 cc, the reaction has progressed relatively far in the direction of the formation of the new compound, by the time equilibrium is reached.
It is obviously more practical to use appreciably higher concentrations when preparing the product on a large scale, as the equilibrium point is further in the direction of product formation rather than reactive and equilibrium is reached in a much shorter time.
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Concentration <SEP> calculated <SEP> of <SEP>% <SEP> of <SEP> SIH <SEP> formed <SEP> at
<tb>
<tb> SIH <SEP> * <SEP> Reaction <SEP> completed <SEP> balance <SEP>. <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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1,000 <SEP> g / 100 <SEP> ml. <SEP> 78
<tb>
<tb>
<tb> 0.500 <SEP> 70
<tb>
<tb>
<tb> 0.2500 <SEP> 59
<tb>
<tb>
<tb> 0.100 <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb> 0.050 <SEP> 41
<tb>
<tb>
<tb> 0.025 <SEP> 27
<tb>
* Streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazene.
The equilibrium constant calculated in this test is of the order of 1400.
EXAMPLE IV.
The double salt of calcium chloride and streptomycin trichlorohydrate is dissolved in 160 cc of water containing 8.5 gr. of isoniazid. The mixture is left to stand at room temperature for 1/2 hour.
85 cc of a solution of triethylamine sulfate in methanol (1.98 mol in sulfate ions and pH 5) are added with stirring. Some of the calcium precipitates in the form of calcium sulfate. Precipitation of calcium sulfate is completed by the gradual addition of 255 cc of methanol over the course of one hour. The mixture is stirred throughout the addition. The precipitated calcium sulfate is filtered off, washed with a small amount of a mixture of 2 volumes of methanolic solution of triethylamine sulfate, 2 volumes of water and 3 volumes of methanol. The filtrate is treated with an additional 100 cc of methanol or with an additional quantity of this alcohol,
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so that a slight cloudiness is formed in the solution.
The mixture is left to stand at room temperature for several hours, so as to initiate the formation of crystals, 2 liters of methanol are then added gradually while stirring and the white crystalline sesquisulfate of the product is filtered, washed with methanol and dried. under vacuum. We obtain a yield of
36 gr (75%). This product melts and decomposes at approximately 230 C.
Analysis calculated for: C27H44N10012.3 / 2H2SO4:
C, 38.25%; H = 5559%; N = 16e52%; S, 5.67%. found: C = 38.04%; H = 5.74%, N = 16.22%
S, 5.63%.
It should be noted that the crystalline salts of streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine, especially the sulfate and the hydrochloride, are very useful forms of the chemotherapeutic agent. These salts can be obtained in crystalline form of high purity and constitute very effective anti-tuberculosis agents, allowing the treatment of the disease with the aid of a material of constant composition and known effectiveness.
EXAMPLE V.
Streptomycin is recovered by adsorption on an ion exchange resin of the carboxylic acid type, eluting with dilute hydrochloric acid. The hydrochloric solution is concentrated and the water is replaced by methanol. The insoluble material is filtered off and the crude methanolic concentrate of streptomycin hydrochloride is then evaporated to dryness. 21.3 g of the crude product (490 mcg / mg) are heated in 150 cc of methanol. 4.26 g of decolorizing carbon are added and the solution is stirred for half an hour before filtration. The filtered solution is treated with 3 g of isoniazid and the mixture is heated under reflux for 20 minutes.
The solution is cooled, seeded with a small amount of streptomycylidene-isonico-tinyl-hydrazine hydrochloride crystals, and the mixture is left to stand overnight at room temperature. The next morning, the crystalline product is filtered, washed and dried. It weighs 7.49 gr. The product is much purer, on a weight basis, than the crude streptomycin hydrochloride used for its preparationo
EXAMPLE VI.
A streptomycin fermentation broth is filtered and the antibiotic is adsorbed on a carboxylic acid type ion exchange resin. The streptomycin hydrochloride is eluted by means of dilute hydrochloric acid and, after adjusting the pH, the solution is spray dried. 110.6 g of this material, measuring 230 mcg / mg., Are stirred in 200 cc. of boiling methanol. The mixture is cooled and the insoluble inorganic salt is filtered off. The methanolic solution is concentrated to half its volume and a new fraction of precipitated salt is filtered.
6.0 g of isoniazid are added to the streptomycin solution and 8.5 g of decolorizing charcoal are added. After stirring the mixture for half an hour, this mixture is filtered, seeded with crystals of streptomycylidene-isonicotinyl-hydrazine hydrochloride and stored in a cooler.
A first crop of crystalline product weighing 14.6 g is obtained. This product has a much higher purity than the crude streptomycin, from which it was prepared.
The following examples relate to the formation of mixtures or compositions, rather than the formation of reaction products.
EXAMPLE VII.
100 gr. of sterile streptomycin sulfate, in dry and finely divided form, are mixed with 50 g of sterile isoniazid in a suitably stirred vessel. The mixture is mixed vigorously, so as to obtain a uniform product. The composition is set
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in small glass vials, under sterile conditions. The vials smell corked and sealed. Each vial contains the equivalent of 1.0 g of streptomycin base. Daily administration of the contents of a vial of the composition to adults as a sterile aqueous solution has been found to be very satisfactory in the treatment of tuberculosis.
EXAMPLE VIII.
200 gr. of dihydrostreptomycin, in the form of sterile crystalline sulfate, are mixed with 50 g of sterile isoniazid. The mixture is kneaded in a sterile apparatus, until a finely divided and completely uniform product is obtained. Portions of the material obtained are placed, under sterile conditions, in small glass vials. The vials are stoppered and sealed. The use of this product by intramuscular injection after the addition of water has been found to be highly effective in the treatment of tuberculosis.
CLAIMS.
1. - A process in which streptomycin and isonicotinyl-hydrazine are condensed in a solvent and the condensation product is separated in solid form.