<EMI ID=1.1>
Procédé pour la production de matières vitaminées par fermentation.
Cette invention concerne la production de produits vitaminés de valeur par fermentation. Plus particulièrement, elle concerne des résidus de fermentation qui peuvent être obtenus par le développement de cultures sélectionnées de . Fana dans des milieux nutritifs, et qui renferment de la vitamine B� synthétisée par moisissure, les substances vitaminées considérées ayant des propriétés d'activation <EMI ID=2.1>
tituant des adjuvants utiles pour la nourriture.
L'invention concerne un procédé pour la production de substances vitaminées convenant pour l'enrichissement
de nourriture pour animaux, déficientes quant au "facteur protéique animal", procédé comportant le développement d'un microorganisme sélectionné parmi le groupe comprenant des
<EMI ID=3.1>
tritif, donnent des produits de fermentation titrant au moins
20 unités LLD par milligramme de solide contenu dans ces produits, le développement étant conduit dans un milieu nutritif pendant une dnrée suffisante pour produire un produit de fermentation ayant une activité LLD, basée sur la teneur en solides de ce produit, d'au moins 20 unités LLD par milligramme, et les matières solides solubles dans l'eau étant récupérées du bouillon de culture sans décomposition substantielle de leur teneur en vitamine.
L'invention concerne également une composition de nourriture pour animaux diététique ment convenable quant au "facteur protéique animal", comprenant une matière nutritive déficiente dans son "facteur protéique animal" et, comme source de ce "facteur", une préparation dérivant du bouillon de fermentation obtenu par le développement d'un
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lorsque cultivées dans un milieu nutritif, donnent des produits de fermentation titrait au moins 20 unités LLD par
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pement étant conduit dans un milieu nutritif pendant une durée suffisante pour produire un produit de fermentation ayant une activité LLD, basée sur la teneur en solide de ce produit , d'au moins 20 unités LLD par calligramme.
protéique animal'* ainsi dénommé (auquel on se référera Ici
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viande, de farine de foie, de farine de poisson, de poisson soluble, et produits analogues. Ces matières sont relativement peu abondantes. les sous produits de viande et la farine de foie sont tous deux coûteux et augmentent considérablement le prix de revient de l'élevage de la volaille. Ces substances présentent aussi l'inconvénient de renfermer des quantités relativement faibles et variables du "APF". était donc désirable de trouver une source plus concentrée et moins onéreuse de ce constituant Important de l'alimentation.
Nous avons maintenant découvert que le résidu de fermentation actif LLD produit par le développement de cer-
<EMI ID=7.1>
sont des sources concentrées d'agents d'activation de croissance qui produisent sur la croissance des poussins essen-
<EMI ID=8.1>
protéique animal". En outre, nous avons trouvé que, lorsque de tels résidus de fermentation sont soumis à un traitement
<EMI ID=9.1>
que, dans une nourriture déficiente en "APF", une teneur
<EMI ID=10.1>
effet satisfaisant et apparemment maximum sur la vitesse de croissance des poussins.
C'est une caractéristique de la présente Invention
<EMI ID=11.1>
partir de bouillons de fermentation, les concentrés desdits bouillons peuvent être employés comme compléments de nour-
<EMI ID=12.1> par développement de cultures sélectionnées de fungus dans un milieu nutritif aqueux, et ensuite par séparation des constituants volatils des bouillons résultant de la fermentation à des températures inférieures à celles décomposant
<EMI ID=13.1>
de moisissures qui ont été trouvées comme étant commercialement réalisables sont celles que produisent les bouillons
<EMI ID=14.1>
gramme de solide contenu dans lesdits bouillons. Nous avons trouvé que les solides solubles dans l'eau de tels bouillons de fermentation peuvent avoir une activité s'élevant jus-
<EMI ID=15.1>
de poisson et la farine de poisson, renfermaient seulement environ 1-3 unités LLD par mg.
Il faut noter qu'une nourriture basale pour volaille déficiente en "APF" est rendue satisfaisante sous le point de vue diététique par l'addition à cette nourriture de
<EMI ID=16.1>
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à celui produit par environ 1 à 5 % d'extrait soluble de poisson, de farine de poisson et produits analogues. Cette
<EMI ID=18.1>
330.000 unités LLD par kg. de nourriture. Un concentré de
2.000 unités LLD par mg. d'activité comme celui mentionné
<EMI ID=19.1>
de nourriture par addition dans.la proportion de 165 mg.
<EMI ID=20.1>
n On sait que divers extraits solubles de fermentation
<EMI ID=21.1>
ment à cause de leur teneur en riboflavine et autres vitamines de structure connue, comme la biotine, l'acide pentothenique, etc. Nous avons trouvé que ces substances préparées primitivement ne renferment que de faibles quantités de substances actives LLD; par exemple, des extraits solubles de fermentation butylique renferment seulement environ
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
extraits solubles de fermentation ne renferment pas assez
de substance active LLD pour rendre possible la récupération à partir de ceux-là, de concentrés convenant pour l'enrichissement de nourriture déficiente quant au "facteur protéi-
<EMI ID=24.1>
Pour rendre possible la récupération de tels con-
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
convenables pour la production de bouillons de cette con-
<EMI ID=28.1>
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
les Myxomycètes, Schizomycetes et Bumycetes. Les Schizo-
<EMI ID=31.1>
être utilisées pour la préparation des antibiotiques streptomycine et griseine. D'autres espèces de Streptomyces,
<EMI ID=32.1>
bienels nov. ap.; le Streptomyces roseochromogenus et le Streptocyces antibioticus renferment des cultures qui don-
<EMI ID=33.1>
D'autres Schizomycetes appropriés sont des membres du genre
<EMI ID=34.1>
trouvé appropriés pour la production commerciale de bouillons de fermentation titrant au moins 20 unités LLD par milligramme de solide contenu dans lesdits bouillons, sont
<EMI ID=35.1>
Nous désirons souligner que, pour tout type de Fungus donné, il est nécessaire de sélectionner les cultures qui donnent des bouillons ayant l'activité LLD désirée. Notre Invention n'est pas limitée à un fungus particulier, et elle n'inclut pas toute culture de tout fungus donné. D'autre part, tout micro-organisme essayé, cependant, qui donnera un bouillon de fermentation titrant au moins 20 unités LID par mg. de solide du bouillon, a été trouvé satisfaisant pour la production de concentrés convenant pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes quant au "facteur protéique animal".
Un autre avantage encore de la présente découverte réside dans le fait que les produits vitaminés de valeur ici décrits peuvent être préparés à partir de liqueurs de fermentation résiduaires résultant de la production des antibiotiques streptomycine et griséine. Les procédés de fermentation de streptomycine et de griséine impliquent la fermentation de moûts de faible concentration, avec la conséquence que des volumes extrêmement importants de bouillon de fermentation doivent Atre utilisés pour une production relativement faible de streptomycine ou de griséine. Le résidu d'une grande installation de fermentation de strepto-
// mycine peut ainsi représenter plusieurs milliers de gallons de liqueurs de fermentation résiduaires par jour. _paravant, on ne connaissait la présence d'aucun produit utile
<EMI ID=36.1>
de vitamines de structure connue réellement contenue dans ces liqueurs est trop faible que pour permettre une concentration économique des liqueurs en vue d'une récupération desdites vitamines. Ces liqueurs de fermentation de la streptomycine ont donc constitué un problème sérieux et onéreux d'utilisation de résidus.
Nous avons maintenant fait l'étonnante découverte que cette liqueur résiduaire de streptomycine, après enlèvement de l'anti-bio tique streptomycine de celle-là par emploi de résines à ion substituable, titre sensiblement plus de 20 unités LLD par mg. de solide y contenu. Nous avons démontré que des concentrés de jurande activité LLD peuvent être récupérés de cette liqueur, et que ces concentrés peuvent être utilisés pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes quant au "facteur protéique animal". Si on le désire, la liqueur peut être traitée
<EMI ID=37.1>
résiduaires de griséine, après récupération de l'anti-biotique griséine, peuvent être traitées pour la récupération
<EMI ID=38.1>
Dans l'application de la présente invention, nous pouvons utiliser tout milieu nutritif généralement utilisé dans le développement de Fungj. Les agents nutritifs habituels renferment une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques et des facteurs de croissance si c'est nécessaire. Le carbone peut être fourni par un hydrate de carbone comme le dextrose, le maltose, le xylose, le sucre inverti, du sirop de blé, ou d'autres produits analogues.
<EMI ID=39.1>
des extraits de levure, un digeste tryptique de caséine, un extrait de viande, de la farina de sang, des déchets protéiques de viande et d'os, de la farine de saumon, des farines de poisson, des extraits solubles de poisson, des extrait solubles de distillation et autres produite analogues. Si
<EMI ID=40.1>
de protéines, (ou acides aminés) sans la présence d'hydrates de carbone dans le milieu, auquel cas les protéines (ou acides aminés) servent à la fois comme source de carbone et d'azote exigés par le micro-organisme. le développement est ordinairement opéré dans un milieu aqueux mais on peut aussi utiliser au lieu dudit milieu aqueux un milieu d'alcool de grain.
Lorsqu'on utilise un milieu nutritif aqueux, celuici est stérilisé puis inoculé avec une culture de filtre sélectionné de fungus et le mélange est soumis à l'incubation jusqu'à ce que le bouillon de fermentation titre au
<EMI ID=41.1>
L'incubation est habituellement effectuée sous des conditions
<EMI ID=42.1>
auquel on se réfère plus haut dans le présent exposé.
<EMI ID=43.1>
fermenté peut être évaporé et les solides de fermentation ainsi obtenus sont utilisés sans autre traitement, pour en-
<EMI ID=44.1>
Il est habituellement préféré de filtrer le bouillon de fer-mentation et de traiter le bouillon filtré avec un adsorbant comme une terre à foulon ou du charbon de bois activé, qui
<EMI ID=45.1>
et peut alors être utilisé comme complément de nourriture.
Si on désire un complément de nourriture exempt d'adsorbant, l'adsorbat est lessivé avec des solvants appropriés comme des solutions aqueuses ou aqueuses alcooliques de pyridine ou d'alpha-picoline, et le produit du lessivage est évaporé à siccité. Le processus opère une purification partielle des constituants actifs LLD et le produit solide ainsi obtenu est une source concentrée de facteurs de croissance appropriée pour 1' enrichissement de nourriture pour animaux déficiente en "APF".
Si on désire une purification plus poussée, le con-
<EMI ID=46.1>
rieur, ccmme l'alcool méthylique, et l'extrait alcoolique est passé dans une colonne garnie d'alumine activée, et
<EMI ID=47.1>
est ensuite soumise à un lessivage avec du méthanol frais comme solvant et les fractions du produit de lessivage qui manifestent une activité LLD (comme déterminé par essai microbiologique) sont réunies, et les fractions du lessivage réunies sont concentrées. La solution alcoolique concentrée est alors mélangée avec un liquide miscible avec la dite solution et dans lequel la substance active est insolu� ble, comme l'acétone. la précipité, qui se forme, est recristallisé dans un mélange d'acétone et d'eau pour obtenir
<EMI ID=48.1>
Les exemples suivants illustrent les méthodes d'exécution de la présente invention, mais il doit être entendu que ces exemples sont donnée à titre exemplatif et ne sont pas limitatifs.
<EMI ID=49.1>
<EMI ID=50.1>
lide), 315 lb de digeste tryptique de caséine, 160 lb de chlorure de sodium, 720 gr de sulfate ferreux heptahydraté,
<EMI ID=51.1>
de la griséine. Le milieu inoculé est soumis à une incuba tion à une température d'environ 28[deg.]C, pendant environ 48 heures, et est aéré de façon continue avec approximativement
5000 pieds cubes d'air par heure. A la fin de la période de fermentation, tout le bouillon de culture est acidifié au pH3 avec de l'acide phosphorique et filtré. Le gateau de filtre est lavé avec de l'eau et le filtrat avec les lavages est rendu légèrement alcalin avec de l'hydroxyde de sodium, puis filtré à nouveau. Le bouillon de fermentation
<EMI ID=52.1>
<EMI ID=53.1>
A. Filtrat séché de bouillon de fermentation du
<EMI ID=54.1>
100 gal. de bouillon de fermentation préparé comme décrit plus haut ont été évaporés sous pression réduite et
<EMI ID=55.1>
Le concentré, qui avait une activité mierobiologique d'environ 40.000 unités LLD par al. a ensuite été séché par pulvé-
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
unités LLD par mg.
B. Adaorbat de charbon de bois de bouillon
de fermentation du 8. grisées.
3500 gai. du môme bouillon de fermentation que celui
<EMI ID=58.1>
tration et lavé par une suspension dans 100 gai. d'esu et filtré à nouveau.
195 gr. de l'adsorbat carboné humide furent séchés
<EMI ID=59.1>
nant ainsi 99 g d'adsorbat sec. L'activité LLD de l'adsor-
<EMI ID=60.1>
partir de l'activité présente à l'origine dans le bouillon de fermentation et de l'activité résiduaire de la liqueur usée après adsorption par le carbone.
C. Concentré obtenu par le lessivage
de l'adsorbat de charbon.
le reste de l'adsorbat de carbone lavé décrit sous le B (provenant de la mime cuvée de fermentation), représentant environ 160 lb de carbone activé, a été soumis à un lessivage par agitation pendant 30 minutes avec 167 gai. de
<EMI ID=61.1>
<EMI ID=62.1>
de pyridine à 26 % pendant 20 minutes. Les deux tiers du produit de lessivage et du lavage réunis furent évaporés
<EMI ID=63.1>
sous état congelé, et donnèrent 14,1 g de produit ayant une activité de 2800 unités LLD/mg.
<EMI ID=64.1>
Un concentré solide préparé suivant le procédé décrit sous B et C ci-dessus en partant avec 3500 gai. de
<EMI ID=65.1>
Que et l'extrait alcoolique fut ensuite passé à travers une
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
avec de l'alcool méthylique frais et les fractions du produit de lessivage révélant l'activité LLD la plus prononcée furent concentrées ensemble. La solution alcoolique concentrée fut alors mélangée avec de l'acétone, provoquant la précipitation
<EMI ID=68.1>
Cette matière fut purifiée par reprécipitation dans une solution d'éthanol par addition d'acétone et le produit fut purifié à nouveau par cristallisation d'une solution aqueuse
<EMI ID=69.1>
La valeur des concentrés ci-dessus et de la vitamine pour remplacer les compléments de nourriture renfermant le "facteur protéique animal" était révélé par des tests d'a-
<EMI ID=70.1>
Les poussins utilisés dans ces tests étaient éclos d'oeufs pondus par des poules maintenues à une alimentation
<EMI ID=71.1>
Des poussins âgés d'un jour furent soumis à un régime basai comme suit:
<EMI ID=72.1>
Après cinq jours sur l'alimentation basale ci-dessus,
on choisit des groupes de sept poussins chacun, équilibrés sous le point de vue du poids et on leur donna la nourriture basale ci-dessus complétée comme Indiqué dans la table suivante:
<EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
Ces tests établissent clairement que la croissance des poussins d'expérience est nettement accrue, si on la compare avec la croissance de poussins nourris avec une
<EMI ID=75.1>
d'expérience sont nourris avec ladite nourriture basale enrichie par l'un Quelconque des concentrés signalés plus haut ou avec la vitamine Bl2.
EXEMPLES.
Une cuve de fermentation de 4000 gel. a été chargée avec 95 lb de concentré d'extrait de boeuf, 315 lb d'un di-
<EMI ID=76.1>
20 litres d'agent anti-mousse, et 3500 gai. d'eau. le milieu fut stérilisé, inoculé, fermenté, acidifié, filtré et neutralisé comme décrit dans l'exemple 1.
<EMI ID=77.1>
ximativement 4000gal.) fut agité avec 96 lb de carbone actif pendant 30 minutas pour adsorber les constituants ac-
<EMI ID=78.1>
par une suspension dons environ 100 gale d'eau et filtré à <EMI ID=79.1>
tation pendant 30 minutes avec 95 gal. d'alpha-picoline à
<EMI ID=80.1>
Le gâteau de filtre fut lave sur filtre presse par recyclage
<EMI ID=81.1>
Les produits du lessivage et du lavage réunis furent évaporés sous pression réduite (température de vapeur inférieure
<EMI ID=82.1>
thanol. La matière inerte qui précipite fut éliminée et
les constituants actifs LLD bruts furent précipités par l'addition de la solution dans le méthanol à 180 gel. d'éther). Le précipité fut séparé par filtration, lavé à l'éther et séché dans un four à vide à une température inférieure à
30[deg.]C, pour donner 860 gr de produit sec; activité microbiologique de 1500 unités LLD/mg.
<EMI ID=83.1>
comparée avec un extrait brut de foie et avec la vitamine
<EMI ID=84.1>
des tests d'alimentaion de poussins comme décrit à la page suivante.
Tests d'alimentation de poussins.
Les poussins utilisés étaient éclos d'oeufs pondus par des poules nourries avec une nourriture déficiente en
<EMI ID=85.1>
Des poussins vieux d'un jour furent soumis à un régime basai, Qui était identique à celui de l'exemple 1,
<EMI ID=86.1>
de dextrose commercial.
Après 5 jours de l'alimentation hasale ci-dessus, on sélectionna des groupes de 7 poussins chacun, équilibrés Quant au poids et on leur donna la nourriture baaale précé-
�
<EMI ID=87.1>
Ces tests montrent que la croissance des poussins d'expérience est nettement accrue, par rapport à celle observée sur des poussins nourris avec une nourriture basale défi-
<EMI ID=88.1>
montrent également que l'accroissement de croissance est approximativement le mime que celui produit en nourissant les poussins avec la nourriture basale enrichie par 1% d'extrait brut de foie, qui est l'un des meilleure produits utilisée procédèrent comme source de "facteur protéique animal*.
F
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
Le milieu fut préparé, stérilisé et soumis à l'incubation avec 10% en volume d'une culture végétative de filtre
<EMI ID=91.1>
2 jours sous immersion et sous aération. Le bouillon fermenté fut acidifié avec de l'acide phosphorique au pH3 et filtré sur
<EMI ID=92.1>
tés LLD par mg de solide du bouillon).
60 gale de ce bouillon de fermentation filtré furent passés dans Un? colonne renfermant 600 g d'une résine du type
<EMI ID=93.1>
sorption de la streptomycine sur la résine. Les bouillons effluents desquels la streptomycine était ainsi éliminée furent réunis.
<EMI ID=94.1>
75 litres de ce bouillon effluent furent traités
<EMI ID=95.1>
des substances actives initialement présentes dans le bouillon.
<EMI ID=96.1>
19 <EMI ID=97.1>
charbon de bois décrit dans l'exemple 1 pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes en "APF".
<EMI ID=98.1>
40 litres de bouillon effluent préparés en substance
<EMI ID=99.1>
furent amenés au pH 2,5 avec de l'acide phosphorique, et le bouillon résultant fut traité avec 600 g de terre à foulon ("O.K. Brand") L'adsorbat dans la terre à foulon, qui renfer-
<EMI ID=100.1>
de la même façon que l'sdsorbat dans le charbon de bois comme décrit plus haut et dans l'exemple 1 pour l'enrichissement des nourritures pour animaux déficientes en "APP".
<EMI ID=101.1>
Une portion de 80 litres du même bouillon effluent Que la matière de départ utilisée dans la partie 4 du présent
<EMI ID=102.1>
de cette solution concentrée (5740 ml) fut séchée par pulvérisation et donna ainsi 335 g. de produit sec ayant une activité microbiologique de 140 unités LLD/mg. Ce produit peut Atre utilisé de la même façon que le bouillon séché de
<EMI ID=103.1>
EXEMPLE 4.
On prépare un milieu constitué par 1% de diges te
<EMI ID=104.1> <EMI ID=105.1>
flacon est alors inoculé avec environ 10 ml. d'une culture végétative de Itreptomyces roseochromogenus, et soumis à une incubation de 7 jours dans une machine à agiter rotative. Les contenus des flacons sont ensuite mélangés et filtrés.
Un litre de bouillon filtré (environ 1500 unités
<EMI ID=106.1>
rieure à 35[deg.]C) et séché à partir de l'état congelé, pour obtenir 6,9 g. de produit ayant une activité d'environ 130 unités LLD/mg.
Une autre portion de bouillon filtré, s'élevant à
<EMI ID=107.1>
avec 23 g. de carbone activé. L'adsorbat, ainsi obtenu, est la-vé deux fois par lessivage sous agitation pendant 30 minutes avec un mélange de 126 ml. d'éthanol; 12,5 ml de pyri-
<EMI ID=108.1>
sont évaporés sous pression réduite (température inférieure à 35[deg.]C) et séchés à partir de l'état congelé pour obtenir
<EMI ID=109.1>
Une culture de Streptomyces albidoflavie est préparée et incubée exactement comme décrit dans l'exemple 4 pour le Streptoayces roseochromogenus.
<EMI ID=110.1>
de l'acide phosphorique, filtré, et le bouillon filtre est neutralisé à environ un pH 7 avec. de 1$hydroxyde de sodium
1570 ml. de bouillon neutre filtré (titrant 1000 unités LLD/ml:
<EMI ID=111.1>
obtenu est récupéré par filtration. L'adsorbat humide est
<EMI ID=112.1>
tenir 50,7 g.(adjuvant de filtration inclus) d'adaorbat sec, dont l'activité est environ 30 unités/mg. comme calculé à partir de l'activité du bouillon original neutre et filtré et de la liqueur épuisée provenant du traitement par le carbone.
L'adsorbat dans le carbone peut être utilisé de la même façon que les produits décrits dans l'exemple l, pour
<EMI ID=113.1>
Un milieu de fermentation fut préparé avec les constituants suivants:
<EMI ID=114.1>
40 il du milieu ci-dessus furent stérilisés dans un
<EMI ID=115.1>
<EMI ID=116.1>
temps durant lequel le flacon fut agité continuellement sur une machine à agiter rotative.
�
Après achèvement de la période de fermentation, le titre LLD du bouillon fermenté était de 4800 unités par ml.
<EMI ID=117.1>
Ce bouillon est utilisé pour obtenir des concentrés
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
EXEMPLE 7.
Huit milieux de fermentation, identiques quant aux sels inorganiques, mais renfermant différents produits azotés complémentaires, furent préparés. La composition de ces milieux était la suivante:
<EMI ID=120.1>
40 ml de chacun de ces milieux furent stérilisés dans un flacon de 250 ml et inoculés avec 2 1/2 % en volume
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
pendant 4 jours pendant lesquels les flacons furent agités continuellement sur une machine à agiter rotative.
Après achèvement de la période de fermentation, les bouillons fermentés furent titrés et les résultats obtenus, dépendant de l'agent complémentaire ajouté , sont résumés dans la table ci-après:
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
Ces bouillons peuvent Atre utilisés pour produire
<EMI ID=125.1>
<EMI ID=126.1>
crit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 8.
<EMI ID=127.1>
Agar Difco 0,37% Cobalt (comme nitrate de cobalt) 2 part./million Eau distillée pour faire 100%
Ce milieu fut préparé et divisé en cinq flacons
<EMI ID=128.1>
cons et leur contenu furent stérilisés et chacun des flacons fut inoculé avec un type différent de Clostridium, comme Indiqué dans la table ci-après..
Après inoculation, les bouillons inoculés furent Incubés sous des conditions anaréobles, sans agitation, pour
<EMI ID=129.1>
Après achèvement de cette période de fermentation, les ac-
<EMI ID=130.1>
lactés Dorner comme test, furent les suivantes :
<EMI ID=131.1>
Chacun de ce* bouillons est ensuite traité comme décrit dans l'exemple 1, pour produire des concentrée solides
<EMI ID=132.1>
1.- Procédé pour la production de substances vitaminées "captées pour l'enrichissement d'aliments, pour ani-
<EMI ID=133.1>
sistant à développer un microorganisme sélectionné dans le groupe comprenant ces filtres de Fume qui, lorsque cultivés dans un milieu nutritif, permettent d'obtenir des produits
<EMI ID=134.1>
gramme de solide contenu dans ces produits, ce développement étant conduit dans un milieu nutritif pendant un temps suffisant pour atteindre un produit de fermentation ayant une
<EMI ID=135.1>
des vitamines y contenues*
<EMI ID = 1.1>
Process for the production of vitamin materials by fermentation.
This invention relates to the production of valuable vitamin products by fermentation. More particularly, it relates to fermentation residues which can be obtained by the development of selected cultures of. Fana in nutritious media, and which contain vitamin B � synthesized by mold, vitamin substances considered to have activating properties <EMI ID = 2.1>
serving as useful adjuvants for food.
The invention relates to a process for the production of vitamin substances suitable for fortification.
of animal feed, "animal protein factor" deficient, a method comprising the development of a microorganism selected from the group consisting of
<EMI ID = 3.1>
tritif, give fermentation products containing at least
20 LLD units per milligram of solid contained in these products, development being carried out in a nutrient medium for a sufficient amount to produce a fermentation product having an LLD activity, based on the solids content of that product, of at least 20 LLD units per milligram, and the water soluble solids being recovered from the culture broth without substantial decomposition of their vitamin content.
The invention also relates to a dietary animal feed composition suitable for the "animal protein factor" comprising a nutrient deficient in its "animal protein factor" and, as a source of this "factor", a preparation derived from the broth of fermentation obtained by the development of a
<EMI ID = 4.1>
when grown in nutrient medium yield fermentation products titrated at least 20 LLD units per
<EMI ID = 5.1>
The preparation is carried out in a nutrient medium for a time sufficient to produce a fermentation product having an LLD activity, based on the solid content of this product, of at least 20 LLD units per calligram.
animal protein '* so called (to which we will refer here
<EMI ID = 6.1>
meat, liver meal, fish meal, soluble fish, and the like. These materials are relatively scarce. both meat by-products and liver meal are expensive and greatly increase the cost of raising poultry. These substances also have the disadvantage of containing relatively small and variable amounts of "APF". It was therefore desirable to find a more concentrated and less expensive source of this important constituent of the diet.
We have now found that the active fermentation residue LLD produced by the development of cer-
<EMI ID = 7.1>
are concentrated sources of growth promoting agents which produce on the growth of essential chicks
<EMI ID = 8.1>
animal protein ". Further, we have found that when such fermentation residues are subjected to a
<EMI ID = 9.1>
that, in food deficient in "APF", a content
<EMI ID = 10.1>
satisfactory and apparently maximum effect on the growth rate of chicks.
It is a feature of the present invention
<EMI ID = 11.1>
from fermentation broths, the concentrates of said broths can be used as food supplements
<EMI ID = 12.1> by growing selected cultures of fungus in an aqueous nutrient medium, and then by separating volatile constituents from broths resulting from fermentation at temperatures below those decomposing
<EMI ID = 13.1>
molds that have been found to be commercially feasible are those produced by broths
<EMI ID = 14.1>
gram of solid contained in said broths. We have found that the water soluble solids of such fermentation broths can have an activity of up to
<EMI ID = 15.1>
of fish and fish meal, contained only about 1-3 LLD units per mg.
It should be noted that basal poultry feed deficient in "APF" is made satisfactory from a dietary point of view by the addition to this feed of
<EMI ID = 16.1>
<EMI ID = 17.1>
to that produced by about 1 to 5% soluble extract of fish, fishmeal and the like. This
<EMI ID = 18.1>
330,000 LLD units per kg. of food. A concentrate of
2,000 LLD units per mg. activity like the one mentioned
<EMI ID = 19.1>
of food by addition in the proportion of 165 mg.
<EMI ID = 20.1>
n We know that various soluble extracts from fermentation
<EMI ID = 21.1>
because of their content of riboflavin and other vitamins of known structure, such as biotin, pentothenic acid, etc. We have found that these originally prepared substances only contain small amounts of LLD active substances; for example, soluble butyl fermentation extracts contain only about
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
soluble fermentation extracts do not contain enough
of active substance LLD to make possible the recovery therefrom of concentrates suitable for the fortification of foods deficient in the "protein factor.
<EMI ID = 24.1>
To make possible the recovery of such con-
<EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
suitable for the production of broths of this con-
<EMI ID = 28.1>
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
Myxomycetes, Schizomycetes and Bumycetes. The Schizo-
<EMI ID = 31.1>
be used for the preparation of the antibiotics streptomycin and grisein. Other species of Streptomyces,
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bienels nov. ap .; Streptomyces roseochromogenus and Streptocyces antibioticus contain cultures which give
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Other suitable Schizomycetes are members of the genus
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found suitable for the commercial production of fermentation broths assaying at least 20 LLD units per milligram of solid contained in said broths, are
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We wish to emphasize that, for any given type of Fungus, it is necessary to select the cultures which give broths with the desired LLD activity. Our Invention is not limited to any particular fungus, and it does not include any culture of any given fungus. On the other hand, any microorganism tested, however, which will give a fermentation broth of at least 20 LID units per mg. of broth solid, has been found to be satisfactory for the production of concentrates suitable for the fortification of animal feeds deficient in "animal protein factor".
Yet another advantage of the present discovery is that the valuable vitamin products described herein can be prepared from residual fermentation liquors resulting from the production of the antibiotics streptomycin and grisein. The streptomycin and grisein fermentation processes involve the fermentation of low concentration musts, with the consequence that extremely large volumes of fermentation broth must be used for a relatively low production of streptomycin or grisein. The residue from a large strepto fermentation plant
// mycine can thus represent several thousand gallons of residual fermentation liquor per day. _ previously, we did not know the presence of any useful product
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of vitamins of known structure actually contained in these liquors is too low to allow an economical concentration of the liquors with a view to recovering said vitamins. These streptomycin fermentation liquors have therefore presented a serious and expensive problem of using residues.
We have now made the astonishing discovery that this residual streptomycin liquor, after removal of the anti-biotic streptomycin therefrom by the use of ion-substitutable resins, titer substantially over 20 LLD units per mg. of solid contained therein. We have demonstrated that concentrates of LLD activity can be recovered from this liquor, and that these concentrates can be used for the enrichment of animal feeds deficient in the "animal protein factor". If desired, the liquor can be processed
<EMI ID = 37.1>
grisein waste, after recovery of the anti-biotic grisein, can be processed for recovery
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In the application of the present invention, we can use any nutrient medium generally used in the development of Fungj. Typical nutrients include a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and growth factors if needed. The carbon can be provided by a carbohydrate such as dextrose, maltose, xylose, invert sugar, wheat syrup, or the like.
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yeast extracts, a tryptic casein digest, a meat extract, blood meal, protein waste from meat and bone, salmon meal, fish meal, soluble fish extracts, soluble extracts from distillation and the like. Yes
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protein, (or amino acids) without the presence of carbohydrates in the medium, in which case the proteins (or amino acids) serve both as a source of carbon and nitrogen required by the microorganism. the development is usually carried out in an aqueous medium but it is also possible to use instead of said aqueous medium a grain alcohol medium.
When using an aqueous nutrient medium, it is sterilized and then inoculated with a selected filter culture of fungus and the mixture is incubated until the fermentation broth is titrated to
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Incubation is usually carried out under conditions
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which is referred to above in the present disclosure.
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fermented can be evaporated and the fermentation solids thus obtained are used without further treatment, to en-
<EMI ID = 44.1>
It is usually preferred to filter the fermentation broth and treat the filtered broth with an adsorbent such as fuller's earth or activated charcoal, which
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and can then be used as a food supplement.
If an adsorbent-free food supplement is desired, the adsorbate is leached with suitable solvents such as aqueous or aqueous alcoholic solutions of pyridine or alpha-picoline, and the leach is evaporated to dryness. The process results in a partial purification of the active LLD constituents and the solid product thus obtained is a concentrated source of growth factors suitable for the enrichment of animal feed deficient in "APF".
If further purification is desired, the
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laughter, as methyl alcohol, and the alcoholic extract is passed through a column packed with activated alumina, and
<EMI ID = 47.1>
is then leached with fresh methanol as a solvent and the leach fractions which show LLD activity (as determined by microbiological testing) are combined, and the combined leach fractions are concentrated. The concentrated alcoholic solution is then mixed with a liquid miscible with said solution and in which the active substance is insoluble � ble, such as acetone. the precipitate, which forms, is recrystallized from a mixture of acetone and water to obtain
<EMI ID = 48.1>
The following examples illustrate the methods of carrying out the present invention, but it should be understood that these examples are given by way of example and are not limiting.
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lide), 315 lb of tryptic casein digest, 160 lb of sodium chloride, 720 g of ferrous sulfate heptahydrate,
<EMI ID = 51.1>
griseine. The inoculated medium is incubated at a temperature of about 28 [deg.] C, for about 48 hours, and is continuously aerated with approximately
5,000 cubic feet of air per hour. At the end of the fermentation period, all the culture broth is acidified to pH3 with phosphoric acid and filtered. The filter cake is washed with water and the filtrate with the washes is made slightly alkaline with sodium hydroxide, then filtered again. Fermentation broth
<EMI ID = 52.1>
<EMI ID = 53.1>
A. Dried fermentation broth filtrate from
<EMI ID = 54.1>
100 gal. of fermentation broth prepared as described above were evaporated under reduced pressure and
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The concentrate, which had a microbiological activity of about 40,000 LLD units per al. was then spray dried
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LLD units per mg.
B. Broth charcoal adaorbat
of fermentation 8. greyed out.
3500 cheerful. of the same fermentation broth as that
<EMI ID = 58.1>
tration and washed with a suspension in 100 gai. from esu and filtered again.
195 gr. wet carbonaceous adsorbate were dried
<EMI ID = 59.1>
thus creating 99 g of dry adsorbate. The LLD activity of the adsor-
<EMI ID = 60.1>
from the activity originally present in the fermentation broth and the residual activity of the spent liquor after adsorption by carbon.
C. Concentrate obtained by leaching
carbon adsorbate.
the remainder of the washed carbon adsorbate described under B (from the same fermentation batch), representing about 160 lbs of activated carbon, was leached by stirring for 30 minutes with 167 gai. of
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26% pyridine for 20 minutes. Two-thirds of the combined leach and wash were evaporated
<EMI ID = 63.1>
under frozen state, and gave 14.1 g of product having an activity of 2800 LLD units / mg.
<EMI ID = 64.1>
A solid concentrate prepared according to the method described under B and C above starting with 3500 gai. of
<EMI ID = 65.1>
That and the alcoholic extract was then passed through a
<EMI ID = 66.1>
<EMI ID = 67.1>
with fresh methyl alcohol and the leach fractions showing the most pronounced LLD activity were concentrated together. The concentrated alcoholic solution was then mixed with acetone, causing precipitation.
<EMI ID = 68.1>
This material was purified by reprecipitation from an ethanol solution with the addition of acetone and the product was further purified by crystallization from an aqueous solution.
<EMI ID = 69.1>
The value of the above concentrates and the vitamin to replace food supplements containing the "animal protein factor" was revealed by tests of a-
<EMI ID = 70.1>
The chicks used in these tests were hatched from eggs laid by hens kept on a feed
<EMI ID = 71.1>
One-day-old chicks were fed a basal diet as follows:
<EMI ID = 72.1>
After five days on the basal diet above,
Groups of seven chicks each, balanced in weight, were selected and given the above basal food supplemented as shown in the following table:
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These tests clearly establish that the growth of experimental chicks is markedly increased, when compared with the growth of chicks fed with
<EMI ID = 75.1>
of experience are fed with said basal food enriched with any of the concentrates mentioned above or with vitamin Bl2.
EXAMPLES.
A fermentation tank of 4000 gel. was loaded with 95 lbs of beef extract concentrate, 315 lbs of a di-
<EMI ID = 76.1>
20 liters of anti-foaming agent, and 3500 gai. of water. the medium was sterilized, inoculated, fermented, acidified, filtered and neutralized as described in Example 1.
<EMI ID = 77.1>
ximally 4000gal.) was stirred with 96 lbs of activated carbon for 30 minutes to adsorb the active constituents.
<EMI ID = 78.1>
by a suspension of about 100 g of water and filtered at <EMI ID = 79.1>
tation for 30 minutes with 95 gal. alpha-picoline
<EMI ID = 80.1>
The filter cake was washed on a filter press by recycling
<EMI ID = 81.1>
The combined leaching and washing products were evaporated under reduced pressure (lower vapor temperature
<EMI ID = 82.1>
thanol. The inert matter which precipitates was removed and
the crude LLD active components were precipitated by the addition of the 180 gel methanol solution. ether). The precipitate was filtered off, washed with ether and dried in a vacuum oven at a temperature below.
30 [deg.] C, to give 860 g of dry product; microbiological activity of 1500 LLD units / mg.
<EMI ID = 83.1>
compared with a raw liver extract and with the vitamin
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chick feeding tests as described on the next page.
Chick feeding tests.
The chicks used were hatched from eggs laid by hens fed a food deficient in
<EMI ID = 85.1>
One day old chicks were put on a basic diet, which was identical to that of Example 1,
<EMI ID = 86.1>
of commercial dextrose.
After 5 days of the above hasal feed, groups of 7 chicks each, balanced in weight, were selected and given the previous baaal feed.
�
<EMI ID = 87.1>
These tests show that the growth of experimental chicks is markedly increased, compared to that observed in chicks fed with a defective basal food.
<EMI ID = 88.1>
also show that the increase in growth is approximately the same as that produced by feeding the chicks with the basal food enriched with 1% crude liver extract, which is one of the best products used as a source of "protein factor. animal*.
F
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The medium was prepared, sterilized and incubated with 10% by volume of a vegetative filter culture.
<EMI ID = 91.1>
2 days under immersion and under ventilation. The fermented broth was acidified with phosphoric acid to pH3 and filtered through
<EMI ID = 92.1>
LLD teas per mg of broth solid).
60 scales of this filtered fermentation broth were passed into Un? column containing 600 g of a resin of the type
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sorption of streptomycin on the resin. The effluent broths from which streptomycin was thus removed were combined.
<EMI ID = 94.1>
75 liters of this effluent broth were treated
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active substances initially present in the broth.
<EMI ID = 96.1>
19 <EMI ID = 97.1>
charcoal described in Example 1 for the enrichment of animal feeds deficient in "APF".
<EMI ID = 98.1>
40 liters of effluent broth prepared in substance
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were brought to pH 2.5 with phosphoric acid, and the resulting broth was treated with 600 g of fuller's earth ("O.K. Brand") The adsorbate in fuller's earth, which contains
<EMI ID = 100.1>
similarly to sdsorbate in charcoal as described above and in Example 1 for the fortification of "APP" deficient animal feeds.
<EMI ID = 101.1>
An 80 liter portion of the same effluent broth as the starting material used in Part 4 of this
<EMI ID = 102.1>
of this concentrated solution (5740 ml) was spray dried to give 335 g. of dry product with a microbiological activity of 140 LLD units / mg. This product can be used in the same way as the dried broth of
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EXAMPLE 4.
A medium consisting of 1% of digests is prepared.
<EMI ID = 104.1> <EMI ID = 105.1>
vial is then inoculated with approximately 10 ml. of a vegetative culture of Itreptomyces roseochromogenus, and subjected to an incubation of 7 days in a rotary shaking machine. The contents of the vials are then mixed and filtered.
One liter of filtered broth (about 1500 units
<EMI ID = 106.1>
higher to 35 [deg.] C) and dried from the frozen state, to obtain 6.9 g. of product having an activity of about 130 LLD units / mg.
Another portion of filtered broth, amounting to
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with 23 g. activated carbon. The adsorbate thus obtained is washed twice by leaching with stirring for 30 minutes with a mixture of 126 ml. ethanol; 12.5 ml of pyri-
<EMI ID = 108.1>
are evaporated under reduced pressure (temperature below 35 [deg.] C) and dried from the frozen state to obtain
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A culture of Streptomyces albidoflavia is prepared and incubated exactly as described in Example 4 for Streptoayces roseochromogenus.
<EMI ID = 110.1>
phosphoric acid, filtered, and the filter broth is neutralized to about pH 7 with. $ 1 sodium hydroxide
1570 ml. of filtered neutral broth (assaying 1000 LLD units / ml:
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obtained is recovered by filtration. The wet adsorbate is
<EMI ID = 112.1>
hold 50.7 g (filter aid included) of dry adaorbate, the activity of which is approximately 30 units / mg. as calculated from the activity of the original neutral and filtered broth and the spent liquor from the carbon treatment.
The adsorbate in carbon can be used in the same way as the products described in Example 1, for
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A fermentation medium was prepared with the following constituents:
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40 he from the middle above were sterilized in a
<EMI ID = 115.1>
<EMI ID = 116.1>
time during which the flask was continuously shaken on a rotary shaker.
�
After completion of the fermentation period, the LLD titer of the fermented broth was 4800 units per ml.
<EMI ID = 117.1>
This broth is used to obtain concentrates
<EMI ID = 118.1>
<EMI ID = 119.1>
EXAMPLE 7.
Eight fermentation media, identical in terms of inorganic salts, but containing different complementary nitrogenous products, were prepared. The composition of these media was as follows:
<EMI ID = 120.1>
40 ml of each of these media were sterilized in a 250 ml vial and inoculated with 2 1/2% by volume
<EMI ID = 121.1>
<EMI ID = 122.1>
for 4 days during which the vials were shaken continuously on a rotary shaker.
After completion of the fermentation period, the fermented broths were titrated and the results obtained, depending on the complementary agent added, are summarized in the table below:
<EMI ID = 123.1>
<EMI ID = 124.1>
These broths can be used to produce
<EMI ID = 125.1>
<EMI ID = 126.1>
crit in Example 1.
EXAMPLE 8.
<EMI ID = 127.1>
Difco Agar 0.37% Cobalt (as cobalt nitrate) 2 part./million Distilled water to make 100%
This medium was prepared and divided into five vials
<EMI ID = 128.1>
cons and their contents were sterilized and each of the vials was inoculated with a different type of Clostridium, as shown in the table below.
After inoculation, the inoculated broths were incubated under anaerobic conditions, without shaking, to
<EMI ID = 129.1>
After completion of this fermentation period, the ac-
<EMI ID = 130.1>
Dorner milk as a test, were the following:
<EMI ID = 131.1>
Each of this * broths is then processed as described in Example 1, to produce solid concentrates.
<EMI ID = 132.1>
1.- Process for the production of vitamin substances "captured for the enrichment of foods, for animals.
<EMI ID = 133.1>
resistant to developing a microorganism selected from the group comprising those smoke filters which, when cultivated in a nutrient medium, make it possible to obtain products
<EMI ID = 134.1>
gram of solid contained in these products, this development being carried out in a nutrient medium for a time sufficient to reach a fermentation product having a
<EMI ID = 135.1>
of the vitamins it contains *