BE1030647A1 - Procede d'echantillonnage de microorganismes sur des surfaces industrielles agro-alimentaires - Google Patents
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Abstract
Procédé de prélèvement de microorganismes sur des surfaces, pour la détection et l'analyse en laboratoire ultérieures.
Description
PROCEDE D'ECHANTILLONNAGE DE MICROORGANISMES SUR DES SURFACES
INDUSTRIELLES AGRO-ALIMENTAIRES
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé d'échantillonnage, de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes sur des surfaces (industrielles et/ou agro-alimentaires et/ou de collectivités), qui soit non létal et compatible avec plusieurs tests ultérieurs, pour la détection et l'analyse en laboratoire ultérieures.
L'art antérieur
Dans de nombreux domaines d'activités comme les secteurs agroalimentaires, les collectivités, les secteurs médicaux et vétérinaires, des contaminations problématiques dues à la présence de microorganismes sont observées très fréquemment.
Classiquement, dans les hôpitaux et dans les cabinets médicaux ou vétérinaires, la présence de microorganismes est responsable de maladies nosocomiales tandis qu'en agroalimentaire et en collectivité, ces microorganismes sont responsables de la dégradation de denrées périssables mais aussi du transfert de contaminants vers les consommateurs des produits issus par exemple d'une chaîne de production de viande, de fruits, de légumes ou autres.
Or, de nos jours, des normes strictes en matière d'hygiène sont imposées et il convient donc de s'assurer que le nombre de microorganismes responsables de telles contaminations soit maintenu sous une valeur seuil acceptable, cette valeur seuil acceptable étant propre à chaque domaine d'activité.
Les bactéries planctoniques sont un premier exemple de microorganismes contaminants, ces bactéries sont libres au niveau d'un substrat liquide ou solide et posent un problème en soi car elles sont à même de contaminer directement tout type de surface comme les denrées alimentaires, les outils médicaux, les bandes transporteuses, les réservoirs de stockage ou encore les patients humains ou les animaux eux- mêmes.
Toutefois, aujourd'hui, il est largement reconnu que les problématiques liés à la contamination par des microorganismes sont d'autant plus importants que ces derniers forment des biofilms.
En effet, dans tout type d'industrie et plus particulièrement dans le domaine de l'industrie agroalimentaire, les biofilms se forment de manière inévitable, cela au vu de la richesse du milieu environnant.
Les biofims sont définis comme un consortium de
Mmicroorganismes enchâssés dans une matrice de substances polymériques extracellulaires. Autrement dit, les biofilms sont des pellicules visqueuses qui se développent sur toutes les surfaces, suite à l'adhésion de microorganismes sur ces surfaces et à la sécrétion par ceux-ci de polymères les recouvrant, facilitant leur adhésion à la surface et formant ainsi Ia matrice extracellulaire. Les biofilms constituent ainsi une couche de protection autour des microorganismes très résistante aux agressions chimiques et thermiques ce qui rend ainsi leur élimination très difficile au moyen des biocides conventionnels et représentent de plus une source récurrente et important de contamination du milieu environnant.
Cette résistance est expliquée d'une part par la matrice de substances polymériques extracellulaires qui forme une barrière physique à la diffusion des molécules biocides dans le biofilm et, d'autre part, à l'état sessile des microorganismes et à leur capacité à s'échanger entre eux très rapidement des gènes responsables de certains mécanismes de résistance aux biocides.
Dès lors, on comprend aisément que les biofilms sont des structures très résistantes et extrêmement variées, par exemple des souches différentes d'une même bactérie peuvent former des biofilms différents, ces biofilms étant encore plus variés qu'ils sont composés de plusieurs bactéries différentes. De plus, les bactéries s'échangeant entre elles des gènes de résistance et l'environnement influe également sur le biofilm, accentuant encore leur complexité et leur résistance.
En outre, la matrice extracellulaire des biofims peut être identifiée lorsqu'elle est fortement développée mais dans la majorité des cas, le biofiim se développe insidieusement dans les installations et sa présence sera détectée que lors de l'analyse de Ia qualité du produit fini.
Concernant la croissance du biofilm, celle-ci a leu de manière cyclique en comprenant une phase de croissance durant laquelle se produit l'accumulation des microorganismes et une phase de détachement durant laquelle des morceaux entiers de biofilms et des microorganismes se détachent par érosion et sous l'effet de leur poids pour contaminer les surfaces, les denrées alimentaires, les outils médicaux, les bandes transporteuses, les réservoirs de stockage ou encore les patients humains, consommateurs ou les animaux eux-mêmes.
Cela devant entraîner pour l'industriel, l'arrêt de sa chaîne de production, effectuer un cycle de nettoyage pour éliminer le biofilm, représentant de nombreuses heures de travail, ressources déployées et de perte de rendement.
De tout ceci, il ressort que les microorganismes contaminants et/ou les biofilms constituent une reelle problématique, tout particulièrement dans le domaine des soins de santé (hôpitaux, cabinets dentaires ou médicaux), des soins vétérinaires et de l'agroalimentaire.
Cette problématique est d'autant plus critique que les microorganismes et/ou les biofilms peuvent impliquer des bactéries responsables d'infections potentiellement mortelles chez les individus, que ces bactéries soient présentes dans les hôpitaux, les cabinets vétérinaires ou encore dans l'industrie agroalimentaire et se retrouvent au final sur les produits alimentaires destinés à la consommation.
Comme cela a été indiqué plus haut, la problématique des microorganismes et plus particulièrement des biofilms est double. D'une part, les désinfectants et biocides classiques sont très souvent inefficaces car ils ne parviennent pas à atteindre les microorganismes protégés par la matrice extracellulaire du biofilm, cette matrice étant de structure et de composition complexe et très variable. D'autre part, un biofilm étant généralement mixte, c'est-à-dire qu'il contient une multitude de bactéries différentes ou de mêmes bactéries mais qui sont de souches différentes, ce qui favorise la propagation des gènes de résistance entre les bactéries du biofilm et rend ainsi leur traitement très difficile voire inefficace.
Par conséquent, d'un environnement à l'autre ou d'un secteur d'activité à l'autre, il est plutôt fréquent que les biofilms détectés soient totalement différents. Afin de détecter les biofilms, il existe des kits de détection de la présence de biofilms sur des surfaces ou dans des installation plus spécifiques (circuits d'eau, etc...), ces kits (tel que lui divulgué dans le document EP2537601) permettent de réaliser une coloration sélective des biofilms. II est donc actuellement possible de déterminer des zones où sont présents des biofilms afin de procéder à une élimination de ces derniers sans toutefois connaître la nature précise des microorganismes (bactéries) à l'origine du biofilm ciblé. en résulte que des compositions d'élimination des biofilms comprenant plusieurs enzymes sont employées sans toutefois savoir si les enzymes utilisées et éventuellement formulées dans une base détergente (voir par exemple le document EP2243821) sont réellement adéquates pour agir sur un biofilm donné. Pour cette raison, les traitements actuels sont plutôt aléatoires et non spécifiques, ce qui est économiquement non rentable et peut entraîner une perte de temps et un arrêt considérable des installations. 5 Par aileurs, des techniques de prélèvement de microorganismes au départ de surfaces ont été développées afin de caractériser et/ou de quantifier les populations de microorganismes présentes sur des surfaces et responsables de contaminations. Ces méthodes de prélèvement permettent donc de déterminer, sur une surface, les différents types (de souches) de bactéries et de microorganismes présents.
Parmi les méthodes de prélèvement de microorganismes présents sur une surface, l'une des références en la matière est la Norme
ISO 18593 :2004(F) qui prévoit et définit des méthodes horizontales pour des techniques de prélèvement sur des surfaces (plus spécifiquement sur des surfaces se rencontrant dans l'environnement des industries agroalimentaire). La méthode à «l'étoffe/éponge » est un exemple de techniques de prélèvement cité dans cette Norme, cette méthode permettant de rechercher et/ou de dénombrer des microorganismes présents sur une surface. Brièvement, selon cette méthode de prélèvement, il s'agit de mouiller l'étoffe/éponge avec une quantité de diluant qui est du sérum physiologique stérile, d'échantillonner la surface dans deux directions perpendiculaires avant d'introduire l'étoffe/éponge dans un récipient stérile avec le diluant. Par la suite, après un éventuel stockage du prélèvement, ce dernier est analysé quantitativement et/ou qualitativement.
Malheureusement, si une telle méthode permet d'assurer un prélèvement de microorganismes libres à Ia surface d'un substrat, c'est- d-dire un prélèvement de microorganismes planctoniques, elle se relève être inefficace lorsque la surface est contaminée por des microorganismes ayant formé un biofilm. En effet, comme expliqué plus haut, les microorganismes protégés par la matrice extracellulaire du biofilm, cette matrice étant de structure et de composition complexe et très variable et les biofilms étant mixtes, ils sont encore plus variés et complexes qu'ils sont composés de plusieurs bactéries différentes ou de souches différentes.
De plus, il s'avère que les techniques de prélèvement reposant sur un support imprégné d'eau peuvent avoir un effet bénéfique sur le développement des microorganismes, même lors de la réalisation d'un prélèvement au départ d'une surface. En effet, il est reconnu que certaines bactéries présentent une croissance accrue en présence d'eau, le support imbibé d'eau favorisant donc cette croissance pendant le prélèvement mais également après celui-ci puisqu'une fine pellicule d'eau subsiste sur le support traité où a eu lieu le prélèvement. Ceci peut donc favoriser le développement de certains microorganismes non prélevés ou encore car ils sont protégés par un biofilm.
Afin de pallier aux inconvénients des supports de prélèvement imprégnés d'eau, on connait de l'état de la technique le document DE10304331 qui divulgue une préparation enzymatique qui peut être utilisée pour éliminer les biofilms des surfaces en l'absence de biocides. Cette préparation enzymatique comprend une ou plusieurs enzymes du groupe des polysaccharidase et/ou protéases et éventuellement des nucléases.
Malheureusement, même si les compositions selon le document DE10304331 présentent une certaine efficacité en terme de prélèvement des microorganismes, il apparaît qu'elles sont insuffisantes compte tenu de la diversité et de la complexité des microorganismes et des biofilms qui peuvent être présents sur une surface d'une installation et qu'elles ne permettent pas un prélèvement représentatif des populations bactériennes y étant pourtant bien présentes, c'est-à-dire qu'elles ne permettent qu'un faible recouvrement des microorganismes.
En effet, les biofilms et/ou les microorganismes présents sur une surface d'une installation sont d'une part composés d'une population de microorganismes variée et complexe, c'est-à-dire différents microorganismes mais également ces différents microorganismes pouvant encore être de souches différents, cela entraînant des résistances différentes mais également la formation de matrices extracellulaires de biofilms variées, complexes et différentes, parfois au sein d'une même surface d'une installation.
Bref résumé de l'invention
Un premier objet de la présente invention porte sur un procédé d'échantilonnage, de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes sur des surfaces, pour la détection et l'analyse en laboratoire ultérieures comprenant les étapes suivantes : - appliquer stérilement et de manière caliprée une composition de prélèvement des microorganismes comprenant un ou plusieurs tensioactif(s), et au moins deux enzymes choisies dans le groupe comprenant une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase, et un agent séquestrant sur une surface à prélever, - laisser agir ladite composition sur ladite surface à prélever pendant une période de temps prédéterminée de manière à récupérer un échantillonnage des microorganismes, - prélever stérilement ladite composition contenant ledit échantillon de microorganismes,
- déposer ladite composition contenant ledit échantillon de microorganismes dans au moins un conteneur stérile, de préférence comprenant une solution de conservation de ladite solution de prélèvement, ledit conteneur stérile contenant ledit échantillon de microorganismes, pour la conservation dudit échantillon en vue de la détection et analyse en laboratoire ultérieures, ledit procédé est caractérisé en ce que ledit ou lesdits tensioactifs présents dans ladite composition de prélèvement comprenne(nt) un tensioactif anionique, ou consiste (essentiellement) en un ou plusieurs tensioactifs anioniques, et en ce que la teneur globale desdits tensioactifs (anionique) est comprise entre 0,01% et 10% en poids (poids du ou des tensioactifs : poids de Ia composition de prélèvement).
Avantageusement, ladite application calibrée de ladite composition de prélèvement est une application calibrée d'un volume contrôlé de ladite composition de prélèvement, de préférence une pulvérisation caliorée d'un volume contrôlé de ladite composition de prélèvement.
De préférence, ladite application calibrée d'un volume contrôlé de ladite composition de prélèvement est une application d'une teneur comprise entre 0,5 et 5 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm”, de préférence d'une teneur comprise entre 0,7 et 3 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm”, préférentiellement entre 0,9 et 2 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm”, avantageusement entre 1 et 1,5 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm2.
De préférence, dans ce procédé, l'étape de laisser agir ladite composition de prélèvement a lieu pendant une durée d'au moins 10 secondes, au moins 20 secondes, au moins 30 secondes, au moins Imn, de préférence d'au moins 2mn, préférentiellement d'au moins 3mn,
avantageusement d'au moins 4mn, de manière particulièrement avantageuse d'au moins 5mn et au maximum de 15 mn, de préférence au maximum de 10 mn, de préférence le temps est d'environ 5 minutes.
Avantageusement, l'étape de prélèvement stérile de ladite composition contenant ledit échantillon de microorganismes comprend une première étape de contact d'au moins un moyen de récolte stérile desdits microorganismes sur ladite surface à prélever.
De préférence, le moyen de récolte stérile est choisi dans le groupe constitué d'un tissu, une lingette, un swap, une éponge, un racloir etunécouvillon.
Avantageusement, une étape de stockage dudit conteneur stérile contenant ledit échantillon de microorganismes est réalisée à une température inférieure à 15 °C, de préférence inférieure à 10 °C, avantageusement inférieure à 5 °C entre 4 et 8°C.
De préférence, les tensioactifs (présents dans la composition de prélèvement utilisée dans le procédé de l'invention} sont présents à une teneur d'au moins 0,15% en poids par rapport au poids de ladite composition, de préférence à une teneur d'au moins 0,02% en poids et, de préférence à une teneur d'au plus 5% en poids, de préférence au plus 1% en poids, de préférence d'au plus 0,5% en poids, voire au plus 0,1%.
De préférence, la composition de prélèvement (utilisée dans le procédé de l'invention) comprend au moins trois enzymes, de préférence au moins quatre enzymes, préférentiellement au moins cinq enzymes et de manière avantageuse au moins six enzymes.
De préférence, la composition de prélèvement (utilisée dans le procédé de l'invention) comprend en outre au moins un agent stabilisant présent à Une teneur d'au moins 15% par rapport au poids de ladite composition, ledit stabilisant étant choisi dans le groupe des polyols (glycérol) et du propylène glycol.
De préférence, la composition de prélèvement (utilisée dans le procédé de l'invention) comprend en outre au moins un agent séquestrant à une teneur d'au moins 0,1% en poids par rapport au poids de ladite composition, de préférence à une teneur d'au moins 0,2%, préférentielement à une teneur comprise entre 0,3% et 3% en poids, avantageusement comprise entre 0,3% et 1% en poids, et de manière particulièrement avantageuse comprise entre 0,3% et 0,8% en poids, ledit agent séquestrant étant de préférence un carboxyméthylinuline, un phosphonate, le glycolate de sodium et leurs mélanges.
De préférence, la composition de prélèvement (utilisée dans le procédé de l'invention) a préalablement été stérilisée par un traiîtement physique choisi parmi l'iradiation par faisceau d'électrons, l'iradiation aux rayons gamma et la filtration stérilisante.
Dans ce procédé, optionnellement, la composition de prélèvement comprend une (sérine) protéase et la solution de conservation comprend au moins un inhibiteur de (sérine) protéase, de préférence le PMSF.
De préférence, la solution de conservation (utilisée dans le procédé de l'invention) comprend au moins un dérivé de polyoxyéthylène sorbitane et/ou au moins un dérivé de phosphoglycéride.
Avantageusement, ce dérivé de polyoxyéthylène sorbitane est présent à une teneur d'au moins 4 g/L, de préférence à une teneur d'au moins 4,3 g/L, préférentiellement à une teneur d'au moins 4,6 g/L, avantageusement à une teneur d'au moins 4,9 g/L et/ou ce dérivé de phosphoglycéride est présent à une teneur comprise entre 0,5 et 3 g/L, de préférence à une teneur comprise entre 0,5 et 2,5 g/L, préférentiellement entre 0,5 et 2 g/L, avantageusement entre 0,5 et 1,5 g/L.
De préférence, la solution de conservation (utilisée dans le procédé de l'invention) comprend en outre au moins un extrait de nutriments, comprenant de préférence un mélange de peptides.
Avantageusement, cet extrait de nutriments (mélange de peptides) est présent à une teneur d'au moins 1 g/L, de préférence d'au moins 2 g/L, préférentiellement d'au moins 3 g/L, avantageusement d'au moins 4 g/L et de manière particulièrement avantageuse d'au moins 5 g/L.
Avantageusement, ce procédé permet, et donc comprend en outre, l'étape de culture des microorganismes (Ex. Listeria et/ou
Salmonella) prélevés et/ou conservés.
Avantageusement, ce procédé permet, et donc comprend (en outre), l'étape de détection spécifique des microorganismes prélevés, conservés et/ou cultivés.
La détection spécifique est réalsée de préférence par immunologie.
Alternativement, ou en outre, la détection spécifique est réalisée par analyse génétique.
Alternativement, ou en outre le procédé selon l'invention permet et donc comprend un test biochimique, ledit test biochimique étant un test enzymatique, ou impliquant des protéines ou des enzymes, de préférence l'ATP métrie, Ia mesure du NADH, la mesure de l'activité catalase et la Mesure de résidus de protéines.
Description détaillée de l'invention
Il existe donc un réel besoin de fournir un procédé qui a pour but de pallier les inconvénients de l'état de la technique en permettant un prélèvement efficace, représentatif et de manière adéquate des populations de microorganismes, qu'ils soient libres mais également sous la forme d'un biofilm de structure complexe qui peut varier considérablement d'un prélèvement à un autre. En outre, il existe un besoin de fournir une composition permettant le prélèvement des
Mmicroorganismes sur différents types de surfaces, dans différents environnements, stable dans le temps et qui soit compatible avec les
Utilisateurs ou encore avec la chaîne de production, por exemple les aliments dans une industrie agroalimentaire.
Pour résoudre ce problème, il est prévu suivant l'invention l’utilisation d'une composition de prélèvement (et de décrochage) de microorganismes comprenant : - QU moins un tensioactif représentant au moins 0,01% en poids par rapport au poids de ladite composition et au plus 10% en poids (somme des poids des tensioactifs : poids total de la composition), ce tensioactif comprenant, voire consistant (essentiellement) en un tensioactit anionique, - Qu moins un agent stabilisant (glycérol) représentant au moins 15%, de préférence au moins 18%, préférentiellement au moins 20% en poids par rapport au poids de ladite composition, et/ou de préférence moins de 30%, voire moins de 25%, en poids par rapport au poids de ladite composition, - Au moins un agent séquestrant, - QU moins deux enzymes choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanose.
Les caractéristiques de la composition de prélèvement selon la présente invention présentent l'avantage de permettre le prélèvement de microorganismes, qu'ils soient sous forme planctoniques ou bien sous forme de biofilms complexes et variés.
La composition de prélèvement, en comprenant au moins deux enzymes choisies dans le groupe comprenant une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase, et une mannanase permet avantageusement de dégrader et de déstructurer efficacement la matrice extracellulaire des biofilms et notamment d'une population variée et complexe de biofims ayant des matrices extracellulaires différentes permettant ainsi de libérer les bactéries afin de les prélever.
Avantageusement, l'agent séquestrant (les cations di- ou multi-valents), est présent en une teneur pondérale d'au moins 0,2%, de préférence au moins 0,3%, voire au moins 0,4%.
L'agent séquestrant est de préférence le glucono-delta- lactone, le gluconate de sodium, le gluconate de potassium, le gluconate de calcium, le glycolate de sodium l'acide citrique (un citrate), l'acide phosphorigue (un phosphate), l'acide tartrique (un tartrate), l'acétate de sodium, le sorbitol, Ia carboxyméthyl inuline (le sel sodique) un phosphonate et les mélanges de ceux-ci. Les agents séquestrants dits « doux » sont préférés : les inventeurs ont remarqué que ces séquestrants « doux» permettaient une meilleure activité enzymatique au niveau du prélèvement et/ou pour les tests microbiologigves en aval impliquant des enzymes (ex. les inventeurs ont noté des interférences avec les tests PCR en aval lorsque trop d'agent séquestrants et/ou des agents séquestrants trop puissants étaient présents).
En outre, l'agent séquestrant ainsi que le pH compris entre 5 et 11 de la composition de prélèvement permet avantageusement de former des complexes avec des ions minéraux qui vont être fixés sous une forme empêchant leur précipitation par les réactions habituelles et ainsi de stabiliser dans le temps la composition, notamment au vu des enzymes présentes dans de telles proportions.
Dans le cadre de la présente invention, il a été déterminé que la composition de prélèvement en comprenant au moins un tensioactif anionique qui représente au moins 0,01% en poids par rapport au poids de ladite composition et, de préférence moins de 10%, voire moins de 5%, voire moins de 1,5%, voire mouis de 1% ou même moins de 0,1%, permet de manière particulièrement avantageuse de décrocher et de prélever une proportion représentative et complète d'une population de microorganismes présents sur une surface, qu'ils soient planctoniques ou bien sous la forme de bDiofilms puisque les enzymes de Ia composition selon l'invention permettent leur libération. Il s'agit, de manière surprenante, de teneurs faibles en tensioactifs.
De préférence les tensioactifs sont choisis de manière à ce que, globalement, ils aient une valeur HLB comprise entre 10 et 16.
Avantageusement, les tensioactifs comprennent des tensioactifs moussants, cela présentant l'avantage d'une part de décrocher et prélever les microorganismes et d'autre part d'emprisonner les microorganismes prélevés dans la composition selon l'invention afin de réaliser un prélèvement efficace et représentatif de la population de contaminants d'une surface.
La composition de prélèvement est avantageusement capable d'adhérer correctement sur différents types de surfaces et dans différents environnements et donc de permettre un prélèvement efficace, représentatif et de manière adéquate des populations de microorganismes, qu'ils soient llores mais également sous la forme d'un biofilm de structure complexe et variable.
en résulte que la composition de prélèvement, au contraire des compositions actuelles, permet d'obtenir un prélèvement réellement représentatif et complet des contaminants présents sur une surface, pour différents types de surfaces et pour différents environnements. Cela est particulièrement avantageux car en ayant un prélèvement représentatif et complet des microorganismes, ceux-ci pourront par la suite être identifiés et un traitement d'élimination ciblé et efficace, en utilisant les composés adéquats et non plus un cocktail de composés bien souvent inefficace pourra être appliqué sur la surface. Ceci représente bien entendu un avantage économique et de temps considérable.
L'intérêt de la composition de prélèvement est donc double en ce sens qu'elle permet d'une part de prélever et d'échantillonner l'ensemble des contaminants d'une surface qu'ils soient planctoniques ou sous forme de biofilms en vue de leur analyse et qu'elle permet ensuite de déterminer précisément quel traitement d'élimination de ces contaminants sera à appliquer.
De préférence, l'au moins un tensioactif anionique de la composition de prélèvement est le laureth sulfate de sodium (CAS 9004- 82-4).
De préférence, l'au moins un agent stabilisant et/ou agent viscosant est choisi dans le groupe comprenant un polyol ou le propane 1,2-diol ou le propane 1,3-diol. De préférence, l'agent stabilisant est le glycérol.
De préférence, la composition de prélèvement présente un pH compris entre 6 et 10, de préférence entre 7 et 9, préférentiellement entre 8 et 9, de manière particulièrement avantageuse entre 8,2 et 8,6.
De préférence, la composition de prélèvement est sous forme liquide, de préférence sous forme liquide pulvérisable, ce qui permet une application aisée et reproductible.
De préférence, la composition de prélèvement comprend en outre au moins une enzyme additionnelle choisie dans le groupe constitué des oxydo-réductases, des lyases, des transférases, des peptidases, des lipases, des estérases, et des glucosaminidases.
D'autres formes de réalisation de la composition de prélèvement suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'un kit de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures.
Comme expliqué ci-avant, l'intérêt de la composition de prélèvement est double en ce sens qu'elle permet d'une part de prélever et d'échontilonner l'ensemble des contaminants d'une surface qu'ils soient planctoniques ou sous forme de biofilms et qu'elle permet ensuite de déterminer précisément quel traitement d'élimination de ces contaminants sera à appliquer après que des analyses aient été réalisées pour identifier et caractériser précisément les contaminants.
Par conséquent, il est important que la composition de prélèvement, qui contient les contaminants, microorganismes et biofilms, suite au prélèvement, puisse permettre une analyse fiable, correcte et représentative de la population prélevée sans que ladite composition après prélèvement n'interfère avec les analyses ultérieures.
Pour résoudre ce problème, il est prévu par la présente invention l'utilisation d'un kit de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures comprenant : - Une composition de décrochage et de prélèvement de microorganismes telle que décrite ci-dessus, - QU moins un moyen de récolte stérile desdits microorganismes, - QU moins un récipient stérile, par exemple un sachet stérile, comprenant une solution de conservation pour la collecte et la conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures.
Avantageusement, l'au moins un moyen de récolte stérile des microorganismes du kit est un tissu, une lingette, une éponge.
L'invention se rapporte donc à un procédé de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures comprenant les étapes suivantes : a) au moins une application contrôlée (calibrée) (et stérile) d'une composition de prélèvement (et de décrochage) de microorganismes telle que décrite ci-dessus, b) laisser agir ladite composition de prélèvement sur ladite surface à prélever, c) déposer au moins un moyen de récolte desdits microorganismes sur ladite surface à prélever, d) laisser imbiber ledit au moins un moyen de récolte par ladite composition de décrochage, e) prélever stérilement ledit au moins un moyen de récolte des microorganismes imbibé et le déposer dans au moins un récipient stérile, par exemple un sachet stérile, comprenant de préférence une solution de conservation pour la collecte et lo conservation de microorganismes à l'état vivant ou revivifiable en vue d'analyses de laboratoire ultérieures.
Avantageusement, l'étape b) a lieu pendant une durée d'au moins 10 secondes, au moins 20 secondes, au moins 30 secondes, au moins 1 mn, de préférence d'au moins 2mn, préférentiellement d'au moins 3mn, avantageusement d'au moins 4mn, de manière particulièrement avantageuse d'au moins 5 mn.
Optionnellement, le procédé selon l'invention comprend en outre au moins une étape préliminaire de préchauffage de ladite composition de décrochage, de préférence à une température comprise entre 20 et 60 °C, préférentiellement entre 30 et 50 °C, avantageusement entre 40 et 50 °C.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend en outre au moins une étape de stockage dudit récipient stérile contenant ledit moyen de récolte imbibé, à une température inférieure à 15 °C, de préférence inférieure à 10°C, avantageusement inférieure à 5°C.
Avontageusement, la composition de conservation comprend un ou 2 ou les 3 composés choisis parmi le groupe des inhibiteurs de protéases, un nutriment (ex. des hydrolysats de protéines et/ou un mélange de peptides) et d'inhibiteurs de conservateurs choisis parmi un dérivé de polyoxyéthylène sorbitane (ex. le monooléate de polyoxyéthylène sorbitane) et/ou au moins un dérivé de phosphoglycéride (ex. phosphatidyl choline).
De préférence les inhibiteurs de conservateurs sont présents à une teneur d'au moins 4g/litre, de préférence à une teneur d'au moins 4,3 g/L, préférentielement à une teneur d'au moins 46 g/L, avantageusement à une teneur d'au moins 4,9 g/L.
Les inhibiteurs de protéases sont, de préférence, absents.
Lorsqu'ils sont présents, ils sont de préférence choisis dans le groupe constitué des agents de sulfonylation (ex. AEBSF, PMSF, DFP), des agents chélatants (ex. EDTA), des agents alkylants (ex. fluoromethyl, chloromethyl et acyloxymethyl cétones, époxides, aziridines, vinyl sulfones, and autres
Accepteur Michael), des agents acylants (ex. B-lactames, lactones, aza- peptides, dérivés heterocycligues}, des agents de phosphonylation (ex.
DFP), des fluorures de phosphonyles, ou de sulfonyle, les thiadiazoles, les sels de sulfate d'acides aminés et les inhibiteurs tissulaires de métalloprotéinases matricielles (TIMP).
Lorsque la composition de prélèvement comprend une sérine protéase, le PMSF (PhenylMethylFulfonyl Fluoride ; en français, fluorure de
Phenylmethylsulfonyle) est l'inhibiteur de protéase préféré, malgré les contraintes associées à son utilisation.
Ce procédé permet avantageusement de réaliser une étape de culture des microorganismes récoltés (prélevés) et/ou conservés, et/ou de réaliser un test biochimique, impliquant des enzymes et/ou des protéines.
En outre, ou en alternative, ce procédé permet de réaliser une étape de marquage spécifique des microorganismes récoltés (prélevés) et/ou cultivés, y compris de Listeria sp. et/ou de Salmonella sp.
Ce marquage spécifique est avantageusement réalisé par un test immunologique et/ou par un test génétique.
Dons le contexte de la présente invention, un test immunologique s'entend, de préférence, par tout test comprenant un ou plusieurs anticorps capables de se lier spécifiquement à un composant d'une bactérie déterminée. Un tel test immunologique est donc qualitatif (identité de la souche bactérienne, présence d'un facteur donné) et/ou quantitatif. Ce test peut comprendre des moyens de marquage secondaires, tels que fluorescents, qui permettent une analyse rapide et précise.
Dans le contexte de la présente invention, un test génétique s'entend, de préférence, par tout test où la présence, voire l'abondance, d'une molécule d'acide nucléique cible dans l'échantillon est analysée.
Les tests génétiques préférés sont le séquençage et Ia PCR (Polymerase
Chain Reaction} ou d'autres types d'amplification génétique (y compris les techniques d'amplifications isothermes) impliquant des sondes et/ou des amorces spécifiques du ou des microorganismes à identifier (ex.
Listeria et/ou Salmonella, y compris la détection spécifique des souches pathogènes de Listeria ou Salmonella, ou la détection spécifique de souches problématiques, par rapport à d'autres microorganismes présents, mais non problématiques).
Description détaillée d'une réalisation de l'invention
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront tirés de la description non limitative qui suit, et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
Exemples.-
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sorti du cadre des revendications annexées
Example 1
Une société de transformation de viande située en Belgique a été sélectionnée pour cette étude. Toutes les installations ont été préalablement nettoyées et désinfectées avant de réaliser les prélèvements.
Le protocole de décrochage est appliqué avec une limitation des actions mécaniques pouvant introduire une erreur de reproductibilité ; il comporte les étapes suivantes :
Parcourir rapidement (screener) les zones à prélever avec la lampe UV et kit de détection BDK (Realco) ;
Préchauffer Ia solution de prélèvement à 45°C ;
Déposer deux gabarits sur les surfaces à prélever (afin de délimiter une surface de 10cm sur 10 cm): eau physiologue vs composition de prélèvement (14 sprays pour couvrir la zone ;1,2 g /spray) ;
Laisser agir 5 minutes la solution de prélèvement ;
Déposer la lingette stérile sur les deux zones de prélèvement et laisser imbiber ;
Prélever stérilement à l'aide de pince et déposé dans un sachet stérile de transport ;
Stocker les échantillons dans des bacs frigos à 4°C ;
Évaluer après les deux zones avec la lampe et le BDK.
Au total 6 zones de prélèvements ont été incluses dans cette étude : Zone 1 table ronde ; Zone 2 couvercle pour table poubelle ; Zone 3 bac inox; Zone 4 table scie; Zone 5 surface plastique ; Zone 6 découenneuse.
Dons ces 6 zones, la composition de prélèvement comprenant des enzymes (dont une subtilisine, activité équivalente à 10
Unités Anson/kg} et des détergents (environ 10% en poids) permet une bien meilleure récupération des microorganismes, tant en microbiologie classique que par mesure ATP (2G) ou par culture. Réciproquement, il ne resta plus de microorganismes sur les surfaces où la solution de prélèvement a été placée, contrairement à la surface traitée par l’eau physiologique. La différence est surtout marquée au niveau de la microbiologie classique, par rapport à l'ATP 2G ou par test impliquent une étape de culture (peu de différence remarquées).
Les inventeurs ont reproduit l'exemple, pour y inclure des analyses métagénomiques, tout en variant le temps de contact de la composition de prélèvement sur la surface (30 secondes et 5 minutes). A nouveau, la composition enzymatique permet un bien meilleur prélèvement (ex. 100 fois mieux en microbiologie classique et 14 fois mieux en aPCR). Les bactéries retrouvées montrent une proportion accrue en
Pseudomonas.
Exemple 2 — addition d'une solution de conservation ;
Salmonella
Les inventeurs, suspectant des effets délétères associés à Ia composition de prélèvement, ont cherché à déterminer dans quelle mesure une solution adjuvante pouvait contrecarrer ceux-ci, dans le cadre de tests visant à déterminer la présence de Salmonella et/ou de Listeria, soit par
PCR ou qPCR, soit en utilisant des kits de détection commerciaux, par exemple ceux de BioMérieux. Pour ce faire, une solution dite ‘de conservation a été testée (en g/l) : Protéines (extrait de viande de bœuf ;
5) ; Peptone, 10 ; Polysorbate 80 (Tween 80 ; 5) ; Lecithin 0,7 ; NaCl, 5. En outre, divers inhibiteurs de sérine protéase ont été utilisés, dans le but de neutraliser l'activité de la subtilisine de la solution de prélèvement.
La première série de tests a été réalisée en laboratoire, où des quantités connues des bactéries (0,1 ml de 107 UFC/ml de Salmonella) ont été incubées soit dans une solution physiologique (100 ml), soit dans la composition de prélèvement de l'exemple 1 (6m! + 94 ml eau physiologique), soit dans la composition de l'exemple 1, avant que lo solution de conservation ne soit ajoutée (6 ml composition de prélèvement, 90 ml eau, 4 ml de la solution de conservation).
Lorsque 107 UFC/ml de Salmonella sont analysés (donc 104
UFC/ml dans le mélange final), les différentes situations sont compatibles avec l'identification du microorganisme ou moyen d'analyses PCR ou du test Vidas® Salmonella. Cependant, une mise en évidence par le test
Vidas SLM® (bouillon culture, puis mesure spécifique par test antigénique et fluorescence ; ce test renseigne quant à l'absence ou à la présence de Salmonella) échoue lorsque la composition de prélèvement est présente, alors qu'il fonctionne lorsque les bactéries sont diluées dans l'eau physiologique ou lorsque la solution de conservation a été ajoutée.
En outre, dans cet exemple, les inventeurs considèrent que les concentrations en Salmonella sont élevées, ce qui ne représente pas nécessairement, voire rarement, la situation sur le terrain, où même 1 CFU doit être détecté.
Exemple 3 - addition d'une solution de conservation ; Listeria
Dans ce cas, la solution enzymatique cause des problèmes au niveau de la détection (dénombrement et gPCR) ; ces problèmes sont réduits grâce à la solution de conservation, cependant le kit commercial Vidas® (LMX) ne fonctionne toujours pas.
En outre, lorsque la quantité de Listera ensemencée est réduite, le microorganisme n'est généralement plus détecté suite au mélange (Vidas LMX®, jamais ; Vidas LMO2®, pas à chaque fois) avec lo composition de prélèvement, alors que la détection reste robuste lorsque le mélange a été effectué uniquement dans l'eau physiologique. Dans ce cas (volontairement extrême), Ia composition de conservation n'a pas amélioré la détection. Par prudence, les tests ont été reproduits et trois souches de Listeria ont été testée avec toujours les mêmes résultats ; il s'agit des souches ATCC 19114, NCTC 11994 et ATCC 13932.
En comparant tous les résultats, les inventeurs concluent que la composition de prélèvement ralentit Ia croissance de microorganismes (Listeria), problème qui est partiellement résolu par la composition de conservation. Par contre, la composition de prélèvement interfère avec certains tests microbiologiques en aval. Vu que la nature et l'apondance des microorganismes sur une surface à tester est inconnue à l'avance, les inventeurs concluent donc que les compositions des exemples 1 à 3 sont utiles, mais gagneraient à être encore améliorées.
Exemple 4 - Identifications des composés délétères
Les inventeurs ont recherché dans les différentes enzymes commerciales si certains composés interféraient avec les tests microbiologiques en aval.
Les inventeurs ont remarqué que la présence de composés tels que le phénoxyéthanol, le sorbate de potassium ou des dérivés de thiazolinone est assez répandue. Ainsi, les inventeurs ont sélectionné des compositions enzymatiques qui sont dépourvues de tels composés, ou les plus pauvres possibles, même si les inventeurs ont retrouvé des concentrations importantes de 2-phénoxyéthanol dans de nombreuses compositions enzymatiques commerciales. Parmi les composés recherchés se retrouvent le Bronopol, le triclosan, l'idocarb, le chlorhexidine, le DCOIT, le
BIT le OT, le CI, le MIT, l'éthyl-parabène, le méthylparabène, le butythylparabène, le phénylparabène, l'isoproylparabène, l'sobutylparabène, le propylparabène, l'acide salisylique, l'acide 4- hydroxybenzoïque, l'acide 4-méthyloenzoïque, l'acide benzoïque, l'acide sorbique, l'acide déhydroacétique, le 1-phénoxypropane-2-ol, le 1,2-dibromo-2,4-dicyanobutane, le 2-hydroxybiphényle, le 2- phénoxyéthanol (le plus abondamment retrouvé, parfois jusqu'à 0,4% en poids), l'alcool bensylique et le chlorophenesin.
Exemple comparatif 1
Suspectant une interférence entre les protéases de la composition de prélèvement et les enzymes ou les anticorps des tests en aval, les inventeurs ont testé l'effet de l'addition d'inhibiteurs de protéases dans la solution de conservation (cfr exemple 3), tout en évitant au maximum les compositions enzymatiques commerciales comprenant des composés identifiés comme délétères (cfr. exemple 4).
Différentes manières d'appliquer l'inhibiteur de protéase ont été testées. La protéase choisie étant une subtilisine ou la trypsine, deux inhibiteurs de serine-protéase ont été testés : le PMSF et l'AEBSF.
Le PMSF a permis une bonne inhibition des activités protéolytiques des sérine-protéases testées. Par contre, l'AEBSF n'a inhibé quellatrypsine. Des tests de mesure où Listeria (les 3 souches ci-dessus ont été testées) est mise en contact avec une composition comprenant une subtilisine, puis l'AEBSF en concentration suffisante pour causer l'inhibition complète de la subtilisine ont montré que différents tests microbiologiques donnaient des valeurs plus basses, voire même ne détectaient pas Listeria dans les conditions du test, au contraire du contrôle sans les enzymes ou lorsque le PMSF est ajouté.
Ainsi, les inventeurs ont choisi d'incorporer le PMSF dans la solution de conservation à tester, malgré les inconvénients de cette molécule.
Malheureusement, même dans ces conditions, le test Vidas®
LMX ne permet pas de mettre en évidence la présence de Listeria monocytogenes.
Exemple 5 - Optimisation de Ia composition de prélèvement
Les inventeurs ont alors décidé de tester l'efficacité d'une composition de prélèvement fortement diluée et évitant autant que possible Ies composés identifiés comme délétères. En outre, les activités enzymatigues sont réduites, tout comme la teneur en détergent. Les détergents sont choisis après des tests au laboratoire pour leur compatibilité avec la vie des microorganismes, y compris de Listeria, qui a été identifiée comme plus sensible.
Tout d'abord, avec des concentrations en détergent de 10% en poids, même en présence d'activité enzymatique faible, en présence de teneur minimales en agents conservateurs (ex. non-détectables pour la quasi-totalité ; phénoxyéthanol inférieur à 4 ppm) et en absence de
PMSF, les tests de détection de Listeria, de type Vidas®, ne fonctionnent pas bien (sous-quantification massive), ou pas de manière reproductible.
Même des tests moins spécifiques ne fonctionnent pas lorsqu'une culture de Listeria est soumise à ces différents traitements.
Ainsi, tous les paramètres de la composition doivent être vérifiés, avec le problème qu'une trop forte dilution des activités enzymatiques risque de ne plus permettre le décrochage des microorganismes, alors qu'une trop forte dilution des détergents risque de ne plus permettre une application homogène de la composition ou un bon contact avec le biofilm. Ainsi, les inventeurs ont remarqué que, outre la quantité des composants, leur nature devait être reconsidérée.
Une formulation diluée a été testée comprenant environ 20% en poids de glycérol, environ 0,03% en poids d'un détergent anionique de type laureth sulfate (de sodium), 0,4% en poids de séquestrant (carboxyméthylinuline) ; 0,4% en poids de glycolate de sodium; 0,04 % en poids d'une subtilisine (activité 1 Unité Anson), ainsi qu'une lipase ; une amylase, une cellulase et une mannanase. Les inventeurs ont sélectionné des enzymes, ici des enzymes commerciales, dépourvues d'agents conservateurs tels que le sorbate de potassium, le MIT, l'OIT, le BIT et le CIT.
Lorsque c'était possible, les inventeurs ont utilisé des enzymes commerciales dépourvues de phénoxyéthanol (cellulase et mannanase), ou à faible teneur en cette molécule (subtilisine ; 4 g/kg de la formulation enzymatique, lipase ; 0,249 g/kg et amylase ; 0,233 g/kg). Les enzymes autres que la subtilisine ont été ajoutées dans des teneurs pondérales comprises entre 0,1 et 0,5% (poids de la composition enzymatique :poids total) et la quantité d'enzyme est typiquement de 1 à 10% en poids par rapport à la formulation commerciale.
Suite à l'utilisation de cette composition, la présence de
Listeria est détectée, et le test Vidas® LMX pour Listeria est, enfin, positif et reproductible. Les inventeurs ont remarqué en outre que, dans ces conditions diluées, l'ajout de l'inhibiteur de protéase PMSF n'est pas nécessaire, et même réduit Ia propagation de Listeria.
Les inventeurs considèrent que la concentration des enzymes autres que les protéases (ici, une subtilisine) peuvent encore être quelque peu réduites, ex. la concentration la plus faible qui permet le détachement, tout comme celles de l'agent séquestrant. A la lumière de la présente invention, ceci peut se tester au laboratoire sur les 3 souches de Listerig ou dans d'autres modèles, y compris, de préférence, plus complexes.
Les inventeurs ont ensuite testé une éventuelle synergie avec la solution de conservation (cfr. exemples 2 et 3) : vu que les résultats sont déjà très bons, l'amélioration associée à l'ajout de la solution de conservation est marginale, mais elle a été cependant intéressante dans le cas d'un test qui comprend une propagation suivie d'une détection par PCR.
Claims (23)
1. Procédé d'échantilonnage, de décrochage, de prélèvement et de conservation de microorganismes sur des surfaces, pour la détection et l'analyse en laboratoire ultérieures comprenant les étapes suivantes : - appliquer stérilement et de manière caliorée une composition de prélèvement des microorganismes comprenant un ou plusieurs tensioactif(s), et au moins deux enzymes choisies dans le groupe constitué d'une protéase, une polysaccharidase, une laccase, une lipase, une cellulase et une mannanase, et un agent séquestrant sur une surface à prélever, - laisser agir ladite composition sur ladite surface à prélever pendant une période de temps prédéterminée de manière à récupérer un échantillonnage des microorganismes, - prélever stérilement ladite composition contenant ledit échantillon de microorganismes, - déposer ladite composition contenant ledit échantilon de microorganismes dans au moins un conteneur stérile, ledit procédé est caractérisé en ce que lesdits tensioactifs présents dans ladite composition de prélèvement comprenne un tensioactif anionique et en ce que la teneur globale desdits tensioactifs est comprise entre 0,01% et 10% en poids (poids du ou des tensioactifs : poids de la composition de prélèvement).
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite application colibrée de ladite composition de prélèvement est une application calibree d'un volume contrôlé de ladite composition de prélèvement, de préférence une pulvérisation calibrée d'un volume contrôlé de ladite composition de prélèvement.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel ladite application caliorée d'un volume contrôlé de ladite composition de prélèvement est une application d'une teneur comprise entre 0,5 et 5 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm”, de préférence d'une teneur comprise entre 0,7 et 3 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm”, préférentiellement entre 0,9 et 2 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm”, avantageusement entre 1 et 1,5 millilitres de composition par application sur une surface de 100 cm2.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel ladite étape de laisser agir ladite composition de prélèvement a lieu pendant une durée d'au moins 10 secondes, au moins 20 secondes, au moins 30 secondes, au moins Imn, de préférence d'au moins 2mn, préférentiellement d'au moins 3mn, avantageusement d'au moins 4mn, de manière particulièrement avantageuse d'au moins 5mn et au maximum de 15 mn, de préférence au maximum de 10 mn, de préférence le temps est d'environ 5 minutes.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite étape de prélèvement stérile de ladite composition contenant ledit échantillon de microorganismes comprend une première étape de contact d'au moins un moyen de récolte stérile desdits microorganismes sur ladite surface à prélever.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite étape de prélèvement stérile de ladite composition contenant ledit échantillon de microorganismes est réalisée via un moyen de récolte stérile, de préférence choisi dans le groupe constitué d'un tissu, une lingette, un swap, une éponge, Un racloir et un écouvillon.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre au moins une étape de stockage dudit conteneur stérile contenant ledit échantillon de microorganismes à une température inférieure à 15 °C, de préférence inférieure à 10 °C, avantageusement inférieure à 5 °C entre 4 et 8 °C.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à7, danslequel les tensioactifs de ladite composition de prélèvement sont présents à une teneur d'au moins 0,02% en poids et, de préférence à une teneur d'au plus 5% en poids, de préférence au plus 1% en poids, de préférence d'au plus 0,5% en poids.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à8, dans lequel ladite composition de prélèvement comprend au moins trois enzymes, de préférence au moins quatre enzymes, préférentiellement au moins cinq enzymes et de manière avantageuse au moins six enzymes.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel ladite composition de prélèvement comprend en outre au moins un agent stabilisant présent à une teneur d'au moins 15% par rapport au poids de ladite composition, ledit stabilisant étant choisi dans le groupe des polyols (glycérol) et du propylène glycol.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel ladite composition de prélèvement comprend en outre au moins un agent séquestrant à une teneur d'au moins 0,1% en poids par rapport au poids de ladite composition, de préférence à une teneur d'au moins 0,2%, préférentiellement à une teneur comprise entre 0,3% et 3% en poids, avantageusement comprise entre 0,3% et 1% en poids, et de manière particulièrement avantageuse comprise entre 0,3% et 0,8% en poids, ledit agent séquestrant étant de préférence un carboxyméthylinuline, un phosphonate, le glycolate de sodium et leurs mélanges.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à11, dans lequel ladite composition de prélèvement a préalablement été stérilisée par un traitement physique choisi parmi l'iradiation par faisceau d'électrons, l'iradiation aux rayons gamma et la filtration stérilisante.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant en outre une application d'une solution de conservation audit échantillon de microorganismes prélevé ou déposé, pour la conservation dudit échantillon en vue de la détection et analyse en laboratoire ultérieures.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel ladite solution de conservation comprend au moins un dérivé de polyoxyéthylène sorbitane et/ou au moins un dérivé de phosphoglycéride.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel ledit au moins un dérivé de polyoxyéthylène sorbitane est présent à une teneur d'au moins 4 g/L, de préférence à une teneur d'au moins 4,3 g/L, préférentiellement à une teneur d'au moins 4,6 g/L, avantageusement à une teneur d'au moins 4,9 g/L et/ou ledit au moins un dérivé de phosphoglycéride est présent à une teneur comprise entre 0,5 et 3 g/L, de préférence à une teneur comprise entre 0,5 et 2,5 g/L, préférentiellement entre 0,5 et 2 g/L, avantageusement entre 0,5 et 1,5 g/L.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans lequel ladite solution de conservation comprend en outre au moins un extrait de nutriments, comprenant de préférence un mélange de peptides.
17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel ledit au moins un extrait de nutriments (mélange de peptides) est présent à une teneur d'au moins 1 g/L, de préférence d'au moins 2 g/L, préférentiellement d'au moins 3 g/L, avantageusement d'au moins 4 g/L et de manière particulièrement avantageuse d'au moins 5 g/L.
18. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 17 comprenant en outre l'étape de culture des microorganismes prélevés et/ou conservés.
19. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 18 comprenant en outre l'étape de détection spécifique des microorganismes prélevés, conservés et/ou cultivés.
20. Le procédé selon la revendication 19 dans lequel la détection spécifique est réalisée par immunologie.
21. Le procédé selon la revendication 19 ou 20 dans lequel la détection spécifique est réalisée (en outre) par analyse génétique.
22. Le procédé selon une quelconque des revendications 19 à 21, dans lequel un test biochimique est (en outre) réalisé, ledit test biochimique étant un test enzymatique, ou impliquant des protéines ou des enzymes, de préférence l'ATP métrie, la mesure du NADH, la mesure de l'activité catalase et la mesure de résidus de protéines.
23. Le procédé selon une quelconque des revendications 18 à 22 dans lequel le microorganisme est Salmonella sp. et/ou Listeria sp.
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