BE1024139B1 - Appareil pour le prélèvement de cellules souches adipeuses - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un appareil pour le prélèvement et l’isolation de cellules souches adipeuses, ledit kit d’éléments comprenant une unité de liposuccion (10) comprenant une canule (4) allongée soumise à un mouvement vibrationnel particulier dont le lumen est relié à une unité de séparation par l’intermédiaire d’une pompe à vide (5a), ladite unité de séparation comprenant une unité de filtrage comprenant : (A) Un filtre grossier (4g), ayant des ouvertures de diamètre moyen compris entre 30 et 120 µm, et, (B) Un filtre fin (4f) situé en aval, du côté filtrat du filtre grossier, ayant des ouvertures de diamètre moyen au moins deux fois plus petit que le diamètre moyen du filtre grossier.

Description

APPAREIL POUR LE PRÉLÈVEMENT DE CELLULES SOUCHES ADIPEUSES DOMAINE DE L’INVENTION

[0001] L’invention se rapporte à un appareil permettant d’extraire des cellules adipeuses et d’en isoler des cellules souches en excellent état et rapidement. L’appareil permet une préisolation d’un volume important de cellules souches d’origine adipeuse dans un circuit fermé et isolé de l’extérieur, diminuant ainsi les risques de contamination des cellules souches.

ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE

[0002] Les cellules mésenchymateuses sont des cellules souches présentes dans le mésenchyme de l'embryon. Par exemple, elles sont présentes dans le sang des cordons ombilicaux Elles sont capables de se différencier en de nombreux types cellulaires comme les ostéoblastes (cellules osseuses), les chondrocytes (cellules cartilagineuses), myocytes (cellules musculaires), andadipocytes (cellules graisseuses). Elles sont également présentes en plus faibles quantités dans divers tissus de l'organisme adulte tels que la moelle osseuse, les tissus adipeux, ou encore le fluide amniotique. D’autres sources de cellules souches chez l’adultes sont explorées. Les tissus adipeux semblent être une des sources les plus riches de cellules souches. Sauf indiqué autrement dans le texte, lorsqu’on parle de « cellules souches » ci-après, on se réfère à des « cellules souches mésenchymateuses d’origine adipeuse.» [0003] Les cellules adipeuses comprennent de nombreuses cellules incluant des adipocytes blancs uniloculaires, des adipocytes bruns multiloculaires qui, ensemble représentent le parenchyme, ainsi que d’autres cellules constituant la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux incluant des fibroblastes, des macrophages, des cellules sanguines et endothéliales, et des cellules souches mésenchymateuses. Les adipocytes blancs uniloculaires constituent environ 95% du tissu adipeux et sont des cellules de diamètre généralement compris entre 100 à 150 pm. Leur cytoplasme est entièrement occupé par des triglycérides tandis que leur noyau se trouve en périphérie contre la membrane. Les adipocytes blancs sécrètent un grand nombre de peptides (des « adipokynes ») comme la résistine, la leptine, hormone régulant l'appétit et la satiété (hormone anorexigène) et l'apeline. Les adipocytes blancs assurent la synthèse, le stockage et la libération des lipides.

[0004] Les adipocytes bruns multiloculaires sont des cellules de diamètre de l’ordre de 30 pm. Ils contiennent de nombreuses gouttelettes lipidiques. Ce sont les cellules de l'hibernation qui participent à la thermogenèse qui est accomplie par phosphorylation d'acide gras dans les nombreuses mitochondries riches en cytochrome, donnant sa couleur brune à la cellule. Ces cellules sont en rapport avec des terminaisons nerveuses β-adrénergique. La présence d'adipocytes bruns chez l'homme adulte a été mise en évidence depuis 2009 [0005] L’isolation des cellules souches présentes dans les tissus adipeux est souvent longue et complexe, nécessitant de nombreuses manipulations avec de nombreux équipements, réactifs ou enzymes. Les techniques d’isolation comprennent par exemple une étape de séparation par gradient de densité, par centrifugation, séparation des cellules non adhérentes à des substrats spécifiques ou digestion enzymatique (par exemple avec de la collagénase). Une fois isolées, les cellules souches peuvent alors être cultivées afin d’en augmenter le nombre.

[0006] WO2011146924 décrit un système d’extraction de cellules adipeuses à travers une canule soumise à une vibration ultrasonique. Les cellules adipeuses ainsi prélevées dans un récipient peuvent être filtrées pour séparer les adipocytes de plus grosse taille du reste du prélèvement. Plusieurs filtres successifs de tailles comprises entre 200 et 800 pm peuvent être agencés en série pour optimiser l’opération de séparation. Lors de l’extraction de tissus adipeux par liposuccion, y compris ultrasonique, les cellules adipeuses et, en particulier les adipocytes blancs et bruns, sont souvent extraits sous forme d’agglomérats de taille importante composés de diverses cellules, qui sont souvent endommagées après extraction, provoquant la nécrose de nombreuses cellules.

[0007] WO2014033209 décrit que l’utilisation d’un appareil de liposuccion du type décrit dans W09844966 et US6336925 comprenant une canule creuse dont l’extrémité libre est soumise à un mouvement d’oscillation de type « nutation » comprenant une composante parallèle à l’axe de la canule et une composante orbitale permettait de prélever des tissus adipeux en endommageant sensiblement moins les cellules prélevées.

[0008] Qu’un appareil de liposuccion ultrasonique ou de nutation soit utilisé dans le procédé décrit dans WO2011146924, il n’en demeure pas moins que le niveau d’isolement des cellules ainsi obtenu reste souvent fort grossier et insuffisant et les cellules ainsi séparées doivent ensuite être traitées par des méthodes d’isolation conventionnelles et longues.

[0009] Il demeure donc un besoin d’un système permettant le prélèvement de tissus adipeux et d’isolation ou, en tout cas de pré-isolation, des cellules souches présentes dans les tissus prélevés en un temps court, ne nécessitant pas de nombreuses manipulations et pouvant être effectuées en circuit fermé. La présente invention propose une solution à ce problème. Les caractéristiques et avantages de la présente invention sont décrits dans la suite.

RÉSUMÉ DE L’INVENTION

[0010] L’invention est telle que définie dans la revendication principale et des variantes préférées sont définies dans les revendications dépendantes. La présente invention comporte notamment un kit d’éléments destiné à être utilisé dans le prélèvement et l’isolation de cellules souches adipeuses, ledit kit d’éléments comprenant : (A) Une unité de liposuccion comprenant : (a) Une poignée permettant la manipulation de l’appareil, (b) Un organe d’entraînement agencé préférablement dans ladite poignée et permettant de transmettre à un moyen de couplage un mouvement réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, à une fréquence, f, et une amplitude, A; (c) Une canule allongée ayant une longueur, L, et un diamètre extérieure, D, et comprenant un lumen s’étendant d’une ou plusieurs ouvertures d’entrée situées à une première extrémité de la canule, qui est libre à un orifice de sortie situé à une deuxième extrémité adaptée pour être couplée solidairement au moyen de couplage relié à l’organe d’entraînement, de sorte que la canule soit sensiblement parallèle à l’axe longitudinal, Z; (B) Une pompe à vide destinée à créer un vide dans le lumen de la canule pour le prélèvement de matière extraite comprenant des cellules adipeuses, (C) Une unité de séparation comprenant un récipient contenant une unité de filtrage permettant de séparer différentes phases de la matière extraite, (D) Un ensemble de tubes permettant de connecter par voie fluide le lumen de la canule au récipient, et le récipient à la pompe à vide ;

Caractérisé en ce que, l’unité de filtrage comprend : (E) Un filtre grossier, ayant des ouvertures de diamètre hydraulique grossier moyen, Dhg=4Ag/Pg, compris entre 30 et 120 pm, et ayant un côté rétentat permettant de retenir des cellules adipeuses et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de taille plus petite que le diamètre hydraulique grossier moyen, Dhg, ayant traversé le filtre grossier et, (F) Un filtre fin situé en aval, du côté filtrat du filtre grossier, ayant des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhf = 4Af / Pt, qui est au moins deux fois plus petit que le diamètre hydraulique moyen, Dhg, des ouvertures du filtre grossier et ayant un côté rétentat permettant de retenir des cellules souches ayant traversé le filtre grossier et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre fin et, dans lequel

Dh est le diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, A est l’aire moyenne des ouvertures, P est le périmètre moyen des ouvertures, et les indices f et g se réfèrent aux filtres fin et grossier, respectivement.

[0011] Le mouvement transmis par l’organe d’entraînement à la première extrémité libre de la canule définit de préférence un mouvement de nutation comprenant : • une composante longitudinale de translation réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, et

• une composante orbitale de rotation autour de l’axe longitudinal, Z

[0012] La fréquence, f, du mouvement réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, du moyen de couplage et de la composante longitudinale de la première extrémité libre de la canule est de préférence comprise entre 1 et 40 Hz, de préférence entre 5 et 20 Hz. L’amplitude, A, de cette même composante est de préférence comprise entre 0.4 et 40 mm, de préférence entre 1.0 et 20.0 mm, de manière plus préférée entre 2.0 et 10.0 mm, et encore plus préférablement entre 4.0 et 8.0 mm. La composante orbitale de rotation de la première extrémité de la canule en l’absence de contraintes externes est de préférence sensiblement circulaire ou elliptique et caractérisée par un grand diamètre, 2xR, de longueur comprise de préférence entre 1 et 20 mm.

[0013] L’organe d’entraînement peut être pneumatique ou électrique. Un organe électrique peut comprendre : (a) un tube creux comprenant le moyen de couplage à la canule et monté en translation le long de son axe dans une cavité de la poignée et comprenant un ou plusieurs aimants distribués le long du tube creux, (b) une ou plusieurs bobines entourant le tube creux et le ou les aimants, lesdites bobines étant reliées à un générateur de courant alternatif dont la fréquence est de préférence variable.

[0014] Dans une forme de réalisation préférée de l’invention, le filtre grossier a un diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, Dhg, compris entre 50 et 100 pm, de préférence entre 60 et 90 pm et est de préférence amovible, permettant de le retirer du récipient. Un tel filtre permet de retenir du côté rétentat les adipocytes présents dans les cellules adipeuses. Le filtre fin a lui de préférence un diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, Dhf, compris entre 4 et 20 pm, de préférence entre 5 et 10 pm et est de préférence amovible, permettant de le retirer du récipient. Un tel filtre permet de retenir du côté rétentat les cellules souches.

[0015] Dans une variante préférée, l’unité de filtrage comprend de plus un filtre intermédiaire) positionné entre le filtre grossier et le filtre fin, et ayant des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhi = 4Ai / Pt, caractérisé en ce que Dhf < Dhi < Dhg, et où l’indice i se réfère au filtre intermédiaire. Un tel filtre permet d’utiliser un filtre grossier d’ouvertures plus grandes, afin de retenir principalement les adipocytes blancs qui sont de plus grande taille, alors que les adipocytes bruns, ayant passé le filtre grossier, sont alors retenus par le filtre intermédiaire. Par exemple, • Le filtre grossier (4f) peut avoir des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dha, compris entre 70 et 100 pm, de préférence entre 75 et 95 pm, permettant de retenir les adipocytes blancs ; • Le filtre intermédiaire (4i) peut avoir des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhi, compris entre 15 et 40 pm, de préférence entre 20 et 35 pm , permettant de retenir les adipocytes bruns ; • Le filtre fin (4f) peut avoir des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhf, compris entre 4 et 12 pm, de préférence entre 5 et 10 pm, encore de préférence entre 7 et 9 pm, permettant de retenir les cellules souches.

[0016] L’opération de séparation des différents types de cellules adipeuses est facilitée si les cellules à séparer sont entraînées par un fluide à travers les divers filtres. Pour cette raison, il est préférable de coupler fluidiquement une solution de rinçage au côté rétentat du filtre grossier permettant de rincer les cellules adipeuses retenues par le filtre grossier et les cellules souches retenues par le filtre fin. Une telle solution est de préférence une solution physiologique.

[0017] Les différents éléments du kit de la présente invention sont reliés entre eux par des tubes qui permettent lors de toute l’opération d’isoler les cellules adipeuses de l’atmosphère environnant. En particulier, • l’unité de séparation comprend un tube d’extraction reliant par voie fluide le lumen de la canule au côté rétentat du filtre grossier dans le récipient ; et • la pompe à vide est reliée par voie fluide par un tube de vide au récipient et, et par le récipient et le tube d’extraction, au lumen de la canule, ce qui crée la dépression nécessaire à l’extraction des cellules adipeuses d’un patient.

[0018] Le tube de vide est de préférence couplé au récipient, soit du côté filtrat, en aval du filtre fin soit du côté rétentat, en amont du filtre grossier et de préférence à un couvercle du récipient.

[0019] Afin de ne jamais exposer les cellules adipeuses extraites et séparées, en particulier les cellules souches ainsi isolées, l’unité de séparation peut comprendre de plus une unité d’isolation comprenant : (a) un récipient cylindrique fermé à une extrémité amont par un plateau d’étanchéité du filtre grossier et à l’autre extrémité avale par un plateau d’étanchéité du filtre fin formant ainsi un logement, les plateaux d’étanchéité comprenant des ouvertures reliant une surface externe à une surface interne de chaque plateau ; (b) un premier plateau situé dans le logement et soutenant le filtre grossier dans des ouvertures agencées dans celui-ci et un second plateau situé dans le logement et soutenant le filtre fin dans des ouvertures agencées dans celui-ci, le premier plateau étant en contact étanche avec le plateau d’étanchéité du filtre grossier et le second plateau étant en contact étanche avec le plateau d’étanchéité du filtre fin, de sorte qu’une rotation des premier et second plateaux relative aux plateaux d’étanchéité des filtres grossier et fin, respectivement permette d’amener l’unité d’isolation alternativement: (c) dans une configuration de filtrage, dans laquelle les ouvertures des plateaux d’étanchéité des filtres grossier et fin fassent face aux ouvertures contenant les filtres grossier et fin, respectivement, et (d) dans une configuration étanche, dans laquelle le logement est isolé de l’atmosphère ambiant et dans lequel aucune des ouvertures des plateaux d’étanchéité des filtres grossier et fin ne fasse face à aucune des ouvertures contenant les filtres grossier et fin, respectivement.

[0020] Les premier et second plateaux d’étanchéité peuvent être montés à rotation par rapport au récipient cylindrique et aux plateaux supportant les filtres grossier et fin qui sont eux montés rigidement par rapport au récipient cylindrique. A l’inverse, les premier et second plateaux d’étanchéité peuvent être montés rigidement par rapport au récipient cylindrique et les plateaux supportant les filtres grossier et fin sont eux montés à rotation par rapport au récipient cylindrique et aux premier et second plateaux d’étanchéité. Un moteur peut induire une vibration de rotation réciproque aux plateaux montés à rotation afin de favoriser l’utilisation des filtres, par un effet de tamisage.

[0021] La présente invention concerne également un procédé pour isoler des cellules souches contenues dans un prélèvement de cellules adipeuses, ledit procédé comprenant les opérations suivantes : (a) Recueillir un prélèvement de cellules adipeuses comprenant des cellules souches dans un filtre grossier dont les ouvertures ont un diamètre hydraulique moyen, Dhg = 4Ag / Pg, compris entre 30 et 120 pm, agencé dans un récipient et ayant un côté rétentat permettant de retenir les cellules adipeuses de taille supérieure à Dhg et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre grossier, (b) Recueillir les liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre grossier dans un filtre fin positionné en aval du filtre grossier et ayant un côté rétentat permettant de retenir des cellules souches et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre fin dont les ouvertures ont un diamètre hydraulique moyen, Dhf = 4Af/Pf, qui est au moins deux fois plus petit que le diamètre hydraulique moyen, DHg, des ouvertures du filtre grossier, dans lequel Dh est le diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, A est l’aire moyenne des ouvertures, P est le périmètre moyen des ouvertures, et les indices f et g se réfèrent aux filtres fin et grossier, respectivement, et (c) Récupérer les cellules souches retenues dans le coté rétentat du filtre fin.

[0022] Les cellules adipeuses retenues du côté rétentat du filtre grossier, sont de préférence rincées par un liquide de rinçage. Les liquides et solides de petites tailles, y compris des cellules souches, ainsi détachés des cellules adipeuses sont entraînées à travers les ouvertures du filtre grossier, vers le filtre fin.

[0023] La présente tel que défini supra pour l’isolation de cellules souches adipeuses.

BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

[0024] Ces aspects ainsi que d’autres aspects de l’invention seront clarifiés dans la description détaillée de modes de réalisation particuliers de l’invention, référence étant faite aux dessins des figures, dans lesquelles :

Fig.1 illustre une variante d’un appareil selon l’invention.

Fig.2 illustre une variante alternative d’un appareil selon l’invention.

Fig.3 représente trois variantes d’unités de séparation comprenant deux filtres adaptées à la présente invention. .Fig.4 représente trois variantes d’unités de séparation comprenant trois filtres adaptées à la présente invention.

Fig.5 représente deux variantes d’unités de séparation comprenant (a) deux filtres et (b) trois filtres, adaptées à la présente invention et montrant le principe de fonctionnement.

Fig.6 illustre une unité de séparation comprenant une unité d’isolation des cellules souches (a) en position de filtrage et (b) en position étanche.

Fig.7 illustre une unité d’isolation des cellules souches (a) en position de filtrage et (b) en position étanche.

Fig.8 illustre deux variantes de mouvements de nutation de l’extrémité libre de la canule.

Fig.9 montre un exemple d’organe d’entraînement électrique.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS

[0025] Tel que représenté aux Figures 1 &amp; 2, un appareil selon la présente invention consiste en l’assemblage de plusieurs éléments. L’appareil comprend une unité de liposuccion (10) comprenant : (a) Une poignée (1) permettant la manipulation de l’appareil, (b) Un organe d’entraînement (32) agencé préférablement dans ladite poignée et permettant de transmettre à un moyen de couplage (2c) un mouvement réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, à une fréquence, f, et une amplitude, A; et (c) Une canule (4) allongée ayant une longueur, L, et un diamètre extérieure, D, et comprenant un lumen s’étendant d’une ou plusieurs ouvertures d’entrée (11) situées à une première extrémité (41) de la canule, qui est libre à un orifice de sortie situé à une deuxième extrémité (42) adaptée pour être couplée solidairement au moyen de couplage (2c) relié à l’organe d’entraînement (32), de sorte que la canule soit sensiblement parallèle à l’axe longitudinal, Z.

[0026] L’appareil comprend également, d’une part, une pompe à vide (5a) destinée à créer un vide dans le lumen de la canule pour le prélèvement de tissus adipeux et, d’autre part, une unité de séparation comprenant un récipient (4) contenant une unité de filtrage permettant de séparer différentes phases des tissus adipeux ainsi extraits. Un ensemble de tubes permet de connecter fluidiquement le lumen de la canule au récipient par un tube d’extraction (3t), et le récipient à la pompe à vide par un tube de vide (5t). Lorsque l’unité de liposuccion, la pompe à vide et le récipient sont reliés les uns aux autres par le tube d’extraction et le tube de vide, l’appareil est opérationnel. La pompe à vide est actionnée, créant une dépression dans le lumen de la canule (4) ce qui, lorsque la canule est insérée à travers une incision sous la peau d’un patient, permet d’aspirer des tissus adipeux à travers le lumen, le tube d’extraction (3t) pour finir dans le récipient (4) à travers l’unité de filtrage.

[0027] L’appareil de la présente invention se distingue des appareils connus, notamment celui décrit dans WO2011146924, en ce que les filtres utilisés sont beaucoup plus fins. En particulier, alors que dans WO2011146924 des filtres successifs de tailles comprises entre 200 et 800 pm sont utilisés, l'unité de filtrage d’un appareil selon la présente invention comprend un filtre grossier (4g), ayant des ouverture de diamètre hydraulique grossier moyen, Dhg, compris entre 30 et 120 pm, de préférence entre 50 et 100 pm, encore de préférence entre 60 et 90 pm, et un filtre fin (4f) ayant des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhf = 4Af / Pf, qui est au moins deux fois plus petit que le diamètre hydraulique moyen, Dhg, où Dh est le diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, A est l’aire moyenne des ouvertures, P est le périmètre moyen des ouvertures, et les indices f et g se réfèrent aux filtres fin et grossier, respectivement. Le filtre fin a des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhf, compris de préférence entre 4 et 20 pm, encore de préférence entre 5 et 10 pm.

[0028] Le filtre grossier (4g) a un côté rétentat permettant de retenir des cellules adipeuses et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de taille plus petite que le diamètre hydraulique grossier moyen, Dhg, ayant traversé le filtre grossier. Comme illustré aux Figures 3 et 5(a), le filtre fin (4f) est situé en aval, du côté filtrat du filtre grossier et, comme le filtre grossier, il a un côté rétentat permettant de retenir des cellules souches ayant traversé le filtre grossier et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre fin.

[0029] Contrairement à l’appareil décrit dans WO2011146924 qui fait vibrer l’extrémité libre de la canule à des fréquences ultrasoniques, la fréquence, f, du mouvement réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, du moyen de couplage (2) et donc de la canule d’une unité de liposuccion selon la présente invention est de préférence comprise entre 1 et 40 Hz, de préférence entre 5 et 20 Hz. L’amplitude, A, de ce mouvement peut être comprise entre 0.4 et 40 mm, de préférence entre 1.0 et 20.0 mm, de manière plus préférée entre 2.0 et 10.0 mm, et encore plus préférablement entre 4.0 et 8.0 mm (voir Figures 8 et 9). Il a été observé que les fréquences ultrasoniques peuvent créer plus de dommages aux tissus adipeux aspirés que des fréquences plus basses.

[0030] Afin de préserver encore mieux l’intégrité des cellules extraites des tissus adipeux, il est préférable que le mouvement transmis par l’organe d’entraînement à la première extrémité (41) libre de la canule définisse un mouvement de nutation tel qu’illustré à la Figure 8, comprenant : • une composante longitudinale de translation réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, ayant de préférence une fréquence, f, et une amplitude, A, telle que décrite supra, et • une composante orbitale de rotation autour de l’axe longitudinal, Z.

[0031] Dans un mode de réalisation préféré, la composante orbitale de la première extrémité de la canule en l’absence de contraintes externes est sensiblement elliptique caractérisée par un grand diamètre, 2 x R, de longueur comprise entre 1 et 20 mm [0032] Sur base de tests effectués, ce type d’unité de liposuccion garantit la meilleure intégrité des cellules extraites, car le mouvement de nutation de la première extrémité libre de la canule semble désolidariser de manière douce les différentes cellules formant les tissus adipeux et permet d’aspirer des cellules individuelles ou des agglomérats de cellules de petite taille à travers le lumen qui sont recueillies dans le récipient avec un niveau d’intégrité très élevé, permettant d’éviter la nécrose de nombreuses cellules qui n’est pas toujours détectable car n’intervenant qu’après quelques jours.

[0033] La Figure 2 illustre une variante préférée de l’invention qui est semblable à la variante de la Figure 1 comprenant de plus, une source d’une solution de rinçage (6) directement couplée fluidiquement à l’aide d’un tube de rinçage (6t) au côté rétentat du filtre grossier (4g). Comme illustré à la Figure 5(a), la solution de rinçage (6) permet de rincer les cellules des tissus adipeux alors qu’ils pénètrent dans le récipient (4) et, en particulier, les cellules adipeuses retenues par le filtre grossier et les cellules souches retenues par le filtre fin (4f). Le flux de la solution de rinçage peut être contrôlé par une valve (6v) ou une pompe (non illustrée) située entre la source de liquide de rinçage et le récipient (4). La solution de rinçage peut simplement être une solution physiologique ou toute autre solution permettant la séparation d’une fraction des cellules souches présente parmi les adipocytes pour les entraîner à travers le filtre grossier (4g) (voir Figure 5(a)).

[0034] La Figure 3(a) à (c) illustre trois exemples d’unités de séparation susceptibles d’être utilisées dans la présente invention. Dans la partie supérieure, les éléments de l’unité sont illustrés séparément et dans la partie inférieure, les éléments sont représentés assemblés, formant chaque fois une variante d’une unité de séparation. Dans les trois exemples illustrés à la Figure 3, les filtres grossier (4g) et fin (4f) sont amovibles, permettant de les retirer facilement du récipient (4). Les filtres grossier et fin peuvent être introduits dans le récipient qui est fermé hermétiquement par un couvercle (4c). Celui-ci peut comprendre des moyens de couplages (43, 45, 46) du récipient à un tube (3t, 5t, 6t). Dans la Figure 3(a) le couvercle (4c) comprend trois moyens de couplages. Un premier moyen de couplage (43) pour coupler le récipient à un tube d’extraction (3t) et à l’unité d’extraction, un second moyen (45) pour coupler le récipient à un tube de vide (5t) et à une pompe à vide pour créer une dépression dans le récipient et dans la canule de l’unité d’extraction, et un troisième moyen (46) pour coupler le récipient à un tube de rinçage et à une source de liquide de rinçage (6). Dans les variantes (b) et (c) de la Figure 3, le couvercle (4c) ne comprend pas de moyen de couplage (45) pour connecter le récipient à une pompe à vide, car un tel moyen est agencé à une paroi du récipient même, de préférence en aval, donc du côté filtrat, du filtre fin (4f), Ainsi, la pompe à vide aspire les cellules des tissus adipeux à travers les filtres grossier et fin. Dans la Figure 3(c), le moyen de couplage (45) à une pompe à vide correspond à l’ouverture d’évacuation (4o) permettant l’évacuation des liquides et solides très fins (53) ayant traversé le filtre fin et se trouvant du côté filtrat de celui-ci. Contrairement aux variantes (a) et (b) de la Figure 3, l’ouverture d’évacuation (4o) dans la variante (c) ne doit pas nécessairement comprendre une valve d’évacuation (4v).

[0035] Dans un mode de réalisation de l’invention, illustré aux Figures 4 et 5(b), outre un filtre grossier (4g) et un filtre fin (4f), l’unité de séparation comprend un filtre intermédiaire (4i) positionné entre le filtre grossier (4g) et le filtre fin (4f). Le filtre intermédiaire (4i) a des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhi = 4Ai / Pi, caractérisé en ce que Dhf < Dhi < Dhg, et où l’indice i se réfère au filtre intermédiaire. La présence d’un fultre intermédiaire permet d’utiliser un filtre grossier ayant des ouvertures de plus grandes dimensions que dans le cas d’un système à deux filtres et donc d’optimiser la séparation des cellules selon leurs tailles. Par exemple, comme illustré à la Figure 5(b), le filtre grossier (4g) peut être dimensionné pour retenir de son côté rétentat notamment les adipocytes blancs (52). Le filtres intermédiaire (4i) peut être dimensionné pour retenir de son côté rétentat notamment les adipocytes bruns (51). Enfin, le filtre fin (4f) sert à retenir les cellules souches (50) qui sont de plus petite taille que les adipocytes, tout en laissant passer les fines et les liquides (53).

[0036] Par exemple dans le cas d’une unité de séparation comprenant trois filtres, le filtre grossier (4f) peut avoir des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhg, compris entre 70 et 100 pm, de préférence entre 75 et 95 pm afin de retenir les adipocytes blancs (52) et laisser passer les adipocytes bruns, les liquides et autres solides plus fins. Le filtre intermédiaire (4i) peut alors avoir des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhi, compris entre 15 et 40 pm, de préférence entre 20 et 35 pm afin de retenir les adipocytes bruns (51) et laisser passer les liquides et autres solides plus fins. Enfin, le filtre fin (4f) peut avoir des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhf, compris entre 4 et 12 pm, de préférence entre 5 et 10 pm, encore de préférence entre 7 et 9 pm afin de retenir les cellules souches (50) et laisser passer les liquides et autres solides plus fins (53), qui peuvent être évacués par l’ouverture d’évacuation (4o) située au bas du récipient, en aval du filtre fin.

[0037] Afin d’éviter qu’une couche compacte de cellules ne se forme à la surface d’un filtre grossier ou fin, qui empêcherait tout passage à travers ledit filtre à des particules plus fines mais séparées du filtre par une telle couche, il est possible d’appliquer une vibration à l’unité de séparation. Une telle vibration permet de disloquer toute couche compacte se formant ainsi. La fréquence et amplitude des vibrations doit être telle qu’une telle couche ne se forme pas, tout en s’assurant que les cellules ne soient pas endommagées. Des filtres plats sont représentés sur les Figures. Il est clair que d’autres géométries sont envisageables. Par exemple, les filtres peuvent former une surface amont qui est convexe, par exemple en forme de cône ou de dôme inversés ou, au contraire, qui est concave, par exemple en forme de dôme. Situer le moyen de couplage (45) vers une pompe à vide (5a) en aval du filtre fin permet également de stimuler le passage des cellules à travers les filtres (voir Figures 2, 3(b)&amp;(c), 4(b)&amp;(c), 5 et 6).

[0038] De manière surprenante, ce simple procédé de séparation par filtrage permet d’effectuer une isolation ou pré-isolation des cellules souches qui permet de grandement faciliter leur culture et/ou utilsations ultérieures. Dans le présent document, les termes « isolation », « pré-isolation » et « (pré-) isolation » et leurs dérivés sont utilisés indifféremment pour désigner une opération d’isolation d’une fraction de cellules souches par filtration d’un prélèvement de tissus adipeux. La présence du préfixe « pré » dépend de si des opérations de purification ultérieures sont nécessaires ou pas pour les applications des cellules souches ainsi prélevées et (pré-) isolées. Au terme de l’opération de filtrage, des cellules souches demeurent dans les adipocytes retenus du côté rétentat du filtre grossier (4g) et le cas échéant du filtre intermédiaire (4i), mais comme de grands volumes de tissus adipeux peuvent facilement être prélevés d’un patient, des quantités importantes de cellules souches peuvent ainsi être (pré-) isolées extrêmement facilement. L’avantage du système de (pré-) isolation des cellules souches selon la présente invention est que non seulement l’opération de pré-isolation par rinçage et filtrage des cellules souches, mais également toutes autres opérations ultérieures considérées comme nécessaires, selon le degré de pureté des cellules souches désiré, peuvent se faire sans jamais exposer les cellules souches à l’atmosphère ambiante par l’un des moyens suivants.

[0039] Par exemple, tel qu’illustré à la Figure 2, une seringue (13p) ou autre système de pompage peut être relié au côté rétentat du filtre fin (4f) par un tube de récupération (13t). Le tube de récupération (13t) peut pénétrer dans le récipient à travers le couvercle (4c) ou celui-ci peut être muni d’un moyen de couplage au tube de récupération (13t) et avoir une lance creuse s’étendant à l’intérieur du récipient, jusqu’à la surface rétentat du filtre fin (4f), Les cellules souches se trouvant du côté rétentat peuvent alors être aspirées par la seringue ou piston de récupération (13t), sans jamais être exposées à l’atmosphère ambiant.

[0040] Dans un autre exemple, illustré aux Figures 6 et 7, l’unité de séparation comprend une unité d’isolation (40) des cellules souches comprenant un récipient (47) cylindrique fermé à une extrémité amont par un plateau d’étanchéité (41g) du filtre grossier et à l’autre extrémité avale par un plateau d’étanchéité (411) du filtre fin. Les plateaux d’étanchéité (41 f, 41g) comprennent des ouvertures (42f, 42g) reliant une surface externe à une surface interne de chaque plateau et sont montés de sorte à pouvoir tourner par rapport au récipient cylindrique autour de son axe. Les expressions « surface interne » et « surface externe » sont définies par rapport à l’intérieur et à l’extérieur du récipient cylindrique (47).

[0041] Le logement défini à l’intérieur du récipient cylindrique (47), entre les plateaux d’étanchéité (41 f, 41g) comprend le filtre grossier et le filtre fin, chacun étant montés dans des ouvertures agencées dans des plateaux étanches montés parallèles aux plateaux d’étanchéité (41 f, 41g) et de manière rigide par rapport au récipient cylindrique (c’est-à-dire que les filtres ne peuvent entrer en rotation par rapport au récipient cylindrique). Corne illustré à la Figure 6, le filtre grossier (4g) est en contact étanche avec la surface interne du plateau d’étanchéité (41g) du filtre grossier et le filtre fin (4f) est en contact étanche avec la surface interne du plateau d’étanchéité (41 f) du filtre fin. Des joints d’étanchéité sont prévus permettant d’assurer l’étanchéité entre les plateaux d’étanchéité et les filtres même lors de la rotation des plateaux d’étanchéité par rapport aux filtres.

[0042] Les ouvertures (42f, 42g) des plateaux d’étanchéité et les ouvertures supportant les filtres sont telles que, dans une première configuration de filtrage illustrée aux Figures 6(a) et 7(a), elles se font face créant un passage fluidique entre la surface externe du plateau d’étanchéité (41g) du filtre grossier jusqu’à la surface externe du plateau d’étanchéité (41f) du filtre fin, permettant l’opération de filtrage des cellules des tissus adipeux extraits, tels que décrits plus haut.

[0043] Dans une seconde configuration étanche, illustrée aux Figures 6(b) et 7(b), la rotation des plateaux d’étanchéité (41 f, 41g) par rapport aux filtres, entraîne les ouvertures (42f, 42g) des plateaux d’étanchéité hors alignement avec l’une quelconque des ouvertures supportant les filtres. Grâce à des joints d’étanchéité, tout passage de fluide entre la surface externe du plateau d’étanchéité (41g) du filtre grossier jusqu’à la surface externe du plateau d’étanchéité (41 f) du filtre fin, isolant de manière étanche le logement défini par le récipient cylindrique de l’atmosphère environnant.

[0044] La Figure 7 illustre un exemple d’une telle unité d’isolation (40) de manière explosée (sans le couvercle (4c)), le filtre grossier (4g) étant séparé du plateau d’étanchéité (41g) du filtre grossier, et le filtre fin étant séparé du plateau d’étanchéité (41 f) du filtre fin afin de montrer les mouvements relatifs des plateaux d’étanchéité par rapport aux filtres. Les accolades indiquent schématiquement que les filtres sont en contact étanche avec les plateaux d’étanchéité comme illustré à la Figure 6. Les ouvertures soutenant les filtres et les ouvertures des plateaux d’étanchéité ont la forme de quartiers de tarte séparés les uns des autres par des quartiers de tarte de taille au moins égale, de préférence un peu plus grandes. Les plateaux d’étanchéité à la Figure 7(a) sont dans leur configuration de filtrage, avec leurs ouvertures (42f, 42g) faisant face aux filtres (4f, 4g) de géométrie correspondante. La rotation des plateaux d’étanchéité à l’aide d’un moyen de rotation (48) par rapport aux filtres qui restent statiques, entraîne les ouvertures (42f, 42g) face aux plateaux supportant les filtres grossier et fin. La rotation simultanée des plateaux d’étanchéité peut par exemple se faire par la rotation d’un axe fixé rigidement aux deux du plateaux d’étanchéité et à rotation par rapport aux plateaux supportant les filtres (par exemple par des roulements tels qu’illustrés à la Figure 6. D’autres moyens connus de l’homme du métier sont possibles et ne sont pas critiques à la présente invention.

[0045] Il est clair qu’une unité d’isolation équivalente à celle décrite ci-dessus et illustrée dans la Figure 7 peut être obtenue en montant les plateaux d’étanchéité rigidement par rapport au récipient cylindrique (47) et en montant les plateaux soutenant les filtres grossier et fin à rotation par rapport aux plateaux d’étanchéité.

[0046] De plus, les plateaux montés à rotation peuvent être reliés à un moteur entraînant une rotation réciproque de fréquence et amplitude contrôlables des plateaux montés à rotation par rapport aux plateaux montés rigidement. Cette rotation réciproque maintient en mouvement la masse de cellules adipeuses se trouvant dans la partie rétentat d’un filtre ce qui permet de favoriser le passage des fluides et particules de plus petite taille en empêchant la formation d’une couche quasi-étanche de cellules adipeuses reposant sur la surface d’un filtre qui empêche l’accès aux cellules se trouvant en amont.

[0047] Avec une unité d’isolation (40) telle que discutée ci-dessus, l’opération de filtrage des cellules peut avoir lieu avec les plateaux d’étanchéité dans leur configuration de filtrage. Une fois l’opération de pré-isolation des cellules souches est terminée, les plateaux d’étanchéité peuvent être amenés par rotation à leur configuration étanche. Les cellules souches sont alors stockées dans l’unité de pré-isolation et protégées de manière étanche de l’atmosphère ambiante. L’unité de pré-isolation peut alors être retirée du récipient (4) et transportée pour d’autres manipulations ou utilisations des cellules souches ainsi (pré-) isolées sans risque de contamination.

[0048] On a vu plus haut que les meilleurs résultats d’isolation de cellules souches adipeuses a été obtenu avec un appareil de liposuccion dont l’extrémité libre de la canule était soumise à un mouvement de nutation. Un mouvement de nutation peut être transmis à la première extrémité libre (41) d’une canule par un organe d’entraînement (32) de type électrique ou pneumatique, de préférence agencé dans une poignée (1) permettant la manipulation de l’appareil. Un exemple d’organe d’entraînement électrique permettant un tel mouvement est illustré à la Figure 8. Un tube creux est monté dans une cavité de la poignée permettant la translation dans les deux sens du tube creux le long de son axe. Le moyen de couplage (2c) auquel vient se monter une canule (2) est couplé de manière rigide à l’extrémité amont du tube creux. A son extrémité avale le tube creux est inséré dans une cavité cylindrique en communication fluidique avec un moyen de couplage au tube d’extraction (3t). Les expressions « amont » et « avale » sont définies par rapport au sens d’écoulement des cellules adipeuses dans le tube creux lors de l’extraction (soit en direction du tube d’extraction (3t)).

[0049] Des aimants (62) sont montés de manière rigide sur la longueur du tube creux. Des bobines (61) entourant le tube creux sont agencées dans la poignée de sorte à provoquer un mouvement réciproque de va-et-vient du tube creux dans la cavité cylindrique à une fréquence, f, en passant un courant alternatif dans les bobines à la même fréquence, f. Des ressorts de retour (63) agencés autour du tube creux permettent, d’une part de réduire le bruit de l’appareil en évitant que le tube creux ou le moyen de couplage à la canule (2c) ne heurtent une paroi de la poignée à chaque fin de course du tube creux et, d’autre part de repousser le tube creux dans la direction opposée.

[0050] Dans un mode de réalisation alternatif, un organe d’entraînement pneumatique est utilisé. Par exemple un organe d’entraînement pneumatique adapté à transmettre un mouvement de nutation à la première extrémité libre d’une canule est décrit en détails dans WO2014033209 et peut ère utilisé dans la présente invention.

[0051] L’appareil de la présente invention est idéal pour le prélèvement de tissus adipeux, et la séparation des cellules prélevées en fonction de leur taille afin de (pré-) isoler des cellules souches mésenchymateuses d’origine adipeuse. Le procédé commence par l’extraction de tissus adipeux d’un patient à l’aide de l’unité de liposuccion (10). De préférence l’unité de liposuccion est telle qu’elle transmette à la première extrémité libre de la canule un mouvement de nutation tel qu’expliqué plus haut et illustré à la Figure 8. Un tel mouvement permet de disloquer les agglomérats de tissus adipeux et d’aspirer des cellules déjà fortement désolidarisées les unes des autres. Les tissus adipeux ainsi extraits sont recueillis dans le récipient de l’unité de séparation, du côté rétentat (ou amont) du filtre grossier (4g). Les cellules de taille supérieure sont retenues par le filtre grossier, telles les adipocytes blancs et, en l’absence d’un filtre intermédiaire, également les adipocytes bruns, alors que les liquides et les solides plus fins traversent le filtre grossier et atteignent le côté filtrat du filtre grossier. S’il y a un filtre intermédiaire (4i) le filtrat atteint le côté rétentat (ou amont) dudit filtre intermédiaire. En l’absence d’un filtre intermédiaire, le filtrat atteint le côté rétentat du filtre fin (4f). Le filtre intermédiaire (4i) permet de retenir des cellules de tailles intermédiaires, supérieures à celle des cellules souches. Le filtre fin permet de retenir les cellules de la taille des cellules souches. Le choix judicieux de la taille des ouvertures du filtre fin et du filtre directement en amont de celui-ci permet d’optimiser l’opération de pré-isolation des cellules souches. Les liquides et solides très fins ayant traversé le filtre fin peuvent être évacués par une ouverture d’évacuation (4o) située sur le récipient (4) en aval du filtre fin.

[0052] Les cellules recueillies du côté rétentat du filtre grossier sont de préférence rincées à l’aide d’une solution de rinçage, afin de favoriser d’avantage le détachement des cellules plus fines, comprenant les cellules souches, des cellules de plus grosse taille telles les adipocytes brands et bruns. La solution de rinçage crée un flux de particules s’écoulant à travers l’unité de séparation. Si le moyen de connexion (45) à une pompe à vide (5a) se trouve en aval du filtre fin, l’écoulement à travers l’unité de séparation est favorisé. Des vibrations peuvent être appliquées aux filtres, ou à l’ensemble de l’unité de séparation.

[0053] Un tel procédé ne prétend pas isoler la totalité des cellules souches présentes dans un prélèvement, comme il serait nécessaire pour des prélèvements de la moelle osseuse, disponible en petits volumes uniquement. Comme les volumes de tissus adipeux qui peuvent être extraits par liposuccion sont abondants chez la plupart des patients, et que les tissus adipeux contiennent une quantité importante de cellules souches, le volume de cellules souches qu’on peut prélever avec cette méthode est important. Cette méthode est plus performante que celle proposée dans WO2011146924 pour deux raisons. Premièrement, la taille des ouvertures des filtres utilisés est mieux adaptée à l’isolation de cellules souches. Deuxièmement, l’utilisation d’une unité de liposuccion induisant un mouvement de nutation à l’extrémité libre de sa canule à des fréquences inférieures de trois à quatre ordres de magnitude permet de désagglomérer les cellules des tissus adipeux en cellules individuelles ou en agglomérats de petite taille, qui peuvent alors être séparés par les filtres sensiblement plus fins que ceux utilisés dans WO2011146924. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, il est présumé que l’unité de liposuccion ultrasonique utilisée dans WO2011146924 aspire des agglomérats de grosses tailles qui engorgeraient rapidement les filtres grossier (intermédiaire) et fin d’un appareil selon la présente invention, raison pour laquelle, il est décrit dans ce document d’utiliser des filtres ayant des ouvertures de diamètre supérieur à 200 pm. Il ne suffit donc pas de réduire la taille des filtres décrits dans WO2011146924 pour arriver à la présente invention, car un tel appareil ne permettrait pas la séparation des gros agglomérats. D’un autre côté, l’utilisation d’une unité de liposuccion induisant un mouvement de nutation dans le procédé décrit dans WO2011146924 ne donnerait pas de bons résultats non plus, car les filtres trop grossiers laisseraient passer toutes les cellules et petits agglomérats ainsi recueillis.

[0054] L’utilisation d’un appareil selon la présente invention est donc particulièrement avantageuse pour l’isolation de cellules souches adipeuses.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS

   1. Un kit d’éléments destiné à être utilisé dans le prélèvement et l’isolation de cellules souches adipeuses, ledit kit d’éléments comprenant : (A) Une unité de liposuccion (10) comprenant : (a) Une poignée (2) permettant la manipulation de l’appareil, (b) Un organe d’entraînement (32) agencé préférablement dans ladite poignée et permettant de transmettre à un moyen de couplage (2c) un mouvement réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, à une fréquence, f, et une amplitude, A; (c) Une canule (4) allongée ayant une longueur, L, et un diamètre extérieure, D, et comprenant un lumen s’étendant d’une ou plusieurs ouvertures d’entrée (11) situées à une première extrémité (41) de la canule, qui est libre à un orifice de sortie situé à une deuxième extrémité (42) adaptée pour être couplée solidairement au moyen de couplage (2c) relié à l’organe d’entraînement (32), de sorte que la canule soit sensiblement parallèle à l’axe longitudinal, Z; (B) Une pompe à vide (5a) destinée à créer un vide dans le lumen de la canule pour le prélèvement de matière extraite comprenant des cellules adipeuses, (C) Une unité de séparation comprenant un récipient (4) contenant une unité de filtrage permettant de séparer différentes phases de la matière extraite, (D) Un ensemble de tubes (3t, 5t) permettant de connecter par voie fluide le lumen de la canule au récipient, et le récipient à la pompe à vide ; Caractérisé en ce que, l’unité de filtrage comprend : (E) Un filtre grossier (4g), ayant des ouvertures de diamètre hydraulique grossier moyen, Dhg=4Ag/Pg, compris entre 30 et 120 pm, et ayant un côté rétentat permettant de retenir des cellules adipeuses et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de taille plus petite que le diamètre hydraulique grossier moyen, Dhg, ayant traversé le filtre grossier et, (F) Un filtre fin (4f) situé en aval, du côté filtrat du filtre grossier, ayant des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhf = 4Af / Pf, qui est au moins deux fois plus petit que le diamètre hydraulique moyen, Dhg, des ouvertures du filtre grossier et ayant un côté rétentat permettant de retenir des cellules souches ayant traversé le filtre grossier et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre fin et, dans lequel Dh est Ie diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, A est l’aire moyenne des ouvertures, P est le périmètre moyen des ouvertures, et les indices f et g se réfèrent aux filtres fin et grossier, respectivement.
2. 2. Le kit selon la revendication 1, dans lequel le mouvement transmis par l’organe d’entraînement à la première extrémité (41) libre de la canule définit un mouvement de nutation comprenant : • une composante longitudinale de translation réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, et • une composante orbitale de rotation autour de l’axe longitudinal, Z, et dans lequel la fréquence, f, du mouvement réciproque périodique de va-et-vient selon un axe longitudinal, Z, du moyen de couplage (2c) et de la composante longitudinale de la première extrémité libre de la canule est de préférence comprise entre 1 et 40 Hz, de préférence entre 5 et 20 Hz, et/ou son amplitude, A, est de préférence comprise entre 0.4 et 40 mm, de préférence entre 1.0 et 20.0 mm, de manière plus préférée entre 2.0 et 10.0 mm, et encore plus préférablement entre 4.0 et 8.0 mm.
3. 3. Le kit selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le filtre grossier a un diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, Dhg, compris entre 50 et 100 pm, de préférence entre 60 et 90 pm et est de préférence amovible, permettant de le retirer du récipient.
4. 4. Le kit selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le filtre fin a un diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, Dhf, compris entre 4 et 20 pm, de préférence entre 5 et 10 pm et est de préférence amovible, permettant de le retirer du récipient.
5. 5. Le kit selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant de plus un filtre intermédiaire (4i) positionné entre le filtre grossier (4g) et le filtre fin (41), et ayant des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dh, = 4A / Pi, caractérisé en ce que Dhf < Dhi < Dhg, et où l’indice I se réfère au filtre intermédiaire.
6. 6. Le kit selon la revendication 4, dans lequel : • Le filtre grossier (4f) a des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhg, compris entre 70 et 100 pm, de préférence entre 75 et 95 pm ; • Le filtre intermédiaire (4i) a des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhi, compris entre 15 et 40 pm, de préférence entre 20 et 35 pm ; • Le filtre fin (4f) a des ouvertures de diamètre hydraulique moyen, Dhf, compris entre 4 et 12 pm, de préférence entre 5 et 10 pm, encore de préférence entre 7 et 9 pm.
7. 7. Le kit selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une solution de rinçage (6) est couplée fluidiquement au côté rétentat du filtre grossier (4g) permettant de rincer les cellules adipeuses retenues par le filtre grossier et les cellules souches retenues par le filtre fin (4f), la solution étant de préférence une solution physiologique.
8. 8. Le kit selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : • l’unité de séparation comprend un tube d’extraction (3t) reliant par voie fluide le lumen de la canule au côté rétentat du filtre grossier dans le récipient ; et • la pompe à vide (5a) est reliée par voie fluide par un tube de vide (5t) au récipient et, et par le récipient et le tube d’extraction (3t), au lumen de la canule.
9. 9. Le kit selon la revendication 7, dans lequel le tube de vide (5t) est couplé au récipient dans le côté filtrat, en aval du filtre fin ou, alternativement, du côté rétentat, en amont du filtre grossier, de préférence à un couvercle (4c) du récipient.
10. 10. Le kit selon l’une quelconque des revendications 2 à 9, dans lequel la composante orbitale de rotation de la première extrémité de la canule en l’absence de contraintes externes est sensiblement elliptique caractérisée par un grand diamètre, 2xR, de longueur comprise entre 1 et 20 mm.
11. 11. Le kit selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant de plus une unité d’isolation (40) comprenant : (a) un récipient cylindrique (47) fermé à une extrémité amont par un plateau d’étanchéité (41g) du filtre grossier et à l’autre extrémité avale par un plateau d’étanchéité (41f) du filtre fin formant ainsi un logement, les plateaux d’étanchéité (41 f, 41g) comprenant des ouvertures (42f, 42g) reliant une surface externe à une surface interne de chaque plateau ; (b) un premier plateau situé dans le logement et soutenant le filtre grossier dans des ouvertures agencées dans celui-ci et un second plateau situé dans le logement et soutenant le filtre fin dans des ouvertures agencées dans celui-ci, le premier plateau étant en contact étanche avec le plateau d’étanchéité (41g) du filtre grossier et le second plateau étant en contact étanche avec le plateau d’étanchéité (41 f) du filtre fin, de sorte qu’une rotation des premier et second plateaux relative aux plateaux d’étanchéité (41g, 41 f) des filtres grossier et fin, respectivement permette d’amener l’unité d’isolation alternativement: (c) dans une configuration de filtrage, dans laquelle les ouvertures des plateaux d’étanchéité (41g, 41 f) des filtres grossier et fin fassent face aux ouvertures contenant les filtres grossier et fin, respectivement, et (d) dans une configuration étanche, dans laquelle le logement est isolé de l’atmosphère ambiant et dans lequel aucune des ouvertures des plateaux d’étanchéité (41g, 41 f) des filtres grossier et fin ne fasse face à aucune des ouvertures contenant les filtres grossier et fin, respectivement.
12. 12. Le kit selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’organe d’entraînement (32) est un organe électrique comprenant : (a) un tube creux comprenant le moyen de couplage (2c) à la canule et monté en translation le long de son axe dans une cavité de la poignée et comprenant un ou plusieurs aimants distribués le long du tube creux, (b) une ou plusieurs bobines entourant le tube creux et le ou les aimants, lesdites bobines étant reliées à un générateur de courant alternatif dont la fréquence est de préférence variable.
13. 13. Procédé pour isoler des cellules souches contenues dans un prélèvement de cellules adipeuses, ledit procédé comprenant les opérations suivantes : (a) Recueillir un prélèvement de cellules adipeuses comprenant des cellules souches dans un filtre grossier (4g) dont les ouvertures ont un diamètre hydraulique moyen, Dhg = 4Ag / Pg, compris entre 30 et 120 pm, agencé dans un récipient (4) et ayant un côté rétentat permettant de retenir les cellules adipeuses de taille supérieure à Dhg et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre grossier, (b) Recueillir les liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre grossier dans un filtre fin (4f) positionné en aval du filtre grossier et ayant un côté rétentat permettant de retenir des cellules souches et un côté filtrat où passent des liquides et autres solides de plus petite taille ayant traversé le filtre fin dont les ouvertures ont un diamètre hydraulique moyen, Dhf = 4Af/Pf, qui est au moins deux fois plus petit que le diamètre hydraulique moyen, Dhg, des ouvertures du filtre grossier, dans lequel Dh est le diamètre hydraulique moyen d’ouvertures, A est l’aire moyenne des ouvertures, P est le périmètre moyen des ouvertures, et les indices f et g se réfèrent aux filtres fin et grossier, respectivement, et (c) Récupérer les cellules souches retenues dans le coté rétentat du filtre fin (4f).
14. 14. Le procédé de la revendication 13, dans lequel les cellules adipeuses retenues du côté rétentat du filtre grossier (4g), sont rincées par un liquide de rinçage (6) et les liquides et solides de petites tailles, y compris des cellules souches, ainsi détachés des cellules adipeuses sont entraînées à travers les ouvertures du filtre grossier, vers le filtre fin (4f).
15. 15. Utilisation d’un kit selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, pour l’isolation de cellules souches adipeuses.