BE1025121A1 - Constructions antigeniques du virus zika - Google Patents

Abstract

Il est fourni ici des composés utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunogène chez un sujet contre une infection virale, des procédés pour leur utilisation dans le traitement, et des procédés pour leur fabrication. Les composés comprennent une construction d'acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène du virus Zika.

Description

(30) Données de priorité :

17/11/2016 US 62423398

13/04/2017 US 62485090

05/10/2017 US 62568559 (71) Demandeur(s) :

Human Services	GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA 1330, RIXENSART Belgique The United States of America, As Represented by the Department of Health and 20892-7660, ROCKVILLE États-Unis
(72) Inventeur(s) :	DOWD Kimberley 20852-3804 ROCKVILLE États-Unis GRAHAM Barney S. 20852-3804 ROCKVILLE États-Unis KO Sung-Youl 20852-3804 ROCKVILLE États-Unis KONG Wing-Pui 20852-3804 ROCKVILLE États-Unis

MASCOLAJohn

20852-3804 ROCKVILLE

États-Unis

PIERSON Theodore

20852-3804 ROCKVILLE

États-Unis

SHARMA Mayuri

02139 CAMBRIDGE

États-Unis

YU Dong

20850 ROCKVILLE

États-Unis (54) CONSTRUCTIONS ANTIGENIQUES DU VIRUS ZIKA (57) Il est fourni ici des composés utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunogène chez un sujet contre une infection virale, des procédés pour leur utilisation dans le traitement, et des procédés pour leur fabrication. Les composés comprennent une construction d'acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène du virus Zika.

Génome S‘ coiife —FKS.l

Signal peptidase de l'hôte JL Protéase virale (NS2B-NS3)

Furîne dé l’hôte ? Protéase inconnue

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CONSTRUCTIONS ANTIGENIQUES DU VIRUS ZIKA

Déclaration de l'intérêt du gouvernement americain

Cette invention a été élaborée dans la misé en œuvre d^Turt accord de recherche et de développement en. collaboration avec les National Institutes of Health, une agence du Department of Health and Human Services.

Le gouvernement des Etats-Unis a certains droit-s sur cette invention.

Domaine de l’invention

Cette invention se situe dans le domaine du 1.0 traitement et de la prévention des infections virales.

En particulier, la présente invention concerne des constructions de vaccins à base d'acide nucléique codant pour des antigènes du virus Zika et 1’utilisation d'antigènes du virus Zika pour le traitement et la 15 prévention des infections par le virus Zika.

Contexte de l'invention

Le virus Zika a été identifié pour la première fois en Ouganda en 1947 chez les: singes Rhésus par .2:0 1 ’ intermédiaire d'un réseau de surveillance de la fièvre jaune selvatiqae. Il a été identifié ensuite chez des êtres humains en 1952 en Ouganda et en République Unie de Tanzanie. Des poussées de la maladie due au virus Zika ont été: .enregistrées en Afrique, dans les Amériques, 25 en Asie et dans le Pacifique. Le virus Zika appartient au genre flavivirus. Son réservoir est inconnu.

Le virus Zika est un virus à ARN brin positif appartenant à la famille des flavivix-idés. La maladie

B E2017/5835 due au virus Zika est provoquée par un virus transmis principalement par les moustiques Aedes. Les personnes atteintes de la maladie due au virus Zika peuvent présenter des symptômes qui peuvent comprendre une 5 fièvre légère, une éruption cutanée, une conjonctivite,.

des douleurs musculaires et articulaires, un malaise ou une céphalée. Ces symptômes durent normalement pendant 2 à 7 jours.

Le virus Zika est connu pour circuler en Afrique, 10 dans les Amériques, en Asie et dans le Pacifique.

Transmis par les moustiques Aedes, le virus est connu pour provoquer soit une infection asymptomatique (chez la majorité des personnes infectées) soit une maladie spontanément résolutive avec une diminution de 15 1’eruption, de la conjonctivite et une fièvre légère.

Toutefois, au cours- de la poussée continue du virus Zika dans les Amériques, il a été rapporté une augmentation alarmante du nombre de bébés nés avec une microcéphalie.,, ainsi qu'une augmentation de l'incidence du syndrome de 20 Guillain-Barré. En plus d’une microcéphalie, d'autres malformations.- fœtales et troubles neurologiques ont été décrits.

Dowd et al. (Science, Vol. 3.54 Issue 6309, pp, 23740 (2016) ont rapporté récemment que des vaccins à ADN 25 exprimant les protéines prémembrànaires et d'enveloppe du virus Zika étaient immunogènes chez les souris et les primates non humains lorsqu'ils étaient administrés par electroporation ou injection sans aiguille. ; et que la protection contre la virémie après 1'épreuve avec le 30 virus Zika était en corrélation avec l’activité neutralisante du sérum.

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1Ö

Chahal et al.

(Soientifie {2. 017 ) ) d é c r i v e n t peur des antigènes est formulé avec un un vecteur structuraux du virus s h a vira 1 coda n t nanomatêriau de dendrimères modifiés a été trouvé que le vaccin est

Richner et al.

virus Zika.

lanopart icu.1 e s (Cell, immunogène.

ARNm modifié codant pour des de e st dans des lipidiques et administré par voie

ARNm a et une protection contre l'épreuve virale.

Etant donné la charge préoccupante due à la maladie existe un besoin urgent de développer des composants utilisation dans une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Zika.

Les présent inventeurs fournissent des en tant que compo s an t s de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse

Munitaire chez un sujet contre une infection par le virus Zika, des procédés pour leur utilisation dan S: le traitement, et des procédés pour leur fabrication.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction de vaccin à base d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant un antigène pré25

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M-E (prME) pleine longueur du. virus Zika, ou l'un de ses fragments immunogènes.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni un vecteur comprenant la construction telle que décrite.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une molécule d’ARN s'auto-répliquant (également appelée ici ARNm s ’ a ut.o-amp 1 if 1-ant.,· ou molécule SAM) comprenant la construction telle que -décrite.

une

Dans certains modes de réalisation, composition comprenant il une est fourni est quantfté iramunologiquement efficace d'unÇe) ou de plusieurs des d'ARN s'autorépliquant tels que décrits

Dans certains modes de une composition telle que réalisation, décrite il est ci-dessus composition, comprend un vaccin à base d'ARN.

Dans certains modes de réalisation, il est une composition, telle que décrite ci-dessus fourni ou la fourni où la composition comprend un(e) ou plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s'auto-répliquant tels que d'émulsion cationique huile dans l'eau.

Dans certains modes de réalisation, fl est fourni une composition telle que décrite ci-dessus pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin

Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé pour 1'induction d’une réponse immunitaire

B E2017/5835 d’une quantité immuhö.lögiquement efficace d'une composition comprenant un.(e) ou plusieurs des constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s’autorépliquant tel s que décrits ci-dessus.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé t el que décri t ci-dessus dans lequel .la composition comprend un(é) ou plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN s’auto-répliquant tels que décrits ci-dessus -complexés avec une particule d'une 10 émulsion cationique huile dans l'eau.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé pour la production d'un vaccin à base d'ARN comprenant une étape de transcription, d'un vecteur pu d'une, molécule d’ADN codant pour une molécule d'ARN 15 s'auto-répliquant décrite ci-dessus pour produire un ARN comprenant une région codante pour l’antigène.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni un procédé de préparation d'une composition telle que décrite ci-dessus dans lequel le procédé comprend 1) la 20 préparation d’une émulsion cationique huile dans l’eau- ;

2) la préparation d’un(e) ou de plusieurs constructions, vecteurs:, ou molécules d 'ARN s ' auto-répliquant tels que décrits ci-dessus ; et 3) l'addition des unie) ou plusieurs constructions, vecteurs, ou molécules d'ARN 25 s’auto-répliquant à l'émulsion cationique huile dans l’eau de telle façon que la construction, le vecteur, ou la molécule d'ARN s'auto-répliquant se complexe avec 1'émulsion.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni 30 une composition produite par le procédé décrit ci-dessus.

B E2017/5835 .Dans certains modes de réalisation, il est fourni une utilisation de la construction, du vecteur, de la molécule d'ARN s'auto-répliquant, ou de la composition décrits ci-dessus pour l’induction d’une réponse 5 immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une utilisation de la construction, du vecteur, de la molécule d'ARN sauto-répliquant, ou de la composition 10 décrits ci-dessus dans la fabrication d'un médicament qui induit une réponse inwunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.

Dans certains modes de réalisation, il. est fourni une construction, un vecteur, une molécule d'ARN s’auto15 répliquant, ou une composition décrits ci-dessus pour une utilisation en thérapie.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, une molécule d’ARN s'autorépliquant, ou une composition décrits ci-dessus pour 20 une utilisation dans un procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.

Description des dessins./figures

Figure 1 - Organisation du génome de Flavivirus, montrant la polyprotéine qui est clivée en protéines structurales et non structurales par une combinaison de protéases virales et cellulaires.

Figure 2 - Formation des virions de Flavivirus et 30 des particules subviralss. (1) Dans les infections naturelles, les protéines dé flavivirus sont produites

B E2017/5835 par le traitement d'une polyprötéine traduite à partir de .l'ARN génomique du virus et .insérées de façon cotraductionnelle dans la membrane du réticulum eu-Îoplasmi gin (RE).· Les- flèches horizontales indiquent les clivages de la polypro’téine par la signal peptidase et les têtes de flèche indiquent le clivage par la protease virale NS2B-3. La flèche vide indique un clivage par une signalase qui est inefficace sauf si le clivage de la capside (C) cytoplasmique est. survenu.

1.0 (2) L*exigence minimale pour la production de-particules subvirales. consiste en les protéines précurseurs membranaires (prM) et d'enveloppe (E) - (3) Les particules de flavivirus sont: formées par bourgeonnement sur la membrane du RE dirigé par les protéines prM et E indépendantes de la protéine 0 ou des nucléocapsides préformées. L'infection virale se traduit principalement par la formation des virions. (4) Des particules pse-üdovirales dépourvues de nucléocapside sont produites efficacement par l'expression recombinante des protéines prM et E et sont un -sous-produit- de l'infection à flavivirus. (5) Les virions et les .particules- pseudovirales suivent la voie exocytaire pour la sécrétion à partir des cellules infectées/transfectées. « Cy >> indique: le côté cytoplasmique de .la membrane du RE.

Figures 3A à D - Alignement de séquences multiples CLUSTAL 0(1.2.1) des protéines CprME des: souches de virus

Zika : Ouganda (Uganda) (SEQ ID NO : 10.) ; Micronésie (Micronesia) (SEQ ID NO : 11.) ; Natal (SEQ ID NO : 2) ;

Salvador	(SEQ	ID	NO :	8) ;	No.	d ' accession.	Genbank
KU3 65 7 7 7	(SEQ	ID	NO :	13) ;	No.	d '.accession	Genbank
EU365778	(SEQ	ID	NO :	14) ;	No .	d ' accession	Genbank

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K.U365779 (SEQ ID NO : 15) ; No. d'accession Genbank KU365780 (SEQ ID NO ; 16) ; Polynésie française .(« French >>) (SEQ ID NO : 12) ; et Sao Paolo (.« Sao ») (SEQ ID NO : 9). Un « * » (astérisque) indique les 7 positions qui ont un résidu unique, totalement conservé.

« : » (deux points) indique la conservation entre des groupes de propriétés fortement similaires. Un « , » (point) indique la conservation entre des groupes de propriétés faiblement similaires.

θ lebleau 1

Souche de virus Zika, année, et référence Genbank

Souche	Année	Numéro Genbank
Uganda		NC 012532
Micronesia	2007	EÜ545988.1
Natal (Brésil)	2016	KU527068
Salvador (Brésil)	2016	KU707826.1
Sao Paulo (Brésil)	2016	KU321639
Polynésie française	2013	KJ776791

Figures 4A à C - Alignement de. séquences multiples

CLUSTAL	0(1.2.1)	des	protéines	CprME des	souches
brésiliennes de	virus	Zika	: Natal. (SEQ ID :	NO : 2) ;
Salvador	(SEQ	ID	NO :	8) ;	No.	d ’ accession	Genbank
KU365777	(SEQ	ID	NO :	13) ;	No.	daccession	Genbank
KU365778	(SEQ	ID	NO :	14) ;	NO.	d ' accession	Genbank
KÜ365779	(SEQ	ID	NO :	15) ;	No.	d!accession	Genbank
KU365780	(SEQ	ID	NO :	16) ;	et.	Sao Paolo	(« Sao >>)

(SEQ ID NO : 9) . Voir le tableau 1 pour les souches de virus Zika, années, et références Genbank.

Figure 5 - Une construction SAM-Zika. Le contexte de l'ARNm s’auto-ampli fiant (SAM) est constitué du

B E2017/5835 répllcoh TC~83 du virus VEE codant pour les protéines non structurales virales 1 à 4 (nsPl à 4), suivi du promoteur subgénomique, et d'un insert. codant pour un antigène du virus Zika. Le vecteur vide est représenté par SEQ :ID. NO : 17 ; 1’insert démarre immédiatement a p r ès 1 e n u c .1. é o t i d e 7 561,

Figure 6' - Conception des inserts d’antigènes pour les constructions Zika-SAM.

L'insert d’antigène #5283, représenté en (A), 10 comprend une séquence signal du virus de l’encéphalite du Japon (JEV) suivie des prME du. virus ZLika, y compris la séquence de départ, de prM de type: sauvage: (« AEVTR >>).. La séquence d'acides aminés pleine Langueur de 1'insert d'antigène #5283 est représentée par SEQ ID NO :: 19,. y 15 compris la séquence signal du JEV (SEQ ID NO : -5) , suivie de la région pr du virus Zika (SEQ ID NO : 20) , la protéine M (SEQ ID NO : 21) et la protéine E (SEQ I'D NO : 22) . Les séquences d’ADN et d'ARN codant pour 1'insert d’antigène présenté en (A) sont 20 représentées par SEQ ID NO : 18 et 39, respectivement.

L'insert d'antigène #5288, présenté en (B), est identique à 1 ' insert de (A) , à l'exception que les 98 derniers acides aminés de la protéine E du virus Zika sont remplacés par les 98 derniers acides aminés 25 provenant de l'extrémité C-terminale de la protéine E du

JEV (,N,o. d’accession Genbank AFV52311.1 ; SEQ ID NO : 7) .

Chang et al. (2003) Virol. 306: 170-180. La séquence d'acides aminés pleine longueur de 1’insert d’antigène #5288 est représentée par SEQ ID NO : 24, y compris la 30 séquence signal du JEV (SEQ ID NO : 5) , suivie de la région pr et de la protéine M du virus Zika

B E2017/5835 (SEQ ID NO : 25 et 26, respectivement) , et d'une protéine E hybride du virus Zika-JEV (SEQ ID NO : 27), Les séquences d'ADN et d'ARN codant pour 1'insert d'antigène présenté en. (B) sont représentées par 5 SEQ ID NO. : 23 et 40, respectivement.

Figure 7 ~ Analyse de 1'expression et de la sécrétion de la protéine E à partir .de: constructions Zika-SAM.

L'expression et la sécrétion de la protéine: E ont 10 été détectées par immunoblot dans des Lysats cellulaires pour des constructions d'ARNm s'auto-amplifiant (SAM) codant pour les inserts d'antigènes #5283 (signal du JEV 1 prME du virus Zika) et #5288 (signal du JEV + prME hybride du virus Zika-JEV). L'expression et la sécrétion 15 de la protéine E ont été également détectées pour une construction d'antigène témoin positif (#8111) mais pas pour une construction témoin négatif (#4974) ou une pseudo-transfection (« Mock »). Voir 1’exemple 5.

Figura 8 - Réponses .ίι antic Dips neutral ί sauta cnee 20 les souris. Il a été trouvé que les souris ont présenté des anticorps neutralisants significatifs contre le virus Zika deux semaines après une seule vaccination avec la construction Zika-SAM #5283 (signal du JEV + prMe du virus Zika), ou avec la construction témoin 25 positif d’ADN du virus Zika #5283, comme il est mesuré par le test de neutralisation des particules virales rapporteurs (:RVPj . Les titres en anticorps neutralisants ont été encore augmentés deux semaines après une seconde vaccination avec la même construction Zika-SAM, ou le 30 témoin positif. Les anticorps neutralisant le virus Zika étaient inférieurs à la limite de quantification avant

B E2017/5835 la. vaccination (Jour 0), et après la vaccination avec la construction témoin négatif (#4974, dosé, dé 1,5 pg) ou avec #52 88 (signal du JEV + prME hybride du virus ZikaJEV,. dose de 1,5 pg) . Un effet dose-réponse a été observé pour la construction SAM #5283, avec 15 pg d'ARN déclenchant plus d’anticorps neutralisants que 1,5 pg d'ARN.

Figure 9 - Protection des souris contre l’épreuve avec le virus Zika : des souris vaccinées aux jours 0 et 10 21 ont été soumises à une épreuve avec le virus zika vivant au jour 49. La charge virale a été mesurée 3 jours après 1·'épreuve virale. La vaccination avec la construction SAM #5283 (à des doses de 1,5 pg et 15 pg), ainsi que le témoin positif (ADN #5283) a été protectrice 15 contre une virémie par le virus Zika. Les souris non vaccinées et les souris vaccinées avec la construction SAM #5288 (dose de 1,5 pg) ou la construction témoin négatif #4974 n'ont pas été protégées dans l'épreuve avec le virus Zika. La ligné en pointillés indique la 20 limite de quantification (LOQ). du test.

Figure 10 - Réponses en anticorps neutralisants chez des primates non humains (PNH) . Des macaques· rhésus ont été .immunisés aux semaines 0 et 4 avec la construction Zika—SAM #5283 (75 pg/dose) ou une construction. SAM avec les codons optimisés codant pour l’antigène prME natif pg/dose) . A des PNH placebo ou ils ont été d’ADN du virus Zika # neutralisant le virus du virus Zika (Co,prME SAM ; témoins, il a été administré un immunisés avec une. construction )283 (4 mg./dose). . Les anticorps .Zika ont été significativement élevés quatre semaines après la première immunisation

B E2017/5835 avec la construction Zika-SAM #5283 ou l'ADN du virus Zika #5283 comparativement au placebo, avec des titres encore augmentés 4 semaines après Ici seconde immunisation. La construction Zik.a~SAM Co.prME SAM a produit signifiçati .vement moins d'anticorps neutralisants comparativement à l'ADN #5283 après une seule dose, mais des titres similaires après deux injections. La ligne en pointillés indique la limite, de quantification (LOQ) du test.

Figure 11 - Protection de PNH contre .1 ' épreuve avec le virus Zika : des macaques rhésus vaccinés comme il a été décrit sur la figure 10 ont été ensuite soumis à une épreuve avec le virus Zika vivant, à la semaine 8. La charge virale a été mesurée quotidiennement des jours 3 à 7 après l'épreuve virale. Les animaux placebo ont présenté une virémie élevée aussi tôt que 3 jours après l'épreuve virale (A). La vaccination avec la construction Zika—SAM #5283 (B), Zika-SAM Co.prMÉ (C) , et l'ADN #5283 (D) a été protectrice contre la virémie par le virus Zika, avec la construction Zika-SAM #5283 présentant une protection complète contre la virémie par le virus Zika. La ligne en pointillés indique la limite de quantification (LOQ) du test.

Figure 12 - Sérologie après l'épreuve virale chez les PNH. Les titres en anticorps neutralisants ont été déterminés 8, 10 et 12 semaines après l'épreuve avec, le virus Zika, et sont exprimés en facteur de variation par rapport aux taux avant l'épreuve virale. Lés animaux placebo ont présenté une brusque augmentation, des anticorps neutralisants après: l'épreuve avec le virus Zika, suggérant une infection par le virus Zika chez ces animaux. Deux animaux du groupe SAM Co.prME, et un animal du groupe de l'ADN #5283, ont montré des titres élevés en anticorps neutralisants après l’épreuve virale, indiquant, que la protection n'était pas stérilisante 5 chez ces animaux. Au contraire, les animaux du groupe

Zika-SAM #5283 n'ont pas présenté d'anticorps neutralisants élevés après l'épreuve avec le virus Zika, indiquant qu'une protection stérilisante a été obtenue .chez tous les sujets. La ligne en pointillés en (B}, (C) 10 et (P) indique un facteur de variation de 4 des titres neutralisants, ce qui est considéré comme non stérilisant dans le domaine des flavivirus.

Peseriptiοn détaillée de Γinvention

Antigenes ; variants ; fragments ; et constructions

Les présents inventeurs fournissent des constructions utiles en tant que composants de compositions immunogènes pour l'induction d'une réponse immunitaire chez un sujet contre une infection par le 20 virus Zika, des constructions utiles pour l'expression d’antigènes, des procédés pour leur utilisation dans le traitement, et des procédés pour leur fabrication. Par construction, il est signifié un acide nucléique qui code pour des séquences polypeptidiques décrites ici, et 25 peut comprendre de l'ADN, de l'ARN, au des monomères d'acide nucléique n’existant pas à l'état naturel. Les composants d'acide nucléique des constructions sont décrits plus pleinement dans la section Acides nucléiques de ce document.

Dans certains modes de réalisation, les constructions divulguées ici codent pour des séquences

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B E2017/5835 polypeptidiques de type sauvage d'un virus Zika, ou l'un de leurs variants, ou l'un de leurs fragments. Les constructions peuvent coder en outre pour une séquence polypeptidique hétérologue aux séquences polypeptidiques 5 d’un virus Zika. Dans certains modes de réalisation, les constructions codent pour des séquences polypeptidiques de type sauvage d'une souche brésilienne du virus Zika, o.u l'un de leurs variants, ou l’un de leurs fragments.

Par « souche brésilienne du virus Zika », il est signifié 10 toute souche du virus Zika indiquée comme « brésilienne. » dans le tableau 1, Sauf indication contraire, les descriptions de l'antigène prME de. type sauvage sont faites en référence à la souche Natal (Brésil), numéro GenBank KU527068.1, tel que représenté 15 par SEQ ID NO : 1 (acide nucléique) et SEQ ID NO : 2 (polypeptide), et tel qu'illustré sur les figures 3A à D, et les figures 4A à G.

Un « variant » d'une séquence polypeptidique comprend des séquences d'acides aminés comportant une ou 20 plusieurs substitutions, insertions et/ou délétions d'acides aminés comparativement à la séquence de référence. Le variant peut comprendre une séquence d’acides aminés qui est identique à au moins 7'0 %, au moins 75 '%, au moins 80 %, au moins 85 au moins 90 %, 25 au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins %, ou au moins 9.9 % à un polypeptide pleine longueur de type sauvage, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 2. En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut, comprendre un fragment immunogène 30 (c'est-à-dire, un fragment contenant un épitope) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une

B E2017/5835 séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d’au moins 14, d'au moins 15, d'au moins

16, d'au moins 17, d'au moins 18, d'au moins 19, acides aminés ou. plus qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.

Un fragment d’un polypeptide peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple, SEQ ID NO : 2, où le fragment comprend une délétion de jusqu’à 1, 2, 3,

4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de 1’-extrémité N-terminale, l ’extrémité C-terminale, ou à la fois

1'.extrémité N-terminale et l'extrémité Cspécifié son d'acides aminés consécutifs,

Tel le terme « antigène » se rappor t. e a une molécule contenant u η o u plu s i eur s (par exemple, linéaires, conformationnels ou de 1 qui stimuleront le système immunitaire d'un pour produire une réponse immunologique spécifique 'antigène humorale- et/ou cellulaire (c'est-à-dire, deux) une réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide antigènique)

Un « épitope » partie d'un antigène qui.

sa immu no1og ique.

]je-s épitopes des lymphocytes T et identifiés empi r iquement (par exemple , en peuvent être utilisant un suivantes des procédés similaires) . Voir les références : Geysen et al. (1984) PNAS USA 81 :- 39984002 ; Carter (1994) Methods Mol Biol 36: 207-23. Ils

B E2017/5835 peuvent être prédits (par exemple, en utilisant l'indice antigénique de Jameson-Wolf (voir Jameson et al. (1988) CABIOS 4(1): 181-186), des approches à base de matrices (voir Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):

179-89) , TEPITOPE (voir De .Lalia et al. (1999) J. Immunol

163: 172529), des réseaux neuronaux (voir Brusic et al. (1998) Bioinformatics 14(2): 121-30), OptiMer et EpiMer (voir Meister et al. (1995) Vaccine 13(6): 581-9.1 ; voir Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retroviruses 12(7): 10 593-610) , ADEPT (voir Maksyutov & Zagrebelnaya (1993)

Comput Appl Biosci 9(3): 291-7), Tsites (voir Feller & de la Crue (1991) Nature 349(6311): 720-1),

1'hydrophilicité (voir Hopp (1993) Peptide Research 6: 18:3-190), l’indice antigènique (voir Welling et al.

1.5 (1985) FEB S Lett. 188: 215-218) ou les procédés divulgués dans la référence Davenport et al. (19.95) Immunogenetics 42: 392-297, etc.).

Dans certains modes de réalisation, les constructions ici codent pour un antigène prME du virus 20 Zika. Par « antigène prMe du virus Zika Z, il est: signifié la séquence d’acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour .la séquence d'acides aminés, d'une protéine structurale'prME de type sauvage du virus Zika, l’un de ses variants, ou l'un dé ses fragments. La 25 figure 3 et la figure 4 identifient la séquence d'acides aminés de plusieurs variants de. la protéine structurale prME pleine longueur de typé sauvage du virus Zika. Les numéros des identifiants des séquences pour chacun sont présentés dans la Liste des séquences .ici. Voir 30 SEQ ID NO : 2 et 8 â 16.

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Ainsi, lorsqu'un antigène prME du virus Zika est un variant d'un polypeptide prME de type sauvage, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide pleine longueur de type sauvage, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 2 et 8 à 16. En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment immunogène (c'est-à-dire, un fragment contenant un épitope) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, d'au moins 18, d'au moins 19, acides aminés ou plus qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.

Un fragment d'un polypeptide prME du virus Zika peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple, SEQ ID NO : 2 et 8 à 16, où le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité Nterminale, l'extrémité C-terminale, ou à la fois l'extrémité N-terminale et l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur. Il peut être spécifié que les délétions sont d'acides aminés consécutifs. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide prME du virus Zika comprend un fragment choisi dans le groupe

BE2017/5835 constitué des acides aminés 1 à 692 de SEQ ID NO : 2 et des acides aminés 21 à 692 de SEQ ID NO : 2.

Dans certains modes de réalisation, un fragment immunogène d'un antigène prME comprend la pleine longueur de l'antigène M du virus Zika. Par « antigène M du virus Zika », il est signifié la séquence d'acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés, de SEQ ID NO : 21. Lorsqu'un antigène M du virus Zika est un variant d'un polypeptide M de type sauvage, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide pleine longueur de type sauvage, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 21.

Un fragment d'un antigène M du virus Zika peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple, SEQ ID NO : 21, où le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité N-terminale, l'extrémité C-terminale, ou à la fois l'extrémité Nterminale et l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur. Il peut être spécifié que les délétions sont d'acides aminés consécutifs.

Dans certains modes de réalisation, un fragment immunogène d'un antigène prME comprend la pleine longueur de l'antigène E du virus Zika. Par « antigène E du virus Zika », il est signifié la séquence d'acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour la

BE2017/5835 séquence d'acides aminés, de SEQ ID NO : 22. Lorsqu'un antigène E du virus Zika est un variant d'un polypeptide E de type sauvage, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à un polypeptide pleine longueur de type sauvage, par exemple, à un polypeptide selon SEQ ID NO : 22. Dans certains modes de réalisation, un antigène E variant du virus Zika peut être un antigène E hybride comprenant un fragment N-terminal d'une protéine E du virus Zika fusionné à un fragment Cterminal d'une protéine E virale hétérologue. Dans certains modes de réalisation, la protéine E virale hétérologue est dérivée d'un flavivirus hétérologue, tel que le virus de l'encéphalite du Japon (JEV).

Un fragment d'un antigène E du virus Zika peut comprendre des délétions N- et/ou C-terminales comparativement à un polypeptide pleine longueur, par exemple, SEQ ID NO : 22, où le fragment comprend une délétion de jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 acides aminés à partir de l'extrémité N-terminale, l'extrémité C-terminale, ou à la fois l'extrémité Nterminale et l'extrémité C-terminale de la séquence pleine longueur. Il peut être spécifié que les délétions sont d'acides aminés consécutifs.

Dans certains modes de réalisation, un antigène prME variant du virus Zika comprend une protéine E hybride du virus Zika-JEV. Un antigène E hybride du virus Zika-JEV peut comprendre un fragment N-terminal d'une protéine E du virus Zika comprenant au moins les acides

BE2017/5835 aminés (1 + x) à (422 ± y) de SEQ ID NO : 22, où x est un nombre entier choisi parmi 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ; et y est un nombre entier choisi parmi 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Dans un mode de réalisation, le fragment N-terminal d'une protéine E du virus Zika comprend les acides aminés 1 à 422 de SEQ ID NO : 22.

Un antigène E hybride peut comprendre un fragment C-terminal d'une protéine E du JEV comprenant au moins les acides aminés (205 ± x) à (302 ± y) de SEQ ID NO : 7, où x est un nombre entier choisi parmi 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ; et y est un nombre entier choisi parmi 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Dans un mode de réalisation, le fragment Cterminal d'une protéine E du JEV comprend les acides aminés 205 à 302 de SEQ ID NO : 7.

Dans un mode de réalisation, un antigène E hybride comprend la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 27, ou l'un de ses fragments ou variants. Un variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % au polypeptide selon SEQ ID NO : 27. En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment immunogène (c'est-à-dire, un fragment contenant un épitope) du polypeptide pleine longueur, tel qu'une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 50, d'au moins 100, d'au moins 150, d'au moins 200, d'au moins

BE2017/5835

250, d'au moins 300, d'au moins 350, d'au moins 400, d'au moins 450, d'au moins 500 acides aminés ou plus qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus de

SEQ ID NO : 27.

Comme il est noté ailleurs dans ce document, l'ARN du virus Zika est traduit sous la forme d'une polyprotéine comprenant une séquence signal prM. La séquence signal prM est localisée en position Nterminale par rapport à la séquence de l'antigène prM. Le clivage survient dans la lumière du RE par une signal peptidase cellulaire et produit l'extrémité N-terminale de prM. Lorsque la polyprotéine comprend une séquence d'acides aminés de type sauvage, la polyprotéine comprend une séquence signal prM native, SEQ ID NO : 3. Par « séquence signal prM native », il est signifié la séquence d'acides aminés, ou une séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés, d'une séquence signal d'une prME virale de type sauvage, SEQ ID NO : 3. Les figures 3A et B et la figure 4A identifient la séquence d'acides aminés de plusieurs variants des séquences signal prM pleine longueur natives issues de diverses souches du virus Zika.

Dans certains modes de réalisation, les constructions codent pour une séquence signal prM native Lorsque la séquence signal prM est un variant d'une séquence signal prM native, le variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % au polypeptide pleine longueur selon SEQ ID NO : 3. En variante, ou en outre,

BE2017/5835 un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment fonctionnel (c'est-à-dire, contenant la séquence reconnue et clivée par la protéase) du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17 acides aminés de SEQ ID NO : 3 qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.

Dans certains modes de réalisation, la construction code pour une séquence signal hétérologue non-Zika. Dans certains modes de réalisation, la construction code pour une séquence signal du virus de l'encéphalite du Japon (JEV) , l'un de ses variants, ou l'un de ses fragments, à la place de la séquence signal prM du virus Zika. Par « séquence signal du JEV », il est signifié la séquence d'acides aminés telle que présentée sur la figure 6 : MGKRSAGSIMWLASLAVVIACAGA (SEQ ID NO : 5). Un variant peut comprendre une séquence d'acides aminés qui est identique à au au ou au moins 99 un polypeptide pleine longueur de type sauvage, par exemple, à un polypeptide selon

SEQ ID NO : 5.

En variante, ou en outre, un fragment d'un polypeptide peut comprendre un fragment fonctionnel (c'est-à-dire, contenant la séquence reconnue et clivée du polypeptide pleine longueur qui peut comprendre une séquence d'acides aminés contigus d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, d'au moins 18, d'au moins 19, d'au moins 20, d'au moins 21, d'au moins 22, d'au moins

BE2017/5835 acides aminés, qui est identique à une séquence d'acides aminés contigus du polypeptide pleine longueur.

Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide comprenant de la partie Nterminale à la partie C-terminale : une séquence signal du JEV et un antigène prME du virus Zika, l'un de ses variants, ou l'un de ses fragments immunogènes. Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide comprenant de la partie N-terminale à la partie C-terminale : une séquence signal du JEV, un antigène prM du virus Zika, et un antigène E hybride comprenant un fragment N-terminal d'une protéine E du virus Zika fusionné à un fragment C-terminal d'une protéine E du JEV.

Dans certains modes de réalisation, une construction code pour chaque composant du polypeptide, si présent, juxtaposé immédiatement à côté du composant adjacent, c'est-à-dire, sans aucun acide aminé intervenant. Dans certains modes de réalisation, un groupe lieur de 1, 2, 3, 4, ou 5 acides aminés est présent entre un ou plusieurs des composants.

Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide ayant une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 24. Dans certains modes de réalisation, la construction code pour un polypeptide qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 24. Dans certains modes de réalisation, la construction code

BE2017/5835 pour un polypeptide qui comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 24, où le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'acides aminés de la séquence pleine longueur jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 acides aminés plus courte que la séquence pleine longueur.

Dans certains modes de réalisation, la construction comprend une séquence d'ADN choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 23. Dans certains modes de réalisation, la construction comprend une séquence d'ADN qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 23. Dans certains modes de réalisation, la construction comprend une séquence d'ADN qui comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 23 où le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'ADN de la séquence pleine longueur jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.

Dans certains modes de réalisation, la construction comprend une séquence d'ARN choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO : 40. Dans certains modes de réalisation, la construction comprend une séquence d'ARN qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins

BE2017/5835 groupe constitué de

Dans certains modes % à une séquence

SEQ ID NO : 39 et de réalisation, choisie dans le

SEQ ID NO : 40.

la construction comprend une séquence d'ARN qui comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID

NO : 39 et SEQ ID NO : 40 où le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'ARN de la séquence pleine longueur jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6,

25, ou 30 acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.

Dans certains modes de réalisation, la construction comprend un fragment d'une séquence d'ARN pleine longueur choisie dans le groupe constitué de

SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO

0, où le fragment comprend une délétion de jusqu'à

1, 2, 3,

4, 5, 6, 7,

9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques à partir de l'extrémité 5', l'extrémité 3', ou les extrémités à la fois 5' et 3' de la séquence pleine longueur.

Polypeptides

Dans certains modes de réalisation, un polypeptide ici est une forme n'existant pas à l'état naturel (par exemple, une forme recombinante ou modifiée).

Par exemple, les polypeptides (par exemple, des antigènes) divulgués ici peuvent être préparés par synthèse chimique (en totalité ou en partie), par digestion de polypeptides plus longs en utilisant des protéases, par traduction à partir d'ARN, par purification à partir d'une culture cellulaire (par exemple, à partir d'une expression recombinante), à partir de l'organisme lui-même, etc. Un exemple de procédé pour la production de peptides d'une longueur

BE2017/5835 < 40 acides aminés in vitro, voir les implique une synthèse chimique références suivantes : Bodanszky of Peptide Synthesis (ISBN:

0387564314) ; et Fields et al. (1997) Meth Enzymol 289:

Solid-Phase Peptide Synthesis. ISBN: 0121821900. Des techniques de synthèse de peptides sur phase solide, telles que des procédés basés sur la chimie tBoc ou Fmoc, sont connues de l'Etat de l'art, voir la référence suivante : Chan & White (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. ISBN: 0199637245. Une synthèse enzymatique peut être également utilisée en partie ou en totalité, voir la référence suivante : Kullmann (1987) Enzymatic

Peptide Synthesis. ISBN: 0849368413. Comme variante de la synthèse chimique, une synthèse biologique peut être utilisée, par exemple, les polypeptides peuvent être produits par traduction. Ceci peut être réalisé in vitro ou in vivo. Les procédés biologiques sont en général restreints à la production de polypeptides à base d'acides L-aminés, mais une manipulation de la machinerie de la traduction (par exemple, des molécules d'aminoacyl-ARNt) peut être utilisée pour permettre l'introduction d'acides D-aminés (ou d'autres acides aminés non naturels, tels que 1'iodotyrosine ou la méthylphénylalanine, 1'azidohomoalanine, etc.), voir la référence suivante : Kullmann (1987) Enzymatic Peptide

Synthesis. ISBN: 0849368413. Toutefois, lorsque des acides D-aminés sont inclus, il est préféré d'utiliser la synthèse chimique. Les polypeptides de la divulgation peuvent comporter des modifications covalentes à l'extrémité C-terminale et/ou N-terminale. Ils peuvent

BE2017/5835 prendre des formes diverses (par exemple, natives, fusions, glycosylées, non glycosylées, lipidées, non lipidées, phosphorylées, non phosphorylées, myristoylées, non myristoylées, monomères, multimères, particulaire, dénaturées, etc.). Les polypeptides peuvent être glycosylés naturellement ou non naturellement (c'est-àdire que le polypeptide peut présenter un profil de glycosylation qui diffère du profil de glycosylation trouvé dans le polypeptide existant à l'état naturel correspondant).

Les formes n'existant pas à l'état naturel des polypeptides ici peuvent comprendre une ou plusieurs séquences d'acides aminés hétérologues (par exemple, une autre séquence d'antigène, une autre séquence signal, un marqueur détectable, ou analogues) en plus d'une séquence d'antigène prME du virus Zika ou d'une séquence de prME chimérique du virus Zika. Par exemple, un polypeptide ici peut être une protéine de fusion. En variante, ou en outre, la séquence d'acides aminés ou la structure chimique du polypeptide peut être modifiée (par exemple, avec un ou plusieurs acides aminés non naturels, par une modification covalente, et/ou en présentant un profil de glycosylation différent, par exemple, par l'élimination ou l'addition d'un ou de une séquence polypeptidique existant à l'état naturel.

Les polypeptides (par exemple, des antigènes), divulgués ici sont fournis de préférence sous une forme purifiée ou sensiblement purifiée, c'est-à-dire, sensiblement dépourvue d'autres polypeptides (par exemple, dépourvue de polypeptides existant à l'état

BE2017/5835 naturel), particulièrement d'autres polypeptides du virus Zika ou de la cellule hôte ; par exemple, au moins pure à environ 50 % (en poids), au moins pure à environ 60 % (en poids), au moins pure à environ 70 % (en poids), au moins pure à environ 80 % (en poids) , ou au moins pure à environ 90 %, etc. En variante, moins d'environ

50 %, moins d'environ 40 %,	moins	d'environ 30	%, moins
d'environ 20 %, moins d'environ 10	%, ou moins	d'environ
5 % d'une composition	sont	constitués	d'autres
polypeptides exprimés.
Acides nucléiques
Les présents inventeurs	divulguent	ici des

molécules d'acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène prME du virus Zika. Les acides nucléiques tels que divulgués ici peuvent prendre des formes diverses (par exemple, simple brin, double brin, vecteurs, etc.). Les acides nucléiques peuvent être circulaires ou ramifiés, mais ils seront généralement linéaires.

Les acides nucléiques utilisés ici sont fournis de préférence sous une forme purifiée ou sensiblement purifiée, c'est-à-dire sensiblement dépourvue d'autres acides nucléiques (par exemple, dépourvue d'acides nucléiques existant à l'état naturel), particulièrement d'autres acides nucléiques du virus Zika ou de la cellule hôte, étant généralement au moins pure à environ 50 % (en poids), au moins pure à environ 60 % (en poids), au moins pure à environ 70 % (en poids), au moins pure à environ 80 % (en poids), et habituellement au moins pure à environ 90 % (en poids).

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Les acides nucléiques peuvent être préparés de nombreuses façons, par exemple, par synthèse chimique (par exemple, la synthèse avec des phosphoramidites d'ADN) en totalité ou en partie, par digestion d'acides nucléiques plus longs en utilisant des nucléases (par exemple, des enzymes de restriction), par jonction d'acides nucléiques plus courts ou de nucléotides (par exemple, en utilisant des ligases ou des polymérases), à partir de banques génomiques ou d'ADNc, etc.

Le terme « acide nucléique » signifie en général une forme polymère de nucléotides de toute longueur, qui contient des désoxyribonucléotides, des ribonucléotides, et/ou leurs analogues. Il comprend l'ADN, l'ARN, des hybrides ADN/ARN. Il peut également comprendre des analogues d'ADN ou d'ARN, tels que ceux contenant des squelettes modifiés (par exemple, des acides nucléiques peptidiques (PNA) ou des phosphorothioates) ou des bases modifiées. Ainsi, l'acide nucléique de la divulgation comprend l'ARNm, ADN, l'ADNc, des acides nucléiques recombinants, des acides nucléiques ramifiés, des plasmides, des vecteurs, etc. Lorsque l'acide nucléique prend la forme d'ARN, il peut ou pas comporter une coiffe en 5 ' .

Les acides nucléiques ici comprennent une séquence qui code pour au moins un antigène prME du virus Zika. Généralement, les acides nucléiques de l'invention seront sous forme recombinante, c'est-à-dire, une forme qui n'existe pas dans la nature. Par exemple, l'acide nucléique peut comprendre une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques hétérologues (par exemple, une séquence codant pour un autre antigène et/ou une séquence

BE2017/5835 de contrôle telle qu'un promoteur ou un site d'entrée interne des ribosomes) en plus de la séquence codant pour au moins un antigène prME du virus Zika. L'acide nucléique peut faire partie d'un vecteur, c'est-à-dire, faire partie d'une construction d'acide nucléique conçue pour la traduction/transfection d'un ou de plusieurs types cellulaires. Les vecteurs peuvent être, par exemple, des « vecteurs d'expression » qui sont conçus pour l'expression d'une séquence nucléotidique dans une cellule hôte, ou des « vecteurs viraux » qui sont conçus pour aboutir à la production d'un virus recombinant ou d'une particule pseudovirale.

En variante, ou en outre, la séquence ou la structure chimique de l'acide nucléique peut être modifiée comparativement à une séquence existant à l'état naturel qui code pour un antigène prME du virus Zika. La séquence de la molécule d'acide nucléique peut être modifiée, par exemple, pour augmenter l'efficacité de l'expression ou de la réplication de l'acide nucléique, ou pour fournir une stabilité ou une résistance à la dégradation supplémentaire.

L'acide nucléique codant pour les polypeptides décrits ici peut être optimisé pour les codons. Par « optimisé pour les codons », il est signifié une modification par rapport à l'usage des codons qui peut augmenter l'efficacité de la traduction et/ou la demivie de l'acide nucléique. Une queue poly A (par exemple, d'environ 30 résidus d'adénosine ou plus) peut être fixée à l'extrémité 3' de l'ARN pour augmenter sa demivie. L'extrémité 5' de l'ARN peut être coiffée d'un ribonucléotide modifié avec la structure m7G (5') ppp

BE2017/5835 (5') N (structure de coiffe 0) ou de l'un de ses dérivés, qui peut être incorporé durant la synthèse de l'ARN ou qui peut être modifié par des enzymes après la transcription de l'ARN (par exemple, en utilisant l'enzyme de coiffage du virus de la vaccine (VCE) constituée d'ARNm triphosphatase, de guanylyltransférase et de guanine-7-méthytransférase, qui catalyse la construction de structures de coiffe 0 N7monométhylée). La structure de la coiffe 0 joue un rôle important dans le maintien de la stabilité et de l'efficacité de la traduction de la molécule d'ARN. La coiffe en 5' de la molécule d'ARN peut être en outre modifiée par une 2'-O-méthyltransférase qui aboutit à la production d'une structure de coiffe 1 (m7Gppp [m2'-0]N), qui peut encore augmenter l'efficacité de la traduction.

Les acides nucléiques peuvent comprendre un ou plusieurs analogues de nucléotides ou nucléotides modifiés. Tel qu'utilisé ici, « analogue de nucléotide » ou « nucléotide modifié » se rapporte à un nucléotide qui contient une ou plusieurs modifications chimiques (par exemple, des substitutions) dans ou sur la base azotée du nucléoside (par exemple, la cytosine (C) , la thymine (T) ou l'uracile (U)), l'adénine (A) ou la guanine (G) ) . Un analogue de nucléotide peut contenir d'autres modifications chimiques dans ou sur la fraction de sucre du nucléoside (par exemple, ribose, désoxyribose, ribose modifié, désoxyribose modifié, analogue de sucre de six chaînons, ou analogue de sucre à chaîne ouverte), ou le phosphate. La préparation des nucléotides et des nucléotides et des nucléosides modifiés est bien connue de l'Etat de l'art, voir les

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références	suivantes : brevets US numéros	4	373	071,
4 458 066,	4 500 707, 4 668	777, 4 973	679,	5	047	524,
5 132 418,	5 153 319, 5 262	530, 5 700	642 .	De	nombreux
nucléosides	modifiés et	nucléotides	modifiés	sont

disponibles dans le commerce.

Les nucléobases modifiées qui peuvent être incorporées dans les nucléosides et les nucléotides modifiés et être présentes dans les molécules d'ARN comprennent : m5C (5-méthylcytidine), m5U (5-méthyluridine), m6A (N6-méthyladénosine), s2U (2-thiouridine), Um (2'-O-méthyluridine), mlA (1-méthyladénosine) ; m2A (2-méthyladénosine) ; Am (2-1-O-méthyladénosine) ; ms2m6A (2-méthylthio-N6-méthyladénosine) ; i6A (N6isopentényladénosine) ; ms2i6A (2-méthylthio-N6isopentényladénosine) ; io6A (N6-(cis-hydroxyisopentényl)adénosine) ; ms2io6A (2-méthylthio-N6-(cishydroxyisopentényl)adénosine) ; g6A (N6-glycinylcarbamoyladénosine) ; t6A (N6-thréonylcarbamoyladénosine) adénosine) adénosine) ;

ms2t6A (2-méthylthio-N6-thréonylcarbamoylm6t6A (N6-méthyl-N6-thréonylcarbamoylhn6A (N6-hydroxynorvalylcarbamoyladénosine) ms2hn6A (2-méthylthio-N6-hydroxynorvalylcarbamoyladénosine) ;

Ar (p) (2'-O-ribosyladénosine (phosphate))

I (inosine) mil (1-méthylinosine) ;

mllm (1,2'-O-diméthylinosine) m3C (3-méthylcytidine) ;

Cm (2T-O-méthylcytidine) s2C (2-thiocytidine) ; ac4C (N4-acétylcytidine)

5FC (5-formylcytidine) ; m5Cm (5,2-O-diméthylcytidine) ;

ac4Cm (N4-acétyl-2TOméthylcytidine) ;

k2C (lysidine) ; mlG (1méthylguanosine) m2G (N2-méthylguanosine) ; m7G (7méthylguanosine)

Gm (2'-O-méthylguanosine) ; m22G

BE2017/5835 (N2,N2-diméthylguanosine) ; m2Gm (N2,2'-O-diméthylguanosine) ; m22Gm (N2,N2,2'-O-triméthylguanosine) ;

Gr (p) (2'-O-ribosylguanosine (phosphate)) ; yW (wybutosine) ; o2yW (peroxywybutosine) ; OHyW (hydroxywybutosine) ; OHyW* (hydroxywybutosine sous-modifiée) ; imG (wyosine) ; mimG (méthylguanosine) ; Q (queuosine) ; oQ (époxyqueuosine) ; galQ (galtactosyl-queuosine) ;

manQ (mannosyl-queuosine) ; preQo (7-cyano-7-déazaguanosine) ; preQi (7-aminométhyl-7-déazaguanosine) ; G* (archaéosine) ; D (dihydrouridine) ; m5Um (5,2'-Odiméthyluridine) ; s4U (4-thiouridine) ; m5s2U (5méthyl-2-thiouridine) ; s2Um (2-thio-2'-O-méthyluridine) ; acp3U (3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine) ; ho5U (5-hydroxyuridine) ; mo5U (5-méthoxyuridine) ; cmo5U (acide uridine-5-oxyacétique) ; mcmo5U (ester méthylique de 1'acide uridine 5-oxyacétique) ; chm5U (5(carboxyhydroxyméthyl)uridine)) ; mchm5U (ester méthylique de la 5-(carboxyhydroxyméthyl)uridine) ; mcm5U (5-méthoxycarbonyl-méthyluridine) ; mcm5Um (Sméthoxycarbonylméthyl-2-O-méthyluridine) ; mcm5s2U (5méthoxycarbonylméthyl-2-thiouridine) ; nm5s2U (5-aminométhyl-2-thiouridine) ; mnm5U (5-méthylaminométhyluridine) ; mnm5s2U (5-méthylaminométhyl-2-thiouridine) ; mnm5se2U (5-méthylaminométhyl-2-séléno-uridine) ; ncm5U (5-carbamoylméthyl-uridine) ; ncm5Um (5-carbamoylméthyl-2'-O-méthyluridine) ; cmnm5U ( 5-carboxyméthylaminométhyluridine) ; cnmm5Um (5-carboxyméthylaminométhyl-2-L-O-méthyl-uridine) ; cmnm5s2U (5-carboxyméthylaminométhyl-2-thiouridine) ; m62A (N6,N6diméthyladénosine) ; Tm (2'-O-méthylinosine) ; m4C (N4méthylcytidine) ; m4Cm (N4,2-O-diméthylcytidine) ; hm5C

BE2017/5835 (5-hydroxyméthylcytidine) ; m3U (3-méthyluridine) ;

cm5U (5-carboxyméthyluridine) ; m6Am (N6,T-O-diméthyladénosine) ; m62Am (N6,N6,O-2-triméthyladénosine) ;

m2'7G (N2,7-diméthylguanosine) ; m2'2'7G (N2,N2,7triméthylguanosine) ; m3Um (3,2T-O-diméthyluridine) ; m5D (5-méthyldihydro-uridine) ; £5Cm (5-formyl-2'-0méthylcytidine) ; mlGm (1,2'-O-diméthylguanosine) ; m'Am ( 1,2-O-diméthyl-adénosine)irinométhyluridine) ; tm5s2U (S-taurinométhyl-2-thiouridine)) ; iniG-14 (4déméthyl-guanosine) ; imG2 (isoguanosine) ; ac6A (N6acetyladénosine), hypoxanthine, inosine, 8-oxo-adénine, leurs dérivés 7-substitués, dihydrouracile, pseudouracile, 2-thiouracile, 4-thiouracile, 5-aminouracile, 5-alkyl(en Ci à Cs)uracile, 5-méthyluracile, 5-alcényl(en C2 à Cs)uracile, 5-alcynyl(en C2 à Cs)- uracile, 5(hydroxyméthyl)uracile, 5-chlorouracile, 5fluorouracile, 5-bromouracile, 5-hydroxycytosine, 5alkyl(en Ci à Ce)cytosine, 5-méthylcytosine, 5-alcényl(en C2 à Ce) cytosine, 5-alcynyl (en C2 à Ce)- cytosine, 5chlorocytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromo-cytosine, N2diméthylguanine, 7-déazaguanine, 8-azaguanine, 7-déazaguanine 7-substituée, 7-déaza-7-alcynyl(en C2 à Ce)guanine, 7-déaza-guanine 8-substituée, 8hydroxyguanine, 6-thioguanine, 8-oxoguanine, 2aminopurine, 2-amino-6-chloropurine, 2,4-diaminopurine, 2,6-diaminopurine, 8-azapurine, 7-déazapurine substituée, 7-déaza-purine 7-substituée, 7-déaza-purine 8-substituée, hydrogène (résidu abasique), m5C, m5U, m6A, s2U, W, ou 2'-O-méthyl-U. Un grand nombre de ces nucléobases modifiées et leurs ribonucléosides

BE2017/5835 correspondants sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux.

Vaccins à base d'acide nucléique

Les présents inventeurs divulguent des compositions comprenant une séquence d'acide nucléique qui code pour un polypeptide comprenant un antigène du virus Zika, l'un de ses variants ou fragments. De telles compositions peuvent être un vaccin à base d'acide nucléique. Une autre composition comprenant une séquence d'acide nucléique qui code pour un ou plusieurs antigènes supplémentaires (par exemple, un deuxième, troisième, quatrième, cinquième ou sixième) du virus Zika peut être également fournie sous la forme d'un vaccin à base d'acide nucléique. Dans certains modes de réalisation, une composition comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un antigène prME du virus Zika provenant d'une première souche de virus Zika et une séquence d'acide nucléique supplémentaire codant pour un antigène prME supplémentaire du virus Zika provenant d'une ou de plusieurs autres souches de virus Zika. Dans certains modes de réalisation, une composition comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un antigène prME du virus Zika et un ou plusieurs antigènes supplémentaires (par exemple, un deuxième, troisième, quatrième, cinquième ou sixième) du virus Zika. En variante, un ou plusieurs antigènes supplémentaires nonvirus Zika peuvent être codés.

L'acide nucléique peut être, par exemple, de l'ARN (c'est-à-dire, un vaccin à base d'ARN) ou de l'ADN (c'est-à-dire, un vaccin à base d'ADN tel qu'un vaccin à base d'ADN plasmidique).

Dans certains modes de

BE2017/5835 réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique est un vaccin à base d'ARN. Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'ARN comprend une molécule d'ARN s'auto-répliquant, également appelée ici molécule d'ARNm s'auto-amplifiant (SAM).

La molécule d'ARN s'autorépliquant peut être un réplicon d'ARN dérivé d'alphavirus.

Les molécules d'ARN s'auto-répliquant sont bien connues de l'Etat de l'art et peuvent être produites en utilisant des éléments de réplication dérivés, par exemple, d'alphavirus, et en substituant les protéines structurales du virus par une séquence nucléotidique codant pour une protéine d'intérêt. Une molécule d'ARN s'auto-répliquant est généralement une molécule brin + qui peut être traduite directement après l'administration à une cellule, et cette traduction fournit une ARN polymérase ARN-dépendante qui produit ensuite des transcrits à la fois antisens et sens à partir de l'ARN administré. Ainsi, l'ARN administré mène à la production de multiples molécules filles d'ARN. Ces molécules filles d'ARN, ainsi que les transcrits subgénomiques colinéaires, peuvent être traduites ellesmêmes pour fournir une expression in situ d'un gène codé (c'est-à-dire, un antigène prM-F du virus Zika), ou elles peuvent être transcrites pour fournir d'autres transcrits avec le même sens que l'ARN administré, lesquels sont traduits pour fournir une expression in situ de l'antigène. Le résultat global de cette séquence de transcriptions est une vaste amplification du nombre de réplicons d'ARN introduits et ainsi

BE2017/5835 l'antigène codé se retrouve être un produit polypeptidique majeur des cellules.

Un système approprié pour obtenir une autoréplication de cette façon est d'utiliser un réplicon à base d ' alphavirus. Ces réplicons sont des ARN brin + (brin sens positif) qui mènent à la traduction d'une réplicase (ou d'une réplicase-transcriptase) après l'administration à une cellule. La réplicase est traduite sous la forme d'une polyprotéine qui s'autoclive pour fournir un complexe de réplication qui crée des copies brin génomique de l'ARN brin + administré. Ces transcrits brin négatif (-) peuvent être eux-mêmes transcrits pour donner d'autres copies de l'ARN parent brin + et également pour donner un transcrit subgénomique qui code pour l'antigène. La traduction du transcrit subgénomique mène ainsi à une expression in situ de l'antigène par la cellule infectée. Les réplicons d'alphavirus appropriés peuvent utiliser une réplicase provenant d'un virus Sindbis, d'un virus de la forêt Semliki, d'un virus de l'encéphalite équine de l'Est, d'un virus de l'encéphalite équine du Venezuela, etc. Les séquences de virus mutants ou de type sauvage peuvent être utilisées, par exemple, le mutant TC83 atténué du VEEV a été utilisé dans des réplicons, voir la référence suivante : WO 2005/113782, dont le contexte est incorporé en référence.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN s ' auto-répliquant décrite ici code pour (i) une ARN polymérase ARN-dépendante qui peut transcrire l'ARN à partir de la molécule d'ARN s'auto-répliquant et (ii) un antigène prME du virus Zika. La polymérase peut

BE2017/5835 être une réplicase d'alphavirus, par exemple, comprenant une ou plusieurs protéines nsPl, nsP2, nsP3 et nsP4 d'alphavirus.

Tandis que les génomes alphaviraux naturels codent pour des protéines structurales de virions en plus de la polyprotéine de la réplicase non structurelle, dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARN s'auto-répliquant ne codent pas pour des protéines structurales d'alphavirus. Ainsi, l'ARN s'autorépliquant peut mener à la production de copies d'ARN génomique de lui-même dans une cellule, mais pas à la production de virions contenant de l'ARN. L'incapacité de produire ces virions signifie que, à la différence d'un alphavirus de type sauvage, la molécule d'ARN s ' auto-répliquant ne peut pas se perpétuer sous forme infectieuse. Les protéines structurales d'alphavirus qui sont nécessaires à la perpétuation des virus de type sauvage sont absentes des ARN s'auto-répliquant de la présente divulgation et leur place est prise par un ou plusieurs gènes codant pour l'immunogène d'intérêt, de telle façon que le transcrit subgénomique code pour 1'immunogène plutôt que pour les protéines structurales des virions d'alphavirus.

Ainsi, une molécule d'ARN s'auto-répliquant utile dans le contexte de 1'invention peut comporter deux cadres de lecture ouverts. Le premier cadre de lecture ouvert (en 5') code pour une réplicase ; le second cadre de lecture ouvert (en 3') code pour un antigène. Dans certains modes de réalisation, l'ARN peut comporter des cadres de lecture ouverts supplémentaires (par exemple,

BE2017/5835 en aval), par exemple, pour coder pour d'autres antigènes ou pour coder pour des polypeptides accessoires.

Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN s'auto-répliquant divulguée ici comporte une coiffe en 5' (par exemple, une 7-méthylguanosine). Cette coiffe peut amplifier la traduction in vivo de l'ARN. Dans certains modes de réalisation, la séquence en 5' de la molécule d'ARN s'auto-répliquant doit être choisie pour assurer la compatibilité avec la réplicase codée.

Une molécule d'ARN s'auto-répliquant peut comporter une queue poly-A en 3'. Elle peut également comprendre une séquence de reconnaissance de poly-A polymérase (par exemple, AAUAAA) près de son extrémité 3'. Les molécules d'ARN s ' auto-répliquant peuvent avoir diverses longueurs mais elles ont généralement une longueur de 5000 à 25 000 nucléotides. Les molécules d'ARN s'autorépliquant seront généralement simple brin. Les ARN simple brin peuvent généralement initier un effet adjuvant par liaison aux TLR7, TLR8, ARN hélicases et/ou PKR. L'ARN administré sous forme double brin (ARNdb) peut se lier au TLR3, et ce récepteur peut être également déclenché par 1'ARNdb qui est formé soit durant la réplication d'un ARN simple brin soit au sein de la structure secondaire d'un ARN simple brin.

L'ARN s'auto-répliquant peut être préparé de façon pratique par une transcription in vitro (IVT) . L ' IVT peut utiliser une matrice (ADNc) créée et propagée sous forme plasmidique dans des bactéries, ou créée par synthèse (par exemple, par des procédés de création par synthèse de gènes et/ou réaction en chaîne de la polymérase (PCR)). Par exemple, une ARN polymérase ADN40

BE2017/5835 dépendante (comme les ARN polymérases des bactériophages T7, T3 ou SP6) peut être utilisée pour transcrire l'ARN s'auto-répliquant à partir d'un ADN matrice. Des réactions appropriées de coiffage et d'addition de polyA peuvent être utilisées selon les besoins (bien que la séquence poly-A du réplicon soit habituellement codée au sein de l'ADN matrice) . Ces ARN polymérases peuvent avoir des exigences stringentes pour le ou les nucléotides transcrits en 5 ' et dans certains modes de réalisation, ces exigences doivent correspondre aux exigences de la réplicase codée, pour garantir que l'ARN transcrit par IVT puisse fonctionner efficacement en tant que substrat pour sa réplicase auto-codée.

Un ARN s'auto-répliquant peut comprendre (en plus de toute structure de coiffe en 5 ' ) un ou plusieurs nucléotides comportant une nucléobase modifiée. Un ARN utilisé dans le cadre de l'invention comprend idéalement uniquement des liaisons phosphodiester entre les nucléosides, mais dans certains modes de réalisation, il peut contenir des liaisons phosphoramidate, phosphorothioate, et/ou méthylphosphonate.

La molécule d'ARN s'auto-répliquant peut coder pour un antigène polypeptidique hétérologue unique (c'est-àdire, un antigène prME du virus Zika) ou, éventuellement, deux antigènes polypeptidiques hétérologues ou plus liés ensemble de telle façon que chacune des séquences conserve son identité (par exemple, liés en série) lors d'une expression sous forme de séquence d'acides aminés. Les polypeptides hétérologues produits à partir de l'ARN s'auto-répliquant peuvent être ensuite produits sous la forme d'un polypeptide de fusion ou modifiés de façon à

BE2017/5835 aboutir à des séquences polypeptidiques ou peptidiques séparées.

Les molécules d'ARN s'auto-répliquant décrites ici peuvent être modifiées pour exprimer de multiples séquences nucléotidiques, à partir de deux cadres de lecture ouverts ou plus, permettant de cette façon une coexpression de protéines, comme un ou deux antigènes du virus Zika ou plus (par exemple, un ou deux antigènes prME du virus Zika ou plus) conjointement avec des cytokines ou d'autres immunomodulateurs, qui peuvent amplifier la production d'une réponse immunitaire. Une telle molécule d'ARN s ' auto-répliquant peut être particulièrement utile, par exemple, dans la production de divers produits géniques (par exemple, des protéines) en même temps, par exemple, sous la forme d'un vaccin bivalent ou multivalent.

Si c'est souhaité, les molécules d'ARN s'autorépliquant peuvent être criblées ou analysées pour confirmer leurs propriétés thérapeutiques et prophylactiques en utilisant divers procédés d'analyse in vitro ou in vivo qui sont connus de l'homme du métier. Par exemple, des vaccins comprenant une molécule d'ARN s'auto-répliquant peuvent être testés pour leur effet sur l'induction de la prolifération ou de la fonction effectrice du type particulier de lymphocytes d'intérêt, par exemple, les lymphocytes B, les lymphocytes T, les lignées de lymphocytes T, et les clones de lymphocytes T. Par exemple, des cellules spléniques provenant de souris immunisées peuvent être isolées et la capacité des lymphocytes T cytotoxiques à lyser des cellules cibles autologues qui contiennent une molécule d'ARN s'auto42

BE2017/5835 répliquant qui code pour un antigène prME du virus Zika peut être analysée. En outre, la différenciation des lymphocytes T auxiliaires peut être analysée en mesurant la prolifération ou la production de cytokines TH1 (IL2 et IFN-γ) et/ou TH2 (IL-4 et IL-5) par une technique ELISA ou directement dans des lymphocytes T CD4+ par coloration cytoplasmique des cytokines et cytométrie en flux.

Les molécules d'ARN s'auto-répliquant qui codent pour un antigène prME du virus Zika peuvent être également testées pour la capacité à induire des réponses immunitaires humorales, comme il est mis en évidence, par exemple, par l'induction de la production par les lymphocytes B d'anticorps spécifiques d'un antigène prME du virus Zika d'intérêt. Ces analyses peuvent être conduites en utilisant, par exemple, des lymphocytes B périphériques provenant d'individus immunisés. De tels procédés d'analyse sont connus de l'homme du métier. D'autres analyses qui peuvent être utilisées pour caractériser les molécules d'ARN s'auto-répliquant peuvent impliquer la détection de l'expression de l'antigène prME du virus Zika codé par les cellules cibles. Par exemple, une analyse FACS peut être utilisée pour détecter l'expression d'antigènes sur la surface cellulaire ou au niveau intracellulaire. Un autre avantage de la sélection par FACS est que l'on peut trier différents taux d'expression ; parfois, une expression inférieure peut être souhaitée. Un autre procédé approprié pour identifier les cellules qui expriment un antigène particulier implique l'adhérence spécifique en utilisant des anticorps monoclonaux sur une plaque ou la capture en utilisant des billes magnétiques revêtues d'anticorps monoclonaux.

Dans certains modes de réalisation, les molécules

BE2017/5835 d'ARN s'auto-répliquant comprennent une séquence choisie dans le groupe constitué de

SEQ ID NO : 36 et

SEQ ID NO : 37. Dans certains modes de réalisation, les molécules d'ARN s'auto-répliquant comprennent une séquence qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37. Dans certains modes de réalisation, la molécule d'ARN s'autorépliquant comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37 où le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'acide nucléique de la séquence pleine longueur jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une séquence d'ADN codant pour une molécule d'ARN s'autorépliquant, ladite séquence d'ADN choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34. Dans certains modes de réalisation, la séquence d'ADN codant pour une molécule d'ARN s'auto-répliquant comprend une séquence qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34. Dans

BE2017/5835 certains modes de réalisation, la séquence d'ADN codant pour une molécule d'ARN s'auto-répliquant comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34 où le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'acide nucléique de la séquence pleine longueur jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 30 acides nucléiques plus courte que la séquence pleine longueur.

Le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre un système d'administration viral ou non viral. Le système d'administration (également appelé ici véhicule d'administration) peut avoir des effets adjuvants qui amplifient l'immunogénicité de l'antigène prME du virus Zika codé. Par exemple, la molécule d'acide nucléique peut être encapsulée dans des liposomes, des microparticules polymères biodégradables non toxiques ou des particules de réplicons viraux (VRP), ou complexée avec des particules d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration de nanoémulsion cationique (CNE) ou un système d'administration de nanoparticules lipidiques (LNP) . Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration non viral, c'est-à-dire que le vaccin à base d'acide nucléique est sensiblement dépourvu de capside virale. En variante, le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre des particules de réplicons viraux. Dans d'autres modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique peut comprendre un acide nucléique nu, tel qu'un ARN nu (par exemple, 1'ARNm), mais l'administration par l'intermédiaire de CNE ou de

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LNP est préférée.

Dans certains modes de réalisation, le vaccin à base d'acide nucléique comprend un système d'administration de nanoémulsion cationique systèmes d'administration de CNE et les procédés pour leur préparation sont décrits dans la référence suivante :

d'administration de CNE, la molécule d'acide nucléique (par exemple, ARN) qui code pour l'antigène est complexée avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Les émulsions cationiques huile dans ' eau peuvent être utilisées pour administrer des molécules chargées négativement, comme une molécule d'ARN à des

Les particules de l'émulsion comprennent cellules.

un noyau d'huile et un lipide cationique. Le lipide cationique peut interagir avec la molécule chargée négativement, ancrant de cette façon la molécule aux particules de l'émulsion. D'autres détails de CNE utiles peuvent être trouvés dans les références suivantes : WO 2012/006380 ;

WO 2013/006834 ; et WO 2013/006837 (dont le contenu de chacune est incorporé ici dans son intégralité).

Ainsi, dans un vaccin à base d'acide nucléique de l'invention, une molécule d'ARN codant pour un antigène prME du virus Zika peut être complexée avec une particule d'une émulsion cationique huile dans l'eau. Les particules comprennent généralement un noyau d'huile (par exemple, une huile végétale ou du squalène) qui est en phase liquide à 25 °C, un lipide cationique (par exemple, un phospholipide) et, éventuellement, un tensioactif (par exemple, le trioléate de sorbitane, le

BE2017/5835 polysorbate 80) ; du polyéthylène glycol peut être également inclus. Dans certains modes de réalisation, la CNE comprend du squalène et un lipide cationique, tel que le 1,2-dioléoyloxy-3-(triméthylammonio)propane (DOTAP). Dans certains modes de réalisation préférés, le système d'administration est un système d'administration non viral, tel qu'une CNE, et le vaccin à base d'acide nucléique comprend un ARN s ' auto-répliquant (ARNm) . Ceci est particulièrement efficace dans le déclenchement des réponses immunitaires humorales et cellulaires. Les avantages comprennent également l'absence de réponse immunitaire anti-vecteur limitante et un manque de risque d'intégration génomique.

Dans certains modes de réalisation, une molécule d'ARN codant pour un antigène prME du virus Zika peut être complexée avec une émulsion cationique huile dans l'eau submicronique. Dans certains modes de réalisation, l'émulsion cationique huile dans l'eau est caractérisée par une taille de particule moyenne d'environ 80 nm à 180 nm de diamètre (ou en variante d'environ 80 à environ 150 nm ; d'environ 80 à 130 nm ; ou d'environ 100 nm). Dans certains modes de réalisation, la concentration du DOTAP dans ladite émulsion, avant la complexation de l'ARN, est d'au moins environ 2,5 mM, ou d'environ 2,5 mM à environ 8 mM. Dans un mode de réalisation particulier, la concentration du DOTAP dans ladite émulsion est d'environ 4 mg/ml (5,73 mM). L'huile peut être du squalène ou du squalane.

Dans certains modes de réalisation, une molécule d'ARN codant pour un antigène prME du virus Zika est complexée à une émulsion cationique huile dans l'eau

BE2017/5835 comprenant du DOTAP, du squalène, du trioléate de sorbitane et du polysorbate 80 dans du tampon citrate. Les émulsions cationiques huile dans l'eau appropriées pour l'administration d'une molécule d'ARN codant pour un antigène prME du virus Zika peuvent contenir environ 2 mg/ml à 7 mg/ml de DOTAP ; environ 3 mg/ml à 6 mg/ml de Span 85 ; environ 3 mg/ml à 6 mg/ml de Tween 80 ; et environ 30 mg/ml à 50 mg/ml de squalène. Dans certains modes de réalisation, l'émulsion cationique huile dans

1'eau,	avant la complexation	avec 1'ARN,	contient
environ	4,3	% p/v de squalène, 0	, 5 % de	Tween	80, 0,5%
de SPAN	85,	et 4 mg/ml de DOTAP.
II	est	également fourni un	procédé	de préparation

d'une composition comprenant une molécule d'ARN codant pour un antigène prME du virus Zika complexée à une émulsion cationique huile dans l'eau, le procédé comprenant : (i) la fourniture d'une émulsion huile dans l'eau telle que décrite ici ; (ii) la fourniture d'une solution aqueuse comprenant la molécule d'ARN ; et (iii) la combinaison de la solution aqueuse de (ii) et de l'émulsion huile dans l'eau de (i), préparant de cette façon la composition. Si c'est souhaité, la solution aqueuse comprenant la molécule d'ARN peut être un tampon. Le tampon peut comprendre un ou plusieurs sel, tampon, saccharide, ou polymère. Dans un mode de réalisation préféré, le tampon comprend 560 mM de saccharose, 20 mM de NaCl, et 10 mM de citrate, qui peuvent être mélangés avec une émulsion cationique huile dans l'eau décrite ici pour produire une phase aqueuse finale qui comprend 280 mM de saccharose, 10 mM de NaCl et 10 mM de citrate.

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Les systèmes d'administration de LNP et les microparticules polymères biodégradables non toxiques, et des procédés pour leur préparation sont décrits dans les références suivantes : WO 2012/006376 (systèmes d'administration de LNP et de microparticules) ; Geall et al. (2012) PNAS USA. Sep 4; 109(36): 14604-9 (système d'administration de LNP) ; et WO 2012/006359 (systèmes d'administration de microparticules). Les LNP sont des particules liposomiques non-virions dans lesquelles une molécule d'acide nucléique (par exemple, ARN) peut être encapsulée. Les particules peuvent comprendre un peu d'ARN externe (par exemple, sur la surface des particules), mais au moins la moitié de l'ARN (et idéalement sa totalité) est encapsulée. Les particules liposomiques peuvent être formées, par exemple, d'un mélange de lipides zwittérioniques, cationiques et anioniques qui peuvent être saturés ou insaturés, par exemple : DSPC (zwittérionique, saturé), DlinDMA (cationique, insaturé), et/ou DMG (anionique, saturé). Les LNP préférées pour une utilisation dans le cadre de l'invention comprennent un lipide amphiphile qui peut former des liposomes, éventuellement en combinaison avec au moins un lipide cationique (tel que DOTAP, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, etc.). Un mélange de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG et cholestérol est particulièrement efficace. D'autres LNP utiles sont décrites dans les références suivantes : WO 2012/006376 ; WO 2012/030901 ;

WO 2012/031046 ; WO 2012/031043 ; WO 2012/006378;

WO 2011/076807 ; WO 2013/033563 ; WO 2013/006825;

WO 2014/136086 ; WO 2015/095340 ; WO 2015/095346;

WO 2016/037053. Dans certains modes de réalisation, les

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LNP sont des liposomes RV01, voir les références suivantes : WO 2012/006376 et Geall et al. (2012) PNAS

USA. Sep 4; 109(36): 14604-9.

Compositions pharmaceutiques ; compositions immunogènes

La divulgation fournit des compositions comprenant un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un polypeptide du virus Zika, par exemple, un antigène prME du virus Zika. La composition peut être une composition pharmaceutique, par exemple, une composition immunogène ou une composition vaccinale. Par conséquent, la composition peut également comprendre un support pharmaceutiquement acceptable. Dans certains modes de réalisation, le virus Zika est une souche brésilienne du virus Zika.

Un « support pharmaceutiquement acceptable » comprend tout support qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs envers l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont généralement des grosses macromolécules métabolisées lentement telles que des protéines, des polysaccharides, des polyacides lactiques, des polyacides glycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose, le tréhalose, le lactose, et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes). De tels supports sont bien connus de l'homme du métier. Les compositions peuvent également contenir un diluant pharmaceutiquement acceptable, tel que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou émulsifiants, des substances tampons de

BE2017/5835 pH, et analogues, peuvent être présentes. Le sérum physiologique tamponné par du phosphate stérile apyrogène est un support classique.

Les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre les constructions, les séquences d'acide nucléique, et/ou les séquences polypeptidiques décrites ailleurs dans ce document dans de l'eau plate (par exemple, de l'eau « p.p.i. ») ou dans un tampon, par exemple, un tampon phosphate, un tampon Tris, un tampon borate, un tampon succinate, un tampon histidine, ou un tampon citrate. Les sels tampons seront généralement inclus dans la plage de 5 à 20 mM. Les compositions pharmaceutiques peuvent avoir un pH situé entre 5,0 et 9,5, par exemple, entre 6,0 et 8,0. Les compositions peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, le chlorure de sodium) pour donner la tonicité. Une concentration de 10 ± 2 mg/ml de NaCl est classique, par exemple, environ 9 mg/ml. Les compositions peuvent comprendre des chélateurs d'ions métalliques. Ceux-ci peuvent prolonger la stabilité de l'ARN en éliminant les ions qui peuvent accélérer l'hydrolyse des phosphodiesters. Ainsi, une composition peut comprendre un ou plusieurs de l'EDTA, l'EGTA, le BAPTA, l'acide pentétique, etc. De tels chélateurs sont généralement présents à une concentration située entre 10 et 500 μΜ, par exemple, 0,1 mM. Un sel citrate, tel que le citrate de sodium, peut également agir comme un chélateur, tout en fournissant également de façon avantageuse une activité tampon. Les compositions pharmaceutiques peuvent avoir une osmolalité située entre 200 mOsm/kg et 400 mOsm/kg, par exemple, entre 240 et 360 mOsm/kg, ou entre 290 et 310 mOsm/kg.

Les compositions

BE2017/5835 pharmaceutiques peuvent comprendre un ou plusieurs conservateurs, tels que le thiomersal ou le 2-phénoxyéthanol. Les compositions dépourvues de mercure sont préférées, et des vaccins dépourvus de conservateur peuvent être préparés. Les compositions pharmaceutiques peuvent être aseptiques ou stériles. Les compositions pharmaceutiques peuvent être non pyrogènes, par exemple, contenant < 1 UE (unité d'endotoxine, une mesure standard) par dose, et de préférence <0,1

UE par dose.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être dépourvues de gluten. Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées sous forme de dose unitaire. Dans certains modes de réalisation, une dose unitaire peut avoir un volume situé entre 0,1 et 1,0 ml, par exemple, environ

0,5 ml.

Dans certains modes de réalisation, les compositions divulguées ici sont des compositions immunogènes qui, lorsqu'elles sont administrées à un sujet, induisent une réponse immunitaire spécifique de l'antigène humorale et/ou cellulaire (c'est-à-dire, une réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide du virus Zika existant

Par exemple, une composition immunogène peut induire une population de lymphocytes T et/ou

B à mémoire par rapport à un sujet non traité à la suite d'une infection par le virus Zika, particulièrement dans ces modes de réalisation où la composition comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène prME du virus Zika ou comprend un antigène du virus Zika. Dans certains modes de réalisation, le sujet

BE2017/5835 est un vertébré, tel qu'un mammifère, par exemple, un être humain ou un mammifère vétérinaire.

Les compositions de l'invention peuvent être formulées sous la forme de compositions vaccinales. Le vaccin comprendra une quantité immunologiquement efficace d'antigène. Par « une quantité immunologiquement efficace », il est signifié que l'administration de cette quantité à un sujet, soit dans une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour induire une réponse immunitaire mesurable contre le virus Zika chez le sujet. Cette quantité varie selon l'état de santé et physique de l'individu l'âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter, à traiter (par exemple, capacité du être humain, primate non humain, système immunitaire de 1'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation de la composition ou du vaccin,

1'estimation du médecin traitant de la situation médicale la gravité de la maladie, la puissance du composé administré, le mode d'administration, et d'autres facteurs pertinents. On s ' attend à ce que la quantité se situe dans une plage relativement large qui peut être déterminée à l'aide d'essais de routine.

Les vaccins tels que divulgués ici peuvent être soit prophylactiques (c'est-à-dire, pour prévenir une infection) soit thérapeutiques (c'est-à-dire pour traiter une infection), mais ils seront généralement prophylactiques. Dans certains modes de réalisation, les compositions vaccinales divulguées ici peuvent induire une réponse immunitaire efficace contre une infection par le virus Zika, c'est-à-dire, une réponse suffisante

BE2017/5835 pour le traitement ou la prévention d'une infection par le virus Zika.

Dans certains modes de réalisation, la composition comprend en outre un antigène supplémentaire. Dans certains modes de réalisation, la composition est administrée à un sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un antigène supplémentaire.

Une composition de la présente divulgation peut également comprendre, ou être administrée conjointement avec, un ou plusieurs adjuvants (par exemple, des adjuvants vaccinaux), en particulier où la composition comprend une quantité immunologiquement efficace d'un acide nucléique codant pour un antigène prME du virus Zika ou d'un antigène prME du virus Zika. Par adjuvant, il est signifié qu'il est capable d'augmenter une réponse immunitaire contre un antigène comparativement à l'administration dudit antigène seul. Dans certains aspects, les compositions d'adjuvants telles que divulguées ici comprennent en outre un ou plusieurs immunostimulants, par exemple, une saponine telle que le QS21.

Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans les compositions de l'invention comprennent, mais n'y sont pas limités : (A) des compositions contenant des minéraux, par exemple, des sels d'aluminium et de calcium, tels que des phosphates d'aluminium. (B) Des émulsions huileuses, par exemple, des émulsions squalène dans l'eau, telles que MF59 ou AS03. L'adjuvant complet de Freund (CFA) et l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) peuvent être également utilisés. (C) Des formulations de saponines. (D) Des virosomes et des particules

BE2017/5835 pseudovirales (VLP). (E) Des dérivés bactériens ou microbiens tels que des dérivés non toxiques de lipopolysaccharide entérobactérien (LPS), des dérivés du lipide A, des oligonucléotides immunostimulants et des toxines ADP-ribosylantes et leurs dérivés détoxifiés. (F) Des immunomodulateurs humains, par exemple, des cytokines, tels que des interleukines, des interférons, le facteur de stimulation des colonies de macrophages, et le facteur de nécrose tumorale. (G) Des bioadhésifs et des mucoadhésifs, tels que des microsphères d'acide hyaluronique estérifié, des dérivés réticulés de poly(acide acrylique), des polyalcools vinyliques, la polyvinylpyrrolidone, des polysaccharides et la carboxyméthylcellulose. (H) Des microparticules, par exemple, des particules d'un diamètre de -100 nm à -150 μm, de façon davantage préférée d'un diamètre de -200 nm à -30 μm, et de façon préférée entre toutes d'un diamètre de -500 nm à -10 μm) formées à partir de matériaux qui sont biodégradables et non toxiques (par exemple, un poly(acide a-hydroxylé), un polyacide hydroxybutyrique, un polyorthoester, un polyanhydride, une polycaprolactone, etc.), avec un poly(lactide-coglycolide) sont préférées, éventuellement traitées pour avoir une surface chargée négativement (par exemple, avec du SDS) ou une surface chargée positivement (par exemple, avec un détergent cationique, tel que le CTAB). (I) Des liposomes. (J) Des formulations d'éthers de polyoxyéthylène et d'esters de polyoxyéthylène. (K) Un polyphosphazène (PCPP). (L) Des mmuramyl-peptides. (Μ) Des composés d'imidazoquinolone, par exemple, 1'imiquimod et ses homologues.

Des combinaisons d'un ou de plusieurs des adjuvants identifiés ci-dessus peuvent être également utilisées dans le cadre de l'invention.

Procédés d'utilisation/utilisations

BE2017/5835

Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour l'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin comprenant une étape d'administration d'une quantité immunologiquement efficace d'une construction ou d'une composition telle que divulguée ici. Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation des constructions ou des compositions divulguées ici pour 1'induction d ' une réponse immunitaire contre un antigène prME du virus

Zika chez un sujet en ayant besoin. Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation des constructions ou des compositions divulguées ici pour

1'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus

Zika chez un sujet. Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation de la construction ou de la composition telle que divulguée ici dans la fabrication d'un médicament qui induit une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet. Par « sujet », il est signifié un vertébré, tel qu'un mammifère, par exemple, un être humain ou un mammifère vétérinaire. Dans certains modes de réalisation, le sujet est humain. Par « réponse immunitaire », il est signifié une réponse immunologique spécifique de l'antigène humorale et/ou cellulaire (c'est-à-dire, une réponse immunitaire qui reconnaît spécifiquement un polypeptide antigénique) qui peut être

BE2017/5835 démontrée comme neutralisant le virus Zika in vitro ou contrôlant/ réduisant/éliminant une infection par le virus Zika in vivo.

Dans certains modes de réalisation, la réponse immunitaire est caractérisée par une mémoire immunologique contre le virus Zika et/ou une population de lymphocytes T à mémoire efficaces et sensibles au virus Zika.

Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une molécule d'ARN codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 24. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une molécule d'ARN codant pour un polypeptide qui est identique à au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, ou au moins 99 % à une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 24. Dans certains modes de réalisation, la composition comprend une molécule d'ARN codant pour un polypeptide qui comprend un fragment d'une séquence pleine longueur choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 24, où le fragment comprend une suite contiguë de la séquence d'acides aminés de la séquence pleine longueur jusqu'à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 acides aminés plus courte que la séquence pleine longueur.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, un ARN et/ou une molécule s ' auto-répliquant tels que décrits ici pour une utilisation en thérapie ou médecine. Dans certains modes

BE2017/5835 de réalisation, les compositions divulguées ici sont pour une utilisation en thérapie ou médecine. Dans un mode de réalisation préféré, la thérapie est une thérapie vaccinale. De préférence, la thérapie est un vaccin pour prévenir une infection par le virus Zika.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, un ARN et/ou une molécule s ' auto-répliquant tels que décrits ici pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.

Dans certains modes de réalisation, les compositions divulguées ici sont pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.

Dans certains modes de réalisation, les compositions divulguées ici sont pour une utilisation dans l'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, une molécule d'ARN s'autorépliquant, et/ou une composition tels que décrits ici pour une utilisation dans un procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour la prévention ou le raccourcissement d'une infection par le virus Zika et/ou la réduction ou la prévention des symptômes cliniques lors d'une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition

BE2017/5835 immunogène telle que fournie ici.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni l'utilisation d'une construction ou d'une composition divulguée ici dans la fabrication d'une composition immunogène pour la prévention ou le raccourcissement d'une infection par le virus Zika chez un sujet et/ou la réduction ou la prévention des symptômes cliniques lors d'une infection par le virus Zika chez un sujet.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni des procédés pour la prévention ou la réduction de la transmission d ' une infection par le virus Zika d'un sujet à un autre.

Dans des modes de réalisation spécifiques, il est fourni des procédés pour la prévention ou la réduction de la transmission d'une infection par le virus

Zika à un fœtus à travers la barrière placentaire. Dans certains modes de réalisation , une composition telle que décrite ici est administrée à une femme dans une quantité efficace pour prévenir la transmission d'une infection par le virus Zika à travers la barrière placentaire.

Dans certains modes de réalisation est fourni l'utilisation d'une construction ou d'une composition divulguée ici dans la fabrication d'une composition immunogène pour la prévention ou la réduction de la transmission d'une infection par le virus

Zika à un fœtus à travers la barrière placentaire.

Dans certains modes de réalisation, il est fourni une construction, un vecteur, une molécule d'ARN s'auto répliquant, et/ou une composition tels que décrits ici pour une utilisation dans un procédé de prévention ou de

BE2017/5835 réduction de la transmission d'une infection par le virus

Zika à un fœtus à travers la barrière placentaire.

Dans certains modes de réalisation, le sujet est un sujet humain. Dans des modes de réalisation spécifiques, le sujet humain a été exposé, ou est à risque d'être exposé, à une infection par le virus Zika.

Voies d'administration/dosages

Les compositions divulguées ici seront généralement administrées directement à un sujet. L'administration directe peut être accomplie par injection parentérale (par exemple, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, intradermique, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu). Des variantes de voie d'administration comprennent une administration rectale, orale (par exemple, comprimé, pulvérisation), buccale, sublinguale, vaginale, topique, transdermique ou transcutanée, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou une autre administration mucosale. Les administrations intradermique et intramusculaire sont deux voies préférées. L'injection peut être effectuée par l'intermédiaire d'une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut être utilisée en variante. Un volume de dose intramusculaire humaine classique est de 0,5 ml.

Une dose d'un acide nucléique (par exemple, un vaccin à base d'acide nucléique, tel qu'un vaccin à base de SAM contre le virus Zika) peut comporter environ 50 pg à environ 100 pg d'acide nucléique. Dans un mode de réalisation, une dose de vaccin à base de SAM contre le virus Zika contient 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 pg d'ARN. Dans d'autres modes de réalisation,

BE2017/5835 une dose d'un vaccin à base de SAM contre le virus Zika peut comporter < 10 pg d'acide nucléique ; par exemple, de 1 à 10 pg, comme environ 1 pg, 2,5 pg, 5 pg, 7,5 pg ou 10 pg, mais une expression peut être observée à des taux bien inférieurs ; par exemple, en utilisant < 1 pg/dose, < 100 ng/dose, < 10 ng/dose, < 1 ng/dose, etc. De façon similaire, une dose d'antigène protéinique peut comporter < 10 pg de protéine ; par exemple, de 1 à 10 pg, comme environ 1 pg, 2,5 pg, 5 pg, 7,5 pg ou 10 pg.

Dans des modes de réalisation préférés, un vaccin à base de SAM contre le virus Zika ou une composition vaccinale est administré à un sujet à une dose efficace, signifiant une dose suffisante pour obtenir une réponse immunitaire souhaitée, comme l'induction d'anticorps neutralisants contre le virus Zika et/ou une protection contre une infection par le virus Zika.

Dans certains modes de réalisation, un vaccin à base de SAM contre le virus Zika décrit ici a une dose efficace qui est inférieure ou égale à 50 %, 40 %, 30 %, 20 % ou 10 % de la dose efficace d'un vaccin à base d'ADN ou d'une composition vaccinale codant pour le même antigène. Dans certains modes de réalisation, un vaccin à base de SAM contre le virus Zika décrit ici a une dose efficace qui est d'un tiers ou moins de la dose efficace d'un vaccin à base d'ADN ou d'une composition vaccinale codant pour le même antigène.

Procédés de fabrication/formulation

Il est fourni ici des procédés pour la fabrication d'ARN s'auto-répliquant. Dans certains modes de

BE2017/5835 réalisation, le procédé de fabrication d'un ARN s'autorépliquant comprend une étape de transcription in vitro (IVT) telle que décrite ailleurs dans ce document. Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication d'un ARN s'auto-répliquant comprend une étape d'IVT pour produire un ARN, et comprend en outre une étape de combinaison de l'ARN avec un système d'administration non viral tel que décrit ailleurs dans ce document. Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication d'un ARN s'auto-répliquant comprend une étape d'IVT pour produire un ARN, et comprend en outre une étape de combinaison de l'ARN avec un système d'administration de CNE tel que décrit ailleurs dans ce document.

Identité de séquence

L'identité ou l'homologie par rapport à une séquence d'acides aminés est définie ici comme le pourcentage de résidus d'acides aminés dans la séquence candidate qui sont identiques à la séquence d'acides aminés de référence après l'alignement des séquences et l'introduction de brèches, si nécessaire, pour obtenir le pourcentage maximal d'identité de séquence, et en ne considérant pas toute substitution conservative comme faisant partie de l'identité de séquence. L'identité ou l'homologie par rapport à une séquence d'acide nucléique est définie ici comme le pourcentage de nucléotides dans la séquence candidate qui sont identiques à la séquence d'acide nucléique de référence après l'alignement des séquences et l'introduction de brèches, si nécessaire, pour obtenir le pourcentage maximal d'identité de séquence.

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L'identité de séquence peut être déterminée par des procédés classiques qui sont couramment utilisés pour comparer la similarité dans une position des acides aminés de deux polypeptides. En utilisant un programme informatique tel que BLAST, deux polypeptides sont alignés pour une correspondance optimale de leurs acides aminés respectifs (soit tout le long de la pleine longueur de l'une ou des deux séquences soit tout le long d'une partie prédéterminée de l'une ou des deux séquences). Les programmes fournissent une pénalité d'ouverture par défaut et une pénalité de brèche par défaut, et une matrice de score telle que PAM 250 [une matrice de score classique ; voir Dayhoff et al., dans Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] peut être utilisée conjointement avec le programme informatique. Par exemple, le pourcentage d'identité peut être ensuite calculé par : le nombre total de correspondances identiques multiplié par 100 et ensuite divisé par la somme de la longueur de la séquence la plus longue au sein de l'étendue de la correspondance et du nombre de brèches introduites dans la séquence la plus courte afin d'aligner les deux séquences. Les mêmes procédés utilisés pour comparer des polypeptides peuvent être également utilisés pour calculer le pourcentage d'identité de deux séquences polynucléotidiques.

Lorsque la présente divulgation se rapporte à une séquence en référence à un code d'accession UniProt ou Genbank, la séquence à laquelle il est fait référence est la version actuelle à la date de dépôt de la présente demande.

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Généralités

Sauf explication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle comprise couramment par l'homme du métier dans le domaine auquel cette divulgation appartient. Les termes au singulier « un », « une », « le » et « la » comprennent les articles au pluriel sauf si le contexte indique clairement le contraire. De façon similaire, le mot « ou » est censé comprendre « et » sauf si le contexte indique clairement le contraire. Le terme « pluralité » se rapporte à deux ou plus. En outre, les limitations numériques données par rapport aux concentrations ou aux taux d'une substance, comme les concentrations de composants de solution ou leurs rapports, et les conditions réactionnelles telles que les températures, les pressions et les temps de cycle sont prévus être approximatifs. Le terme « environ » utilisé ici est censé signifier ± 10 %.

Le terme « comprend » signifie « inclut ». Ainsi, sauf si le contexte l'exige autrement, le mot « comprend », et des variations telles que « comprennent » et « comprenant » seront compris comme impliquant l'inclusion d'un composé ou d'une composition indiqué(e) (par exemple, acide nucléique, polypeptide, antigène) ou d'une étape, ou d'un groupe de composés ou d'étapes, mais pas l'exclusion de tout (e) autre composé, composition, étape ou groupe de ceux-ci. Les modes de réalisation décrits comme comprenant certains composants sont censés comprendre les modes de réalisation constitués des composants indiqués.

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L'abréviation, « e.g. » est dérivée du Latin exempli gratia, et est utilisée ici pour indiquer un exemple non limitatif. Ainsi, l'abréviation « e.g. » est synonyme du terme « par exemple ».

L'invention sera en outre décrite en référence aux figures et exemples, non limitatifs, qui suivent.

Exemples

Exemple 1- Résumé du projet

Les présents inventeurs ont commencé à travailler sur un vaccin contre le virus Zika en utilisant la plateforme SAM - ARNm s'auto-amplifiant (SAM) synthétique dérivé du génome d'alphavirus, exprimant des antigènes d'intérêt. Les constructions SAM sont évaluées pour la production robuste d'antigènes et l'antigénicité et testées en outre pour leur immunogénicité et efficacité en utilisant des modèles in vivo.

Procédés

Le vecteur SAM TC-83 du virus VEE a été utilisé comme construction contextuelle pour le clonage dans les exemples. Voir SEQ ID NO : 17.

Exemple 2 - Sélection de l'antigène

Le génome de Flavivirus est constitué d'un ARN simple brin coiffé de polarité positive d'une longueur d' approximativement 11,3 kb (figure 1) . Le quart proximal en 5’ du génome code pour les protéines structurales de la capside (C), prémembranaire (prM), et d'enveloppe (E) . Les protéines non structurales NSI, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, et NS5 sont impliquées dans

BE2017/5835 la réplication de l'ARN viral. La région codante est flanquée de régions non traduites en 5' et 3' (UTR en 5’ et 3’) d'une longueur d'approximativement 100 et 600 nucléotides, respectivement. La traduction du génome viral produit un polypeptide unique qui est traité en protéines individuelles par une combinaison de protéases cellulaires et d'une protéase virale constituée d'une sous-unité catalytique, NS3, et de son cofacteur, NS2B.

Les protéines structurales prM et E sont insérées de façon cotraductionnelle dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et traitées par des signaux peptidases, produisant des protéines qui encapsident C conjointement avec l'ARN viral, par bourgeonnement dans la lumière du RE (figure 2). A une étape ultérieure dans la maturation virale, prM sur ces particules est clivée en protéine M mature par une protéase cellulaire, la furine, avant la libération à partir de la cellule. Ce clivage de prM est nécessaire à l'infectivité des virions libérés. En plus des virions infectieux, les cellules infectées par le flavivirus libèrent des particules subvirales (SVP) (figure 2). Ces particules sont plus petites que les virions, mais contiennent la protéine E importante d'un point de vue antigénique et la protéine prM/Μ, qui est essentielle au repliement correct et à 1 ' incorporation de la protéine E dans les SVP et les particules virales. Toutefois, à la différence des virions, les SVP ne contiennent ni la protéine C ni le génome viral, et sont ainsi non infectieuses. Les SVP peuvent être produites dans divers systèmes par coexpression des protéines prM et E, et les SVP partagent des propriétés avec les virus de type sauvage, comme

BE2017/5835 l'activité fusogène et l'induction d'une réponse immunitaire neutralisante et il a été montré de façon répétée qu'elles stimulent les réponses immunitaires protectrices contre un certain nombre de maladies dues aux flavivirus. Les présents inventeurs ont choisi des protéines structurales du virus Zika, à savoir prM et E, pour une autre expérimentation.

Exemple 3 - Sélection des souches

Les séquences d'acides aminés des protéines C-prME des souches de virus Zika (disponibles auprès de NCBI/Genbank) issues de poussées du virus Zika dans le monde entier depuis 2007 ont été alignées pour rechercher les similarités et les différences (figure 3) . Cellesci comprenaient la souche de lignée africaine originale de l'Ouganda, de la Micronésie (2007), de la Polynésie française (2013), et les souches brésiliennes depuis 2016 (figure 3) . En outre, sept souches de virus Zika provenant de diverses régions du Brésil, ont été également comparées pour les différences d'acides aminés dans la région C-prME (figure 4). Une conservation élevée a été observée dans toutes les souches provenant de différentes poussées, avec les souches brésiliennes presque identiques dans la région CprME. La souche Natal, Bahia (KU527068) a été choisie comme souche représentative. KU527068 a été l'une des premières souches à être isolées à partir du cerveau d'un fœtus présentant une microcéphalie.

BE2017/5835

Exemple 4 - Conception des constructions

La conception des constructions Zika-SAM de la figure 6 comprend le clonage de la séquence codant pour les protéines structurales prémembranaire (prM) et d'enveloppe (E) (souche Natal, Brésil) sous le promoteur subgénomique dans un vecteur SAM. Une série de modifications sur les constructions SAM-prME ont été effectuées (tableau 1, figure 6). Celles-ci comprennent :

i. Substitution du peptide signal prM natif par le peptide signal du JEV (figures 6A et B, inserts d'antigènes #5283 et #5288).

ii. Substitution de l'extrémité C-terminale native de la protéine E du virus Zika par l'extrémité Cterminale de la protéine E du JEV (figure 6B, insert d'antigène #5288).

iii. Troncature de la séquence de départ de prM du virus Zika de type sauvage pour altérer l'expression et la sécrétion de l'antigène prME (insert d'antigène #4974). L'insert d'antigène #4974 a été utilisé en tant que témoin négatif. La séquence d'acides aminés de l'insert d'antigène #4974 est représentée par SEQ ID NO : 29, y compris la séquence signal du JEV (SEQ ID NO : 5), suivie d'une région pr tronquée du virus Zika (SEQ ID NO : 30), de la protéine M du virus Zika (SEQ ID NO : 31) et de la protéine E du virus Zika (SEQ ID NO : 32) . Les séquences d'ADN et d'ARN codant pour l'insert d'antigène #4974 sont représentées par SEQ ID NO : 28 et 41, respectivement.

BE2017/5835 iv. Une construction d'antigène non-virus Zika, #8111, a été conçue et utilisée en tant que témoin positif.

Evaluation/conception de l'étude

Les constructions sont évaluées dans des cellules de mammifères à la suite de 1 ' électroporation de l'ARN Zika-SAM dans des cellules BHK en utilisant les procédés suivants :

a. La	réplication-puissance	de	1 ' ARN SAM	des
constructions SAM-Zika est testée	en	utilisant	des
anticorps	dirigés contre 1'ARNdb et	une	technique FACS.
b. L'	expression des antigènes	est	déterminée	par

des immunoblots et des tests d'immunofluorescence, pour étudier les protéines prM et E clivées dans les lysats cellulaires et le surnageant cellulaire.

c. La production des SVP est testée dans des cellules de mammifères en utilisant des procédures établies pour l'isolement des SVP à partir du surnageant cellulaire.

A la suite de l'identification des constructions candidates les plus efficaces, une formulation dans des systèmes d'administration à base de LNP/CNE est réalisée et l'analyse pour l'antigénicité et l'immunogénicité est réalisée in vivo.

Exemple 5 - Expression et sécrétion des constructions Zika-SAM

La capacité des cellules à exprimer et sécréter la protéine E du virus Zika et la protéine E hybride du virus Zika-JEV à partir des constructions Zika-SAM

BE2017/5835 décrites ci-dessus a été évaluée selon les procédés suivants.

Au jour 0, des cellules BHK ont été déposées à 8 x 10⁶ dans des flacons T225 dans du milieu de croissance. Pour la trypsination, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées avec 5 ml de PBS. Le liquide de lavage de PBS a été ensuite retiré, et 5 ml de trypsine préchauffée ont été ajoutés et étalés uniformément sur toute la plaque. La trypsine a été retirée et les plaques ont été maintenues à 37 degrés C pendant 1 à 2 min. Les cellules ont été ensuite remises en suspension dans 10 ml de milieu de croissance (5 % de FBS) . Les cellules ont été comptées et déposées à la concentration requise dans un nouveau flacon. Les cellules ont été ensuite incubées à 37 degrés C, 5 % de CO2 pendant environ 20 heures.

Au jour 1, les plaques ont été préparées par l'addition de 2 ml de DMEM + 1 % de FBS + P/S (milieu de croissance) dans chaque puits d'une plaque de 6 puits (un puits par électroporation) . Les plaques ont été conservées au chaud dans un incubateur à 37 degrés C. L ' électroporateur a été préparé pour délivrer 120 V, pulsion de 25 ms, intervalle des pulsions de 0,0, 1 pulsion pour une cuvette de 2 mm. Les cuvettes ont été marquées et conservées sur de la glace. Les cellules en phase de croissance ont été récoltées comme la normale dans du milieu BHK (croissance) et comptées en utilisant un hémocytomètre. Les cellules ont été trypsinées en suivant le même protocole de trypsination que ci-dessus. Des électroporations d'étalons et de témoins négatifs ont été également préparées.

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Les cellules ont été centrifugées à 1500 tr/min (462 x g) pendant 5 min. Le milieu a été aspiré, et les cellules ont été lavées une fois avec 20 ml de milieu Opti-MEM froid. Les cellules ont été à nouveau centrifugées à 1500 tr/min (462 x g) pendant 5 min. Le milieu a été aspiré, et les cellules ont été remises en suspension dans du milieu Opti-MEM à 0,25 ml par électroporation.

Pour chaque échantillon, 4000 ng d'ARN ont été mélangés avec 250 μΐ de cellules, et le mélange a été pipeté doucement 4 à 5 fois. Le mélange de cellules et d'ARN a été transféré dans des cuvettes de 2 mm et soumis à une pulsion d ' électroporation en utilisant les paramètres décrits ci-dessus. Les cellules ont été laissées reposer à température ambiante pendant 10 min. Les cellules provenant d'une cuvette ont été ajoutées à un puits d'une plaque de 6 puits préchauffée, et la plaque a été basculée d'avant en arrière et ensuite d'un côté à l'autre selon un angle de 45° pour distribuer les cellules uniformément.

Au jour 2 (30 h après 1 ' électroporation) , le surnageant a été recueilli. Une aliquote de 75 μΐ a été prélevée pour une analyse Western blot, 25 μΐ de tampon NuPAGE 4X ont été ajoutés à 1'aliquote (aucun agent réducteur), et l'aliquote a été stockée à -20 degrés C. Le reste du surnageant a été stocké à -80 degrés C.

Les cellules ont été lavées une fois avec du PBS glacé, et ensuite raclées dans 200 μΐ de tampon RIPA contenant un cocktail d'inhibiteurs des protéases (1 comprimé dans 10 ml) tout en conservant la plaque sur de la glace. Le tampon contenant les cellules a été

BE2017/5835 recueilli dans des tubes de microcentrifugeuse, et soumis à deux séries de congélation/décongélation sur de la glace sèche. Les échantillons ont été brièvement passés au vortex, et centrifugés à 8000 tr/min pendant 5 min. Les culots ont été jetés et les surnageants ont été retenus. 25 μΐ de tampon NuPAGE 4X ont été ajoutés à une aliquote de 75 μΐ des lysats pour l'analyse Western blot. Les aliquotes ont été stockées à -20 degrés C. Le reste des lysats a été stocké à -80 degrés C.

Immunoblot μΐ des surnageants des cultures cellulaires et 15 μΐ des lysats cellulaires ont été passés sur un gel SDS-PAGE à 4 à 12 % (Bis-Tris) dans le tampon de migration MOPS IX. Les échantillons séparés ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées pendant 2 à 3 heures dans du PBS-Tween 20 + 5 % de lait. L'anticorps primaire 4G2 de flavivirus a été ajouté à une dilution au 1/120 dans du PBS-T-lait et les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 degrés C. Les membranes ont été ensuite lavées 3 fois pendant 10 minutes à chaque fois dans du PBS-T. Un anticorps secondaire anti-souris (Odyssey® anti-Mouse 800CW-green (LI-COR, Inc., Lincoln, NE) au 1/5000) dans du tampon de blocage LI-COR a été ensuite ajouté, et les membranes ont été incubées pendant 1 heure. Les membranes ont été lavées trois fois pendant 2 minutes à chaque fois, et ensuite lues sur un imageur LI-COR Odyssey® (LI-COR, Inc., Lincoln, NE) au canal 800, intensité moyenne.

Résultats

BE2017/5835

L'expression et la sécrétion de la protéine E du virus Zika sont détectables par immunoblot dans les lysats des cellules électroporées avec les constructions Zika-SAM #5283 (signal du JEV + prME du virus Zika de type sauvage) , #5288 (signal du JEV + prME hybride du virus Zika-JEV) et #8111 (antigène témoin positif) . (Figure 7). L'expression et la sécrétion de la protéine E du virus Zika n'ont pas été détectées dans la construction tronquée à l'extrémité N-terminale (#4974) ou les témoins Mock.

Exemple 6 - Emulsions cationiques huile dans l'eau

Des nanoémulsions cationiques (CNE) ont été préparées essentiellement selon les procédés décrits dans Brito et al., Molecular Therapy, Vol. 22, No. 12, pp. 2118-29 (2014) et la publication de brevet international WO 2013006834.

En bref, du squalène (Sigma, St. Louis, MO) a été chauffé à 37 °C, et de la DOTAP (Lipoid, Ludwigshafen, Allemagne) a été dissoute directement dans le squalène en présence de trioléate de sorbitane (SPAN 85 ; Sigma, St. Louis, MO) . La phase huileuse résultante a été ensuite combinée avec la phase aqueuse (Tween 80 ; Sigma, St. Louis, MO, dans du tampon citrate) et homogénéisée immédiatement pendant 2 min en utilisant un homogénéiseur T25 (IKA, Wilmington, NC) à 24 000 tr/min pour produire une émulsion primaire. Les émulsions primaires ont été passées trois à cinq fois à travers un microfluidiseur

M-110S ou un microfluidiseur M-110P (Microfluidics,

Newton, MA) avec un serpentin de refroidissement de bain de glace à une pression

BE2017/5835 d'homogénéisation d'approximativement 15 000 à 20 000 psi. Les échantillons du lot ont été retirés de l'unité et stockés à 4 °C. La formulation de CNE utilisée dans les présents exemples contient 4 mg/ml de DOTAP ;

4,7 mg/ml de Span 85 ; 4,7 mg/ml de Tween 80 ; et 39 mg/ml de squalène.

Exemple 7 - Préparation des complexes ARN-CNE

1. Synthèse de l'ARN

Les constructions Zika SAM contiennent un promoteur de bactériophage T7 localisé en amont de l'ADNc d'alphavirus pour faciliter la synthèse du réplicon d'ARN in vitro. L'ARN SAM-Zika pour les constructions #5283 (codant pour le signal du JEV + prME du virus Zika) et #5288 (codant pour le signal du JEV + prME hybride du virus Zika-JEV), ainsi que la construction témoin négatif #4974, a été synthétisé en utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire. En bref, l'ADN plasmidique codant pour les constructions Zika-SAM a été linéarisé par digestion avec des endonucléases d'un site unique localisé à l'extrémité 3' de la séquence du réplicon. L'ADN linéarisé a été ensuite transcrit en ARN par synthèse in vitro en utilisant une T7 ARN polymérase en présence de l'ADN matrice et des nucléosides triphosphates (ATP, CTP, GTP et UTP). A la suite de la transcription, l'ADN matrice a été digéré avec une DNase, et les transcrits d'ARN ont été purifiés par précipitation au LiCl et reconstitués dans de l'eau dépourvue de nucléases. L'ARN a été ensuite coiffé en utilisant le système de coiffage de la vaccine (New England BioLabs, Ipswich, MA) et purifié par

BE2017/5835 précipitation au LiCl. La concentration de l'ARN dans chaque réaction a été déterminée par spectrophotométrie. Avant la complexation de l'ARN, l'ARN a été dilué jusqu'à une concentration de 300 pg/ml dans du tampon citrate (10 mM de citrate pH 6,2, 20 mM de NaCl, 560 mM de saccharose).

2. Complexation de l'ARN

L'ARN Zika SAM a été complexé avec des particules de nanoémulsion cationique (CNE) essentiellement comme il est décrit dans Brito et al., Molecular Therapy, Vol. 22, No. 12, pp. 211829 (2014). En bref, l'ARN Zika SAM (300 pg/ml dans du tampon citrate) a été ajouté dans un volume égal aux CNE produites dans l'exemple 6, mélangé, et laissé se complexer sur de la glace pendant 30 minutes à 2 heures. La concentration finale de l'ARN complexé aux CNE était de 150 pg/ml.

Le rapport de l'ARN sur le lipide cationique peut être exprimé en rapport N/P, défini comme la quantité (moles) d'atomes d'azote protonables (N) dans le lipide cationique divisée par la quantité (moles) de phosphates (P) sur l'ARN. La DOTAP, par exemple, a un azote qui peut être protoné par molécule. La concentration de l'ARN a été utilisée pour calculer la quantité de phosphate en solution en utilisant une estimation de 3 nmol de phosphate par microgramme d'ARN. Les formulations de CNE décrites ci-dessus ont un rapport N/P de 6,3/1.

Exemple 8 - Immunogénicité in vivo et protection des formulations de CNE de Zika SAM

L'immunogénicité et la protection des formulations de CNE de Zika SAM ont été examinées chez des souris et des primates non humains (PNH).

I. Etude chez des souris

Des souris BALB/c femelles (âgées de 6 à 12 semaines ; The Jackson Laboratory), ont été logées et

BE2017/5835 élevées dans l'établissement pour animaux du Vaccine

Research Center, NIAID, NIH,

Bethesda, MD. Toutes les expériences animales ont été revues et approuvées par

1'Animal Care and Use

Committee du VRC,

NIAID, NIH.

Tous les animaux ont été logés et soignés conformément aux politiques locales, d'état, fédérales, et institutionnelles dans un établissement accrédité par

1'American Association for

Accreditation of Laboratory

Animal Care au NIH.

Les souris ont été immunisées deux fois selon la conception de l'étude présentée dans le tableau 2 .

En bref, à des groupes de 10 souris, il a été administré à chacune des formulations de

CNE contenant les constructions d'ARN Zika ou la construction d'ARN témoin négatif #4974. Un autre groupe de souris a reçu 50 pg d' un vaccin à base d'ADN codant pour la construction intramusculaire, en tant que témoin positif. Voir Dowd et al., Science, Vol. 354

Issue 6309,

Toutes les souris ont été soumises à une épreuve par virus Zika vivant au jour 49.

Tableau 2

Conception de l'étude chez des souris

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Group e	n	Administration	Constructio n	Immunisatio n Jour 0	Immunisatio n Jour 21	Epreuv e Jour 49
1	1 0	CNE56 / ARN	4974	1,5 pg	1,5 pg	100- PFU, IP
2	1 0	CNES6 / ARN	5288	1,5 pg	1,5 pg	100 PFU, IP
3	1 0	CNE56 / ARN	5283	15 pg	15 pg	100 PFU, IP
4	1 0	CNES6 / ARN	5283	1,5 pg	1,5 pg	100 PFU, .IP
5	1 0	Electroporation / ADN	5283	50 pg	50 pg	100 PFU, !P

Les sérums sanguins ont été recueillis au jour 0, ainsi que 2 semaines après la première immunisation, 2 semaines après la seconde immunisation, et trois jours après l'épreuve avec le virus Zika.

Les titres en anticorps neutralisant le virus Zika ont été mesurés par le test de neutralisation des particules virales rapporteurs (RVP) selon des procédés décrits dans Dowd, KA et al. Cell Rep. 16 (6) : 1485-9 (2016). Les résultats sont présentés sur la figure 8. Deux semaines après la première immunisation avec la construction Zika SAM #5283, ou la construction d'ADN témoin positif, il a été détecté des taux significatifs d'anticorps neutralisant le virus Zika dans les sérums des souris immunisées. Les taux d'anticorps neutralisant le virus Zika ont été même supérieurs deux semaines après

B E2017/5835 la seconde immunisation avec la construction SAM #5283 ou la construction d'ADN témoin positif.

Un effet dépendant de la dose a été observé, avec la dose de 15 pg de la construction Zika SAM #5283 produisant des taux supérieurs d'anticorps neutralisants par rapport à la dose de 1,5 pg. Notamment, la dose de 15 pg de la construction Zika SAM #5283 a produit une réponse en anticorps neutralisants qui a été comparable à la dose de 50 pg du format ADN de la même construction vaccinale (ADN #5283). Ces résultats indiquent que la construction Zika SAM #5283 est capable d'induire une réponse significative en anticorps neutralisants contre le virus Zika. Au jour 49 de l'étude, les souris ont été soumises à une épreuve avec des injections intrapéritonéales du virus Zika vivant (souche PRVABC57) à une dose de 100 unités formant une plaque (PFU) . Des échantillons de sérum ont été prélevés trois jours après l'épreuve, et les charges virales ont été déterminées par une PCR quantitative en temps réel (qPCR) du gène de la capside du virus Zika.

Comme il est représenté sur la figure 9, les souris vaccinées avec la construction Zika SAM #5283 (doses de

1,5 ou 15 pg) ou la construction témoin positif (ADN #5283) ont montré peu ou pas de virus Zika détectable dans le sérum. Au contraire, une charge significative en virus Zika a été détectée chez les animaux non vaccinés, ainsi que chez les animaux vaccinés avec la construction Zika SAM 5288 ou la construction témoin négatif #4974. Ces résultats indiquent que la construction Zika SAM #5283 est capable de produire une réponse immunitaire protectrice contre une infection par le virus Zika.

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II· Etude chez des primates non humains (PNH)

L'immunogénicité des constructions Zika SAM a été évaluée chez des primates non humains (PNH). Des macaques rhésus ont été immunisés deux fois selon la conception de l'étude présentée dans le tableau 3. En bref, des formulations de CNE-ARN SAM-Zika ont été préparées comme il a été décrit dans l'exemple 7, A des groupes de 8 PNH, il a été administré à chacun soit le placebo (solution tampon phosphate) soit une formulation de CNE contenant une construction SAM optimisée pour les codons, Co.prME, codant pour l'antigène prME natif du virus Zika (groupe 2, 75 pg x 2 ; comme il est décrit dans le document PCT/IB2017/053242, déposé le 1er juin 2017) ; ou la construction Zika SAM #5283 (groupe 3 ; 75 pg x 2} . Un autre groupe de PNH (groupe 4 ; n = 8) a reçu

deux immunisations	(4 mg	chacune) d1	un vaccin à	base
d'ADN codant pour	la	construction	#5283 par	voie
intramusculaire par	un	dispositif	d'injection	sans
aiguille (PharmaJet)	, en	tant que témoin positif.	Voir

Dowd et al., Science, Vol. 354 Issue 6309, pp. 237-40 (2016) . Tous les animaux ont été soumis à une épreuve par injection intrapéritonéale (i.p.) de virus Zika vivant (1000 PFU) 8 semaines après la première immunisation.

Tableau 3

Groupe	Vaccin	Taille du groupe	Vaccination Semaine 0	Rappel Semaine 4	Epreuve Semaine 8
1	Placebo	8	PBS	PBS	1000 PFU ZIKV
2	Co.prME SAM	8	7 5 pg	75 pg	1000 PFU ZIKV
3	SAM #5283	8	75 pg	75 pg	1000 PFU ZIKV
4	ADN #5283	8	4 mg	4 mg	1000 PFU ZIKV

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Des échantillons de sérum sanguin ont été recueillis au jour 0, ainsi que 4 et 8 semaines après la première immunisation ; à chacun des jours 3 à 7 après l'épreuve avec le virus Zika ; et aux semaines 8, 10 et 12 après l'épreuve avec le virus Zika. Les titres en anticorps neutralisant le virus Zika ont été mesurés par le test de neutralisation des particules virales rapporteurs (RVP) selon des procédés décrits dans Dowd, KA et al. Cell Rep. 16(6): 1485-9 (2016).

Les résultats de l'immunogénicité présentés sur la figure 10 démontrent que les anticorps neutralisant le virus Zika ont été significativement élevés quatre semaines après la première immunisation avec* la construction Zika SAM #5283 comparativement au placebo, avec des titres encore augmentés 4 semaines après la seconde immunisation. L'ADN de virus Zika #5283 a déclenché des titres similaires en anticorps neutralisants à 4 et 8 semaines. La construction ZikaSAM Co.prME SAM a produit significativement moins d'anticorps neutralisants comparativement à l'ADN #5283 après une seule dose, mais des titres similaires après deux injections.

Dans la semaine 8 de l'étude, les PNH ont été soumis à une épreuve avec des injections intrapéritonéales de virus Zika vivant (souche PRVABC57) à une dose de 1000 unités formant une plaque (PFU). Les charges virales après 1¹ épreuve ont été déterminées par PCR quantitative en temps réel (qPCR) du gène de . la capside du virus Zika.

Comme il est montré sur la figure 11, les animaux qui ont reçu le placebo ont présenté une virémie élevée

B E2017/5835 aussi tôt que 3 jours après l'épreuve (A). La vaccination avec la construction Zika-SAM #5283 (B), ainsi que les témoins positifs Zika-SAM Co.prME (C) et ADN #5283 (D), a été protectrice contre une virémie par le virus Zika, avec la construction Zika-SAM #5283 présentant une protection complète contre la virémie par le virus Zika.

En conformité avec les résultats de la virémie, les animaux qui ont reçu le placebo ont présenté une augmentation brusque des anticorps neutralisants après l'épreuve avec le virus Zika, confirmant en outre une infection par le virus Zika chez ces animaux (figure 12) . Deux animaux dans le groupe SAM Co.prME, et un animal dans le groupe ADN #5283, ont également présenté des titres élevés en anticorps neutralisants après l'épreuve, indiquant que la protection n'était pas stérilisante chez ces animaux. Au contraire, les animaux dans le groupe Zika SAM #5283 n'ont pas présenté des anticorps neutralisants élevés après l'épreuve avec le virus Zika, indiquant qu'il a été obtenu une protection stérilisante chez tous les sujets.

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Claims (15)

REVENDICATIONS

1 ' une quelconque des revendications 26

31, comprenant en outre une étape de combinaison de l'ARN comprenant la région codante pour l'antigène avec une composition supplémentaire comprenant un adjuvant.

33. Procédé selon la revendication 32, dans lequel ledit adjuvant comprend un immunostimulant.

34. Composition produite par le procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 33.

35. Utilisation de la construction selon les revendications 1 à 9 r du vecteur selon la revendication 10 r de la molécule d'ARN s ' auto- répliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou d ' une composition selon Les revendications 14 à 22 pour l'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet. 36. Utilisation de la construction selon les revendications 1 à 9 r du vecteur selon la

revendication 10 ; de la molécule d'ARN s'autorépliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou d'une

BE2017/5835 composition selon les revendications 14 à 22 dans la fabrication d'un médicament qui induit une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.

1. Construction de vaccin à base d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant un antigène prME de virus Zika ou l'un de ses fragments immunogènes ou variants.

2. Construction selon la revendication 1, dans laquelle ledit acide nucléique est un ARN comprenant la région codante pour l'antigène.

3. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, où la construction code pour une séquence signal.

4. Construction selon la revendication 3, dans laquelle la séquence signal est une séquence signal hétérologue de flavivirus.

5 37. Construction selon les revendications 1 à 9 ;

vecteur selon la revendication 10 ; molécule d'ARN s ' auto-répliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou composition selon les revendications 14 à 22 pour une utilisation en thérapie.

5. Construction selon la revendication 4, dans laquelle la séquence signal hétérologue de flavivirus est une séquence signal du JEV.

6. Construction selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans laquelle la séquence signal comprend SEQ ID NO : 5.

7. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'antigène prME du virus Zika comprend une protéine E hybride du virus ZikaJEV.

8. Construction selon la revendication 7, dans laquelle la protéine E hybride du virus Zika-JEV comprend la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 27.

9. Construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, où ladite construction comprend

BE2017/5835 une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué de :

(a) une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 19 ou SEQ ID NO : 24 ;

(b) une séquence d'acide nucléique comprenant la séquence d'ADN de SEQ ID NO : 18 ou SEQ ID NO : 23 ;

(c) une séquence d'acide nucléique comprenant la séquence d'ARN de SEQ ID NO : 39 ou SEQ ID NO : 40 ; et (d) un variant ou un fragment de (a) à (c).

10 38. Construction selon les revendications 1 à 9 ;

vecteur selon la revendication 10 ; molécule d'ARN s'auto-répliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou composition selon les revendications 14 à 22 pour une utilisation dans un procédé d'induction d'une réponse

10. Vecteur comprenant la construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.

11. Molécule d'ARN s'auto-répliquant comprenant la construction selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.

12. Molécule d'ARN s'auto-répliquant codant pour un antigène comprenant une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37.

13. Molécule d'ADN codant pour la molécule d'ARN s'auto-répliquant selon les revendications 11 ou 12 comprenant une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34.

14. Composition comprenant une quantité immunologiquement efficace d'une ou de plusieurs des constructions selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ; du vecteur selon la revendication 10 ; ou de la molécule d'ARN s'autorépliquant selon les revendications 11 ou 12.

15. Composition selon la revendication 14 comprenant un vaccin à base d'ARN.

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16. Composition selon la revendication 15 comprenant une molécule d'ARN s'auto-répliquant.

17. Composition selon la revendication 16, dans laquelle la molécule d'ARN s'auto-répliquant comprend une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37.

18. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, où la composition comprend un matériau d'administration non viral, tel qu'une émulsion cationique huile dans l'eau submicronique ; un liposome ; ou un système d'administration de microparticules polymères biodégradables.

19. Composition selon la revendication 18, dans laquelle l'émulsion cationique huile dans l'eau submicronique comprend un noyau d'huile, un lipide cationique, et un tensioactif.

20. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 19 où la composition comprend en outre une ou plusieurs séquences d'acide nucléique qui codent pour un ou plusieurs antigènes supplémentaires et/ou la composition comprend en outre un ou plusieurs antigènes supplémentaires.

21. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 20 où la composition est pharmaceutiquement acceptable pour une administration à un sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un acide nucléique comprenant une séquence qui code pour un antigène supplémentaire ; et/ou la composition est pharmaceutiquement acceptable pour une administration au sujet en combinaison avec une autre composition qui comprend un antigène supplémentaire.

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22. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 21 où la composition comprend un ou plusieurs adjuvants.

23. Procédé d'induction d'une réponse immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet en ayant besoin, qui comprend l'administration au dit sujet d'une quantité immunologiquement efficace d'une composition comprenant un(e) ou plusieurs d'une construction selon les revendications 1 à 9 ; du vecteur selon la revendication 10 ; de la molécule d'ARN s'autorépliquant selon les revendications 11 ou 12 ; ou d'une composition selon les revendications 14 à 22.

24. Procédé selon la revendication 23, dans lequel la réponse immunitaire est caractérisée par une mémoire immunologique contre le virus Zika et/ou une population

de lymphocytes T à mémoire efficaces et sensibles au virus Zika. 25. Procédé selon 1'une quelconque des revendications 23 ou 24, dans lequel le sujet est humain.

26. Procédé de production d'un vaccin à base d'ARN comprenant une étape de transcription du vecteur selon la revendication 10 ou de l'ADN selon la revendication 13 pour produire un ARN comprenant une région codante pour l'antigène.

27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel ladite transcription est in vitro.

28. Procédé selon la revendication 26, dans lequel ladite transcription est in vivo.

29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, comprenant en outre une étape de formulation de l'ARN comprenant la région codante pour l'antigène avec un système d'administration.

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30. Procédé selon la revendication

29, dans lequel le système d'administration est un matériau d'administration non viral.

31. Procédé selon la revendication

30, dans lequel le système d'administration est choisi dans le groupe constitué de : une émulsion cationique huile dans 1'eau submicronique ;

un liposome ; et un système d'administration de microparticules polymères biodégradables.

32. Procédé selon

15 immunitaire contre une infection par le virus Zika chez un sujet.