BE1001736A4

BE1001736A4 - Gelaagde immunoassay waarbij antilichamen worden gebruikt die gebonden zijn aan transportdeeltjes, voor het bepalen van de aanwezigheid van een antigeen.

Info

Publication number: BE1001736A4
Application number: BE8700633A
Authority: BE
Original assignee: Liotta Lance A
Priority date: 1986-06-09
Filing date: 1987-06-05
Publication date: 1990-02-20
Also published as: IT1205137B; ES2006484A6; JPS6340859A; ZA873748B; CA1293442C; FR2599845A1; GB2191577B; AU604020B2; US4837145A; LU86909A1; AU7345487A; FR2599845B1; DE3718621A1; GR870872B; SE8702334L; NZ220560A; DK282987A; NL8701324A; GB8712777D0; GB2191577A

Abstract

Voor het bepalen van de aanwezigheid van een antigeen (28) wordt een monster gemengd met twee klassen van antilichamen die specifiek zijn voor het te bepalen van antigeen (28), maar met verschillende domeinen van het antigeen reageren, waarbij het mengsel bestaat uit klasse éénantilichamen (10), gebonden aan een transportdeeltje (14) dat vrijelijk door de vangzone (18) stroomt, en klasse twee-, aan enzym-gebonden antilichamen (12) die, tenzij ze aan de transportdeeltjes (14) zijn gebonden, niet in staat zijn om vrijelijk door de vangzone (18) te stromen. In tegenwoordigheid van het te bepalen antigeen (28) binden beide klassen van antilichamen (10 en 12) aan het antigeen en stromen door de vangzone (18) naar de substraatzone (20), waarin een reactie plaats vindt die een indicatie voor de aanwezigheid van het antigeen (28) geeft.

Description

Gelaagde immunoassay waarbij antilichamen worden gebruikt die gebonden zijn aan transportdeeltjes, voor het bepalen van de aanwezigheid van een antigeen.

Achtergrond van de uitvinding.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze en inrichting voor het bepalen'van de aanwezigheid van een antigeen in testmonsters door middel van het gebruik van een speciaal ontworpen, met enzym-ge- labelde,"double site"immunoassay-techniek.

Met enzym-gelabelde immunoassay's, waarbij antilichamen worden gebruikt die met verschillende domeinen op hetzelfde antigeen reageren, zijn in de wetenschappelijke literatuur beschreven. In het algemeen wor- den al dergelijke"double site"immunoassay's op de volgende wijze uitge- voerd : Edn lid van het antilichamenpaar wordt bevestigd aan een vaste drager zoals de wand van een kunststofbuis of het oppervlak van een kunststofstaaf. Het tweede antilichaam wordt geconjugeerd met een enzym-' label. Het antigeen-bevattende monster en het conjugaat van het tweede antilichaam worden samen met het eerste, aan de vaste drager gebonden antilichaam gemengd. In tegenwoordigheid van het antigeen wordt het geconjugeerde antilichaam gebonden aan de vaste drager via het andere lid van het antilichamenpaar.

De vaste drager wordt daarna grondig gewassen om eventueel niet- gebonden conjugaat te verwijderen. Tenslotte wordt de vaste drager ge- incubeerd met een kleur-vormend enzymsubstraat. De kleurreactie kan daarna visueel of met behulp van een instrument worden afgelezen, waar- bij een indicatie wordt verkregen van de aanwezigheid en hoeveelheid van het antigeen. Dergelijke"two site"immunoassay's kunnen specifiek en snel zijn, maar vereisen veelvoudige was-en kleurvormings-incubatie- stappen.

De onderhavige uitvinding is een"two site"immunoassay zonder was- of aparte kleurreactiestappen. Het antigeen-bevattende monster wordt gemengd met de twee antilichaamreagentia en het mengsel wordt aan- gebracht op het oppervlak van een testinrichting die van twee lagen is voorzien. De bodemlaag bevat het kleur-vormende substraat. In tegenwoor- digheid van het antigeen wordt het conjugaat naar de bodemlaag vervoerd en produceert een kleurreactie. In afwezigheid van het antigeen wordt al het conjugaat gevangen in de bovenste vaste fase vanglaag en bereikt

aldus niet de onderste kleur-vormende laag. Het principe van de uitvinding is exact het tegengestelde van de bekende two site-immunoassay's, omdat het conjugaat dat niet aan het antigeen bindt, op de vaste fase wordt gevangen.

Het conjugaat dat aan het antigeen bindt, wordt door de vaste fasezone naar de kleurvormingslaag gewassen.

Het bovenstaande en andere voordelen van de onderhavige uitvinding zullen aan de deskundigen duidelijk worden bij lezing van de hierna volgende beschrijving en conclusies. samenvatting van de uitvinding.

In een aspect betreft de onderhavige uitvinding een inrichting voor het bepalen van de aanwezigheid van een antigeen, omvattende een vangzone die een materiaal bevat dat in staat is om vrij stromende, aan enzym-gebonden antilichamen te vangen, maar niet in staat is om antilichamen te vangen die aan een transportdeeltje zijn gebonden dat vrijelijk door de vangzone naar de substraatzone stroomt, alsmede een substraatzone die materiaal bevat dat in staat is om te reageren met de aan enzym-gebonden antilichamen waarbij een reactie wordt verkregen die een indicatie geeft van de aanwezigheid van het enzym en daarmede het desbetreffende antigeen.

In een ander aspect is de onderhavige uitvinding gericht op een unieke methode voor het bepalen van de aanwezigheid van antigenen in een monster, omvattende de stappen van het in contact brengen van het monster met twee klassen van antilichamen die specifiek zijn voor het te bepalen antigeen, maar waarbij elke klasse van antilichamen reageert met een ander domein in het antigeen onder vorming van een complex dat in staat is om door de vanglaag te stromen waarbij een reactie wordt verkregen in de substraatlaag die een indicatie geeft van de aanwezigheid van het te bepalen antigeen.

Beschrijving van de tekening.

Hierna volgend wordt een korte beschrijving van de tekening gegeven, welke tekening slechts ter toelichting van de uitvinding dient en niet ter beperking daarvan.

Figuur l is een schematische weergave van de i. 1. richting A wAgens de onderhavige uitvinding. Hij omvat twee onderscheiden lagen, namelijk een vangzone 18 en een substraatzone 20. Klasse een-antilichamen 10 en klasse twee-antilichamen 12 zijn op een korte afstand van inrichting A

weergegeven. Klasse een-antilichamen 10 zijn bevestigd aan het oppervlak van transportdeeltjes 14, en klasse twee-antilichamen 12 zijn geconjugeerd met enzymen 16.

De vangzone 18 is uitgevoerd uit een poreus materiaal dat klasse twee-antilichamen 12, geconjugeerd met enzym 16, vangt, maar transportdeeltjes 14 die verbonden zijn met klasse een-antilichamen 10, niet vangt. Substraatzone 20 is eveneens vervaardigd van een poreus materiaal en bevat een gebonden kleur-vormend reagens 22, dat wil zeggen een materiaal dat met het aan klasse twee-antilichamen 12 geconjugeerde enzym 16 reageert onder vorming van een kleur. De inrichting A is weergegeven op een draagorgaan 24.

Figuur 2 geeft schematisch de methode volgens de uitvinding weer, waarbij inrichting A van figuur 1 wordt toegepast. In het bijzonder wordt een in het algemeen met verwijzingscijfer 26 aangeduid vloeibaar materiaal dat vrij antigeen 28 bevat, gemengd met klasse een-antilichamen 10 die aan transportdeeltjes 14 zijn gebonden, en met klasse twee-antilichamen 12 die met enzym 16 zijn geconjugeerd. Klasse een-antilichamen 10, die aan transportdeeltjes 14 zijn gebonden, binden met specifieke herkenningsplaatsen op de antigenen 28. Evenzo binden klasse twee-antilichamen 12, die met enzym 16 zijn geconjugeerd, met alternatieve specifieke receptorplaatsen op de antigenen 28, welke antigenen gebonden zijn aan klasse een-antilichamen 10 die op hun beurt gebonden zijn aan transportdeeltjes 14 waardoor resulterende complexen 32 worden gevormd.

Wanneer het vloeibare materiaal door de vangzone 18 diffundeert, worden alle klasse twee-antilichamen 12 die met enzym 16 zijn geconjugeerd maar geen resulterende complexen 32 hebben gevormd, in de vangzone 18 gevangen, terwijl alle klasse twee-antilichamen 12 die met enzym 16 zijn geconju- serden resulterende complexen 32 hebben gevormd, door de vangzone 18 naar de substraatzone 22 stromen waar het geconjugeerde enzym 16 met het kleur-vormende reagens 22 reageert onder vorming van een onderscheidbare kleur die een indicatie van de aanwezigheid van antigeen 28 in het aangebrachte vloeibare materiaal 26 geeft.

Figuur 3 toont schematisch de methode volgens de uitvinding waarDij inrichting A volgens figuur 1 werd toegepast en laat de resultaten zien die verkregen worden wanneer het geteste vloeibare materiaal 26 geen antigeen 28 bevat. Meer in het bijzonder wordt een algemeen met 26 aangeduid vloeibaar materiaal aangebracht op het oppervlak 30 van vang-

zone 18. Wanneer het vloeibare materiaal door de vangzone 18 di. ffmdeert, worden alle klasse twee-antilichamen 12 die met enzym 16 zijn geconjugeerd, door de vangzone 18 gevangen. Derhalve bereiken geen aan enzym gebonden antilichamen het kleur-vormende reagens 22 in de substraatzone 20 en wordt geen kleurverandering waargenomen, hetgea saTMijst datantn.- geen 28 in het geteste vloeibare materiaal 32 niet aanwezig is.

Figuur 4 toont het vangen van het vrije enzym-antilichaamconjugaat door een moleculair zeefmateriaal als de vanglaag te gebruiken.

Figuur 5 toont het vangen van het vrije enzym-antilichaamconjugaat door proteine A nitrocellulose als de vanglaag te gebruiken.

Figuur 6 toont het vangen van het vrije enzym-antilichaamconjugaat door gebruik te maken van een kationen-uitwisselingshars als de vanglaag.

Beschrijving van de praktische uitvoering van de uitvinding.

De onderhavige uitvinding omvat het gebruik van de volgende ele- menten : klasse één-en klasse twee-antilichamen die verschillende plaatsen op hetzelfde antigeen herkennen ; een transportdeeltje waaraan antilichamen van klasse een zijn bevestigd ; enzymen die geconjugeerd zijn met de klasse twee-antilichamen ; en een immunoassay-inrichting die bestaat uit een vangzone welke antilichamen van klasse twee bindt maar antilichamen van klasse een niet bindt, en een substraatzone die reageert met het met klasse twee-antilichamen geconjugeerde enzym onder vorming van een onderscheidbare kleur (zie fig. 1).

De antilichamen bestaan uit klasse een-antilichamen die gebonden zijn aan een transportdeeltje en klasse twee-antilichamen die geconjugeerd zijn met een label zoals een enzym. Hoewel beide klasscn \an anti- lichamen specifiek zijn voor hetzelfde antigeen, worden verschillende epitopen of bindingsplaatsen door elke klasse van antilichamen herkend.

Derhalve kan elke klasse van antilichamen aan hetzelfde altigeen binden waarbij het gebruik van een double site-immunoassay wordt vergemakkelijkt.

Het basisch concept van de onderhavige uitvinding draait om het onderlinge verband van het transportdeeltje, de twec klassen van antilichamen, en een immunoassay-inrichting die bestaat uit gelaagde vangen substraatzones. De vangzone is in hoge mate specifiek voor het vrije antilichaamconjugaat bestaande uit klasse twee-antilichamen, tervnjl het
EMI4.1
. -

transportdeeltje vrijelijk tussen de twee lagen passeert. De substraatzone produceert een kleur-vormende reactie in tegenwoordigheid van het enzym.

Wanneer de twee klassen van antilichamen worden gemengd met een antigeen-vrij-monster, dit mengsel in contact wordt gebracht met de gelaagde vang-en substraatzones, wordt geen kleurverandering waargenomen (zie fig. 3). Als gevolg van de afwezigheid van antigeen, kan geen double site-herkenning plaatsvinden en worden alle indicatieve klasse twee-vrije-antilichaamconjugaten door de vangzone gevangen. Er vindt derhalve geen enzymsubstraatreactie plaats en er wordt geen kleurverandering waargenomen.

In tegenwoordigheid van een antigeen-bevattend monster echter, worden de geconjugeerde klasse twee-antilichamen gebonden aan het transportdeeltje via het antigeen (zie fig. 2). Als gevolg van de double site herkenning, kan het met antilichaam-geconjugeerde enzym niet in de vangzone worden gevangen omdat het transportdeeltje het conjugaat beschermt tegen het invangen door de vanglaag. Het transportdeeltje vervoert derhalve het conjugaat naar de kleur-vormende laag alleen wanneer het antigeen aanwezig is.

In een geprefereerde praktische uitvoering van de uitvinding bestaan de toegepaste antilichamen uit twee klassen van antilichamen die specifiek zijn voor het te bepalen antigeen. Elke klasse van antilichaam is echter in hoge mate specifiek voor verschillende herkenningsplaatsen of epitopen op het desbetreffende antigeen zodat geen kruisreactiviteit of overlap kan optreden. Bovendien kunnen beide klassen van antilichamen die specifiek zijn voor het te bepalen antigeen, werden gevonden in de vangzone van de inrichting, waardoor de noodzaak van enige voorafgaande vermenging wordt geelimineerd.

De materialen die gebruikt worden voor het construeren van de inrichting volgens de onderhavige uitvinding zijn op zichzelf wel bekend.

De vanglaag kan bestaan uit elk moleculair zeefmateriaal dat het conjugaat met klein molecuulgewicht vangt maar het transportdeeltje niet vangt.

Het vangmechanisme kan, zonder daartoe beperkt te zijn, gebaseerd zijn op afmetingen, dat wil zeggen door het gebruik van moleculaire zeefdeeltjes die kleine spleten bevatten die slechts de kleine antilichaamenzymconjugaten vangen en niet de complexen met transportdeeltjes

die te groot zijn om in de spleten van het moleculaire zeefmateriaal door te dringen ; op ladingd. w. z. het antilichaam-enzymconjugaat bindt aan tegengesteld geladen groepen die zieh in de vangzone bevinden waaraan het transportdeeltje niet bindt omdat zijn gemiddelde lading afwijkt van die van het in de vangzone of in de testoplossing aanwezige materiaal, en omdat de massa van het transportdeeltje veel groter is dan die van de andere eiwitten ;

en door de eigen natuurlijke affiniteiten van de eiwitten voor hun bindingsplaatsen, dat wil zeggen proteine A zal alleen binden aan het Fc-deel van de antilichamen, zodat wanneer de Fc-delen van de antilichamen aan het oppervlak van het transportdeeltje zijn gebonden, het fysisch onmogelijk voor proteine A wordt om aan deze antilichamen te worden gebonden, waardoor mogelijk wordt dat het complex van het transportdeeltje door de vangzone stroomt terwijl de vrij stromende antilichamen worden gevangen.

Voorbeelden van een geschikt vastefasemateriaal voor de constructie van de vangzone omvatten harsen en vezelhoudende materialen, agarosegels en elk ander materiaal dat voldoende lege ruimten bevat om de vrij stromende antilichamen te vangen zonder dat de transportdeeltjes worden gevangen.

Bovendien zijn ook geschikte substraten of kleurvormende reagentia die in de onderhavige uitvinding worden toegepast, op zichzelf welbekend. In dit opzicht kan een aantal verschillende typen van gezuiverde enzymen worden gebruikt, die direct of indirect met het kleurvormende middel dat zieh in het substraat bevindt, werken. Een voorbeeld van een dergelijk enzym en het bijbehorende substraat is mierikswortelperoxydase en p-nitrofenylfosfaat. De antilichamen kunnen ook worden gelabeld met radioactieve of fluorescente merkers.

In een uitvoeringsvorm van de uitvinding leidt de fysische binding van het conjugaat aan het transportdeeltje tot bescherming daarvan tegen binding aan een op het oppervlak van de vanglaag bevestigd proteine A. De wijze waarop de vanglaag het conjugaat vangt is niet beperkt tot deze specifieke uitvoeringsvormen. Andere alternatieve middelen zoals de vorming van een biotine-avidinecomplex kunnen eveneens worden gebruikt.

De onderhavige uitvinding is echter niet beperkt tot het gebruik van dit enzym en de daarbij behorende substraten. Andere enzym-substraat-

combinaties die op zichzelf bekend zijn, kunnen eveneens worden gebruikt.

Het transportdeeltje kan ook op verscheidene wijzen worden vervaardigd. Het transportdeeltje kan bijvoorbeeld een colloldale stof zijn met een hoog molecuulgewicht zoals dextran, vaste deeltjes bestaande uit kunststof, glas, hars of metalen materialen, of een polymeer met hoog molecuulgewicht. Bovendien kan het transportdeeltje ook een netto anionogene oppervlaktewijziging vertonen die het conjugaat beschermt tegen het gevangen worden door een kationogene lading op de vanglaag.

De onderhavige uitvinding zal thans verder worden beschreven aan de hand van het hierna volgende voorbeeld.

VOORBEELD Test : Teneinde de uitvoerbaarheid te bepalen van het gebruik van de onderhavige uitvinding voor het vaststellen van zwangerschap door middel van de detectie van humaan chorion gonadotrofine (HCG) ant- geen.

Gebruikte materialen : A. Antigeen : humaan chorion gonadotrofine (HCG) van positieve urine- controle Pregnospia Kit 150 mIU/ml.

B. Antilichamen : i) klasse een-antilichamen, gebonden aan transport- deeltjes ; muizemonoklonale antilichamen tegen HCG (partij 4284148 in gelyofiliseerde vorm geleverd) gebonden aan pregnospia colloidale gouddeeltjes.

(ii) klasse twee-antilichamen geconjugeerd met enzym :
Anti HCG Miles Yeda Inc. (partij 1064 beta subeenheid specifieke bron ascites PC-2 kloon)
Peroxidaseconcentratie 0, 53 mg/ml
Muize IgG 1, 01 mg/ml
Affiniteit 5, 3 x 10 liter/mol C. Vangzones
A. Voorgezwollen Sephadex G-100 M, gepakt in een kegelvormige kamer met 0, 4 cm top, 0, 4 cm hoogte, 0, 1 cm bodem, volume 75 micro- liter.

B. Nitrocellulose met een poriengrootte van 5 micrometer,
Millipore, 4 lagen gestapeld in een immunoputjesmatrijs die met proteine A is bekleed (S. aureus, Cowan-stam, Vector Labs) 10 mg/ml geblokkeerd met BSA.

C. Kationogene hars (Beckman FPLC Mono C) bereid als bovenstaand onder A.

D. Kleurvormend enzymsubstraat : glucoseoxydase 2, 0 mg/ml + tetramethyl- benzidine (TMB 20, 0 mg/ml, opgelost in absolute methanol, aan de lucht gedroogd op Whatman Nr. 5 papier.

Procedure Stap 1 : Bereiding van de twee klassen van antilichamen en de daaraan gebonden middelen :
Klasse een-antilichamen, bestaande uit monoklonale antilichamen tegen een specifieke receptorplaats op het HCG-antigeen, worden gebonden aan transportdeeltjes bestaande uit pregnospia colloidale gouddeeltjes.

Klasse twee-antilichamen, bestaande uit monoklonale antilichamen beta subeenheid specifiek, die een ander domein op het HCG-antigeen herkennen dan de klasse een-antilichamen, worden geconjugeerd met mierikswortelperoxydase (HRP).

Stap 2 : Bereiding van verscheidene immunoassay-inrichtingen.

Drie typen immunoassays werden gebruikt (van de eerder hierin be- schreven typen onder het hoofd"Vangzones"). Bij elk werd een ander type vangzone gebruikt, die bovenop de substraatlaag werd geplaatst volgens op zichzelf bekende methoden.

Stap 3 : De testoplossing wordt gemengd met de twee klassen van anti- lichamen. Het mengsel wordt daarna in contact gebracht met de oppervlaktelaag van de verscheidene immunoassay-inrichtingen.

RESULTATEN
Fig. 4 toont het vangen van het vrije conjugaat door de moleculaire zeefzone. In afwezigheid van antigeen werd geen significante kleurvorming waargenomen voor een verdunning van 1/1000 en een volume van 100 microliter. Bij directe aanbrenging op de substraatlaag werd een kleurdichtheid van 0, 47 du opgeroepen binnen 2 minuten. In tegenwoordigheid van een voorincubatie gedurende 2 minuten met het antigeen werd een significante kleurreactie van 0, 31 du opgeroepen.

Fig. 5 toont de uitvoeringsvorm waarbij de proteine A nitrocellulosevanglaag wordt gebruikt. De vanglaag was gematigd efficient.

In afwezigheid van antigeen werd slechts een kleur van 0, 13 due boven de achtergrond opgeroepen. In tegenwoordigheid van het antigeen was

het kleursignaal 0, 25 du, hetgeen een indicatie is dat binding van het conjugaat aan het transportdeeltje een duidelijke bescherming daarvan tegen het vangen door proteine A gaf.
EMI9.1

Fig. 6 toont het gebruik van een kationogene uitwisselingshars als vanglaag. Deze uitvoeringsvorm was minder efficient dan de boven- staand vermelde andere uitvoeringsvormen, maar diende voor het bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van antigeen. In afwezigheid van het antigeen werd een significante kleur verkregen bij alle antilichaamverdunningen. In tegenwoordigheid van het antigeen werd een kwantitatieve toename van de kleur waargenomen, hetgeen een indicatie is dat het transportdeeltje enige bescherming tegen binding aan de hars verleende.

Uit het bovenstaande is duidelijk dat de inrichting een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding bijzonder effectief is in de bepaling of een specifiek antigeen in een bepaald testmonster aanwezig is. De vele toepassingen waarvoor de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt, zullen aan deskundigen op het gebied waarop de uitvinding betrekking heeft gemakkelijk duidelijk zijn.

Hoewel beschreven is wat tot nog toe beschouwd wordt voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding te zijn, zal het aan de deskundigen duidelijk zijn dat verschillende wijzigingen en modificaties daarin kunnen worden aangebracht zonder dat daarmede de uitvinding wordt verlaten, en het is derhalve de bedoeling dat de bijgaande conclusies al dergelijke veranderingen en modificaties dekken voorzover ze binnen de ware geest en omvang van de uitvinding vallen.

Claims

CONCLUSIES 1. Inrichting voor het bepalen van de aawezigheid van antigenen (28) in een monster, daardoor gekenmerkt dat ze omvat : a. een vangzone (18) die materiaal bevat dat in staat is om vrij stromende, aan enzym-gebonden antilichamen (12) te vangen, maar niet in staat is om antilichamen (10) te vangen die gebonden zijn aan een transport- deeltje (14) dat vrijelijk door de vangzone (18) stroomtj en b. een substraatzone (20) die materiaal bevat dat in staat is om te reageren met aan enzym-gebonden antilichamen (12), onder vorming van een reactie die een indioatie geeft van de aanwezigheid van genoemde antilichamen.
2. Inrichting volgens conclusie l, daardoor gekenmerkt dat genoemde vang-en substraatzones (18 en 20) in een naast elkaar geplaätst verband staan.
3. Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat de genoemde reactie in de substraatzone (20) die een indicatie voor de aanwezigheid van genoemde, aan enzym-gebonden antilichamen (12) geeft, een kleurvormingsreactie is. EMI10.1
4. Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat genoemde vangzone (18) vervaardigd is uit nitrocellulose dat met proteine A is bekleed.
5. Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat genoemde vangzone (18) vervaardigd is uit agarosegel.
6. Werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid van een antigeen (28) in een testmonster, daardoor gekenmerkt dat ze de stappen omvat van : a. Het in contact brengen van. het testmonster met een mengsel van klasse een-en klasse twee-antilichamen (10 en 12) die beide specifiek zijn voor genoemd antigeen (28) maar elk verschillende domeinen op het <Desc/Clms Page number 11> antigeen (28) herkennen, waarbij genoemde klasse een- antilichamen (10) gebonden zijn aan een transportdeeltje (14) en genoemde klasse twee-antilichamen (12) gebonden zijn aan een enzym (16) waarbij in tegenwoordigheid van het antigeen (28) complexen (32) worden gevormd met genoemd mengsel die klasse een-antilichamen (lO) gebenden aan een transportdeeltje (14),

het antigeen (28), en klasse twee-, aan enzym-gebonden antilichamen (12) omvatten ; b. Het in contact brengen van genoemd mengsel met een inrichting (A) die een vangzone (18) en een substraat- zone (20) omvat, waarbij genoemde vangzone (l8) materiaal bevat dat in staat is om vrije antilichamen te vangen die niet gebonden, aan enzym-gebonden klasse twee-antilichamen (12) omvatten, maar niet in staat is om klasse een-antilichamen (10) te vangen die gebonden zijn aan een transportdeeltje (14) of enige andere stof die aan genoemd transportdeeltje (14) is gebonden met inbegrip van genoemde complexen (32), en waarbij genoemde substraatzone (20) materiaal bevat dat in staat is om met het enzym (16)

te reageren waarbij een indicatie wordt verkregen voor de aan- wezigheid van genoemde, aan enzym-gebonden klasse twee-antilichamen (12) ; :. het aan genoemd mengsel de gelegenheid geven om door genoemde vangzone (18) te passeren, waarbij alle aan genoemde transportdeeltjes (14) gebonden antilichamen, met inbegrip van genoemde complexen (32), vrijelijk door genoemde vangzone (18) stromen naardesubstraat- zone (20), terwijl alle niet direct of indirect aan genoemde transportdeeltjes (14) gebonden antilichamen, met inbegrip van vrij stromende, aan enzym-gebonden klasse twee-antilichamen (12), door genoemde vangzone <Desc/Clms Page number 12> (18) worden gevangen ;

en d. het observeren van de aanwezigheid of afwezigheid van enige verandering in genoemde substraatzone (20) om daardoor de aanwezigheid of afwezigheid van het te bepalen antigeen (28) in het monster te bepalen.
7. Werkwijze volgens conclusie 6, daardoor gekenmerkt dat genoemde vang-en substraatzones (18 en 20) in een. naast elkaar geplaatst verband staan.
8. Werkwijze volgens conclusie 6, daardoor gekenmerkt dat genoemde verandering in de substraatzone (20) om daardoor de aanwezigheid of afwezigheid van het te bepalen antigeen (28) in het monster te bepalen, veroorzaakt wordt door een kleurverandering.
9. Werkwijze volgens conclusie 6, daardoor gekenmerkt dat genoemde vangzone (18) vervaardigd is uit nitrocellulose.
10. Werkwijze volgens conclusie 6, daardoor gekenmerkt dat het te bepalen antigeen (28) humaan chorion gonadotrofine is.
11. Inrichting voor het bepalen van de aanwezigheid van antigenen in een monster, daardoor gekenmerkt dat ze omvat : a. Een vangzone (18) omvattende (i) klasse een-en klasse twee -antilichamen (10 en 12), die beide specifiek zijn voor het te bepalen antigeen (28) maar verschillende domeinen op het antigeen (28) herkennen, waarbij deklasse een-antilichamen (10) gebonden zijn aan een transport- deeltje (14) en de klasse twee-antilichamen (12) gebonden zijn aan een enzym (16), waarbij in tegertwoordig- beid van het te bepalen antigeen (28) de klasse een-en de klasse twee-antilichamen (10 en 12) complexen (32) vormen met genoemd antigeen (28) in de vangzone (18) welke complexen (32) klasse een-antilichamen (10)

gebonden aan een transportdeeltje (14) het antigeen (38), en klasse twee-, aan enzym-gebonden antilichamen <Desc/Clms Page number 13> (12) omvatten, en (ii) materiaal dat in staat is om de klasse twee-antilichamen (12) te vangen maar niet in staat is om de klasse een-antilichamen (10) of enige andere stof die aan het transportdeeltje (14) gebonden is, te vangen ; en b. een substraatzone (20) welke materiaal bevat dat in staat is om te regeren met de met enzym-gebonden EMI13.1 klasse twee-antilichamen (12) onder vorming van een reactie-die een indicatie geeft van de aanwezigheid van genoemde antilichamen (28).
12. Inrichting volgens con & lusie 11, daardoor gekenmerkt da t genoemde'vang- en substraatzones (18 en 20) in een naast elkaar geplaatst verband staan.
13. Inrichting volgens conclusie 11, daardoor gekenmerkt dat genoemde reactie in de substraatzone (20) die een indicatie geeft van de aanwezigheid van genoemde enzym-gebonden antilichamen (12), een kleur- vormingsreaetie is.
14. Inrichting volgens conclusie 11, daardoor gekenmerkt dat genoemde vangzone (18) vervaardigd is uit nitrocellulose dat met proteïne A is bekleed.
15. Inrichting volgens conclusie 11, daardoor gekenmerkt dat genoemde'langzone (18) vervaardigd is uit agarosegel.
16. Werkwijze voor. het bepalen van de aanwezigheid van een antigeen (28) in een testmonster, daardoor gekenmerkt dat ze de stappen omvat van : a. Het in contact brengen van het testmonster met een inrichting (A) omvattende (i) eenangzone (18) die klasse een-en klasse twee-antilichamen (10 en 12) bevat die beide specifiek zijn voor het antigeen (28) maar verschillende domeinen op het antigeen (28) herkennen, waarbij de klasse een-antilichamen (10) gebonden zijn aan een transportdeeltje (14) en de klasse twee-antilichamen (12) gebonden zijn <Desc/Clms Page number 14> aan een enzym (16), waarbij in tegenwoordigheid van het te bepalen antigeen (28) de klasse een- en de klasse twee-antilichamen (10 en 12) complexen (32)

vormen met genoemde antigeen (28) in de vangzone (18), welke complexen (32) klasse een-antilichamen (10) gebonden aan een transport- deeltje (14), het antigeen (28), en klasse twee-, aan enzym-gebonden antilichamen (12) omvatten, (ii) materiaal dat in staat is om de klasse twee- antilichamen (12) te vangen, maar niet in staat is om de klasse een-antilichamen (10) of enig ander materiaal dat aan genoemde transportdeeltjes (14) gebonden is, te vangen, en (iii) een substraatzone (20) die materiaal bevat dat in staat is om te reageren met de met enzym-gebonden klasse twee- antilichamen (12) onder vorming van een reactie die een indicatie geeft van de aanwezigheid van genoemde antilichamen (28) ;

b. het aan genoemd mengsel de gelegenheid geven om door genoemde vangzone (18) te passeren, waarbij alle aan genoemde transportdeeltjes (14) gebonden anti- lichamen (lotmet inbegrw van de complexen (32), vrijelijk door genoemde vangzone (18) naar de substraatzone (20) stromen, terwijl alle niet aan genoemde transportdeeltjes (14) gebonden anti- lichamen, met inbegrip van vrij stromende enzym- gebonden klasse twee-antilichamen (10) door genoemde vangzone (18) worden gevangen, en c. het observeren van de aanwezigheid of afwezigheid van enge verandering in genoemde substraatzone (20) om daardoor de aanwezigheid of afwezigheid van het te bepalen antigeen (28) in het monster te bepalen.
17. Werkwijze volgens conclusie 16, daardoor gekenmerkt dat genoemde vang-en substraatzones (18 en <Desc/Clms Page number 15> 20) in een naast elkaar geplaatst verband staan.
18. Werkwijze volgens conclusie 16, daardoor gekenmerkt dat genoemde verandering in de substraatzone (20) waardoor de aanwezigheid of afwezigheid van het te bepalen antigeen (28) in het monster wordt bepaald, veroorzaakt wordt door een kleurverandering.
19. Werkwijze volgens conclusie 16, daardoor gekenmerkt dat de vangzone (18) vervaardigd is van nitrocellulose.
20. Werkwijze volgens conclusie 16, daardoor gekenmerkt dat het te bepalen antigeen (28) humaan chorion gonadotrofine is.