CA2123587A1

CA2123587A1 - Bactericide product; pharmaceutical composition and food additive containing the same

Info

Publication number: CA2123587A1
Application number: CA002123587A
Authority: CA
Inventors: Jean Dabard; Francoise Ramare; Pierre Raibaud
Original assignee: Individual
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1991-11-15
Filing date: 1992-11-16
Publication date: 1993-05-27
Also published as: WO1993010153A1; FR2683724A1; AU3163093A; JPH07501328A; ZA928679B; EP0613484A1

Abstract

2123587 9310153 PCTABS00162 La présente invention concerne un produit bactéricide, caractérisé en ce qu'il comporte un noyau porphine. Elle concerne également une composition pharmaceutique ainsi qu'un additif alimentaire contenant un tel produit.2123587 9310153 PCTABS00162 The present invention relates to a bactericidal product, characterized in that it comprises a porphine nucleus. It also relates to a pharmaceutical composition and a food additive containing such a product.

Description

WO 93/lOlS3 2 1 2 3 5 ~ 7 PCI/FR92/01063 .'' 1 PRODUIT ~ACTERICIDE, COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE CON-TENANT ET ADDITIF ALIMENTAIRE.

La présente inven~ion concerne de nouvelles substances 5 bactericides, possédant un spectre d'ac~ivité étendu.
Parmi les substances bactéricides connues, on distingue notamment un certain nombre d'antibiotiques, et les antiseptiques.
Les antiseptiques sont des agents chimiques qui s'opposen~ à la prolifération des microorganismes et les détruisent. On peut citer par l0 exemple la chlorhexidine, les halogènes, les sels de métaux lourds, les ammonlums qualernaires, l'acide salicylique et ses dérivés.
Les antibiotlques sont définis à l'origine comme des substances chimiques produites par des microorganismes et ayant le pouvoir d'inhiber ou de détruire les bactéries et d'autres microorganismes, en solution diluée.
15 Un grand nombre de ces molécules sont actuellement préparées par hémisynthèse ou synthèse chimique.
Ces molécules peuvent avoir une action ~actériostatique ou bactéricide.
On distingue plusieurs grandes familles d'antibiotiques, en 20 fonction de leur structure et de leur mode d'action. Les principales sont lesbéta-lactamines (pénicillines et céphalosporlnes), les aminosides, les cyclines, les phénicolés, les macrolides, les polymyxlnes et les qulnolones.
Les sulfamides constituent un autre groupe de produits antibactérlens.
Cependant, l'emergence constante de souches préseritant une 25 résistance aux substances bactéricldes connuès et la propagation rapide de ce caractère, conduisent à rechercher en permanence de nouveaux prodults actifs.
En outre, on recherche de plus en plus des antibiotiques présentant des spectres limités ou destinés à des applications spécifiques.
30 de façon à ne pas bouleverser, notamment au niveau digestif, l'équllibre microbiologique naturel.
L'un des intérêts du produit selon la présente Inventlon, est de présenter une activilé intéressan~e sur des bactéries impliquées dans les désordres du système digestif, en particulier les Clostridium.
3~

WO 93/10153 PCl`/FR92/01063 21~3~X~ 2 En effet, on a découvert que des dérivés porphyriques possèdent une activité bactéricide.
La présente invention a pour objet un produit bactéricide, caractérisé en ce qu'il comporte un noyau porphine.
Le noyau porphine est le noyau fondamental des porphyrines, constitué par quatre noyaux pyrroliques reliés par quatre chainons -CH=
et se trouve représenté ci-dessous:

--C H ~
~I~C~H ~ CHO

1 5 R~

avec R=R =R -H

L'invention se rapporte aux dérivés des porphyrines, pour leur 20 application en tant que substances thérapeutiquement actlves, en particulier en tant que produits bactéricides.
Parmi les produits bactérlcides selon l'inventlon, on peut notamment citer les produits comportant une molécule d'hématoporphvrine, pour laquelle R-CH3, R 1 =CHOH-CH3 et R2=CH2CH2COOH.
D'autres produits bactéricides particulièrement adaptés selon l'invention sont les produits comportant au moins une molécule choisle parmi l'hémine et l'hématine; I'invention concerne également un produit bactéricide qui comporte au moins une partie du groupement hème. ou au moins une molécule dérivée des chlorophyllines~ qui sont des sels des 30 différentes chlorophylles.
Par fixation comple.xante d'un groupement métalllque auY
quatre atomes d'azote du squelette de base, on obtient une série de groupements prosthétiques qui conviennent à la mise en oeuvre de l'invention.

WO 93/101~3 2 1 2 3 ~i ~ 7 PCr/FR92/01063 Cependant, la présence de ce groupement métallique n'apparaît pas essentielle, et sa nature peut être variable, avec conser-vation de l'activité bactéricide des dérivés. Ces pararnètres seront adaptés par l'homme du métier.
Le produit bactéricide selon l'invention peut être prépare par synthèse, tout au moins pour sa partie porphyrlque; ceci présente des avantages tant pour des raisons de sécurlté que de spécificité d'action.
Selon un autre aspect de l'invention, le produit bactériclde peut être préparé par incubation d'un substrat contenant de l'hémoglobine avec un mélange enzymatique contenant au moins une prc~téase (puis récupération de la solution du prodult obtenue).
Le produit bactéricide peut être obtenu à partir de différents substrats contenant de l'hémoglobine, notamment à partir de sang total. de globules rouges, du contenu érythrocytaire ou d'hémoglobine purifiée.
On fait agir sur ce substrat un mélange enzymatique contenant au moins une protéase, notamment de la trypsine; toutefois, de meilleurs résul~ats sont obtenus en associant la trypslne à d'autres enzymes, tels que celles trouvées dans le suc pancréatique ou dans les surnageants de fecès d'animaux axéniques.
Le produit bactéricide peut également être obtenu par incubation d'un substrat contenant de l'hémoglobine avec de la protélnase K. L'hydrolyse est alors conduite de préférence à une tempéra~ure de l'ordre de 50 C.
Les conditions de l'incubation dépendront de l'actlvlté du mélange enzymatique et de l'origine du sùbstra~, mais la dlgestlon est conduite de préférence à 37 C pendant envlron 24 heures, mals ll est possible d'utiliser des tempéralures inférieures jusqu'à ~0 C, et des durees de l'ordre de 1 heure à 72 heures.
Après incubation. Ie produit est récupéré en solution après élimination des éléments solides résiduels.
Le produit selon la presente invention peut être prepare notamment par le procédé sulvant:
a) on centrif uge un échantlllon de sang to~al de mammifère~ et on recueille le culot co~tenant les érythrocvtes, WO 93/101~3 PCl`/FR92/01063 212~ ~8~

b) après lavage (par exemple avec une solution tampon isotonique), on met le culot en présence d'eau distillée pour provoquer l'hémolyse des érythrocytes, c) on centrifuge, 5 d) on fait incuber le surnageant obtenu à l'issue de l'étape c) avec du suc pancréatique, e) la solution de produit bactéricide obtenue est stérllisée par flltratlon (0,45 ~m~.
Le sang peut provenir de différents mammifères. Il est recueilli sur un anticoagulant comme l'héparine.
Les érythrocytes sont isolés, par exemple par centrifugalion à
2000 rpm, 10 min à +4 C, pUlS lavés dans le même volume de tampon~ de préférence du tampon PBS; ils sont ensuite hemolysés par addition du même volume d'eau distillée, et les débris cellullaires sont séparés du contenu érythrocytaire par centrlfugation, par exemple à 13000 rpm, l min à +4 C- L'extrait obtenu peut être conservé à s4 C ou congelé à -20 C, s'il n'est pas soumis immédiatement à l'action des enzymes.
L'incubation en présence du mélange enzymatique est plus particulièrement e~fectuée à 37 C pendant 24 heures? en aérobiose, après WO 93 / lOlS3 2 1 2 3 5 ~ 7 PCI / FR92 / 01063 . '' 1 PRODUCT ~ ACTERICIDE, PHARMACEUTICAL COMPOSITION CON-SUPPORT AND FOOD ADDITIVE.

The present invention relates to new substances 5 bactericides, with an extended spectrum of activity.
Among the known bactericidal substances, there are including a number of antibiotics, and antiseptics.
Antiseptics are chemical agents that oppose ~
proliferation of microorganisms and destroy them. We can quote by l0 example chlorhexidine, halogens, heavy metal salts, qualitative ammoniums, salicylic acid and its derivatives.
Antibiotics were originally defined as substances chemicals produced by microorganisms with the power to inhibit or destroy bacteria and other microorganisms, in a dilute solution.
15 Many of these molecules are currently being prepared by hemisynthesis or chemical synthesis.
These molecules can have an acterostatic action or bactericide.
There are several major families of antibiotics, 20 according to their structure and their mode of action. The main ones are lesbeta-lactams (penicillins and cephalosporins), aminoglycosides, cyclins, phenicolics, macrolides, polymyxlnes and qulnolones.
Sulfonamides are another group of antibacterial products.
However, the constant emergence of strains 25 resistance to known bacteria and the rapid spread of this character, lead to the constant search for new prodults assets.
In addition, there is an increasing search for antibiotics with limited spectra or intended for specific applications.
30 so as not to upset, especially at the digestive level, the balance natural microbiological.
One of the interests of the product according to the present Inventlon, is to present an interesting activity on bacteria involved in digestive system disorders, especially Clostridium.
3 ~

WO 93/10153 PCl` / FR92 / 01063 21 ~ 3 ~ X ~ 2 Indeed, it was discovered that porphyritic derivatives have bactericidal activity.
The subject of the present invention is a bactericidal product, characterized in that it comprises a porphine core.
The porphine nucleus is the fundamental nucleus of porphyrins, consisting of four pyrrol nuclei connected by four links -CH =
and is shown below:

--CH ~
~ I ~ C ~ H ~ CHO

1 5 R ~

with R = R = R -H

The invention relates to porphyrin derivatives, for their 20 application as therapeutically active substances, in especially as bactericidal products.
Among the bacterial products according to the invention, one can in particular mention the products containing a hematoporphvinin molecule, for which R-CH3, R 1 = CHOH-CH3 and R2 = CH2CH2COOH.
Other bactericidal products particularly adapted according to the invention are the products comprising at least one selected molecule among hemin and haematin; The invention also relates to a product bactericide which comprises at least part of the heme group. or to minus one molecule derived from chlorophyllins ~ which are salts of 30 different chlorophylls.
By complete fixing of a metal group in Y
four nitrogen atoms of the basic skeleton we get a series of prosthetic groups which are suitable for the implementation of the invention.

WO 93/101 ~ 3 2 1 2 3 ~ i ~ 7 PCr / FR92 / 01063 However, the presence of this metallic grouping does not appear essential, and its nature can be variable, with the bactericidal activity of the derivatives. These parameters will be adapted by the skilled person.
The bactericidal product according to the invention can be prepared by synthesis, at least for its porphyrlque part; this presents advantages both for safety reasons and for specific action.
According to another aspect of the invention, the bactericidal product can be prepared by incubating a substrate containing hemoglobin with an enzyme mixture containing at least one prc ~ tease (then recovery of the product solution obtained).
The bactericide can be obtained from different substrates containing hemoglobin, especially from whole blood. of red blood cells, erythrocyte or purified hemoglobin content.
An enzyme mixture containing this substrate is made to act at least one protease, in particular trypsin; however, better résul ~ ats are obtained by combining trypslne with other enzymes, such as those found in pancreatic juice or in feces supernatants axenic animals.
The bactericide can also be obtained by incubation of a hemoglobin-containing substrate with protellase K. The hydrolysis is then preferably carried out at a temperature of ~
around 50 C.
The conditions of the incubation will depend on the activity of the enzymatic mixture and the origin of sùbstra ~, but the dlgestlon is preferably run at 37 C for about 24 hours, but it is possible to use lower temperatures up to ~ 0 C, and durations in the range of 1 hour to 72 hours.
After incubation. The product is recovered in solution after elimination of residual solid elements.
The product according to the present invention can be prepared in particular by the sulvant process:
a) centrifuging a blood sample to mammal al ~ and collects the pellet co ~ holding the erythrocytes, WO 93/101 ~ 3 PCl` / FR92 / 01063 212 ~ ~ 8 ~

b) after washing (for example with an isotonic buffer solution), the pellet is placed in the presence of distilled water to cause hemolysis erythrocytes, c) centrifuging, 5 d) the supernatant obtained at the end of step c) is incubated with juice pancreatic, e) the solution of bactericidal product obtained is sterilized by flltratlon (0.45 ~ m ~.
The blood can come from different mammals. It is collected on an anticoagulant such as heparin.
The erythrocytes are isolated, for example by centrifugalion to 2000 rpm, 10 min at +4 C, pUlS washed in the same volume of buffer ~
preferably PBS buffer; they are then hemolyzed by adding the same volume of distilled water, and cell debris is separated from the erythrocyte content by centrlfugation, for example at 13000 rpm, l min at +4 C- The extract obtained can be stored at s4 C or frozen at -20 C, if it is not immediately subjected to the action of enzymes.
Incubation in the presence of the enzyme mixture is more particularly e ~ performed at 37 C for 24 hours? aerobically, after

2~ dilution du substrat dans la préparation enzymatique.
Selon un autre des aspects de l'invention, le produ bactéricide peut être obtenu par incubatlon d'hémoglobine purlflée humaine ou animale avec du suc pancréatique. Ce prodult peut etre stérilisé par filtration.
Dans le cas où l'incubation~ esl réalisée avec du suc pancréatique, on u~ilisera de préférence du suc pancréatique de porc, dilué
à 2 %.
L'action d'un mélange enzymatique tel qu'il a été définl ci-dessus, sur le sérum issu de la coagulation, le plasma des sangs héparlnés 30 séparé par centrifugation, ou les parois érythrocytaires séparées après WO 93/101~3 2 12 3 5 8 7 PCr~FR92/01û~3 hémolyse, conduit à un produit dépourvu d'activité bactéricide. De même, I'incubation du mélange enzymatique avec la globine seule conduit à un produi~ inactif, démonTrant la nécessité de la présence de l'hème lors de la réaction. L'action du mélange enzymatique sur le sang total conduit à un produit bactéricide ayant une activité inférieure à celle du produit obtenu à partir du contenu érythrocytalre.
De manière générale, I'activité bactéricide du produit est portée par ia fraction porphyrique, qui est insoluble dans l'eau.
Des produits solubles dans l'eau, préférés selon l'invention, comportent donc le noyau porphine évenluellement substitué et/ou complexé par un métal, et associé à un résidu de 3 à 10 acides amlnés, plus particulièrement des acides aminés provenant des chaînes de globlne.
L'analyse par chromatographie d'hydrolysats d'hémoglobine brute par la protéinase K permet de séparer et de purifier la plus petite molécule soluble en eau portant l'activité bactéricide. Il s'agit d'un composé absorbant à 214 nm et 380 nm, qui possède un poids moléculaire apparent compris entre 600 et 1000 daltons.
Un tel composé présente une bonne activité bactéricide, favorisée par une solubilité permettant une bonne répartition dans les liquides biologiques.
L'administration per os de ce produit à une souris axénlque permet de constater que l'activité du produit est maintenue dans le contenu intestinal. Il s'agit donc d'un produit qui n'est pas absorbé et resle dans la lumière du tractus digestif; en outre ce produit n'est pas dégradé par les enzymes digestives.
Si on le souhaite, le produit bactéricide peut comporter un nombre plus grand d'acides aminés. ce qui augmente sa solubililé et permet son passage éventuel à travers la barrière digestive pour avoir une ac~lvlté
systémique.
Les molécules actives ont comme structure commune le groupement porphyrinique et différent par les résidus d'acides ammes maintenus associés au noyau porphyre.
Elles sont autoclavables.

WO 93/10152 ~ dilution of the substrate in the enzyme preparation.
According to another aspect of the invention, the product bactericide can be obtained by incubation of purified hemoglobin human or animal with pancreatic juice. This product can be sterilized by filtration.
In the case where the ~ esl incubation carried out with juice pancreatic, preferably u ~ ilisera pancreatic juice of pig, diluted at 2%.
The action of an enzyme mixture as defined above, on the coagulation serum, the plasma of heparlated blood 30 separated by centrifugation, or the erythrocyte walls separated after WO 93/101 ~ 3 2 12 3 5 8 7 PCr ~ FR92 / 01û ~ 3 hemolysis, leads to a product devoid of bactericidal activity. Likewise, Incubation of the enzyme mixture with globin alone leads to a product ~ inactive, demonstrating the need for the presence of heme during reaction. The action of the enzyme mixture on whole blood leads to a bactericidal product having an activity lower than that of the product obtained from the erythrocyte content.
In general, the bactericidal activity of the product is carried by the porphyritic fraction, which is insoluble in water.
Water-soluble products, preferred according to the invention, therefore have the porphine nucleus possibly substituted and / or complexed by a metal, and associated with a residue of 3 to 10 amino acids, plus particularly amino acids from globlne chains.
Chromatography analysis of hemoglobin hydrolysates crude proteinase K separates and purifies the smallest water-soluble molecule carrying bactericidal activity. It is a absorbent compound at 214 nm and 380 nm, which has a molecular weight apparent between 600 and 1000 daltons.
Such a compound has good bactericidal activity, favored by a solubility allowing a good distribution in the biological fluids.
Oral administration of this product to an axenic mouse shows that the activity of the product is maintained in the content intestinal. It is therefore a product which is not absorbed and remains in the lumen of the digestive tract; furthermore this product is not degraded by digestive enzymes.
If desired, the bactericide may have a greater number of amino acids. which increases its solubility and allows its possible passage through the digestive barrier to have ac ~ lvlté
systemic.
Active molecules have as common structure the porphyrinic group and different by the residues of amino acids maintained associated with the porphyry nucleus.
They are autoclavable.

WO 93/1015

3 PCI~/FR92/01063 2l2~8~
Le produit bactéricide selon l'invention esl un produit ayant une partie substantielle de nature peptidique pouvant provenir de la globine. Le produit obtenu est certainement constitué par un mélan~e de molécules qui diffèrent par leur nombre d'acides aminés.
11 s'agit d'un produit résistant, dont l'activité perslste après un traitement à 60 C, pendant 15 heures~ Ce produit est Iyophilisable.
Il résiste en outre à l'action de la protéase K, 24 heures à
50 C.
Ce produit est sans doute dérivé de l'hémoglobine comportant tout ou partie de l'hème. Le produit bactéricide selon l'invention est actif sur des bactéries gram anaérobies strictes, en particulier sur des bactéries du genre Closlridium, tel que Clostridium per~ringens, Clostridium butyricum, et des sporulés isolés de la flore humaine. Il n'est pas actif sur plusieurs souches de Clostridium difficile. 11 est actif sur d'autres souches de la flore dominante de l'homme adulte, tel que bifides, les peptoslrep-tocoques, et Eubacterium.
Son activité s'exerce également sur les bactéries du genre Bacillus.
Ce produit est donc particulièrement intéressant puisqu'il s'agit d'un produit d'origine naturelle, actif sur des germes responsables d'infections particulièrement dangereuses; par exemple Clostridium butyricum est impliqué dans l'entérocolite ulcéronécrosante du nouveau-né.
Ce produit donne donc naissance à une nouvelle génération de substances inhibitrices, Iyophilisables, stérilisables par filtration. Ce produit purifié
pourra être utilisé notamment comme additif alimentaire, par exemple pour éviter les troubles observés lors du sevrage du porcelet.
Les produits bactéricides selon l'invention peuvent é~alement être utilisés comme conservateurs.
La présente invention concerne donc des composltions médicamenteuses comportant à titre de principe actif un produit selon la présente invention avec un excipient compatible avec une applicatlon thérapeutique notamment par vole orale.

2123 .~7 WO 93/10153 7 PCI`/FR92/01063 Il pourra s'agir notamment de compositions telles que des tablettes, comprimés? poudre ou autre f orme administrable per os.
La présente inventlon concerne également des comprlmés destinés à l'alimentationl notamment animale, contenanl SOlt des 5 concentrés du prodult selon l'invention destinés à être ajoutés aux allments proprement dits, soit à l'eau de boisson ou bien des pré-mélan~es d'aliments animaux contenant le produit selon l'invention.
D'autres carac~éristiques et avantages de la présenle Inventlon apparaitront à la lec~ure des exemples qui suivent.
Figure l: Mise en évidence de l'ef~et bactériclde des substances lnhibitrlces produltes par l'hydrolysat ES

EXEMPLE l: PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDF A PARTIR
DE SANG TOTAL

Du sang total ou ses fractions (globules rouges lavés, contenu érythrocytaire) sont traités par des enzymes digestives.

a) Ptéparation des substrats sanguins ~0 On utilise le sang de n'lmporte quel mammifère, homme ou animal, SOlt ses différentes fractlons obtenues par les technlques ciasslques de fractlonnement du sang:
- le sérum issu de la coagulatlon, - le plasma: surnageant de sang héparlné cer.trlfugé 2000 tours. l0 mln.
+4o C
- les globules rouges; culot de centrifuga~ion des sangs héparlnés lavés 3 fois en PBS 0901 M, - les parois des globules rouges obtenues après hémolyse dans l'eau dlstillée des globules rouges lavés centrlfuges ( 13000 tours. l 5 mln.
l 4C) - le contenu érythrocytalre (E) surnageant de centrlfugatlon de l'hemo-lysat des globules rouges.

b) Préparations enzymatiques On util ise :

- le surnageant des féces fraichement collectées sur rat ou sourls axéniques (sans germe) diluées au l/lOè, - le suc pancréatlque Iyophilisé de porc (S) à raison de 2 g/100 ml de PBS
0,0 l M, - la trypsine purifiée de bovin (Sigma T8642) à 5 mg/ml de P~S.

Suc pancréatique et trypsine sont préparés extemporanément.

c) Incubation des substrats dans les préparations enzymatiques Les su~strats sanguins fraîchemen~ préparés ou stockés, ali~uotés à la température ambiante ou au froid, sont dilués au l/lOè et au I t20è dans les préparations enzymatiques, ils sont incubés pendant 24h à
37 C.
EXEMPLE 2: ACTIVITE BACTERICII)E DE PRODUITS C)BTENUS A
l'EXEMPLE I

Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

WO 93/10153~ 1 2 ~ S X 7 PCI /FW2~01063 ... ~ 9 ~ ~L 1 ' 10 , ~ _ l l Q)~C
w ~o l l l ~ d u~ . _ E3 ~ r I C

1 5 ~ Z .~ _ l l l E~ ~ C
, ............ C:~ o c~ ~ ~ ~ _ ~

20 E 1~ l ¦ 3 ~ ~ O E
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Jo ~ CZ~I ~ E~o"

WO 93/101~3 PCI/FR92/01063 `'`' ~
~l23~87 L'incubation de sang humain total, d'un culot de globules rouges lavés ou de la fraction soluble de glohules rouges hémolysés avec les enzymes pancréatiques génère in vitro une activité bactéricide. L~
production des substances inhibitrices est le résultat d'un processus 5 en~ymatique: les témoins substrats sanguins et enzymes seuls sont sans ef f et.
Les substrats ne sont pas les constituants du sérum et du plasma. L'activité enzymatique s'exerce sur les globules rouges, non pas sur la paroi, mais sur le contenu érythrocytalre.
L'effet bactericide est moins fort avec le sang total; ceci est sans doute lié à la présence d'inhibiteurs trypsiques. L'actlvité bactériclde est plus forte après l'action de mélanges enzymatiques comme ceux présents dans les féces des animaux axéniques ou dans le suc pancréatique qu'avec la trypsine seule~

EXEMPLE 3: PREPARATION DE SU~STANCE BACTERICIDE A PARTIR
D'HEMOGLOBINE

Des hémoglobines brutes, de préférence purifiées (H) d`origine 20 humaine (Hl) ou animale (H2~ sont traitées par n'importe quel type de protéase, pas nécessairement digestive. On utilisera de préférence la protéinase K purifiée qui hydrolyse les proléines, glycoprotéines. peptldes e~ esters d'acides aminés.

2 5 a) Préparation des solutions d'tlémoglobine Hl: hémoglobine humaine purifiée ~Sigma H7379). Hl est diluée et utilisée à même concentration que celle du san~ d'un homme adulte. On dilue 12,5 à 15 g d'hémoglobine dans 100 ml de P~S 0~01~
H2 : hémoglobine bovine brute ou purifiée (Sigma H262 5-H2500). H2 est préparée comme Hl mais diluée 10 fois soit 1~2 à l.S
g/lOOml de PBS.

WO 93/lOlS3 Z 1 2 ~ 7 PCI/FR92/01063 b) Préparation enzymatique Une solution mère de protéinase K à 10 mg/ml est préparee en tampon Tris 0,OlM-pH=7,9. Cette solution est stabilisée avec 2 mM de 5 Ca+ sous forme de CaC12.

c) Conditions d'hydrolyse La protéinase K est utilisée à plusieurs concentralions, de 10 préférence à la concentration finale de 0,1 mg/ml d'hémoglobine à
hydrolyser. L'hydrolyse est conduite de préférence à 50 C sous agilation lente. La durée d'hydrolyse est variable de I heure à 24 heures. Les hydrolysals oblenus après 2 heures d'incubation génèrent une bonne activité antibiotique.
EXEMPLE 4: EFFICACITE INHIBITRICE DE DIFFERENTS TYPES
D'HYDROLYSATS

Les résultats d'hydrolysats obtenus montren~ que le contenu 20 érythrocytaire ou l'hémoglobine purifiée traités par la protéinase K à 0,1 mg/ml génère une substance inhibitrice sur BFR efficace jusqu'au 1/128. La quantité de substance bactériclde produite dépend de la concenlration d'hémoglobine à hydrolyser. L'hvdrolysat du contenu érvthrocytalre par le suc pancréatique produit une substance plus diffusible donc plus soluble.
Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

WO 93/lOlS3 PCI/FR92/01063 2123~87 5 ~ _ _ _ ~ C U~ ot~ U~ U~ U~

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3 0 ~ c ~ I _ ~ C v c _ c 5 WO 93/lOlS3 231 2 3 ~ 8 7 PCr/FR92/01063 EXEMPLE 5: PREPARATION DE SUBSTANCE BACTERICIDE A PARTIR
DES FRACTIONS DE L'HEMOGLOBINE

a) Extraction chimique de l'hème de l'hémo~lobine H 1 On uti lise la méthode de F. Ascoli et col. (Methods in enzvmology vol 76.5.1981 ) qui consiste à extraire la globine des hémoprotéines en enlevant l'hème. Le principe consiste, dans les conditions décrites, à mélanger 2,5 ml d'hémoglobine à 100 ml d'une solution d'acide chlorhydrique et d'acétone. Le précipité ou culot de centrifugation contienl la globine que l'on peut solubiliser en PBS. Le surnageant contient l'hème.
Pour tester l'activité de ce surnageant et parce que le mélange alcool acétone est inhibiteur de la croissance des cellules cibles BFR, il est 15 évaporé par Speed Vac. Le concentrat est insoluble en PBS mals peut être partiellement solubilisé en acétonitrile, 60 % dans 40 % d'acide Irifluoro-acétique à 0,1 % inactif sur les cellules BFR.

b~ Effet bactéricide des fractions de l'hémoglobine humaine purifiée, traitée par un mélange HCl Les résultats, présentés dans le tableau 3, montrent que le prlncipe actif de l'inhibition est localisé dans la fraction du sang forlement colorée: la fraction héminique. La fraction~ globinique est inactl~e alors que la fraction héminique conduit à un produit bactéricide insoluble en PBS
donc different dans sa structuré chimique des hydrolysats actlfs dejà
.
utlllses.

WO 93/10153 PCI`/FR92/01063 2123a8~

2 ~ 7 WO 93/10153 P{~/FR92/01063 EXEMPLE 6: EFFET BACTERICIDE DE DIFFERENTS TYPES DE
PORPHYRINES DU COMMERCE EXTRAITES DE
L'HEMOGLOBINE Oy DE CHLOROPLASTES

Tableau 4 Concenlration Minirnale Inhibl~rlce Types de porphyrlne .
à 2 m~/m I dans leur solvant ~acillus subtilis Clostridium l 5 __ _ _ ~FR perfringens Hématoporphyrine l /256 l /8 2b ~ 60% 1 ~
~1 0,016N ~ I/28 ~ 1/32 l 60 96 ~ 11256 ~ 1116 . . _ _ ._ .

Chlorophylline en PBS l /8 ~ l /64 lemoins solvant 0 ~ 0 16 ~.
2123~

L'effet inhibiteur obtenu soit avec une porphine (l'hémato-porphyrine~ soit avec des dérivés de substitution combinés au fer (hémine, hématine) ou bien au magnésium (chlorophylline) confirme que les noyaux porphyres sont impliqués dans l'activité bactéricide. Dans cet essai, la nature du complexe métallique seul (Fe ou Mg) ou chimiquement combiné
(FeCl, FeOH) n'est pas. déterminante. Les noyaux sont insolubles en eau mais ils peuvent être chimiquement solubilisés (cas de la chlorophylline) ou obtenus plus ou moins solubles (cas des hydrolysats) suivant le degré de dénaturation de la globine associee, en fonction de l'efficacité de la l protéase utilisée (suc pancréatique et protéinase K par exemple).
Toutes les chromoprotéides porphyriques peuvent générer une substance inhibitrice à partir de leur groupement proslhétique. Dans le cas de l'hémoglobine, mieux que l'extraction chimique, l'hydrolyse enzymatique moins coûteuse et plus spécifique conduit suivant le type de protéase, à la l 5 production de molécules héminiques actives qui diffèrent entre elles par leur niveau d'efficacité et leur solubilité en eau (exemple hydrolysat E5 et HK).

EXEMPLE 7: MISE EN EyIDENCE DE L'ACTIVITE ANTIBIOTIQUE SUR
DES CELLULES CIBl ES BACTERIENNES

1. Principe et realisation du test d'antibiose 108 cellules végétatives et viables d'une souche bactérlenne utilisée comme cible sont ensemencées en masse ou à la surface de 15 ml du m ilieu de culture suivant - milieu coeur-cervelle (Difco 0037) 37 g/l - extrait de levure (Difco 0127) 5 g/l gelose Biteck agar (Difco 0138) 14 g/l WO 93~101S3 2 1 2 3 S 8 7 PCl`/FR92/01063 Des puits, ouverts dans l'épaisseur de la ~élose coulée en boîte de Pétri, sont remplis avec 30 1ll de l'antibiotlque à tesler. Ap~ès Incuba~lon, I'actlvité antlbiotique esl mesurée par le rayon e n mm de la plage de Iyse totale développée autour des pUitS.

2. Souche cible de référence On utilise une souche de Bacillus subtilis, la souche BFR isolée d'une conserve alimentaire qui a la parlicularité d'êlre facile à manlpuler:
10 souche mésophile, aérobie stricte, capable d'inilier une populallon abondanle en 6 heures de cullure à température du Laboratolre. Cetle souche ne sporule pas dans le mllieu de cullure précité. Celte souche esl '~ Irès sensible aux différents Iypes d'antlblotlques el sera ulilisée pour tester les divers hydrolysals, les témoins d'une part, el, d'aulre part rechercher et contrôler le ~evenlr des fracllons actives dans les trallements de purif ication.

, -WO 93/101~3PCI/FR92/01063 1~ , 2123~i8~

3. Effet de divers traitements physiques et chimiques sur l'activité de l'hydrolysat ES

Tableau 5 Traitements Rayon de la zone d'inhibition de croissance de la souche E~FR ~mn) I O _ Congélation -20C, - 80C 5~5 24h à 20C 5,5 8 jours à +4C 4,5 Ebullition 10-30 minutes 5,5 Pasteurisation 1 5h 2,5 Filtration stérilisante 5,5 Evaporation et concentration lO fois 7,0 Lyophilisation et concentration 10 fois ~,0 + protéa~e K ( 1 mg/ml) l heure 50C 5,5 + protéase K ( 10 mg/ml) :4 beur-s J0-C 3 PCI ~ / FR92 / 01063 2l2 ~ 8 ~
The bactericidal product according to the invention is a product having a substantial part of a peptide nature which may come from the globin. The product obtained is certainly constituted by a mixture of molecules that differ in their number of amino acids.
It is a resistant product, the perslste activity of which after a treatment at 60 ° C., for 15 hours ~ This product is freeze-dry.
It also resists the action of protease K, 24 hours at 50 C.
This product is probably derived from hemoglobin containing all or part of the heme. The bactericidal product according to the invention is active on strict anaerobic gram bacteria, especially on bacteria of the genus Closlridium, such as Clostridium per ~ ringens, Clostridium butyricum, and sporules isolated from the human flora. It is not active on several strains of Clostridium difficile. 11 is active on other strains of the dominant flora of adult humans, such as bifides, peptoslrep-tocoques, and Eubacterium.
Its activity is also exerted on bacteria of the genus Bacillus.
This product is therefore particularly interesting since it is a product of natural origin, active on responsible germs particularly dangerous infections; for example Clostridium butyricum is involved in ulcerative necrotizing enterocolitis of the newborn.
This product therefore gives birth to a new generation of substances inhibitory, lyophilizable, sterilizable by filtration. This purified product could be used in particular as a food additive, for example to avoid the disorders observed during the weaning of the piglet.
The bactericidal products according to the invention can also be made.
be used as preservatives.
The present invention therefore relates to compositions.
medicinal products containing as active ingredient a product according to the present invention with an excipient compatible with an applicatlon therapeutic including oral flies.

2123. ~ 7 WO 93/10153 7 PCI` / FR92 / 01063 These may in particular be compositions such as tablets, tablets? powder or other form which can be administered orally.
The present invention also relates to tablets intended for animal feed, especially SOl content 5 concentrates of the prodult according to the invention intended to be added to the ingredients proper, either with drinking water or pre-melan ~ es animal feed containing the product according to the invention.
Other characteristics and advantages of the present Inventlon will appear on reading the examples which follow.
Figure l: Demonstration of the ef ~ and bactericlde inhibitory substances produced by the hydrolyzate ES

EXAMPLE 1: PREPARATION OF BACTERICIDF SUBSTANCE FROM
TOTAL BLOOD

Whole blood or its fractions (washed red blood cells, content erythrocyte) are treated with digestive enzymes.

a) Preparation of blood substrates ~ 0 We use the blood of any mammal, man or animal, SOlt its different fractlons obtained by cilclic technlques blood fractionation:
- the serum from coagulatlon, - plasma: supernatant of heparlated blood cer.trlfugée 2000 turns. 10 mln.
+ 4o C
- red blood cells; centrifuga pellet ~ ion of washed heparlated blood 3 times in PBS 0901 M, - the walls of red blood cells obtained after hemolysis in water distilled centrlfuge washed red blood cells (13000 rpm. 5 mln.
l 4C) - the erythrocytalre (E) supernatant content of hemlugugatlon of the hemo-lysate of red blood cells.

b) Enzyme preparations We use :

- the supernatant of fresh faeces collected from rats or males axenic (germ-free) diluted to l / lOè, - freeze-dried pancreatic juice from pork (S) at a rate of 2 g / 100 ml of PBS
0.0 l M, - purified bovine trypsin (Sigma T8642) at 5 mg / ml of P ~ S.

Pancreatic sugar and trypsin are prepared immediately.

c) Incubation of substrates in enzyme preparations Su ~ fresh blood strats ~ prepared or stored, ali ~ uotés at room temperature or cold, are diluted l / lOè and I t20è in enzymatic preparations, they are incubated for 24 hours at 37 C.
EXAMPLE 2: BACTERIC ACTIVITY II) E OF PRODUCTS C) OBTAINED AT
EXAMPLE I

The results are presented in Table 1.

WO 93/10153 ~ 1 2 ~ SX 7 PCI / FW2 ~ 01063 ... ~ 9 ~ ~ L 1 ' 10, ~ _ ll Q) ~ C
w ~ olll ~ d u ~. _ E3 ~ r IC

1 5 ~ Z. ~ _ Lll E ~ ~ C
, ............ C: ~ o c ~ ~ ~ ~ _ ~

20 E 1 ~ l ¦ 3 ~ ~ OE
C ~ `~ ~ O lll ~, ~ o ~ ra o ~ ~ ¢ ~ ~ ta 25: ~: ~. ~. ~ _-- ~ OS ~
H ~ Y; ~ æ ~ O ~ ~ Sl ~ U ~ 1 z ~ n- '~ _ l ~, ~

Z .. _ .. ... ~. ~ a ~
Jo ~ CZ ~ I ~ E ~ o "

WO 93/101 ~ 3 PCI / FR92 / 01063 `` '' ~
~ l23 ~ 87 Incubation of whole human blood, a pellet of blood cells washed red or soluble fraction of red blood cells hemolyzed with Pancreatic enzymes generate bactericidal activity in vitro. L ~
production of inhibitory substances is the result of a process 5 in ~ ymatic: the blood substrates and enzymes only witnesses are without ef f and.
The substrates are not the constituents of serum and plasma. Enzyme activity works on red blood cells, not on the wall, but on the erythrocytal content.
The bactericidal effect is less strong with whole blood; this is probably linked to the presence of tryptic inhibitors. Bactericidal activity is stronger after the action of enzyme mixtures like those present in the faeces of axenic animals or in pancreatic juice than with trypsin alone ~

EXAMPLE 3 PREPARATION OF SU ~ STANCE BACTERICIDE FROM
HEMOGLOBIN

Raw hemoglobins, preferably purified (H) original 20 human (Hl) or animal (H2 ~ are treated with any type of protease, not necessarily digestive. We will preferably use the purified proteinase K which hydrolyses proléines, glycoproteins. peptldes e ~ amino acid esters.

2 5 a) Preparation of the hemoglobin solutions Hl: purified human hemoglobin ~ Sigma H7379). Hl is diluted and used at the same concentration as that of a man's san ~
adult. 12.5 to 15 g of hemoglobin are diluted in 100 ml of P ~ S 0 ~ 01 ~
H2: raw or purified bovine hemoglobin (Sigma H262 5-H2500). H2 is prepared as Hl but diluted 10 times, ie 1 ~ 2 to lS
g / 100 ml of PBS.

WO 93 / lOlS3 Z 1 2 ~ 7 PCI / FR92 / 01063 b) Enzymatic preparation A 10 mg / ml stock proteinase K solution is prepared in Tris 0 buffer, OlM-pH = 7.9. This solution is stabilized with 2 mM of 5 Ca + in the form of CaC12.

c) Hydrolysis conditions Proteinase K is used in several concentrations, from Preferably at the final concentration of 0.1 mg / ml hemoglobin at hydrolyze. The hydrolysis is preferably carried out at 50 ° C. with agilation slow. The duration of hydrolysis is variable from I hour to 24 hours. The hydrolysals oblenus after 2 hours of incubation generate good antibiotic activity.
EXAMPLE 4: INHIBITORY EFFICIENCY OF DIFFERENT TYPES
HYDROLYSATS

The hydrolysate results obtained show that the content 20 erythrocyte or purified hemoglobin treated with proteinase K 0.1 mg / ml generates an inhibiting substance on BFR effective up to 1/128. The quantity of bactericidal substance produced depends on the concentration of hemoglobin to be hydrolyzed. The hydrolyzate of the erythrocytal contents by the pancreatic juice produces a more diffusible substance therefore more soluble.
The results are presented in Table 2.

WO 93 / lOlS3 PCI / FR92 / 01063 2123 ~ 87 5 ~ _ _ _ ~ CU ~ ot ~ U ~ U ~ U ~

'.'jl ~ ~ v ~
oo oooo oo ~. ,, _ ~ ~~ ~ ~ ~. ' ~
~ __ __ ~ ~ ~, ~

VS

c E_ _ _ o `~, ~ Uo ~, C '- - ~ ~ U

20 ~ _ _ _ ~ oc ~. ' o - I ~ ~ - S
~ --_ u ~ u ~ _ ~ E

~ ~ ~ r--~ ~ _ ~ ~ C ~. "C
3 0 ~ c ~ I _ ~ C vc _ c 5 WO 93 / lOlS3 231 2 3 ~ 8 7 PCr / FR92 / 01063 HEMOGLOBIN FRACTIONS

a) Chemical extraction of heme from hemo ~ lobin H 1 We use the method of F. Ascoli et al. (Methods in enzvmology vol 76.5.1981) which consists in extracting globin from hemoproteins by removing heme. The principle consists, under the conditions described, to mix 2.5 ml of hemoglobin with 100 ml of an acid solution hydrochloric acid and acetone. The precipitate or centrifugation pellet contains globin which can be dissolved in PBS. The supernatant contains heme.
To test the activity of this supernatant and because the alcohol mixture acetone is a BFR target cell growth inhibitor it is 15 evaporated by Speed Vac. The concentrate is insoluble in poor PBS can be partially dissolved in acetonitrile, 60% in 40% of Irifluoro-acid 0.1% acetic inactive on BFR cells.

b ~ Bactericidal effect of human hemoglobin fractions purified, treated with an HCl mixture The results, presented in Table 3, show that the active principle of inhibition is localized in the fraction of the blood forcing colored: the heme fraction. The globin fraction is inactive then that the heme fraction leads to a bactericidal product insoluble in PBS
therefore different in its chemical structure from hydrolysates actlfs already .
utlllses.

WO 93/10153 PCI` / FR92 / 01063 2123a8 ~

2 ~ 7 WO 93/10153 P {~ / FR92 / 01063 COMMERCIAL PORPHYRINS EXTRACTED FROM
THE HEMOGLOBIN Oy OF CHLOROPLASTS

Table 4 Minimal Concentration Inhibl ~ rlce Types of porphyrlne .
at 2 m ~ / m I in their solvent ~ acillus subtilis Clostridium l 5 __ _ _ ~ FR perfringens Hematoporphyrin l / 256 l / 8 2b ~ 60% 1 ~
~ 1 0.016N ~ I / 28 ~ 1/32 l 60 96 ~ 11256 ~ 1116 . . _ _ ._.

Chlorophyllin in PBS l / 8 ~ l / 64 lemoins solvent 0 ~ 0 16 ~.
2123 ~

The inhibitory effect obtained either with a porphine (the hemato-porphyrin ~ either with substitution derivatives combined with iron (hemin, haematin) or magnesium (chlorophyllin) confirms that the nuclei porphyries are involved in bactericidal activity. In this essay, the nature of the metal complex alone (Fe or Mg) or chemically combined (FeCl, FeOH) is not. decisive. The nuclei are insoluble in water but they can be chemically dissolved (case of chlorophyllin) or obtained more or less soluble (case of hydrolysates) according to the degree of denaturation of the associated globin, depending on the effectiveness of the the protease used (pancreatic juice and proteinase K for example).
All porphyritic chromoproteins can generate inhibitory substance from their prosthetic group. In the case hemoglobin, better than chemical extraction, enzymatic hydrolysis less expensive and more specific leads, depending on the type of protease, to the l 5 production of active hemin molecules which differ from each other by their level of efficiency and their water solubility (example hydrolyzate E5 and HK).

EXAMPLE 7: OUTLINE OF THE ANTIBIOTIC ACTIVITY ON
TARGET BACTERIAL CELLS

1. Principle and realization of the antibiotic test 108 vegetative and viable cells of a bacterial strain used as target are seeded in mass or on the surface of 15 ml from the next culture medium - heart-brain medium (Difco 0037) 37 g / l - yeast extract (Difco 0127) 5 g / l gelose Biteck agar (Difco 0138) 14 g / l WO 93 ~ 101S3 2 1 2 3 S 8 7 PCl` / FR92 / 01063 Wells, open in the thickness of the box-cast elose of Petri dishes are filled with 30 μl of the tesler antibiotic. After ~
Incuba ~ lon, I'lbiotic activity is measured by the radius in mm of the total Iyse range developed around the wells.

2. Reference target strain We use a strain of Bacillus subtilis, the isolated BFR strain a canned food that has the particularity of being easy to handle:
10 mesophilic strain, strict aerobic, able to iniliate a populallon abundant in 6 hours of boiling at Laboratolre temperature. Cetle strain does not spore in the above-mentioned mold. Celtic strain esl '~ Irès sensitive to the different types of antlblotlques and will be used to test the various hydrolysals, the witnesses on the one hand, and on the other hand to search for and control the ~ evenlr of the active fracllons in the trallements of purification.

, -WO 93/101 ~ 3PCI / FR92 / 01063 1 ~, 2123 ~ i8 ~

3. Effect of various physical and chemical treatments on ES hydrolyzate activity Table 5 Treatments Radius of the inhibition zone of growth of strain E ~ FR ~ mn) IO _ Freezing -20C, - 80C 5 ~ 5 24h at 20C 5.5 8 days at + 4C 4.5 Boiling 10-30 minutes 5.5 Pasteurization 1 5h 2.5 Sterilizing filtration 5.5 Evaporation and concentration 10 times 7.0 Lyophilization and concentration 10 times ~, 0 + protein K (1 mg / ml) hour 50C 5.5 + protease K (10 mg / ml) : 4 butter D0-C

4. Mise en évidence de l'effet ba~téricide des substances inhibitrices produites par l'hydrolysat ES

Des tubes de 9 ml de milieu de culture sans gélose contenant des dilutions croissantes de l'hydrolysat brut ES sont ensemencées avec Iml d'une population de 3.107 cellules végétatives de BFR. Après ~ heures de contact à 37 C, on mesure dans chaque tube le nombre de cellules vivantes et le rayon de la zone d'antibiose.

WO 93/10153 2 l ~ 5 8 7 Les résulta~s sont présenlés à la figure l.

L'hydrolysat ES utilisé pur et dilué jusqu'au lt32, empêche la multiplication bactérienne et tue les bactéries de l'inoculum. La dilution au 4. Demonstration of the bactericidal effect of the substances inhibitors produced by ES hydrolyzate 9 ml tubes of agar-free culture medium containing increasing dilutions of the crude hydrolyzate ES are seeded with Iml of a population of 3,107 BFR vegetative cells. After ~ hours of contact at 37 C, the number of cells in each tube is measured and the radius of the antibiotic area.

WO 93/10153 2 l ~ 5 8 7 The results ~ s are presented in Figure l.

The hydrolyzate ES used pure and diluted up to lt32, prevents the bacterial multiplication and kills bacteria in the inoculum. The dilution at

5 1/32 représente la concentration minimale inhibitrice à partir de laquelle apparaît l'effet bactéricide.

EXEMPLE 8: SPECTRE D'ACTIVITE DE L'HYDROLYSAT ES SUR
-DIFFERENTES SOUCHES BACTERIENNES

OriRine des souches -A l'exception des souches de collection ou en provenance de Belgique, tou~es les souches ont été isolées au Laboratoire de la microflore dominante de l'intestin d'enfants et d'adultes. Les prélèvements d'enfants viennent du service de néonatologle d l'hôpital A. Béclère: les enfants prématurés étaient agés de I à 2 mois et n'avaient pas de trouble pathologique intestinal. Les prélèvements d'adultes concernent des individus sains non hospitalisés ou malades (pouchite ou colite).
Caractérisation des souches isolées au Laboratoire Elles sont classées par leur morphotype. Un certaln nombre ont été caractérisées sur 20 réactlons biochimiques différentes (API 20A) e~
2S sur les produits finaux de leur métabolisme fermentalre (acides fixes et acides gras volatils).

Techniques du test de bactéricidie sur les souches bactériennes t Les souches anaérobles facultatives sont testées comrne la souche lémoin Bacillus FR.
Pour les souches anaerobles strlctes, deux techniques ont ete utilisees:

WO 93~101~3 PCI`/FR92/01063 ~_ ~.~ 20 - les souches très senslbles à l'oxygène (EO5) sont cultlvées dans une chambre anaéroble (Freler). Elles sont ensemencées à la surface de la gelose et incubées 48 heures à 37 C dans la chambre anaérobie.
- les souches anaérobies moins sensibles à l'oxygène sont ensemencées à
I'extérieur dans la masse de la gélose. Elles sont ~ncubées 4~ heures a 37 C en jarré anaérobie (Gaspack system).

21~3;~7 WO 93/10153 21 P~/FR92/01063 .

TEST DE ~ E DE D~FER~N1ES SOUCHES ~ACDE~E~NES
A L'HYD~OLYSAT ES BRUT OU CONCE~TRE 3 FO~

G ~ ou ~o ~PI TO.~E O~G~ RAYON DE LAZO~E
TYPE ou D' ~ BIOSE(n~n~
~OM DE LA SOUCHE
~RUT ~3 . _ _ C~SrR~ UM, Cperfr~n~ens ~1.C10 ~0005002 _ enfan~l9 j) 3.0 3.0 Poul5.3(Cp?) 46326002 pouc~tead~te 3.0 3~5 CpFR type A _ ad~te 3,5 Pou4 2.11 type A ~6125022 pou~tead~te 1.0Cp ~.6 e~t+ + co~ PasL 3,0 DG2.H8 t~pe A ~612~22 _ eDfant~58 j) 2. 5 UK2.F4 t~pe A 46124002 _ enfant(46 j) 2. 0 DG3.C3 47 / 773~2 _ enfant(65 j) ~. 0 Cp ~1 adulte(~ele) 2. 0 C~ifficil~ .
_ IS3.1 ~10~103 + ~nfant(~0 j) 0. 0 0. 0 I~;El,B8 _ enfant(39 j) 0. 0 0. 0 DG3.A6 ~12~6103 _ e~ t(65 j) 0, 0 0. 0 SBCl.D6 41666123 _ enfant(l8 j) 0, 0 0. 0 ISl .Z 41444123 + enfa~t(19 j) 0, 0 0. 0 b~1.2 ~10~4103 _ enfant(19 j) 0, 0 0. 0 VPL10463 ~ collection 0. 0 0. 0 M~ra + adulte(colite) 0. 0 û. 0 DGl.A10 416~6123 _ enfant(51 j) 0.0 Cpara~utrificum l~K2.E6 ~63~6023 e~fant(46 j) 1.5 6.0 ~l.A3 423~600l enfant(l9 j) 2.0 ~.0 ~C3.E5(Cpa?~ 4644600l enfan~30 j) 0,0 0.0 67 pa~b~EeO 0.0 97 ads~(Eb~) O.û

FE UILLE D E R E~P U ~C t M E~rr wo 93/10153 22 PCr/FR92/nl063 212~S87 C butvricum DR2.B6 467~7223 enfan~(49 j) 0. 5 ~ j ~lU~.C10 46756202 enfant(33 j) 0, 0 ~
Cb 1002.5 enterocolite ~ + 1. 0 DG3.Hll 47757733 enfant(65 j) 1. j 4, SBCl.H9 467472"3 e~fant(l8 j) 1, 5 3. 5 I~;EU.F4 467472''3enfant(39 j) 3. 5 NCI~ 7423 collection 2. 0 105 hémocult.(Belg.) 3. 0 Autres Clcstridium Csor~ellii VPI 9048 collection ~ ~ 5 (Belg.) 0. 0 Cbif/sor~ellii NCI~ 87-80 colllBelg) NCI~ 6g27 coll~Belg) 0. 0 NCI~ ?914 colllBel~g) 0. 0 Cbi~ermentans .
N~I~ 506 colllBelg) 0. 0 ga pus ~ elg.) ~. 0 C~mosum .
I~ 7 473462Z''enfant(53 j) Z~ 5 4. 0 lS3.D5 47346232 enfant(40 j~ 4. 0 Chistol~ticum NC~ 503 colllBelg~ ~ 0 66 (Belg~) 3. 0 CseDticum (Bel~ ) 4~ 0 ~1 11l I F nE REMPLACEMENT

2123~87 ,~ WO g3/10153 PCr/FR92/01063 C.tertium NCIC 541 co~eO 0.0 114 cop~.(~e~.) 0.0 ~3.2 47346122 enfant(40 j) 1.0 3,0 Gsub~n~ e 92 h~m~c(Be~) 5.0 .
C.SDo~neS
NCTC 532 co~8e~) 3.0 107 (Be~ ) ~ 0 Csnn~iosurn ~.U 41010001 en~n~28 ii 1.5 6,0 Atll~ES S~O~JIE~
T~l.S(o~s) 46756220 ~n~16 j) 0,0 4.5 UK3.E4(P~) 45342003 eDfan~53 j) 4.0 ~Gl.B2(C~st) 47756222 en~n~51 j) 3.5 SPR ch H~(P~pl) _ ad~te ~n ~.0 6,0 ~PR ch C7(end~) 47757731 adulte ~n 1. 0 2. 5 SPR ch A9(endcsp,~ 44514733 adulte sain 1, 0 +
SPR ch FlO(pepto) 45404002 adulte sa~n 3. 5` 3. 0 SPR ch D3(pepto~ 44414401 a~ulte sa~n 5, 0 PR ch Al(plec~ a~ulte sa~n 1. 0 PP~ ch A2(plec~ a~ulte sain O, O
PR ch BlO(plec) ~dulte sain 2. 5 PR ch C5~pl~c) adulte sain O, O
PR ch DlZ(inflab) adulte sain O. O
P~ ch E6(inflab) adulte sa~n O. O
PR ch Bl(endoEOS) adulte sai~ 4. 0 PR ch B3(endoEOS) adulte sain 5. 0 PR ch Dl~i~fEOS) a~ulte cs~in 2, 0 PR ch D4(i~fEOS~ adulte ~in 2, 5 P~ ch D5(infEOS) adulte sai~ 2. 5 PR ch D6(ir~EOS) adulte ~in 3. 0 PR ch D3tCll~6Eos) adulte sain 3~ 5 PR ch E~(plecEOS) ad~te sain 3. 5 ~ l I F n~ REMpLAcEMENT

wo 93~10153 P~/FR92/Q~063 2123~7 L~3 ~ I ~
~oralis ARG11 46146Z00 adulte sain 1. 5 0. 0 ~caecae ~1 patho(Belg) 0. 0 0, 0 a~uminLPoul3E~ 47104600 pouchite adulte 0. 0 0. 0 ~fragilis ARD2 46144240 adulte ~in 1. 0 O, O
~melanARF2 46104200 adulte sain 0. 0 0. 0 ~splanch 41 patho(Belg) 0. 0 1. 0 ~uniL Poul2D8 ~6556210 pouchite adulte 0. 0 0, 0 Elmerdae Pou42A10 46544200 pouchite adulte 4. 5 4~ 0 ap~acutus 5~ 46716210 pathdBelg) 1. 5 t adista~ FRF3 46746370 adulte sain 0. 0 0. 0 B.n~GCE7 46514210 ad~te sain i), 0 0, 0 ~o~atus FRF4 565~6330 adulte sain 0. 0 0 0 GCD5(~ser+~ adulte sain + 0 0 PS3C~ 467~6330 enfant 0. 0 8.~.Poul3B~ ~B5~4220 pouchite adulte 0. 0 ~bi~ 8(colo1 pa~ho(Belg) 0. 0 abinus ~8(colD2) pathdBelg~ 3, 5 BlFlDOBAC~M
abifidum ~536 enfant 4. 0 ,.,. . ,-~. ~ . ~ ~
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~:1111 LE ~E REMPLACEMENT

WO 93/10153 212 3 ~ ~ 7 PCI`/FR92/01063 ~U~SOUCH3 1 .
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t~ PeDt~t~Dto.
PRC8 46750216 ~te 5~ +
MCU G7tEOS) 47510606 ad~te ~n 3.0 4.0 FREl 46710216 ad~te ~n 1.0 2.5 LGK3 D12 47104626 en~nt 0,0 2,0 D8(E~ 4~656216 ~nt 1,0 5,0 ~CU D8(E~ 46516616 ad~te 5~ 4,0 6,5 PS3A12~EQ~ 4B710216 en~t 2,0 3.0 MCM D12(EOS) 47510606 a~te s~n B.0 MoU F7~E~ 47756616 a~ s~n 6.5 GC C9 ad~ n 3" 0 FR F6 a~ulte sa~n S, 0 ~ U adulte sain 4. 5 F~ E~i adulte sain 4. 5 FR D9 adulte sain S, 0 FR F9 adulte 51~1 4, 5 FR D10 adulte sain D, 0 t~e Euba~ter~um Ml:U C6 46346002 adulte ~ + 4, 5 A5 47710402 adulte sain + 2. 0 ~lJl C4 46142222 adulte ~ 8. 0 GC ~10 adulte 51in 5, 0 GC FB adulte sain 4, 5 FR E10 adulte 5~1n 6. 0 ~?e bif~e GC G6 a~ulte ~ +
G~ A3 adulte ~ ~. 0 3. 5 Gt: D10 adulte sain + 3, 5 GC D9 adul~e sain 0, 0 4. 0 GC H~O a~ult~ s~in O. 0 3. 0 GC G6 adulte s~in 2, 5 GC H8 adulte sam 3. 0 GC E8 adulte sain O. 0 2. 0 GC D6 a~te s~n 0~ O +

t~l LF I~E REMPLACEMEN~

w o 93/10153 PC~r/F~92!Q1063 t~pe bacter/fuso Pou 13B6 poucbite adulte 3. 0 +
~ E2 adulte saLn 0. 0 GC E7 adulte s2in 0, 0 GC A2(ba~ cocc) adulte saLn + 7, 0 GiC C6~dipLD) adulte sai~ 0. 0GC C10(bat pal! adulte saLl 0. 0 0. 0 GC C3(bat ef~ adulte saLl 3, 0 GXC D2(ba~ poly~ adulte saLl 0, 0 GC ~ (bat cocc) adul~e saL~ 0. 0 AlD(bat cocs) adulte saLl 0. 0 GC Gl(bat cocc~ adu~te saii 0, 0 AE3ROBDES' F.~C
Lacto ferm entPA4 enfan ~5 j) Eco~ 5148 ent+porc adulte 0. 0 EcoiE~lO adult saLn 0. 0 strepto GX~CB adulte sain 0. 0 entenlGCAl adulte saLl 0, 0 s~r fecalb~3R10 adulte saLn 0. 0 .. __ . _ _ . , _ Ebsi~us FR ~. 5 5. S

_ . _ I:EUILLE DE REMPLACEMENT

WO 93/101~3 212 3 ~ 8 7 P(~r/FR92/01063 EXEMPLE 9 : DEVFNIR DE L'ANTIBIOTIQUE H2K DANS LE TUaE
DiGESTIF DE LA SOUR!S AXENIQUE (SANS G_RME) ~,5 ml de l'hydrolysat bru~ H2K lyophlllse et concentré l 5 fols, stérllisé à l '`~ C pendant 30 mlnutes est admlnlstre par sonae gastrique à des sourls axénlques selon le protocole sulvant:

Tableau 6 50 n-ln 3h 30 1 5h . . _ . _ l ~ Souris S l ~,5ml sacrifiée Sourls 52 0,5ml 0,5ml sacrif iée Sourls S3 0,5ml ~ 0~sml ~ 0,Sml sacrlflee ¦

~ 0,5ml ~ - 0,5ml ¦ - 0,5ml ~ac~ ee, Les contenus lntestlnaux, dilues au l / l0è en PBS sont controlés sur cellule clble BFR; les résultats sont présentés au.taDleau 7.
L'antlbiotlque contenu dans l'hydrolvsat brut n~est pas absorbé. Il translte dans le tube digestlf de la souris axénlque et est re~rouvé actif sur ~FR dans tous les contenus et les féces 3h 30 après la premiere lngestlon.
Dans la sourls temoln, l'apparltlon d'une petlte zone d'antibiose dans l'lG3 pourralt correspondre à l'effet inhlblteur ~e substances digestlves sécretees dans l'intestln grêle et réabsorDees au nlveau du caecum.

~:FI 111 I E ~E~ REMPLACEMEI~

2123S8~

I O ~ O ~ O
,c ~ ~ ~ ~ ' z 2 0 N ~7 ~ 3 ~ o ~ 1 ~
25 ~ ~

3o I ~ A~

FEUILLE DE REMPLACEMENT

212~ i87 WO 93/101S3 PCI`/FR92/01063 .~ . 2g LA SUBSTANCE BACTERICIDE SOLUBLE PRODUITE
DANS L'HYDROLYSAT H 1 K

a) Purification par fractionnement de la partie soluble en eau L'hydrol,vsat brut es~ élué dans une colonne Fractogel Butyl TSK 650.S. On recherche les fractions actives par test d'antibiose sur ~FR.
Les résultats du chromatogramme monlrent qu'après la fraction non retenue (fraction 1), la première fraction retenue, éluée en eau (fraction 11) con~ient 10 I'effet antibiotiaue. La fraction active, éluée en méthanol 20% correspond probablement à la partie insoiuble de l'antibiolique H 1 K.

b) Purification de la fraction active soluble en eau Les chromatogrammes comparés en HPLC.C18 de l'h,vdrol,vsat 15 brut, des fractians I et 11 du s,vstème Fractogel Butyl montrent que seule la fraction éluée à 100% de tampon B, absorbant à la fois à 214 et 3~0 nm es active~
Cette fraction active est obtenue purifiée à partir de l'éluat 11 Fractogel Butyl.
2~
c) Détermination du poids moléculaire La fraction purifiée HPLC.C18 étudiée en` ~el flllra~lon Sephadex LH20 esl éluee en une seule fraction aclive absorbanl à 214 et 380 nm à un poids moiéculaire correspondanl situé entre 6GG e~ 1 55G
5 daltons-~ * ~ * ~

LEGENDE DE LA FIGURE I

Conditions du test:
- 9 ml LBHI [E5]
- I ml 3.107 BFR

- aucune spore 35 - 8H de contact FEUILLE DE REMPLACEMENr 5 1/32 represents the minimum inhibitory concentration above which the bactericidal effect appears.

-DIFFERENT BACTERIAL STRAINS

OriRine strains -With the exception of collection strains or from Belgium, all strains were isolated at the Microflora Laboratory dominant in the intestines of children and adults. Child samples come from the neonatal service at A. Béclère hospital: the children premature babies were I to 2 months old and had no problems intestinal pathology. The samples of adults relate to healthy individuals not hospitalized or sick (pouchitis or colitis).
Characterization of strains isolated at the Laboratory They are classified by their morphotype. A certain number were characterized on 20 different biochemical realons (API 20A) e ~
2S on the final products of their fermental metabolism (fixed acids and volatile fatty acids).

Techniques for bactericidal testing on bacterial strains t Optional anaerobic strains are tested for Bacillus FR lémoin strain.
For the strains anaerobles strlctes, two techniques were used:

WO 93 ~ 101 ~ 3 PCI` / FR92 / 01063 ~ _ ~. ~ 20 - strains very sensitive to oxygen (EO5) are cultivated in a anaeroable chamber (Freler). They are sown on the surface of the gelose and incubated for 48 hours at 37 ° C. in the anaerobic chamber.
- the anaerobic strains less sensitive to oxygen are sown with The exterior in the mass of the agar. They are ~ ncubated 4 ~ hours a 37 C in anaerobic jumper (Gaspack system).

21 ~ 3; ~ 7 WO 93/10153 21 P ~ / FR92 / 01063 .

TEST OF ~ E DE D ~ FER ~ N1ES STRAINS ~ ACDE ~ E ~ NES
A HYD ~ OLYSAT ES CRUDE OR CONCE ~ TRE 3 FO ~

G ~ or ~ o ~ PI TO. ~ EO ~ G ~ RADIUS OF LAZO ~ E
TYPE or ~ BIOSE (n ~ n ~
~ OM OF THE STRAIN
~ RUT ~ 3 . _ _ C ~ SrR ~ UM, Cperfr ~ n ~ ens ~ 1.C10 ~ 0005002 _ enfan ~ l9 j) 3.0 3.0 Poul5.3 (Cp?) 46326002 pouc ~ tead ~ te 3.0 3 ~ 5 CpFR type A _ ad ~ te 3,5 Pou4 2.11 type A ~ 6125022 pou ~ tead ~ te 1.0Cp ~ .6 e ~ t + + co ~ PasL 3.0 DG2.H8 t ~ pe A ~ 612 ~ 22 _ eDfant ~ 58 j) 2.5 UK2.F4 t ~ pe A 46124002 _ child (46 days) 2. 0 DG3.C3 47/773 ~ 2 _ child (65 days) ~. 0 Cp ~ 1 adult (~ ele) 2. 0 C ~ ifficil ~.
_ IS3.1 ~ 10 ~ 103 + ~ nfant (~ 0 d) 0. 0 0. 0 I ~; El, B8 _ child (39 d) 0. 0 0. 0 DG3.A6 ~ 12 ~ 6103 _ e ~ t (65 d) 0, 0 0. 0 SBCl.D6 41666123 _ child (18 d) 0, 0 0. 0 ISl .Z 41444123 + child (19 d) 0, 0 0. 0 b ~ 1.2 ~ 10 ~ 4103 _ child (19 days) 0, 0 0. 0 VPL10463 ~ collection 0. 0 0. 0 M ~ ra + adult (colitis) 0. 0 û. 0 DGl.A10 416 ~ 6123 _ child (51 days) 0.0 Cpara ~ utrificum l ~ K2.E6 ~ 63 ~ 6023 e ~ fant (46 d) 1.5 6.0 ~ l.A3 423 ~ 600l child (l9 d) 2.0 ~ .0 ~ C3.E5 (Cpa? ~ 4644600l child ~ 30 d) 0.0 0.0 67 pa ~ b ~ EeO 0.0 97 ads ~ (Eb ~) O.û

SHEET DERE ~ PU ~ C t ME ~ rr wo 93/10153 22 PCr / FR92 / nl063 212 ~ S87 C butvricum DR2.B6 467 ~ 7223 child ~ (49 d) 0.5 ~ d ~ lU ~ .C10 46756202 child (33 days) 0, 0 ~
Cb 1002.5 enterocolite ~ + 1. 0 DG3.Hll 47757733 child (65 d) 1. d 4, SBCl.H9 467472 "3 e ~ fant (l8 j) 1, 5 3. 5 I ~; EU.F4 467472``3 child (39 days) 3.5 NCI ~ 7423 collection 2. 0 105 blood culture (Belg.) 3. 0 Other Clcstridium Csor ~ ellii VPI 9048 collection ~ ~ 5 (Belg.) 0. 0 Cbif / sor ~ ellii NCI ~ 87-80 colllBelg) NCI ~ 6g27 coll ~ Belg) 0. 0 NCI ~? 914 colllBel ~ g) 0. 0 Cbi ~ ermentans.
N ~ I ~ 506 colllBelg) 0. 0 ga pus ~ elg.) ~. 0 C ~ mosum.
I ~ 7 473462 Z 'child (53 d) Z ~ 5 4. 0 lS3.D5 47346232 child (40 d ~ 4. 0 Chistol ~ ticum NC ~ 503 colllBelg ~ ~ 0 66 (Belg ~) 3. 0 CseDticum (Bel ~) 4 ~ 0 ~ 1 11l IF nE REPLACEMENT

2123 ~ 87 , ~ WO g3 / 10153 PCr / FR92 / 01063 C.tertium NCIC 541 co ~ eO 0.0 114 cop ~. (~ E ~.) 0.0 ~ 3.2 47 346 122 child (40 days) 1.0 3.0 Gsub ~ n ~ e 92 h ~ m ~ c (Be ~) 5.0.
C.SDo ~ neS
NCTC 532 co ~ 8e ~) 3.0 107 (Be ~) ~ 0 Csnn ~ iosurn ~ .U 41010001 en ~ n ~ 28 ii 1.5 6.0 Atll ~ ES S ~ O ~ JIE ~
T ~ lS (o ~ s) 46756220 ~ n ~ 16 j) 0.0 4.5 UK3.E4 (P ~) 45342003 eDfan ~ 53 j) 4.0 ~ Gl.B2 (C ~ st) 47756222 in ~ n ~ 51 j) 3.5 SPR ch H ~ (P ~ pl) _ ad ~ te ~ n ~ .0 6.0 ~ PR ch C7 (end ~) 47757731 adult ~ n 1. 0 2. 5 SPR ch A9 (endcsp, ~ 44514733 healthy adult 1, 0 +
SPR ch FlO (pepto) 45404002 adult sa ~ n 3. 5` 3. 0 SPR ch D3 (pepto ~ 44414401 a ~ ulte sa ~ n 5, 0 PR ch Al (plec ~ a ~ ulte sa ~ n 1. 0 PP ~ ch A2 (plec ~ a ~ healthy ulte O, O
PR ch BlO (plec) ~ healthy adult 2.5 PR ch C5 ~ pl ~ c) healthy adult O, O
PR ch DlZ (inflab) healthy adult O. O
P ~ ch E6 (inflab) adult sa ~ n O. O
PR ch Bl (endoEOS) adult sai ~ 4. 0 PR ch B3 (endoEOS) healthy adult 5. 0 PR ch Dl ~ i ~ fEOS) a ~ ulte cs ~ in 2, 0 PR ch D4 (i ~ fEOS ~ adult ~ in 2, 5 P ~ ch D5 (infEOS) adult sai ~ 2.5 PR ch D6 (ir ~ EOS) adult ~ in 3. 0 PR ch D3tCll ~ 6Eos) healthy adult 3 ~ 5 PR ch E ~ (plecEOS) healthy ~ 3. 5 ~ l IF n ~ REPLACEMENT

wo 93 ~ 10153 P ~ / FR92 / Q ~ 063 2123 ~ 7 L ~ 3 ~ I ~
~ oralis ARG11 46146Z00 healthy adult 1. 5 0. 0 ~ caecae ~ 1 patho (Belg) 0. 0 0, 0 a ~ uminLPoul3E ~ 47104600 adult pouchitis 0. 0 0. 0 ~ fragilis ARD2 46144240 adult ~ in 1. 0 O, O
~ melanARF2 46 104 200 healthy adult 0. 0 0. 0 ~ splanch 41 patho (Belg) 0. 0 1. 0 ~ uniL Poul2D8 ~ 6556210 adult pouchitis 0. 0 0, 0 Elmerdae Pou42A10 46544200 pouchitis adult 4. 5 4 ~ 0 ap ~ acutus 5 ~ 46716210 pathdBelg) 1.5 t adista ~ FRF3 46746370 healthy adult 0. 0 0. 0 Bn ~ GCE7 46514210 healthy ad i), 0 0, 0 ~ o ~ atus FRF4 565 ~ 6330 healthy adult 0. 0 0 0 GCD5 (~ ser + ~ healthy adult + 0 0 PS3C ~ 467 ~ 6330 child 0. 0 8. ~ .Poul3B ~ ~ B5 ~ 4220 adult pouchitis 0. 0 ~ bi ~ 8 (colo1 pa ~ ho (Belg) 0. 0 abinus ~ 8 (colD2) pathdBelg ~ 3, 5 BlFlDOBAC ~ M
abifidum ~ 536 child 4. 0 ,.,. . , - ~. ~. ~ ~
DRl.C9 ¦ - child +

~: 1111 LE ~ E REPLACEMENT

WO 93/10153 212 3 ~ ~ 7 PCI` / FR92 / 01063 ~ U ~ SOUCH3 1.
4NA ~ D ~
t ~ PeDt ~ t ~ Dto.
PRC8 46750216 ~ te 5 ~ +
MCU G7tEOS) 47510606 ad ~ te ~ n 3.0 4.0 FREl 46710216 ad ~ te ~ n 1.0 2.5 LGK3 D12 47104626 in ~ nt 0.0 2.0 D8 (E ~ 4 ~ 656 216 ~ nt 1.0 5.0 ~ CU D8 (E ~ 46516616 ad ~ te 5 ~ 4.0 6.5 PS3A12 ~ EQ ~ 4B710216 en ~ t 2.0 3.0 MCM D12 (EOS) 47510606 a ~ te s ~ n B.0 MoU F7 ~ E ~ 47756616 a ~ s ~ n 6.5 GC C9 ad ~ n 3 "0 FR F6 a ~ ulte sa ~ n S, 0 ~ U healthy adult 4. 5 F ~ E ~ i healthy adult 4. 5 FR D9 healthy adult S, 0 FR F9 adult 51 ~ 1 4, 5 FR D10 healthy adult D, 0 t ~ e Euba ~ ter ~ um Ml: U C6 46346002 adult ~ + 4, 5 A5 47710402 healthy adult + 2. 0 ~ lJl C4 46142222 adult ~ 8. 0 GC ~ 10 adult 51in 5.0 GC FB healthy adult 4, 5 FR E10 adult 5 ~ 1n 6. 0 ~? e bif ~ e GC G6 a ~ ulte ~ +
G ~ A3 adult ~ ~. 0 3.5 Gt: D10 healthy adult + 3, 5 GC D9 healthy adult 0, 0 4. 0 GC H ~ O a ~ ult ~ s ~ in O. 0 3. 0 GC G6 adult s ~ in 2, 5 GC H8 adult Sat 3. 0 GC E8 healthy adult O. 0 2. 0 GC D6 a ~ te s ~ n 0 ~ O +

t ~ l LF I ~ E REPLACEMEN ~

wo 93/10153 PC ~ r / F ~ 92! Q1063 t ~ pe bacter / fuso Pou 13B6 adult poucbite 3. 0 +
~ E2 adult saLn 0. 0 GC E7 adult s2in 0, 0 GC A2 (ba ~ cocc) adult saLn + 7, 0 GiC C6 ~ dipLD) adult sai ~ 0. 0GC C10 (bat pal! Adult saLl 0. 0 0. 0 GC C3 (bat ef ~ adult saLl 3, 0 GXC D2 (ba ~ poly ~ adult saLl 0, 0 GC ~ (bat cocc) adul ~ e saL ~ 0. 0 AlD (bat cocs) adult saLl 0. 0 GC Gl (bat cocc ~ adu ~ te saii 0, 0 AE3ROBDES 'F. ~ C
Lacto ferm entPA4 enfan ~ 5 j) Eco ~ 5148 ent + adult pork 0. 0 EcoiE ~ lO adult saLn 0. 0 strepto GX ~ healthy adult CB 0. 0 entenlGCAl adult saLl 0, 0 s ~ r fecalb ~ 3R10 adult saLn 0. 0 .. __. _ _. , _ Ebsi ~ us FR ~. 5 5. S

_. _ I: REPLACEMENT SQUARE

WO 93/101 ~ 3,212 3 ~ 8 7 P (~ r / FR92 / 01063 EXAMPLE 9: DEVELOPING H2K ANTIBIOTICS IN THE TUaE
AXENSIC SOURCE DIGESTIVE (WITHOUT G_RME) ~, 5 ml of the raw hydrolyzate ~ H2K lyophlllse and concentrated l 5 times, sterilized at ~ C for 30 mlnutes is admlnlstre by sonae gastric to axenic arteries according to the following protocol:

Table 6 50 n-ln 3 h 30 1 5 h . . _. _ l ~ Mouse S l ~, 5ml sacrificed Sourls 52 0.5ml 0.5ml sacrificed Sourls S3 0.5ml ~ 0 ~ sml ~ 0, Sml sacrlflee ¦

~ 0.5ml ~ - 0.5ml ¦ - 0.5ml ~ ac ~ ee, The lntestlnaux contents, diluted to l / l0è in PBS are monitored on a BFR cell; the results are presented in. ta 7.
The antibiotic contained in the crude hydrosol is not absorbed. It translates into the digestive tract of the axenic mouse and is re ~ found active on ~ FR in all contents and faeces 3 h 30 after the first lngestlon.
In sourls temoln, the apparltlon of a small area Antibiotic in lG3 pourralt correspond to the inhlblteur effect ~ e digestive substances secreted in the small intestine and reabsorbed in the new caecum.

~: FI 111 IE ~ E ~ REPLACEMEI ~

2123S8 ~

IO ~ O ~ O
, c ~ ~ ~ ~ ' z 2 0 N ~ 7 ~ 3 ~ o ~ 1 ~
25 ~ ~

3o I ~ A ~

REPLACEMENT SHEET

212 ~ i87 WO 93 / 101S3 PCI` / FR92 / 01063 . ~. 2g THE SOLUBLE BACTERICIDAL SUBSTANCE PRODUCED

a) Purification by fractionation of the water-soluble part Hydrol, raw vsat es ~ eluted in a column Fractogel Butyl TSK 650.S. The active fractions are sought by antibiotic test on ~ FR.
The results of the chromatogram show that after the fraction not retained (fraction 1), the first fraction retained, eluted with water (fraction 11) con ~ ient 10 the antibiotic effect. The active fraction, eluted in 20% methanol corresponds probably to the insoluble part of the antibiotic H 1 K.

b) Purification of the active fraction soluble in water Chromatograms compared in HPLC.C18 of h, vdrol, vsat 15 brut, fractians I and 11 of the s, vstème Fractogel Butyl show that only the fraction eluted at 100% buffer B, absorbing both at 214 and 3 ~ 0 nm es active ~
This active fraction is obtained purified from eluate 11 Fractogel Butyl.
2 ~
c) Determination of molecular weight The purified fraction HPLC.C18 studied in `~ el flllra ~ lon Sephadex LH20 is elected in a single absorbent fraction to 214 and 380 nm at a corresponding molecular weight between 6GG and ~ 1 55G
5 daltons-~ * ~ * ~

LEGEND OF FIGURE I

Test conditions:
- 9 ml LBHI [E5]
- I ml 3.107 BFR

- no spores 35 - 8 hours of contact REPLACEMENT SHEET

Claims

1. Bactericidal product, characterized in that it comprises a porphine nucleus.

2. Bactericidal product, characterized in that it can be prepared by incubation of a substrate containing hemoglobin with a mixture enzymatic containing at least one protease, then recovery of the solution of the product obtained.

3. Bactericidal product according to one of claims 1 or 2, characterized in that the enzyme mixture contains at least trypsin or an equivalent enzyme.

4. Product according to one of claims 1 to 3, characterized in what the enzyme mixture is pancreatic juice.

5. Bactericidal product according to one of claims 1 to 3, characterized in that the protease is proteinase K.

6. Product according to one of claims 1 to 5, characterized in that the substrate is constituted by the erythrocyte content.

7. Bactericidal product according to one of claims 1 to 6, characterized in that it comprises at least part of the heme group.

8. Bactericidal product according to claim 1, characterized in that it contains a hematoporphyrin molecule.

9. Bactericidal product according to claim 1, characterized in that it comprises at least one molecule chosen from hemin and hematin.

10. Bactericidal product according to claim 1, characterized in that it contains at least one molecule of chlorophyllin.

11. Bactericidal product according to one of claims 1 and 7 to 10, characterized in that it further comprises at least three amino acids, bound to the porphine ring.

12. Bactericidal product according to claim 11, characterized in that it has a molecular mass of about 1000 daltons.

13. Bactericidal product according to one of claims 1 to 7, 11 and 12, characterized in that it can be prepared by the following steps:
a) a whole mammalian blood sample is centrifuged, and collects the pellet containing the erythrocytes, b) after washing, the pellet is placed in the presence of distilled water to cause hemolysis of erythrocytes, c) we centrifuge, d) the supernatant obtained at the end of step c) is incubated with juice pancreatic, e) the bactericidal product is recovered, which can be sterilized by filtration.

14. Bactericidal product according to one of claims 1 to 4, characterized in that it can be prepared by incubating hemoglobin with pancreatic juice.

15. Product according to one of claims 1 to 14, characterized in that it is in freeze-dried form.

16. Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one product according to one of claims 1 to 15.

17. Pharmaceutical composition according to claim 16, characterized in that it is formulated for oral administration.

18. Food additive, characterized in that it contains a product according to one of claims 1 to 15.