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Procédé de préparation de substances vitaminiques.
L'invention est relative., de façon générale, à la produc- tion de substances de valeur au point de vue thérapeutique et alimentaire par fermentation, et en particulier à un procédé perfectionné de production microbiologique de substances vita- miniques ayant des propriétés favorisant la croissance du micro- organisme Lactobacillus lactis Dorner. Elle est également rela-
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tive à un procéda perfectionné de production microbiologique de vitamine B 12. La vitamine B 12 est un dérivé soluble dans l'eau., de couleur rouge, cristallin pouvant être extrait du foie et utile au traitement de certains genres d'anémie humaine, par exemple l'anémie pernicieuse. Il est également utile comme facteur alimentaire pour des animaux.
L'invention a pour but la production de substances vitamini- ques par fermentation d'un milieu d"alimentation contenant du cobalt ajouté, au moyen d'une culture produisant une activité LLD d'un micro-organisme appartenant aux Champignons sub-phylum.
Les substances vitaminiques telles que la vitamine B12 pro- duites par application du procédé perfectionné de l'invention, sont étudiées commodément en utilisant la réponse de croissance du micro-organisme Lactobacillus lactis Dorner dans les conditi- ons décrites par Shorb (J.Biol.Chem, 169.455-6). Les puissan- ces de ces substances vitaminiques et de bouillies fermentées et de concentrés enrichis en ces substances, sont exprimées en termes d'activité LLD en se basant sur un standard arbitraire de foie, ayant une puissance de 1,000 unités LLD par milligram- me. On a déterminé que la vitamine B12 cristalline pure a une activité LLD d'environ 11.000.000 unités LLD/mgr.
On produit des substances vitaminiques ayant une activité LLD par fermentation de milieux d'alimentation par des cultu- res sélectionnées de différentes variétés de Champignons sub- phylum. La puissance de bouillies résultant de la fermentation de milieux d'alimentation ordinaires par ces organismes, est cependant excessivement faible en comparaison de la puissance de la vitamine B12 pure. Ces produits ont une teneur variable en substances à activité LLD, qui dépend de la variété de cham- pignon utilisée, mais ordinairement ils possèdent une activité LLD équivalente à une teneur en vitamine B12 de l'ordre de 0,00003 mgrs/ml.
Il est extrêmement difficile de séparer la
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vitamine B12 pure ou des concentrés à activité LLD de grande activité, des grandes quantités d'impuretés présentes dans ces milieux. Il est par conséquent de grande importance de trouver un moyen d'augmenter la puissance LLD de la bouil fermentée et d'augmenter en même tempw la concentration de substances à activité LLD par rapport aux solides totaux de la bouillie.
On a maintenant découvert que ces buts peuvent être réalisés on cultivant des cultures de Champignons qui produisent des subs- tances ayant une activité LLD,, dans dès milieux d'alimentation aqueux contenant du cobalt ajouté. On a trouvé que lorsque ces champignons sont cultivés en présence de cobalt ajoutée des quan- tités fortement accrues de substances à activité LLD sont produi- tes par le micro-organisme. On obtient ainsi une bouillie finale d'activité LLD fortement accrue, et également une augmentation considérable de la concentration en vitamine B12 par rapport aux matières solides totales de la bouillie.
Cette production micro- biologique accrue de matière à activité LLD non seulement facili- te la séparation de vitamine B12 pure de la bouillie fermentée mais rend également possible l'utilisation des matières solides de la bouillie comme supplément d'alimentation pour des animaux.
Il est particulièrement surprenant que l'addition de cobalt puisse stimuler une production microbiologique accrue de subs- tances à activité LLD telles que la vitamine B12, car on sait que le cobalt est extrêmement toxique vis-à-vis de nombreux mi- cro-organismes. On a trouvé qu'à des concentrations plus élevées, le cobalt est en fait également toxique aux cultures de champi- gnons qui produisent des substances ayant une activité LLD. Par exemple, une quantité de cobalt (sous forme de nitrate de cobalt) de plus de 10 à 20 parties par million basées sur le milieu em- pêche en réalité la production de substances à activité LLD par le champignon Streptomyces grisous.
On peut varier la quantité de cobalt présente pendant la
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fermentation suivant le Milieu utilisée mais on préfère d'habi- tude employer une quantité de cobalt comprise entre 0,1 et 20 parties par million de parties de milieu. Dans certains cas, il peut être désirable d'utiliser des quantités de cobalt plus élevées ou plus faibles suivant la toxicité du cobalt pour le champignon particulier employé. Dans le cas de Streptomyces griseus . on a préparé des bouillies de fermentation de grande activité LLD et assuré des productions excellentes de vitamine B12 cristallins en cultivant les micro-organismes dans des mi- lieux contenant environ deux parties de cobalt par million (sous forme de nitrate de cobalt).
On peut ajouter le cobalt sous forme métallique, mais on l'ajoute ordinairement saus forme d'un composé de cobalt, de préférence un sel de cobalt tel que le nitrate de cobalt; ou sous la forme d'un sel ou complexe de cobalt existant dans la nature tel qu'il peut exister dans des aliments microbiens ri- ches en cobalt. Par suite de la difficulté d'assurer la quanti- té désirée de cobalt par addition de ces matières nutritives existant dans la nature, on préfère ajouter le cobalt sous for- me d'un sel de cobalt.
Pour l'application de l'invention, on peut utiliser un mi- lieu d'alimentation utilisé ordinairement à la propagation de champignons. La production d'activité LLD par un champignon don- né peut, il est vrai, varier suivant le milieu d'alimentation employé., mais on a trouvé que pour un type quelconque donné de milieu trop pauvre en cobalt, l'addition d'une petite quanti- té de cobalt produit invariablement une grande augmentation de la production de substances à activité LLD.
Les aliments usuels comprennent une source de carbone as- similable, une source d'azote assimilable, des sels inorganiques et des facteurs de puissance lorsque c'est nécessaire. On peut introduire le carbone sous forme d'un hydrate de carbone tel que la dextrose, maltose., xylose.. sucre interverti, sirgpde/
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grains, etc.. On peut introduire l'azote sous forme d'un sel d'ammonium acides aminés ou protéines, telles que fèves de soya, avoine, levure, extraits de levure, produit de digestion tryptique de caséine, extrait de viande, poudre de sang, vian- de protéinique et déchets d'os, farine de saumon , farines de poissons, produits de poissons solubles, produits solubles de distilleries, etc.
Si on le désire, les champignons peuvent être cultivés en utilisant des protéines (ou aminoacides) sans qu'au- cun hydrate de carbone ne soit présent dans le milieu, et dans ce cas les protéines (ou aminoacides) servent à la fois de sour- ce de carbone et d'azote exigés par le micro-organisme.
Les micro-organismes, dont des cultures sélectionnées sont considérées comme appropriées à la fermentation, en utilisant des milieux d'alimentation aqueux contenant du cobalt ajouté, sont des éléments de Champignons, tels que définis aux pages 1 et 2 de l'ouvrage intitulé : "An Introduction to Industrial Mycology" par Smith & Raistrick (Londres, Edward Arnold and C , troisième édition, i946), c' est :ci dire des Myxomycètes, Schizomycetes et Eumycetes. Les Schisomycetes conviennent par- ticulièrement bien, et particulièrement certaines cultures du genre Streptomyces griseus qui peuvent être également utilisées à la production des antibiotiques streptomycine et griséine.
D'autres variétés de Streptomyces, telles que Streptomyces albidoflavus, Streptomyces colombiensis nov. sp. Streptomyces rosechromogenus et Streptomyces antibioticus comprennent des cultures produisant de grandes quantités de substances à activi- té LLD. D'autres Schizomycetes appropriés sont des éléments du genre Clostridium, et on a trouvé que des cultures sélectionnées des variétés suivantes produisent des substances à activité LLD dans les conditions de fermentation du procédé de l'invention; clostridium tetanoporphum, Clostridium cochlearium, Clostridium
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flabelliferum et Clostridium butyricum.
D'autres micro-organis- mes parmi les champignons, qui ont été trouvés de môme produire une activité LLD sont les Torula, Eremothecium ashbyii et Escherichia coli. Il faut cependant appuyer sur le fait que pour un genre quelconque donné de champignon, il est nécessai- re de choisir des cultures produisant des substances à activité LLD. L'invention n'est ni limitée à un champignon quelconque en particulier et ne comprend non plus n'importe qielle culture d'un champignon donné quelconque. D'autre part., tout micro-orga- nisme essayé jusqu'à présent, produisant des substances à acti- vité LLD, produira ces substances à, activité LLD avec un ren- dement notablement accru si on la cultive dans un milieu ali- mentaire aqueux contenant une concentration optimum en cobalt.
Le milieu est stérilisé et le milieu stérilisé contenant la quantité désirée de cobalt est inoculé dans une culture du champignon choisi, et le mélange est soumis à l'incubation jusqu'à ce qu'on atteigne l'activité LLD optimum. On conduit habituellement la fermentation pendant une période d'environ deux à sept jours, bien que des durées plus courtes ou plus longues puissent être employées si on le désire. L'incubation s'effectue d'habitude dans des conditions submergées et à une température appropriée au champignon spécifique utilisé.
La vitamine B12 peut être séparée du mélange de fermenta- tion sous forme cristalline, si on le désire, par filtration de la bouillie de fermentation et traitement de la bouillie filtrée par du charbon de bois activé, pour adsorber la vita- mine B12. On élutrie le charbon activé par une solution aqueuse de pyridine ou d'alpha-picoline et on évapore l'élutriat à sic- cité. On extrait le concentré solide par un alcool aliphatique inférieur, tel que l'alcool méthylique, et on fait passer l'ex- trait alcoolique à travers une colonne chargée d'alumine acti-
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vée pour adsorber la vitamine B12 sur l'alumine.
On fait en- suite passer dais la colonne un solvant d'alcool aliphatique inférieur frais et on réunit les fractions de l'élutriat qui présentent une activité de vitamine B12 (telle que déterminée par l'essai microbiologique), et on concentre les élutriats réunis. On mélange alors la solution alcoolique concentrée à un liquide miscible à la solution et dans lequel la substance active est insoluble, comme l'acétone. On purifie le précipité qui se forme par reprécipitation à partir d'alcool par addi- tion d'acétone et on purifie le produit davantage par cristalli - sation à partir d'eau par addition d'acétone pour produire la vitamine B12 cristalline.
Les exemples qui suivent illustrent des procédés d'applica- tion de la présente invention., mais il est bien entendu que ces exemples sont donnés à titre d'illustration et non de li- mitation.
EXEMPLE 1
On prépare des milieux contenant 2 % de levure séchée en suspension dans l'eau distillée et différentes quantités de co- balt (sous forme de nitrate de cobalt), comme on l'indique sur le tableau suivant, et on les subdivise dans des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml. contenant 40 ml. par flacon. Après stérilisation des flacons et de leurs contenus à 1200 C pen- dant une demi -heure, on inocule les flacons au moyen d'envi- ron 2,5 % en volume d'une culture végétative de 48 heures de Streptomyces griseus 25G (culture produisant la griséine) cul- tivée dans un milieu d'extrait de viande-produit de digestion tryptique de caséine. Après inoculation, on maintient les bouillies inoculées à 280 C pendant 4 jours pendant lesquels on les remue continuellement sur une machine à remuer rotative.
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Après la fin de cette période de fermentation., les activités des bouillies, déterminées par des essais sur le Lactobaoillus lactis Dorner sont les suivantes :
Cobalt : parties par Unités LLD par ml. de million bouillie fermentée
EMI8.1
<tb> 0 <SEP> 300
<tb>
<tb> 1 <SEP> 2760
<tb>
<tb> 2 <SEP> 3000
<tb>
<tb> 10 <SEP> 4600
<tb>
<tb> 20 <SEP> 3000
<tb>
E X E M P L E 2
EMI8.2
..¯¯¯..s..,sm rmvm On prépare un milieu contenant les éléments suivants : Viande protéinique et déchets d'os . 8 % Chlorure de sodium ........ 05 %
EMI8.3
Fes04.HaO ........... 15 parties par mail- lion
Eau distillée pour parfaire le total de 100 %.
On prépare ce milieu, on le stérilise, on l'inocule et on le soumet à l'incubation comme il est décrit dans l'exemple 1. La deuxième partie du même mélange additionnée de 2 parties par million de cobalt (qu'on ajoute sous forme de nitrate de cobalt) est stérilisée, inoculée et soumise à l'incubation de la même manière. A la fin de la période de fermentation, les bouillies donnent les analyses suivantes :
EMI8.4
Sans cobalt Cobalt 2 parties dan million 160 unités LLD/ml 590 unités LLD/ml.
EXEMPLE 3 On prépare des milieux de fermentation contenant les
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constituants suivants :
Produit de digestion tryptique de caséine 1 %
Extrait de viande ............. 0,3 %
Chlorure de sodium ............ 0,5 %
FeSO4.H2O ................ 50 parties par million.
Huile de fèves de soya ......... 0,15 % (comme antimousse)
Eau de conduite pour parfaire un total de 100 %.
On prépare le milieu ci-dessus dans un appareil de fermen- tation de 3000 gallons et on le stérilise. On inocule le milieu par 275 gallons d'inoculum végétatif d'une culture produisant la griséine de Streptomyces griseus, désignée comme 25G, et on soumet le milieu à l'incubation à 28 C pendant 48 heures dans des conditions agitées., submergées et aérées.
On soumet la bouillie fermenté à un essai en utilisant la Lactobacillus lactis Dorner comme organisme d'essai et on traite ensuite la bouillie pour obtenir la vitamine B12 cris- 12 talline. On effectue cette obtention par filtration de la bouil- lie et adsorption de la matière active qu'elle renferme au moyen de charbon de bois activé. On élutrie l'adsorbat du charbon par une solution aqueuse de pyridine et on évapore l'é- lutriat résultant à siccité sous pression réduite.
On extrait le concentré solide ainsi obtenu par l'alcool méthylique et on adsorbe l'extrait alcoolique dans une colonne en utilisant de l'alumine activés, et on élutrie la matière active, au moyen d'alcool méthylique frais. On concentre ensemble les fractions présentant l'activité microbiologique la plus prononcée et on mélange ensuite la solution concentrée avec de l'acétone, pour précipiter la vitamine B12 brute, qu'on sépare. On purifie ce produit par réprécipitation de sa solution dans l'éthanol par @
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addition d'acétone. On purifie davantage ce produit par cris- tallisation en partant d'eau-acétone pour produire de la vita- mine B12 cristalline.
Les résultats suivants ont été obtenus sur des essais en duplicata montrant l'effet du cobalt, qu'on a ajouté sous for- me de nitrate de cobalt : Essais n Cobalt, parties Puissance des bouillies Vitamine % par million Unités LLD/ml. cristalline
EMI10.1
¯¯¯¯ ¯...¯¯¯ ni ¯ .=-âÉB&r4e¯
EMI10.2
<tb> 1 <SEP> Aucun <SEP> 173 <SEP> 18,4 <SEP> mgrs.
<tb>
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> parties <SEP> 3250 <SEP> (en <SEP> moyenne) <SEP> 106.7 <SEP> mgrs.
<tb>
EXEMPLE 4
On prépare un milieu de fermentation contenant les consti- tuants suivants :
Farine de fèves de soya (Staley 4-s) 3 %
Dextrose .............. 2%
EMI10.3
Nazi .............. z 25 z%
Produits de distilleries solubles 0,75 %
Eau pour parfaire un total de 100 %
On prépare ce milieu et le subdivise dans des flacons d'Erlenmeyer de 250 ml. contenant 40 ml. par flacon. On ajoute différentes quantités de cobalt (sous forme de nitrate de co- balt) comme on l'indique sur le tableau ci-dessous et on stéri- lise les flacons et leur contenu par chauffage à 1200 C. pen- dant une demi-heure. On inocule les flacons avec environ 2,5 % en volume d'une culture végétative de 48 heures d'une culture de Streptomyces griseus produisant de la streptomycine.
Après
EMI10.4
inoculation,, on Maintient les bouillies inoculées à 27 C. pen- dant 3 jours et, pendant ce temps, on les remue continuellement dans uns machine à remuer rotative. A la fin de cette période de fermentation, las activités de streptomycine et LLD des
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bouillies sont les suivantes :
Cobaltparties par million Streptomycine Unités LLD/ml.
EMI11.1
¯¯#, ¯ ¯¯¯¯¯ #¯. nr! .e. ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI11.2
<tb> 0,0 <SEP> 850 <SEP> 300
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,5 <SEP> 825 <SEP> 3000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 845 <SEP> 3100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2,0 <SEP> 650 <SEP> 4200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> , <SEP> 0 <SEP> 235 <SEP> 5000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,0 <SEP> moins <SEP> de <SEP> 150 <SEP> 2400
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8,0 <SEP> idem <SEP> 2000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12, <SEP> 0 <SEP> idem <SEP> 220
<tb>
EXEMPLE 5 On prépare un milieu contenant les constituants suivants:
EMI11.3
<tb> Infusion <SEP> cervelle-coeur <SEP> ...... <SEP> 18,5 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Agar <SEP> ................ <SEP> 1,85 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Eau <SEP> 495 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> $7,0-7,2
<tb>
On prépare ce milieu et le subdivise dans des flacons Erlenmeyer contenant 100 ml. de milieu par flacon. On stérili- se les flacons et leurs contenus par chauffage pendant 25 mi- nutes à 120 C. On refroidit les milieux à 370C. et les inocule par 1 ml. par flacon d'une suspension de Clostridium tetanomor- phum cultivée anaérobiquement sur un milieu cervelle-foie-coeur Bacto. Après inoculation, on maintient les bouillies inoculées au repos à 37 C pendant une période indiquée sur le tableau ci-dessous.
On stérilise, inocule et soumet à l'incubation de façon semblable un second groupe de flacons contenant la même milieu
EMI11.4
additionné de 10 microgrammes d'haaa,hrdrats de nitrate de co- balt par ml. (environ 3 parties de cobalt par million de par- ties par milieu). A la fin de la période de fermentation les
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bouillies donnent les résultats d'essais suivants (les valeurs données ont été obtenues en prenant la moyenne des valeurs obtenues sur quatre fermentations différentes effectuées cha- cune dans les conditions indiquées).
Période pas de Activité LLD par ml. de fermentation cobalt Cobalt: 3 parties -par million.
EMI12.1
<tb>
Jours
<tb>
<tb> 4 <SEP> 600 <SEP> 4600
<tb>
<tb> 7 <SEP> 760 <SEP> 6300
<tb>
On peut apporter différents changements et modifications au mode d'application de la présente invention sans s'écarter de son esprit ni de son domaine, par exemple en utilisant des milieux d'alimentation solides tels que du son de grain au lieu des milieux d'alimentation spécifiés. Pour autant que ces chan- gements et modifications rentrent dans le domaine des revendica- tions jointes, ils doivent être considérés comme faisant partie de l'invention.
REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de substances vitaminiques, caracté- risé en ce qu'il comprend la fermentation d'un milieu d'a- limentation contenant du cobalt ajouté, au moyen d'une culture de micro-organisme produisant une activité LLD, et appartenant aux champignons sub -phylum .
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Process for the preparation of vitamin substances.
The invention relates in general to the production of substances of therapeutic and nutritional value by fermentation, and in particular to an improved process for the microbiological production of vital substances having properties promoting the fermentation. growth of the microorganism Lactobacillus lactis Dorner. It is also rela-
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tive to an improved process for the microbiological production of vitamin B 12. Vitamin B 12 is a water soluble derivative, red in color, crystalline which can be extracted from the liver and useful in the treatment of certain kinds of human anemia, by example pernicious anemia. It is also useful as a feed factor for animals.
The object of the invention is the production of vitamin substances by fermentation of a food medium containing added cobalt, by means of a culture producing LLD activity of a microorganism belonging to the sub-phylum fungi.
Vitamin substances such as vitamin B12 produced by application of the improved method of the invention are conveniently studied using the growth response of the microorganism Lactobacillus lactis Dorner under the conditions described by Shorb (J. Biol. Chem, 169.455-6). The potencies of these vitamin substances and of fermented porridge and concentrates enriched with them, are expressed in terms of LLD activity based on an arbitrary liver standard, having a potency of 1,000 LLD units per milligram. Pure crystalline vitamin B12 has been determined to have an LLD activity of about 11,000,000 LLD units / mgr.
Vitamin substances having LLD activity are produced by fermenting feed media with selected cultures of different varieties of subphylum fungi. The potency of porridge resulting from the fermentation of ordinary feeding media by these organisms, however, is excessively low compared to the potency of pure vitamin B12. These products have a variable content of substances with LLD activity, which depends on the variety of fungus used, but usually they have an LLD activity equivalent to a vitamin B12 content of the order of 0.00003 mgs / ml.
It is extremely difficult to separate the
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pure vitamin B12 or concentrates with high activity LLD activity, large amounts of impurities present in these media. It is therefore of great importance to find a way to increase the LLD potency of the fermented broth and at the same time increase the concentration of LLD active substances relative to the total solids of the slurry.
It has now been discovered that these objects can be achieved by cultivating cultures of fungi which produce substances having LLD activity in aqueous feed media containing added cobalt. It has been found that when these fungi are grown in the presence of added cobalt greatly increased amounts of LLD active substances are produced by the microorganism. There is thus obtained a final slurry of greatly increased LLD activity, and also a considerable increase in the concentration of vitamin B12 relative to the total solids of the slurry.
This increased microbiological production of material with LLD activity not only facilitates the separation of pure vitamin B12 from the fermented slurry but also makes it possible to use the solids of the slurry as a feed supplement for animals.
It is particularly surprising that the addition of cobalt can stimulate an increased microbiological production of substances with LLD activity such as vitamin B12, since it is known that cobalt is extremely toxic to many microorganisms. . It has been found that at higher concentrations cobalt is in fact also toxic to cultures of fungi which produce substances with LLD activity. For example, an amount of cobalt (in the form of cobalt nitrate) of more than 10 to 20 parts per million based on the medium actually prevents the production of LLD active substances by the fungus Streptomyces grisous.
You can vary the amount of cobalt present during
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fermentation depending on the medium used but it is usually preferred to employ an amount of cobalt between 0.1 and 20 parts per million parts of medium. In some cases, it may be desirable to use higher or lower amounts of cobalt depending on the toxicity of the cobalt to the particular fungus employed. In the case of Streptomyces griseus. Fermentation slurries of high LLD activity were prepared and excellent production of crystalline vitamin B12 was ensured by culturing the microorganisms in media containing about two parts cobalt per million (as cobalt nitrate).
The cobalt can be added in metallic form, but it is usually added as a cobalt compound, preferably a cobalt salt such as cobalt nitrate; or in the form of a naturally occurring cobalt salt or complex such as may exist in cobalt-rich microbial foods. Due to the difficulty of securing the desired amount of cobalt by adding these naturally occurring nutrients, it is preferred to add the cobalt in the form of a cobalt salt.
For the application of the invention, a feed medium commonly used for the propagation of fungi can be used. The production of LLD activity by a given fungus may, it is true, vary depending on the feed medium employed, but it has been found that for any given type of medium too low in cobalt, the addition of a small amount of cobalt invariably produces a large increase in the production of substances with LLD activity.
Common foods include a source of assimilable carbon, a source of assimilable nitrogen, inorganic salts, and potency factors when necessary. The carbon can be introduced in the form of a carbohydrate such as dextrose, maltose., Xylose .. invert sugar, sirgpde /
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grains, etc. Nitrogen can be introduced in the form of an ammonium salt of amino acids or proteins, such as soya beans, oats, yeast, yeast extracts, triptych casein digestion product, meat extract, blood powder, protein meats and bone waste, salmon meal, fish meal, soluble fish products, soluble products from distilleries, etc.
If desired, the fungi can be cultivated using proteins (or amino acids) without any carbohydrates present in the medium, and in this case the proteins (or amino acids) serve both as sour - that of carbon and nitrogen required by the micro-organism.
Microorganisms, from which selected cultures are considered suitable for fermentation, using aqueous feed media containing added cobalt, are elements of Fungi, as defined on pages 1 and 2 of the work entitled: "An Introduction to Industrial Mycology" by Smith & Raistrick (London, Edward Arnold and C, third edition, i946), ie Myxomycetes, Schizomycetes and Eumycetes. Schisomycetes are particularly suitable, and particularly certain cultures of the genus Streptomyces griseus which can also be used for the production of the antibiotics streptomycin and grisein.
Other varieties of Streptomyces, such as Streptomyces albidoflavus, Streptomyces colombiensis nov. Sp. Streptomyces rosechromogenus and Streptomyces antibioticus include cultures producing large amounts of LLD active substances. Other suitable Schizomycetes are members of the genus Clostridium, and selected cultures of the following varieties have been found to produce substances with LLD activity under the fermentation conditions of the process of the invention; clostridium tetanoporphum, Clostridium cochlearium, Clostridium
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flabelliferum and Clostridium butyricum.
Other microorganisms among fungi which have also been found to produce LLD activity are Torula, Eremothecium ashbyii and Escherichia coli. However, it should be emphasized that for any given genus of fungus, it is necessary to choose crops producing substances with LLD activity. The invention is neither limited to any particular fungus nor does it include any culture of any given fungus. On the other hand, any microorganism tried so far which produces substances with LLD activity will produce these substances with LLD activity with a markedly increased yield if it is cultivated in a food medium. aqueous layer containing an optimum concentration of cobalt.
The medium is sterilized and the sterilized medium containing the desired amount of cobalt is inoculated into a culture of the selected fungus, and the mixture is incubated until optimum LLD activity is reached. The fermentation is usually carried out for a period of about two to seven days, although shorter or longer times can be employed if desired. Incubation is usually carried out under submerged conditions and at a temperature appropriate for the specific fungus used.
Vitamin B12 can be separated from the fermentation mixture in crystalline form, if desired, by filtration of the fermentation slurry and treatment of the filtered slurry with activated charcoal to adsorb the vitamin B12. The activated charcoal is eluted with an aqueous solution of pyridine or alpha-picoline and the elutriate is evaporated to dryness. The solid concentrate is extracted with a lower aliphatic alcohol, such as methyl alcohol, and the alcoholic extract is passed through a column loaded with activated alumina.
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vee to adsorb vitamin B12 on alumina.
A fresh lower aliphatic alcohol solvent is then passed through the column and the elutriate fractions which exhibit vitamin B12 activity (as determined by the microbiological test) are pooled, and the combined elutriates are concentrated. . The concentrated alcoholic solution is then mixed with a liquid miscible with the solution and in which the active substance is insoluble, such as acetone. The precipitate which forms by reprecipitation from alcohol is purified by the addition of acetone and the product is further purified by crystallization from water by the addition of acetone to produce crystalline vitamin B12.
The following examples illustrate methods of applying the present invention, but it is understood that these examples are given by way of illustration and not of limitation.
EXAMPLE 1
Media containing 2% dried yeast suspended in distilled water and various amounts of co-balt (as cobalt nitrate), as shown in the following table, are prepared and subdivided into vials. Erlenmeyer flask of 250 ml. containing 40 ml. per bottle. After sterilization of the vials and their contents at 1200 C for half an hour, the vials are inoculated with approximately 2.5% by volume of a 48-hour vegetative culture of Streptomyces griseus 25G (culture grisein producing) cultured in a medium of meat extract-triptic casein digestion product. After inoculation, the inoculated slurries are maintained at 280 ° C. for 4 days during which they are continuously stirred on a rotary stirrer.
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After the end of this fermentation period, the activities of the porridge, determined by tests on Lactobaoillus lactis Dorner are as follows:
Cobalt: parts per LLD Units per ml. million fermented porridge
EMI8.1
<tb> 0 <SEP> 300
<tb>
<tb> 1 <SEP> 2760
<tb>
<tb> 2 <SEP> 3000
<tb>
<tb> 10 <SEP> 4600
<tb>
<tb> 20 <SEP> 3000
<tb>
E X E M P L E 2
EMI8.2
..¯¯¯..s .., sm rmvm A medium is prepared containing the following elements: Protein meat and bone waste. 8% Sodium chloride ........ 05%
EMI8.3
Fes04.HaO ........... 15 games by mail- lion
Distilled water to make the total 100%.
This medium is prepared, sterilized, inoculated and subjected to incubation as described in Example 1. The second part of the same mixture supplemented with 2 parts per million of cobalt (which is added as cobalt nitrate) is sterilized, inoculated and incubated in the same manner. At the end of the fermentation period, the porridge gives the following analyzes:
EMI8.4
Cobalt Free Cobalt 2 parts in million 160 LLD units / ml 590 LLD units / ml.
EXAMPLE 3 Fermentation media are prepared containing the
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following constituents:
1% casein tryptic digestion product
Meat extract ............. 0.3%
Sodium chloride ............ 0.5%
FeSO4.H2O ................ 50 parts per million.
Soybean oil ......... 0.15% (as defoamer)
Pipe water to perfect a total of 100%.
The above medium is prepared in a 3000 gallon fermentation apparatus and sterilized. The medium is inoculated with 275 gallons of vegetative inoculum of a grisein producing culture of Streptomyces griseus, designated as 25G, and the medium is incubated at 28 ° C for 48 hours under shaken, submerged and aerated conditions. .
The fermented slurry was tested using Lactobacillus lactis Dorner as the test organism and then the slurry was processed to obtain crystalline vitamin B12. This is achieved by filtration of the broth and adsorption of the active material which it contains by means of activated charcoal. The adsorbate is eluted from the carbon with an aqueous solution of pyridine and the resulting elutriate is evaporated to dryness under reduced pressure.
The solid concentrate thus obtained is extracted with methyl alcohol and the alcoholic extract is adsorbed in a column using activated alumina, and the active material is eluted with fresh methyl alcohol. The fractions showing the most pronounced microbiological activity are concentrated together and the concentrated solution is then mixed with acetone to precipitate the crude vitamin B12, which is separated. This product is purified by reprecipitation of its solution in ethanol with @
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addition of acetone. This product is further purified by crystallization from water-acetone to produce crystalline vitamin B12.
The following results were obtained on duplicate tests showing the effect of cobalt, which was added as cobalt nitrate: Tests n Cobalt, parts Potency of slurries Vitamin% per million LLD units / ml. crystalline
EMI10.1
¯¯¯¯ ¯ ... ¯¯¯ ni ¯. = - âÉB & r4ē
EMI10.2
<tb> 1 <SEP> None <SEP> 173 <SEP> 18.4 <SEP> mgrs.
<tb>
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> parts <SEP> 3250 <SEP> (in <SEP> average) <SEP> 106.7 <SEP> mgrs.
<tb>
EXAMPLE 4
A fermentation medium is prepared containing the following constituents:
Soybean flour (Staley 4-s) 3%
Dextrose .............. 2%
EMI10.3
Nazi .............. z 25 z%
Soluble distilleries 0.75%
Water to perfect a total of 100%
This medium is prepared and subdivided into 250 ml Erlenmeyer flasks. containing 40 ml. per bottle. Various amounts of cobalt (as cobalt nitrate) are added as indicated in the table below and the vials and their contents are sterilized by heating at 1200 ° C. for half an hour. . The vials are inoculated with about 2.5% by volume of a 48 hour vegetative culture of a streptomyces griseus culture producing streptomycin.
After
EMI10.4
Inoculation, The inoculated slurries are kept at 27 ° C. for 3 days and during this time they are continuously stirred in a rotary stirrer. At the end of this fermentation period, the streptomycin and LLD activities of the
<Desc / Clms Page number 11>
porridge are as follows:
Cobaltparties per million Streptomycin LLD units / ml.
EMI11.1
¯¯ #, ¯ ¯¯¯¯¯ # ¯. nr! .e. ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI11.2
<tb> 0.0 <SEP> 850 <SEP> 300
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.5 <SEP> 825 <SEP> 3000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 845 <SEP> 3100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2.0 <SEP> 650 <SEP> 4200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP>, <SEP> 0 <SEP> 235 <SEP> 5000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6.0 <SEP> less <SEP> of <SEP> 150 <SEP> 2400
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8.0 <SEP> same as <SEP> 2000
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12, <SEP> 0 <SEP> same as <SEP> 220
<tb>
EXAMPLE 5 A medium is prepared containing the following constituents:
EMI11.3
<tb> Infusion <SEP> brain-heart <SEP> ...... <SEP> 18.5 <SEP> gr.
<tb>
<tb> Agar <SEP> ................ <SEP> 1.85 <SEP> gr.
<tb>
<tb>
<tb>
Water <SEP> 495 <SEP> ml.
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> $ 7.0-7.2
<tb>
This medium is prepared and subdivided into Erlenmeyer flasks containing 100 ml. of medium per vial. The vials and their contents were sterilized by heating for 25 minutes at 120 ° C. The media were cooled to 370 ° C. and inoculate them with 1 ml. per vial of a suspension of Clostridium tetanomorphum grown anaerobically on a Bacto brain-liver-heart medium. After inoculation, the inoculated slurries are kept standing at 37 ° C. for a period indicated in the table below.
A second group of vials containing the same medium is sterilized, inoculated and incubated in a similar fashion.
EMI11.4
added 10 micrograms of haaa, hrdrates of cobalt nitrate per ml. (about 3 parts of cobalt per million parts per medium). At the end of the fermentation period the
<Desc / Clms Page number 12>
slurries give the following test results (the values given have been obtained by taking the average of the values obtained from four different fermentations each carried out under the conditions indicated).
Period no LLD activity per ml. fermentation cobalt Cobalt: 3 parts-per million.
EMI12.1
<tb>
Days
<tb>
<tb> 4 <SEP> 600 <SEP> 4600
<tb>
<tb> 7 <SEP> 760 <SEP> 6300
<tb>
Various changes and modifications to the mode of application of the present invention can be made without departing from its spirit and scope, for example by using solid feed media such as grain bran instead of grain bran media. power supply specified. So far as these changes and modifications fall within the scope of the appended claims, they are to be regarded as forming part of the invention.
CLAIMS 1.- Process for the preparation of vitamin substances, characterized in that it comprises the fermentation of a feed medium containing added cobalt, by means of a culture of microorganism producing LLD activity , and belonging to the sub -phylum fungi.