FR2677373A1 - Detection de pesticides de la famille des organophosphores et/ou des carbamates, en milieu aqueux. - Google Patents
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Abstract
L'invention consiste en un kit pour la détection dans un échantillon en milieu aqueux, de la présence de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou de la famille des carbamates, caractérisé en ce qu'il comprend: - une enzyme de la famille des cholinestérases, fixée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique de façon telle que ni le support ni la matrice ne réagissent avec le site actif de l'enzyme lorsque celle ci est immobilisée, - un réactif permettant de révéler (révélateur) par coloration ou absence de coloration selon le révélateur choisi, une réaction d'inhibition de l'enzyme immobilisée par les pesticides éventuellement présents dans l'échantillon en milieu aqueux testé préalablement mis en contact avec l'enzyme immbolisée, - un récipient ou un support dépourvu de pesticides de type organophosphorés ou carbamates susceptible de constituer un témoin négatif, - de l'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphorés et de la famille des carbamates.
Description
Détection de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, en milieu aqueux
L'invention a pour objet des moyens pour la détection de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, en milieu en phase finale aqueuse. L'invention a plus précisément pour but de permettre la mise en évidence des pesticides du type décrit ci-dessus, lorsqu'ils sont présents à l'état de traces, c'est à dire à des concentrations égales ou supérieures à 0,1 ppb dans un milieu en phase finale aqueuse. Le terme de pesticides regroupe l'ensemble des produits chimiques utilisés contre les espèces animales ou végétales considérées comme indésirables ou nuisibles. Les pesticides comprennent en particulier les insecticides.
L'invention a pour objet des moyens pour la détection de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, en milieu en phase finale aqueuse. L'invention a plus précisément pour but de permettre la mise en évidence des pesticides du type décrit ci-dessus, lorsqu'ils sont présents à l'état de traces, c'est à dire à des concentrations égales ou supérieures à 0,1 ppb dans un milieu en phase finale aqueuse. Le terme de pesticides regroupe l'ensemble des produits chimiques utilisés contre les espèces animales ou végétales considérées comme indésirables ou nuisibles. Les pesticides comprennent en particulier les insecticides.
Un des aspects de la présente invention est de fournir des moyens propres à la détection de la famille des organophosphorés et/ou de la famille des carbamates dès lors qu'ils sont suceptibles de produire un effet toxique sur les organismes supérieurs présents en milieu aquatique.
Un autre aspect de l'invention est de permettre la détection de traces de pesticides dans tout échantillon préparé dans un milieu en phase finale aqueuse et en particulier dans le cadre du contrôle des produits destinés directement ou indirectement à l'alimentation humaine ou animale.
Cette application de l'invention peut de façon intéressante être mise en oeuvre pour détecter et le cas échéant doser les pesticides ci-dessus dans des produits alimentaires, en particulier dans le vin, dans des substrats végétaux, par exemple à partir de céréales.
Une autre application est la recherche de ces pesticides dans des échantillons obtenus à partir du sol, afin de détecter une pollution du sol par des organophosphorés et/ou des carbamates.
On connait l'action toxique des organophosphorés et des carbamates sur le système nerveux des organismes supérieurs; cette action s'exerce par l'intermédiaire d'une inhibition quasi-irréversible des enzymes de la famille des cholinestérases, inhibition qui entraîne des désordres au niveau de la transmission de l'influx nerveux.
Ce principe étant connu, divers travaux ont été réalisés afin de rechercher des moyens adaptés à la détection dans des milieux donnés, de la présence des pesticides ci-dessus décrits.
A cet égard, l'invention pose le problème d'offrir des moyens pour la mise en évidence des pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, adaptés à la détection dans des échantillons en milieu aqueux, suffisamment sensibles pour rechercher des concentrations en pesticides de l'ordre du ppb voire inférieures après concentration, fiables, utilisables en routine, sur le terrain ou au laboratoire et offrant une simplicité de mise en oeuvre suffisante pour être utilisés par des operateurs n'ayant pas de compétences spécifiques dans le domaine de la détection des pesticides. En outre les moyens proposés sont d'un coût peu elevé.
L'invention fait appel pour l'application du principe de la réaction des pesticides ci-dessus sur les enzymes, à la technique d'immobilisation des enzymes et à la l'inhibition du développement d'une réaction colorée en présence des pesticides concernés.
Afin de satisfaire aux besoins de l'invention, l'immobilisation de l'enzyme dans le cadre de la mise en oeuvre de la méthode de détection des pesticides ci-dessus, est réalisée de façon telle que, d'une part le site actif de l'enzyme n'est pas modifié après l'immobilisation, d'autre part l'enzyme ainsi immobilisée ne puisse être relarguée dans la solution à doser au cours de l'incubation et/ou de la révélation, dans les conditions normales d'utilisation sur un échantillon en milieu préparé en phase finale aqueuse.
Dans la suite l'expression "milieu aqueux" sera utilisée, pour désigner soit un échantillon aqueux indépendemment de toute préparation, soit un échantillon qui après préparation par exemple séparation de certains constituants, concentration ou extraction, se présente en phase finale aqueuse.
L'invention concerne un kit pour la détection dans un échantillon en milieu aqueux, de la présence de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou de la famille des carbamates, caractérisé en ce qu'il comprend
- une enzyme de la famille des cholinestérases, fixée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique de façon telle que ni le support ni la matrice ne réagissent avec le site actif de l'enzyme lorsque celle ci est immobilisée,
- un réactif permettant de révéler (révélateur) par coloration ou absence de coloration selon le révélateur choisi, une réaction d'inhibition de l'enzyme immobilisée par les pesticides éventuellement présents dans l'échantillon en milieu aqueux testé, préalablement mis en contact avec l'enzyme immobilisée,
- un récipient ou un support dépourvu de pesticides du type organophosphorés ou carbamates susceptible de constituer un témoin négatif,
- de l'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphorés et de la famille des carbamates.
- une enzyme de la famille des cholinestérases, fixée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique de façon telle que ni le support ni la matrice ne réagissent avec le site actif de l'enzyme lorsque celle ci est immobilisée,
- un réactif permettant de révéler (révélateur) par coloration ou absence de coloration selon le révélateur choisi, une réaction d'inhibition de l'enzyme immobilisée par les pesticides éventuellement présents dans l'échantillon en milieu aqueux testé, préalablement mis en contact avec l'enzyme immobilisée,
- un récipient ou un support dépourvu de pesticides du type organophosphorés ou carbamates susceptible de constituer un témoin négatif,
- de l'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphorés et de la famille des carbamates.
L'échantillon testé est avantageusement constitué par une petite quantité de solution obtenue à partir d'un matériau donné, liquide ou non à l'origine, en général de l'ordre de quelques millilitres, avantageusement environ 1 a 3 ml.
Le cas échéant et selon les conditions d'utilisation du kit (laboratoire d'analyses, analyses de terrain), l'eau ci-dessus n'est pas fournie avec le kit.
A titre d'exemple et selon le domaine d'application du kit, l'échantillon peut être constitué par de l'eau de rejet d'usines, l'eau de nettoyage des systèmes industriels de fabrication des pesticides, de l'eau d'un cours d'eau, ou toute eau dont on peut avoir intérêt à connaître la teneur en pesticides organophosphorés ou en carbamates. I1 peut s'agir également d'échantillons préparés à partir de substances vegétales, par exemple par des opérations d'extraction et/ou d'évaporation, ces substrats végétaux étant par exemple constitués par des céréales, des fruits, des legumes.
On peut egalement rechercher les pesticides dont il est question ci-dessus dans des échantillons obtenus à partir de produits alimentaires ou de substances destinées à entrer dans la composition de produits pour l'alimentation humaine ou animale. A titre d'exemple, on peut rechercher des traces de pesticides dans le vin, les jus de fruits, les aliments pour bébés (petits pots).
L'échantillon peut aussi être obtenu à partir d'un sol que l'on souhaite tester.
L'enzyme utilisée pour la réalisation du kit selon l'invention est immobilisée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique. Différentes protéines peuvent être choisies pour constituer la matrice; à titre d'exemple, on peut citer la gélatine, la sérum albumine, l'hémoglobine.
Le support peut être par exemple l'intérieur d'un tube de réaction en verre, des microbilles de verre ou de plastique ou toute matière habituellement utilisée pour constituer des supports de proteines et par exemple une hélice de matière plastique.
Un exemple particulier de réalisation d'une matrice de gélatine et d'un support de type hélice comportant cette matrice avec l'enzyme immobilisée est donné dans les exemples.
De façon particulièrement avantageuse pour la réalisation de l'invention, on utilise de la gélatine et en particulier une gélatine ayant un degré de dureté élevé, avantageusement de l'ordre de 200 à 300 blooms, de préférence d'environ 240.
L'enzyme immobilisée sur le support est avantageusement présentee dans un récipient. Ce récipient peut notamment être un tube fermable. Dans ce cas le support contenant l'enzyme peut être lié à un bouchon fermant le tube et en particulier ce support est avantageusement une plaque ou une hélice rattachée au bouchon par une tige démontable ou non, afin de permettre la mise en contact de l'enzyme immobilisée, avec l'échantillon testé.
Pour l'utilisation du kit de l'invention, la concentration d'enzyme active immobilisée est déterminée en fonction du temps de reaction compatible avec le test effectué. En particulier le temps de reaction doit être module en fonction de la sensibilité désirée de la réaction, de quelques minutes par exemple, pour 1 ppm de malaoxon (pesticide dont la formule chimique est donnée plus loin), à 48 heures pour 0,1 ppb de ce même malaoxon. La vitesse de la réaction de coloration est aussi un paramètre à considérer : en effet la réaction colorée (ou l'absence de coloration) ne doit pas être obtenue trop rapidement si l'échantillon testé est positif.Une coloration trop rapide ne permet pas en effet de détecter des concentrations faibles des pesticides et ne permet pas de faire une différence entre un échantillon non contaminé et un échantillon légèrement contaminé.
L'enzyme immobilisée dans ou sur une matrice de gélatine, ou dans ou sur toute autre matrice protéique convenable pour la réalisation de l'invention, peut être incorporée sur ou dans la matrice sous forme réticulée et par conséquent être liée à cette matrice par l'intermédiaire de liaisons covalentes, dès lors que ce type de liaisons n'affecte pas l'activité du site actif de l'enzyme.
D'autres méthodes d'immobilisation peuvent toutefois être utilisées et en particulier on peut avoir recours à des procédés par inclusion qui permettent d'éviter toute interaction chimique entre l'enzyme et le support.
Dans le cas de l'immobilisation au sein d'une matrice réticulée, le choix de l'agent destiné à effectuer la liaison entre l'enzyme et la matrice peut être déterminant dans l'établissement des relations covalentes n'affectant pas le site actif de l'enzyme. A titre d'exemple et dans le cas où le support est de la gélatine, on peut par exemple avoir recours au glutaraldéhyde.
Le révélateur de la réaction d'inhibition entre l'enzyme immobilisée et les pesticides éventuellement présents dans l'échantillon aqueux testé, doit être sensible et permettre l'obtention d'une coloration nette afin de mettre en évidence des concentrations de pesticides de l'ordre du ppb voire jusqu'à moins de 0,1 ppb sans concentration prealable de l'échantillon.
La sensibilité de la réaction et le niveau de la fiabilité de la coloration peuvent être améliorés suivant les cas en allongeant le temps d'incubation de l'enzyme immobilisée avec l'échantillon testé.
Le kit selon l'invention comprend avantageusement de l'eau, destinée au rinçage des récipients ou supports mis en contact avec l'échantillon testé ou avec le témoin négatif.
L'utilisation de l'eau peut également être destinée à la reconstitution du révélateur lorsqu'il est par exemple présenté sous forme lyophilisée dans le kit.
De façon particulièrement avantageuse on utilisera de l'eau pure par exemple obtenue après traitement sur un appareil Millipore et présentant une résistivité élevée de l'ordre de 18 mégohms, puis éventuellement filtrée par exemple sur un filtre de 0,22 micron, pour la rendre stérile.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le kit comprend également un témoin positif pouvant consister en
1) un support et une matrice dont l'enzyme immobilisée a été inhibée irréversiblement par les pesticides considérés, ou
2) un support sans matrice ni enzyme ne permettant donc pas à la coloration de se développer.
1) un support et une matrice dont l'enzyme immobilisée a été inhibée irréversiblement par les pesticides considérés, ou
2) un support sans matrice ni enzyme ne permettant donc pas à la coloration de se développer.
La composition exacte de cette composition est avantageusement connue du point de vue qualitatif et du point de vue quantitatif. Ce témoin positif permet notamment la comparaison de la coloration obtenue, ou de l'absence de coloration dans l'échantillon testé, avec la coloration caractéristique d'une solution contaminé par les pesticides.
Selon la définition précédemment donnée, l'enzyme immobilisée utilisée pour rechercher les pesticides organophosphores ou les carbamates, est une cholinestérase capable de reagir avec ces pesticides.
D'une façon particulièrement intéressante, cette cholinestérase est une acétylcholinestérase.
En particulier il s'agit de l'acétylcholinestérase de poisson et notamment de poisson torpille. D'autres acétylcholinestérases peuvent être naturellement être utilisées. Cette acétylcholinestérase presente l'avantage de pouvoir être extraite facilement et obtenue à un degré de pureté intéressant pour faciliter la réaction.
Une autre cholinestérase utilisable pour realiser l'invention est par exemple la butyrylcholinestérase.
En particulier des resultats intéressants ont été obtenus en utilisant la butyrylcholinestérase du sérum humain.
D'autres cholinestérases comme celles extraites de l'anguille électrique, de la tête de drosophile, de sérum de cheval, d'érythrocytes de boeuf peuvent aussi être utilisées.
Selon l'utilisation souhaitée du kit de l'invention, il est possible de déterminer quelle cholinestêrase est suceptible d'offrir la meilleure sensibilité de réaction. En effet si l'on considère par exemple les carbamates, il est préférable d'utiliser l'acetylcholinesterase.
En revanche la sensibilité de la réaction obtenue est en moyenne meilleure pour les pesticides de la famille des organophosphorés lorsque l'on utilise la butyrylcholinestérase.
Avantageusement le kit précédemment défini peut être modifié et peut comprendre plusieurs matrices protéiques sur lesquelles sont immobilisées des enzymes différentes, par exemple au moins une acétylcholinestérase et au moins une butyrylcholinesterase et ce afin de rechercher un spectre plus large de pesticides.
On peut également prévoir que les differentes cholinestérases peuvent être immobilisées sur une même matrice protéique. Dans ce cas cependant la sensibilité de la réaction serait éventuellement moins forte, dès lors que l'échantillon testé contiendrait par exemple un type de pesticides réagissant uniquement ou de façon plus favorable avec un type particulier de cholinestérase, présente en quantité moindre dans ce cas, du fait de la présence des autres cholinestérases.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'enzyme cholinestérase immobilisée est sous forme purifiée. Dans ce cas les techniques classiques de purification des enzymes peuvent être utilisées et on aura par exemple recours à la technique décrite par MASSOULLIE J. et BON S. (1976) Eur. J. of
Biochem 68, p 531-539.
Biochem 68, p 531-539.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la matrice protéique pour l'immobilisation de l'enzyme est de la gélatine réticulée, dont le degré bloom de dureté est compris entre 200 et 300 blooms, de préférence voisin de 240.
Différents révélateurs peuvent être incorpores dans le kit de l'invention. A titre d'exemple on utilisera un révélateur mis en oeuvre dans la réaction d'ELLMAN (ELLMAN et al Biol. Pharmaco, 1961, Vol. 7 p 88-95) correspondant à l'acide dithiobisnitroben azoïque associé à l'acéthylthiocholine et conduisant à l'obtention d'une coloration jaune lorsque l'enzyme immobilisée n'est pas inactivée (la coloration ne pouvant se développer en présence de pesticides inhibant l'enzyme).
D'autres revelateurs sont des révélateurs habituels utilisés dans les réactions colorées, par exemple donnant des couleurs rouge, bleue ou violette.
Pour des questions de conservation et de facilité de mise en oeuvre du kit, le révélateur peut être présenté sous forme lyophilisée. Dans ce cas il est reconstitué au moment du test avec de l'eau et de préférence avec de l'eau pure fournie le cas échéant avec le kit.
L'invention vise également une méthode pour la détection dans un échantillon en milieu aqueux, de la présence de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, caractérisée par la mise en oeuvre des étapes suivantes
- mise en contact de l'échantillon testé avec une enzyme de la famille des cholinestérases, immobilisée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique dans des conditions telles que ni le support ni la matrice n'interagissent avec le site actif de l'enzyme,
- incubation de l'échantillon testé avec l'enzyme immobilisée pendant un temps suffisant pour permettre la reaction entre l'enzyme et l'échantillon testé, la température de l'échantillon étant inférieure à 40"C et de préférence inférieure à 25"C,
- addition d'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphorés ou des carbamates aux récipients ou aux supports constituant le témoin négatif et le témoin positif,
- rinçage avec de l'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphores et/ou des carbamates, du support et de la matrice comprenant l'enzyme immobilisée et des récipients ou supports contenant l'échantillon teste, le témoin négatif, et s'il y a lieu le témoin positif,
- mise en contact de l'enzyme immobilisée, du témoin négatif et le cas échéant du témoin positif ainsi rincés avec le révélateur sous forme active pendant un temps suffisant pour obtenir une réaction colorée caractéristique de l'activité de l'enzyme ou une absence de coloration témoin de l'inactivation de l'enzyme,
- comparaison de la coloration obtenue ou de l'absence de coloration, avec la coloration des témoins négatif et positif.
- mise en contact de l'échantillon testé avec une enzyme de la famille des cholinestérases, immobilisée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique dans des conditions telles que ni le support ni la matrice n'interagissent avec le site actif de l'enzyme,
- incubation de l'échantillon testé avec l'enzyme immobilisée pendant un temps suffisant pour permettre la reaction entre l'enzyme et l'échantillon testé, la température de l'échantillon étant inférieure à 40"C et de préférence inférieure à 25"C,
- addition d'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphorés ou des carbamates aux récipients ou aux supports constituant le témoin négatif et le témoin positif,
- rinçage avec de l'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphores et/ou des carbamates, du support et de la matrice comprenant l'enzyme immobilisée et des récipients ou supports contenant l'échantillon teste, le témoin négatif, et s'il y a lieu le témoin positif,
- mise en contact de l'enzyme immobilisée, du témoin négatif et le cas échéant du témoin positif ainsi rincés avec le révélateur sous forme active pendant un temps suffisant pour obtenir une réaction colorée caractéristique de l'activité de l'enzyme ou une absence de coloration témoin de l'inactivation de l'enzyme,
- comparaison de la coloration obtenue ou de l'absence de coloration, avec la coloration des témoins négatif et positif.
Le temps d'incubation de l'échantillon testé peut être très variable et notamment être compris entre 5 minutes et 20 heures ou plus, de préférence autour de 30 minutes. D'une façon générale l'augmentation du temps de l'incubation permet d'obtenir une sensibilité de réaction plus intéressante.
Par exemple, la durée de mise en contact pour des échantillons très contaminés ou très concentrés peut être de l'ordre de 5 à 10 minutes et inversement, pour des échantillons très peu contaminés, la durée d'incubation pourra atteindre 48 heures.
Pour mettre en oeuvre la méthode précédemment définie, on choisira de preference un échantillon à tester dont le pH est compris entre 4 et 9.
De préférence la concentration de solvants oragniques de l'échantillon testé est inférieure à 5%.
En effet une concentration trop forte risque de detruire ou d'endommager le support utilisé pour fixer la gélatine ou une autre matrice protéique destinée à l'immobilisation de l'enzyme.
Par exemple, 5% de toluène ou de dichlorométhane detruisent le support inerte tandis qu'une teneur en acétone de 10% est sans effet sur l'activité enzymatique.
Dans un mode de réalisation particulier de cette méthode, on peut procéder à une étape de concentration prealable de l'échantillon en milieu aqueux, permettant ultérieurement d'augmenter la sensibilité de la détection.
L'étape de rinçage décrite permet de tester des échantillons même lorsqu'ils sont colorés, tout en n'affectant pas la qualité de la reaction colorée finale utilisée pour détecter la présence des pesticides.
Selon les conditions d'utilisation du test, et en fonction du niveau de précision souhaité pour la recherche des pesticides, on pourra utiliser à la suite de l'obtention de la reaction colorée, un appareil du type colorimètre pour mesurer la quantite de pesticides présente dans l'échantillon.
Comme il a été décrit précédemment dans le cadre de la définition du kit, la cholinestérase utilise pour la réalisation de la méthode ci-dessus peut être une acétylcholinestérase et en particulier du poisson torpille.
Il peut également s'agir d'une butyryl cholinestérase, et notamment de celle du sérum humain ou d'une autre acétylcholinestérase comme mentionné plus haut.
De même on peut utiliser un mélange de ces cholinestérases ou les utiliser de façon séparée pour la recherche des pesticides dans un même échantillon donné.
De même les caractéristiques décrites pour la gélatine lorsqu'elle est utilise comme matrice d'immobilisation de l'enzyme, dans le cadre de la définition précédemment donnée, sont applicables pour la réalisation de la méthode précédente.
Les utilisations du kit de la méthode précédemment décrite sont variables et concernent différents secteurs d' activité.
En effet ce kit peut être interessant dans le domaine de la recherche de pollution des eaux de rejet de certaines usines ou des eaux de cours d'eau et notamment de rivières, etc...
L'invention vise d'une façon générale l'utilisation d'un kit répondant aux définitions cidessus ou d'une méthode telle que celle décrite cidessus, pour la détection de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, présents dans un échantillon en milieu aqueux à partir d'une concentration égale ou supérieure à 0,1 ppb.
En particulier cette utilisation peut être appliquee à la recherche pour la détection de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, presents dans un échantillon en milieu aqueux choisi parmi les composés disponibles sous les noms suivants ou leurs formes oxydées
- pour les organophosphorés, le naled, le phosdrin, le dichlorvos, le malathion et le malaoxon, l'oxydéméton-méthyl, le déméton-S-méthyl, le paraoxon méthyl et éthyl;
- pour les carbamates, le carbofuran, l'aldicarb, le méthomyl, le carbaryl.
- pour les organophosphorés, le naled, le phosdrin, le dichlorvos, le malathion et le malaoxon, l'oxydéméton-méthyl, le déméton-S-méthyl, le paraoxon méthyl et éthyl;
- pour les carbamates, le carbofuran, l'aldicarb, le méthomyl, le carbaryl.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples qui suivent.
EftEnPLE8
PRESENTATION DU KIT
Le kit présenté dans une mallette comprend - 1 tube test - 1 tube témoin négatif - 1 tube témoin positif - 1 flacon de révélateur lyophylisé - 1 flacon d'eau ultrapure, destinée à reconstituer le révélateur, à effectuer l'incubation du témoin négatif, et à rincer les supports et les tubes entre l'étape 1 et l'étape 2 - 1 mode d'emploi détaillé
Le support est constitué d'une hélice démontable ou non, fixée au bouchon à vis des tubes test. Les tubes sont remplis d'eau afin d'empêcher le dessèchement de l'enzyme sur le support. Chaque tube porte un capuchon de couleur différent de façon à le différencier des autres.
PRESENTATION DU KIT
Le kit présenté dans une mallette comprend - 1 tube test - 1 tube témoin négatif - 1 tube témoin positif - 1 flacon de révélateur lyophylisé - 1 flacon d'eau ultrapure, destinée à reconstituer le révélateur, à effectuer l'incubation du témoin négatif, et à rincer les supports et les tubes entre l'étape 1 et l'étape 2 - 1 mode d'emploi détaillé
Le support est constitué d'une hélice démontable ou non, fixée au bouchon à vis des tubes test. Les tubes sont remplis d'eau afin d'empêcher le dessèchement de l'enzyme sur le support. Chaque tube porte un capuchon de couleur différent de façon à le différencier des autres.
REALISATION DU TEST
1 - Etape 1
Le test est effectué à température ambiante, mais la température de l'eau à tester ne doit pas être supérieure à 25-30"C.
1 - Etape 1
Le test est effectué à température ambiante, mais la température de l'eau à tester ne doit pas être supérieure à 25-30"C.
Le tube d'analyse est rempli avec l'échantillon d'eau à tester. Les tubes témoins sont remplis avec de l'eau ultrapure fournie.
Les hélices correspondantes sont alors placées dans les tubes et les bouchons sont vissés. Les tubes sont alors, ou peuvent être, placés verticalement dans les trous prévus pour les accueillir dans la garniture de la mallette.
La durée d'incubation des supports est fonction de la sensibilité désirée; par exemple, elle peut aller de quelques minutes pour des concentrations en carbofuran de 1 ppm à 48 heures pour une concentration en carbofuran de 0,1 ppb.
2 - Etape 2
Lorsque le temps d'incubation est écoulé, les hélices sont sorties des tubes et rincées avec quelques gouttes d'eau. Les tubes sont vidés et également rincés avec l'eau fournie. Le tube témoin positif est également vidé. Les trois tubes sont remplis avec le révélateur préalablement reconstitué avec de l'eau fournie. Les hélices sont placées dans les tubes et les bouchons vissés.
Lorsque le temps d'incubation est écoulé, les hélices sont sorties des tubes et rincées avec quelques gouttes d'eau. Les tubes sont vidés et également rincés avec l'eau fournie. Le tube témoin positif est également vidé. Les trois tubes sont remplis avec le révélateur préalablement reconstitué avec de l'eau fournie. Les hélices sont placées dans les tubes et les bouchons vissés.
Le temps nécessaire à la révélation varie suivant la température du reactif et il faut environ une demiheure pour atteindre la coloration jaune maximum; mais le résultat peut être visible dès les premières minutes de la rédaction.
Le témoin négatif développe une coloration jaune intense qui correspond à 100% d'activité des cholinestérases (0% d'inactivation). Le témoin positif ne développe pas de coloration jaune (sa coloration jaune très pâle correspond à la couleur du révélateur).
Cette coloration correspond à 0% d'activite (100% d'inactivation). La lecture du résultat du test se fait par rapport à ces deux témoins
si la coloration est égale à celle du témoin négatif, le test est négatif,
si la coloration est inférieure à celle du témoin négatif, le test est positif,
une coloration égale à celle du témoin positif correspond à 100% d'inactivation.
si la coloration est égale à celle du témoin négatif, le test est négatif,
si la coloration est inférieure à celle du témoin négatif, le test est positif,
une coloration égale à celle du témoin positif correspond à 100% d'inactivation.
La différence de coloration entre les tubes peut être évaluée à l'oeil nu, ou à l'aide d'un colorimètre de terrain.
SENSIBILITE
Dans les résultats rapportés dans les différents tableaux, l'enzyme utilisée est l'acétylcholines- terse de poisson torpille (AChE).
Dans les résultats rapportés dans les différents tableaux, l'enzyme utilisée est l'acétylcholines- terse de poisson torpille (AChE).
La zone de sensibilité moyenne du test pour les formes actives de pesticides est actuellement de 10 ppb pour une durée d'incubation de 30 min. Certains pesticides seront reconnus à une concentration plus faible, d'autres à une concentration plus élevée (voir tableaux 1 et 2).
Le test ne permet pas de différencier entre les différents organophosphorés et carbamates inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (ou de la butyrylcholinestérase), mais les détecte à différents degrés.
A titre d'exemple, les thiosphosphates peu (ou pas) réactifs et peu (ou pas) toxiques dans leurs formes natives, donnent après oxydation, des formes plus actives inhibant fortement les enzymes immobilisées.
L'augmentation moyenne de sensibilité est de 1000.
INTERFERENCES
Le principe du test en deux temps permet d'éliminer des interferences pouvant être dues à d'autres substances présentes dans l'eau telles que les métaux lourds, les ions fluorure, et les inhibiteurs réversibles de l'enzyme.
Le principe du test en deux temps permet d'éliminer des interferences pouvant être dues à d'autres substances présentes dans l'eau telles que les métaux lourds, les ions fluorure, et les inhibiteurs réversibles de l'enzyme.
L'immobilisation de l'enzyme dans ou sur la matrice augmente sa stabilité naturelle, et la rend peu sensible à des variations de pH, ou à la présence dans l'eau de substances telles que des solvants organiques ou des hydrocarbures, etc...
Des mesures effectuées dans des eaux de différentes origines (rivière, étang, bassin, pluie, eau de rejet d'usine chimique) n'ont montré aucune modification de l'activité du kit.
Certaines eaux de nettoyage de machines, ayant une forte proportion de solvants organiques ou d'huile ne permettent pas l'utilisation, sans préparation du kit, par exemple par extraction préalable avec un ou plusieurs solvants organiques puis évaporation du solvant ou des solvants, suivie de la reprise du résidu dans l'eau.
CONSERVATION
Le kit peut être conservé à température ambiante sans toutefois être soumis à des températures inférieures à 00C ou supérieures à 30 C. La température de stockage idéale est de 4"C (réfrigérateur).
Le kit peut être conservé à température ambiante sans toutefois être soumis à des températures inférieures à 00C ou supérieures à 30 C. La température de stockage idéale est de 4"C (réfrigérateur).
Durée de conservation : les études de stabilité montrent qu'une durée minimale de conservation de 6 mois à 1 an est possible, l'enzyme immobilisée étant de loin plus stable que le réactif.
Tableau 1
Acétylcholinesterase de poisson torpille
Seuil de sensibilité pour 30 minutes d'incubation
au colorimètre1 à l'oeil nu2
Pesticide
Organophosphorés
Phosdrin 3 ppb 5 ppb
Malaoxon 5 ppb 10 ppb
Naled 10 ppb 20 ppb Paraoxon-Mêthyl 22 ppb 50 ppb
Paraoxon-Ethyl 35 ppb 100 ppb
Déméthon-S-Méthyl 20 ppb 100 ppb
DDVP 100 ppb 177 ppb Oxydéméton-Méthyl 200 ppb 300 ppb
Malathion 1 ppm 3 ppm
Carbamates
Carbofuran 1 ppb 2 ppb
Méthomyl 12 ppb 30 ppb
Carbaryl 22 ppb 40 ppb Aldicarb 35 ppb 100 ppb concentration d'inhibiteur donnant 20% d'inhibition 2 : concentration d'inhibiteur donnant 30% d'inhibition
Tableau 2
Acétylcholinestérase de poisson torpille
Seuil de sensibilité pour 20 heures d'incubation
au colorimètre1 à l'oeil nu2
Pesticide
Organophosphorés Phosdrin 0,4 ppb 1,5 ppb
Malaoxon 0,3 ppb 0,6 ppb
Naled 0,5 ppb 1 ppb
Paraoxon-Méthyl 0,7 ppb 2 ppb
Paraoxon-Ethyl 1 ppb 2 ppb Déméthon-S-Méthyl 7 ppb 10 ppb
DDVP 6 ppb 10 ppb Oxydêméton-Méthyl ND ND
Malathion 50 ppb 100 ppb
Carbamates
Carbofuran 0,4 ppb 0,8 ppb
Méthomyl ND ND
Carbaryl 6 ppb 13 ppb
Aldicarb 2 ppb 16 ppb : : concentration d'inhibiteur donnant 20% d'inhibition 2 : concentration d'inhibiteur donnant 30% d'inhibition
ND: non déterminé
Les formules des différents composés ci-dessus sont données ci-après, par référence à l'ouvrage the Pesticide
Manual, 8ème Edition, C. WORTHING publié par The British
Crop Protection Council.
Acétylcholinesterase de poisson torpille
Seuil de sensibilité pour 30 minutes d'incubation
au colorimètre1 à l'oeil nu2
Pesticide
Organophosphorés
Phosdrin 3 ppb 5 ppb
Malaoxon 5 ppb 10 ppb
Naled 10 ppb 20 ppb Paraoxon-Mêthyl 22 ppb 50 ppb
Paraoxon-Ethyl 35 ppb 100 ppb
Déméthon-S-Méthyl 20 ppb 100 ppb
DDVP 100 ppb 177 ppb Oxydéméton-Méthyl 200 ppb 300 ppb
Malathion 1 ppm 3 ppm
Carbamates
Carbofuran 1 ppb 2 ppb
Méthomyl 12 ppb 30 ppb
Carbaryl 22 ppb 40 ppb Aldicarb 35 ppb 100 ppb concentration d'inhibiteur donnant 20% d'inhibition 2 : concentration d'inhibiteur donnant 30% d'inhibition
Tableau 2
Acétylcholinestérase de poisson torpille
Seuil de sensibilité pour 20 heures d'incubation
au colorimètre1 à l'oeil nu2
Pesticide
Organophosphorés Phosdrin 0,4 ppb 1,5 ppb
Malaoxon 0,3 ppb 0,6 ppb
Naled 0,5 ppb 1 ppb
Paraoxon-Méthyl 0,7 ppb 2 ppb
Paraoxon-Ethyl 1 ppb 2 ppb Déméthon-S-Méthyl 7 ppb 10 ppb
DDVP 6 ppb 10 ppb Oxydêméton-Méthyl ND ND
Malathion 50 ppb 100 ppb
Carbamates
Carbofuran 0,4 ppb 0,8 ppb
Méthomyl ND ND
Carbaryl 6 ppb 13 ppb
Aldicarb 2 ppb 16 ppb : : concentration d'inhibiteur donnant 20% d'inhibition 2 : concentration d'inhibiteur donnant 30% d'inhibition
ND: non déterminé
Les formules des différents composés ci-dessus sont données ci-après, par référence à l'ouvrage the Pesticide
Manual, 8ème Edition, C. WORTHING publié par The British
Crop Protection Council.
CARBOFURAN
ALDICARB
CARBARYL
ALDICARB
CARBARYL
METHOMYL
DEMETHON-S-METHYL
OXYDEMETON -METHYL
MALATHION
DDVP
PHOSDRIN
NALED
MALAOXON
PARAOXON-ETHYL
PARAOXON-METHYL
Réalisation des hélices1 (1) Hélices immunostick Maxisorp NUNC : L'immunostick se présente sous la forme d'une tige munie d'une hélice fixée à l'intérieur du capuchon vissant un tube en prolypropylène.
1. Préparation de la matrice de gélatine
Pour une matrice de gélatine à 5%, 7,5 g de gelatine (de peau de porc, 240 bl SANOFI BIOINDUSTRIE) sont ajoutés à 150 ml d'une solution de tampon phosphate (monohydrogénophosphate et dihydrogénophosphate de sodium) 25 mM à pH 6,8. La gélatine est mise à fondre dans une etuve à 47"C.
Pour une matrice de gélatine à 5%, 7,5 g de gelatine (de peau de porc, 240 bl SANOFI BIOINDUSTRIE) sont ajoutés à 150 ml d'une solution de tampon phosphate (monohydrogénophosphate et dihydrogénophosphate de sodium) 25 mM à pH 6,8. La gélatine est mise à fondre dans une etuve à 47"C.
La solution est ensuite placee au bain-marie à 30 C.
La quantité adéquate d'enzyme (480 pitres d'une solution d'acétylcholinestérase acétylcholinestérase à 0,5 mg/ml) est ajoutée à la gélatine lorsque celle-ci est à une température de 30 C.
2. Préparation des hélices
Chaque hélice est trempée durant 15 secondes dans la solution de gélatine, puis retirée délicatement de la solution et mise à secher durant environ 20 minutes en position horizontale sur du papier non absorbant.
Chaque hélice est trempée durant 15 secondes dans la solution de gélatine, puis retirée délicatement de la solution et mise à secher durant environ 20 minutes en position horizontale sur du papier non absorbant.
Après séchage chaque hélice est trempée durant exactement 3 minutes dans un bain de glutaraldéhyde (SIGMA CHIMIE ref
G.6257)à 1%, puis retirée et rincée à l'eau milliporée (MilliQ).
G.6257)à 1%, puis retirée et rincée à l'eau milliporée (MilliQ).
Les hélices sont ensuite trempées pendant au moins 8 heures dans une solution de glycine (MERCK ref 4201) à 10g/l. Après trempage elles sont rincées à nouveau avec de l'eau milliporée.
Elles sont alors placées dans les tubes à vis, chaque tube contient 1,8 ml de tampon phosphate 50 mM pH 7,2, 0,2% en azidure de sodium.
Les hélices ainsi préparées peuvent être conservées à 4"C ou à température ambiante.
Claims (19)
1/ Kit pour la détection dans un échantillon en milieu aqueux, de la présence de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou de la famille des carbamates, caractérisé en ce qu'il comprend
- une enzyme de la famille des cholinestêrases, fixée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique de façon telle que ni le support ni la matrice ne réagissent avec le site actif de l'enzyme lorsque celle ci est immobilisée,
- un réactif permettant de révéler (révélateur) par coloration ou absence de coloration selon le révélateur choisi, une réaction d'inhibition de l'enzyme immobilisée par les pesticides éventuellement présents dans l'échantillon en milieu aqueux testé préalablement mis en contact avec l'enzyme immbolisée,
- un récipient ou un support dépourvu de pesticides de type organophosphorés ou carbamates, susceptible de constituer un témoin négatif,
- de l'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphorés et de la famille des carbamates.
2/ Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un témoin positif.
3/ Kit selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme utilisée pour rechercher la présence de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates est une acétylchol inestérase.
4/ Kit selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'acétylcholinestérase est celle du poisson torpille.
5/ Kit selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme utilisée pour rechercher la présence de pesticides de la famille des organophosphorés ou des carbamates est une butyrylcholinestérase.
6/ Kit selon la revendication 5, caractérisé en ce que la butyrylcholinestérase est celle du sérum humain.
7/ Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'enzyme est sous forme purifiée.
8/ Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la matrice protéique pour l'immobilisation de l'enzyme est de la gélatine réticulée dont le degré de dureté est compris entre 200 et 300 blooms, de préférence voisin de 240.
9/ Kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérise en ce que le révélateur est le réactif d'ELLNAN.
10/ Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce que le révélateur est présenté sous forme lyophilisée.
11/ Méthode pour la détection dans un échantillon en milieu aqueux, de la présence de pesticides de la famille des organophosphorés ou des carbamates, caractérisée par la mise en oeuvre des etapes suivantes
- mise en contact de l'échantillon testé avec une enzyme de la famille des cholinestérases, immobilisée sur un support par l'intermédiaire d'une matrice protéique dans des conditions telles que ni le support ni la matrice n'interagissent avec le site actif de l'enzyme,
- incubation de l'échantillon teste avec l'enzyme immobilisée pendant un temps suffisant pour permettre la réaction entre l'enzyme et l'échantillon testé, la température de l'échantillon étant inférieure à 40"C et de préférence inférieure à 25 C,
- addition d'eau dépourvue de pesticides de la famille des organophosphorés ou des carbamates aux récipients ou aux supports constituant le témoin négatif et le témoin positif,
- rinçage avec de l'eau dépourvue des pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, de la matrice et du support comprenant l'enzyme immobilisée et des récipients ou supports contenant l'échantillon testé, le témoin négatif, et s'il y a lieu le témoin positif,
- mise en contact de l'enzyme immobilisée, du témoin négatif et le cas échéant du témoin positif ainsi rincés avec le révélateur sous forme active pendant un temps suffisant pour obtenir une réaction colorée caractéristique de l'activité de l'enzyme ou une absence de coloration témoin de l'inactivation de l'enzyme,
- comparaison de la coloration obtenue avec la coloration des temoins négatif et positif.
12/ Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que la réaction colorée est mesurée à l'aide d'un colorimètre.
13/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que l'enzyme utilisée pour rechercher la présence de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates est une acétylcholinesterase.
14/ Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'acétylcholinestêrase est celle du poisson torpille, et en ce que l'eau utilisée est de l'eau pure.
15/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que l'enzyme utilisée pour rechercher la présence de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates est une butyrylcholinestérase, et en ce que l'eau utilisée est de l'eau pure.
16/ Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la butyrylcholinestérase est celle du sérum humain.
17/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisée en ce que la matrice d'immobilisation de l'enzyme est de la gélatine réticulée dont le degré de durete est compris entre 200 et 300 blooms, de préférence voisin de 240.
18/ Utilisation d'un kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ou d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, pour la détection de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, présents dans un échantillon en milieu aqueux à une concentration égale ou supérieure à 0,1 ppb.
19/ Utilisation d'un kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ou d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, pour la détection de pesticides de la famille des organophosphorés et/ou des carbamates, presents dans un échantillon en milieu aqueux choisi parmi les composés suivants ou leurs formes oxydées
- pour les organophosphorés, le naled, le phosdrin, le dichlorvos, le malathion et le malaoxon, l'oxydéméton-méthyl, le déméton-S-méthyl, le paraoxon méthyl et ethyl;
- pour les carbamates, le carbofuran, l'aldicarb, le méthomyl, le carbaryl.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9106976A FR2677373B1 (fr) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Detection de pesticides de la famille des organophosphores et/ou des carbamates, en milieu aqueux. |
| PCT/FR1992/000512 WO1992021779A1 (fr) | 1991-06-07 | 1992-06-05 | Detection de pesticides de la famille des organophosphores et/ou carbamates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9106976A FR2677373B1 (fr) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Detection de pesticides de la famille des organophosphores et/ou des carbamates, en milieu aqueux. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2677373A1 true FR2677373A1 (fr) | 1992-12-11 |
| FR2677373B1 FR2677373B1 (fr) | 1995-10-06 |
Family
ID=9413614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9106976A Expired - Fee Related FR2677373B1 (fr) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Detection de pesticides de la famille des organophosphores et/ou des carbamates, en milieu aqueux. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2677373B1 (fr) |
| WO (1) | WO1992021779A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0675197A1 (fr) * | 1994-03-28 | 1995-10-04 | Anda Biologicals S.A. | Support solide fixant l'acétylcholinestérase et/ou un récepteur à acétylcholinestérase stabilisé et procédé pour son obtention |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ288576B6 (cs) * | 1992-09-01 | 2001-07-11 | Oritest Spol. S R. O. | Biosenzor pro detekci a rozlišení inhibitorů cholinesteráz, způsob přípravy zóny biosenzoru s imobilizovanou cholinesterázou, způsob detekce inhibitorů cholinesteráz a způsob rozlišení inhibitorů cholinesteráz |
| CN107746838A (zh) * | 2017-08-21 | 2018-03-02 | 郑州炜盛电子科技有限公司 | 农药残留检测用酶源及其应用 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| DE2650213A1 (de) * | 1975-11-04 | 1977-05-12 | Tno | Verfahren und mittel fuer den nachweis und/oder die bestimmung alkylierender verbindungen |
| US4324858A (en) * | 1980-06-16 | 1982-04-13 | Midwest Research Institute | Stabilization of cholinesterase, detector kit using stabilized cholinesterase, and methods of making and using the same |
-
1991
- 1991-06-07 FR FR9106976A patent/FR2677373B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-06-05 WO PCT/FR1992/000512 patent/WO1992021779A1/fr active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2650213A1 (de) * | 1975-11-04 | 1977-05-12 | Tno | Verfahren und mittel fuer den nachweis und/oder die bestimmung alkylierender verbindungen |
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| FRESENIUS` ZEITSCHRIFT FUR ANALYTISCHE CHEMIE vol. 331, no. 3/4, 1988, pages 316 - 320; G. SCHWEDT ET AL.: 'Reaktivierbare Enzymelectrode mit Acetylcholinesterase zur differenzierten Erfassung von Insekticiden im Spurenbereich.' * |
| INTERNATIONAL JOURNAL OF ENVIRONMENTAL ANALYTICAL CHEMISTRY vol. 8, no. 4, 1980, pages 277 - 282; G.M.CHRISTENSEN ET AL.: 'An Enzyme-Immobilization Procedure for the Analysis of Enzyme-Inhibiting Chemicals in Water.' * |
| Z. WASSER-ABWASSER-FORSCH. vol. 22, 1989, WEINHEIM pages 67 - 72; P. HERZSPRUNG ET AL.: 'Bestimmung von Phosphorpestiziden und insektiziden Carbamaten mittels Cholinesterasehemmung.' * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0675197A1 (fr) * | 1994-03-28 | 1995-10-04 | Anda Biologicals S.A. | Support solide fixant l'acétylcholinestérase et/ou un récepteur à acétylcholinestérase stabilisé et procédé pour son obtention |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2677373B1 (fr) | 1995-10-06 |
| WO1992021779A1 (fr) | 1992-12-10 |
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