AT507364A1 - Verfahren zur herstellung eines futtermittelzusatzes zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie futtermittelzusatz und verwendung desselben - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines futtermittelzusatzes zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen abbau von mykotoxinen sowie futtermittelzusatz und verwendung desselben Download PDF

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Description


  Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Futtermittelzusatzes zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen und einen Futtermittelzusatz zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in Futtermitteln bzw. im Verdauungstrakt von Tieren sowie die Verwendung derselben. 

  
Verschiedenste Mykotoxine treten auf landwirtschaftlichen Produkten sehr häufig auf und verursachen je nach Art der Mykotoxine schwere wirtschaftliche Schäden, insbesondere in den aus den landwirtschaftlichen Produkten hergestellten Nahrungsmitteln und auch bei Tieren und Menschen, welche derartige Nahrungsmittel verzehren, wobei derartige Schäden äusserst vielfältig sind. Es wurden bereits zahlreiche Methoden entwickelt, um zu versuchen, derartige Mykotoxine zu entgiften bzw. abzubauen oder unschädlich zu machen, um die durch die Mykotoxine verursachten Schäden in den Bereichen von tierischer und menschlicher Ernährung, der Tierzucht, Viehwirtschaft, Verarbeitung von Futter und Lebensmittel und dgl. hintanzuhalten. 

  
Unter den bekannten Mykotoxinen existiert eine Vielzahl von untereinander strukturell verwandten Mykotoxinen, wie beispielsweise die Fumonisine, von welchen Fumonisin Bx das am häufigsten vorkommende Toxin der Gruppe ist. Jedoch sind zahlreiche Derivate und verwandte Moleküle bekannt, welche ebenfalls giftige Wirkungen bei Tieren aufweisen, wie beispielsweise im Zusammenhang mit der Fütterung von kontaminiertem Mais. Fumonisine sind in diesem Zusammenhang eine nahezu allgegenwärtige Kontamination auf Mais, welche aber auch auf anderen Getreiden, Nüssen und Gemüse einen stark negativen Effekt in bezug auf die Tiergesundheit und Leistung darstellen. 

  
Der mikrobielle Abbau von Fumonisinen wurde bereits in der EP 1 860 954 beschrieben, gemäss welcher Mikroorganismen zur Entgiftung von Fumonisinen und Fumonisinderivaten eingesetzt werden, bei welchen die detoxifizierenden Bakterien oder Hefen, gewählt aus genau definierten Stämmen zur Entgiftung von Fumonisinen Futtermitteln zugesetzt werden. 

  
Auch wurden bereits katabolische Stoffwechselwege für den biologischen Abbau von Fumonisinen und die hiefür verantwortlichen Gene und Enzyme beschrieben. So beschreibt beispielsweise die EP 0 988 383 Fumonisin entgiftende Zusammensetzungen und Verfahren, wobei die eingesetzten, Fumonisin abbauenden Enzyme in erster Linie in transgenen Pflanzen produziert werden, bei welchen die Entgiftung von Fumonisinen mit Hilfe einer Aminooxidase, welche für ihre enzymatische Aktivität molekularen Sauerstoff benötigt, erfolgt. 

  
Des weiteren beschreibt die WO 2004/085624 Transaminasen, Deaminasen und Aminomutasen und Zusammensetzungen und Verfahren zur enzymatischen Detoxifizierung, wobei insbesondere aminierte Toxine, beispielsweise Fumonisine, entgiftet werden. In diesem Zusammenhang werden Polypeptide, welche eine Deaminaseaktivität besitzen, zur Entgiftung eingesetzt. 

  
Bisher bekannten Verfahren ist jedoch gemeinsam, dass sie für eine Detoxifizierung der Mykotoxine molekularen Sauerstoff für die beschriebenen, katabolischen Stoffwechselwege benötigen, wobei die insbesondere erforderlichen Aminooxidasen unter sauerstoffunabhängigen Bedingungen nicht arbeiten können. Ein Einsatz von derartigen Genen und Enzymen zur Detoxifizierung von Futtermitteln, beispielsweise im Verdauungstrakt von Tieren, ist aufgrund des im wesentlichen sauerstofffreien Milieus in dem Verdauungstrakt von Tieren nicht möglich bzw. zeigen die bekannten Gene oder Enzyme keinerlei Wirkung. 

  
Die Erfindung zielt nun darauf ab, ein Verfahren zur Herstellung eines Futtermittelzusatzes zur Verfügung zu stellen, mit welchem es gelingt, Mykotoxine und insbesondere Fumonisine unabhängig von Sauerstoff sicher und zuverlässig zu entgiften. 

  
Zur Lösung dieser Aufgaben ist das erfindungsgemässe Verfahren im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotisehen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder auch ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus gewonnen werden kann, wobei das wenigstens eine Enzym gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem Futtermittel eingesetzt wird. Dadurch, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend den nachfolgenden Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, gelingt es, spezifische, Fumonisine bzw.

   Mykotoxine abbauende Gene zu klonieren und zu produzieren, wobei beispielsweise die Expression in E.coli und Pichia pastoris unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt wird, bei welcher Expression Enzyme entsprechend den Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder auch ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus gewonnen werden können, welcher gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem Futtermittel eingesetzt wird. Mit einem nach einem derartigen Verfahren hergestellten Futtermittelzusatz gelingt es, Mykotoxine im Verdauungstrakt von Tieren auch in einem anaeroben oder einem sauerstoffunabhängigen Milieu vollständig und zuverlässig abzubauen, wobei die spezifischen bei diesem Verfahren exprimierten bzw. produzierten Enzyme den Abbau von Fumonisinen und von Zwischenprodukten des Abbauweges katalysieren.

   Mit einem derartigen Verfahren gelingt es weiterhin, den SphingolipidstoffWechsel, der durch eine Wechselwirkung der Fumonisine mit dem Enzym Ceramidsynthase behindert wird, aufrecht zu erhalten und gleichzeitig die Fumonisine biologisch zu nicht toxischen Substanzen abzubauen, welche von dem Tier ohne Schädigung ausgeschieden werden können. Schliesslich können technologische Anwendungen der Detoxifizierung erzielt werden, da dieses Verfahren auch im grösseren technischen Massstab, entgegen den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, anwendbar ist, so dass mit dem erfindungsgemässen Verfahren sicher und zuverlässig ein Futtermittelzusatz hergestellt werden kann, der Mykotoxine und insbesondere Fumonisine im sauerstoffunabhängigen Milieu enzymatisch abbauen kann. 

  
Die in dem erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Nukleinsäuresequenzen bzw. die mittels dieser Nukleinsäuresequenzen in bakteriellen und eukaryotischen Wirtszellen exprimierten, in sauerstoffunabhängigem Milieu sauerstoffunabhängig katalytisch wirkenden Enzyme sind nachfolgend aufgelistet. 

  
Nukleinsäuren Sequenzen: 

  
>Seq ID 1 ( fu (Fumonisinkatabolismus) Geneluster, 15.420 bp) 

  
TGTCGGCGATCRGTAAACTTCTACCGTGGTCCTCGTTCGCCCACAKCATACATCACAGACRTCGGGATTTCCAACTGAAC 

  
GGGTCCCGGCCTGCCGGCCCACATTTCCCGGAACGCCATATGGGTGATTTCGACAATCCGGTTCCAGGCGAAGATGGGTG 

  
CGCCCCATTTAACCGCGGGTCGAAAGAGGTCGATCTGGTCT[Tau]GTCCCTGAAAGGTTTTTGGCGTGCAGGGATAAACGACA 

  
CCAAGTTGATGCTGGGACGTTATTGCGACGAAGGGAACCCCTTCGTGGCGTGCCGTCACGACTCCAGGCAGAAGGTTTGC 

  
CGTACCGGGACCCGGATTCGTGACAATCGCGGCGACCTGTCCGGTGGTCTTGTAAATGCCCTCGGCCATATAGGCTGCGG 

  
CGGCCTCGTGCCGCACCGGGACGAACAATATCCCÄTTGTCTTCGAGCGCAGCCAGGAGCGGATCCACCTCCGGCGACATG 

  
AGGCCGAAGACATACCGGACGCCT[Tau]CGACGGCCAAACATCGTGCCAATAATTCTCCGCCCGTGAGGCGCATGACGATCTC 

  
CAGTACGAAAGGTGAGTGCCCAGGTTCCGGCACATTCGCTGTGGTTAGTTGATGCGCTGATCGGCCAACCGACTGAGTGG 

  
AGTTGGATGGCCGCACCTTACCCTGTCGCGCATAACTCTCAGATCCGGAAACGGACCCCGACATTAAAATAGCGGCCGAC 

  
CGGATCATAGGCAGAGCTGGTCGGGCTGGAAAAACTGCTGGGGTCGTTCGTCGCTATTGGCGGATCTCGGTCGAACAAAT 

  
TATTGACCGATAGAAACAGCTGCTGCTTCTGGCCAAAAGCCGCGATGTCGAAGGTCAATGTCGCGTCGGTGTACCAAACC 

  
GCCGGAGCGTGGTTCAAATTCGTATCGACGCCCTCCACATTGTCGGCATTGAACACCGATGCTGCGATGAAGCGCTGCTG 

  
CACGAGAAGCGCCCAATCGTCGGTCGAATATCGCGCCTGGAAGTTGGCCGACCATTTTGGCGTGTCCGGTTGTCCGAGCG 

  
AACGGATGGGCGCCGAGCCGGTCGCGATGCGATAGGCAGAGGTATGGTGCGTTGCCAGCGCACGAAGACTGAACGTGCCG 

  
CCGCCGACGGGGCGTGAGTAATAGGCCTCGAAGTCAATTCCCGCCGCTTTCTGGACAGCCAGGTTGAGATTGGGACCCGT 

  
CACTGTGATGGTGCCGTCCGGATTCTCCGTTATGAGGTCGCAGAAGAAGGTGTTTCCTGCATCGCACGCGTCGATTTCCT 

  
GCTGGG[Sigma]AAGGAGGAAATCGATCGCGCCCTTCACCTTCACCACATAGCGATCGACCGAAAACTGAAACCCCGGCACGAAG 

  
GCGGGGCGTAGCACCGCGCCGAATGTAAGGACGTCCGCCTTTTCAGGGCGCAAATCCGCGTTGCCGGCGGTAAAGAACCG 

  
CGTCTGCACAGCCTGTCCGCCATAAATTGAATTGAGCGTCGCCTGACGGCCGGGGTCGAATAGCTCGACAAGGCTTGGCC 

  
CGCGGATATCTCGCGAACGGGTCGCGCGGAACCTGAGGCCGTCGATCGGCTCATATTCTCCGCCCAGCTTCCAGGTTGTT 

  
ACTCCACCGGACTGGCTGTAATCGGCATATCGGACGGCGCCGTTTAAGTTCAGCGAACGTCCCAGCGCGCTGTCCTTCAG 

  
AATCGGGACGCCGATTTCGACAAAACCTTCCTTGATGTCATAGCTTCCCGAGAAGGGAAGTGGGT[Tau]GTAGAGATTGAAGC 

  
CTCCAGGCCGACCTGCCTGCGCCGCCGGAGCCCCCCTGATTCCCGTGATCGAGGTCGTCGCCTGCGATATCGCGTCGGTT 

  
TCCTGCCGGGCCTTCTCCTTGCGATATTCGATACCAGCGGCGACCGAGACCGGGCCCGCGCCGAACGACAGGCTATCGCC 

  
GAGGTCGCCGGAAATCGTGAGTCCCGCCACATATTGCTCAAGCCTCAGCTGAGCGACGCCATCAGCGGTGACATAGTCGA 

  
TGGCCGACGCGCTCGGCGAGCCTGTGCCGAAGAGAT[Tau]GAGCGGCACGCAATCTTGGTCGAGGCCGGCCAGTGTTGAACGG 

  
CAGACGATATTGCCCGCGGGATCGCGGACCGCATCGACGGCGGCGTAGAGATTGCGG[Tau]TGATGGTGAGATTGTTTTCACG 

  
AAGCTCGAGGTCCGTAAGGCCAAAGGAGGCCGAGCCATCGAGTTTCCAGCCATTGCCAATGTCTGCCCGGAAGCCGGCAG 

  
CGCCGCGGTAGACCTTTGCGAAATTC[Tau]CGATTTCGACCAAGGGAAAGTCGCTTGAGAAGCGACCGACAACGATCGAAGCC 

  
TGGGCATTTCTG[Tau]CCATGAGCGTCGCGAGTGGAGCCGGAAGGAAGGCGTTATCACGGAAGATCCGGAAATTATTCGAGCC 

  
ACCGACATGCGATATTACGAAT[Sigma]CACCCAGGTTGGTGTGGGAATAAGCATAGGTGCCCTCCGCATACACCTGCACAGTGT 

  
CGGACACATCATATGCGGCGCGTAGGAACGCGTTGTAGCGAAGCTGATCCGGGGCGAAGCCGATATTCACGCGCGGTCCA 

  
TCGCCGCCGCTCTGGAACGACGAGCTCGTAAAATTCCCGTAGTCGAAGGTCCCTAGGACTCCTCCGGGCAAAAACGCGAT 

  
GCCTTTCAGAGGGCCGGACGTGACAAGTCCGCCGTAGGATCCGCGAGAACTGCGAATATCGGGC[Alpha]CGACCGTGACGCCTG 

  
TCGTAGCGCCGGGCACGGGATATTGGCCGGCGGCGATGTCGAACCAGCGGCGACCCGTTGCTTCATCGGCCCGGATTCCG 

  
TCCTGTCGAAAATATTCGAAGCTGCCGAGCAAGTGCAACCGGTCGTCGGCTIAACGAAGTGCCGAAGGCGATCGAACCGCC 

  
GTAGGACGGGAGGTCGCCGCGGGTTGAAACACCCGACTGGAGCTCGGCCCTGATGCCTTCCAGATCTTCGTCGAGCACGA 

  
AGTTGATGACGCCCGAAACGGCATCGGAACCGTAGGCGGCCGAGGCGCCGCCCGTCACGACATCGACGCGCTTGACCAAC 

  
GCCTGCGGCAGCACGTTGATATCGACCGAGCCTGTGAAATTGGTCGCGACGAAACGGTTGCCGTTCAGCAGGACGAGGTT 

  
CCGGTTTGACCCGAGGCCGCGCATGTTGAGCAGGTTCTGACCGCTGTTCCCC[Sigma]TTCCGGGTGTCGTGCCAGGGTTGGAGG 

  
TCTTCAAGCTGTCGTTGAACACGGGCAGCTGGTTGAGTGCGTCGGCAAGGTTGGTCGGAGATGCCTCCTTCAACTGCTCG 

  
CTGGATACGGCTGTAACCGGCGTCGGCGAATTGAAGCCGTTCTGGAGGCGGCTGCCGGTCACGACGATTTCGCTCGTTCC 

  
CCGGTCCGTGTCCGCTTCGTCCGGCTGACCTATCGATGCGGGATCGCTATCCTGAGCACTGGCAGAGACAGGAAATGCGA 

  
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CCCTCCCGAATTGATAGGGACTCCGTTTGAGTCCCCTTGTTTCTTGACGCCGCCGTCGCTCACCACGGTCCGGTCGGAGG CTAAGCGTCGGGCCTAAGGACCCGCAATTTGAACATCÄAATGCAATGATCGGAGGCTTCATTGCACTTCGCGCATAGACC GGCGCGGTAGCTGAAAGTGCCAATAATCAGGGATTTTGCTGAACAGTTGCGGCATGACGTCCGGCATCGGCCACGCGGTT GGCGGCATCGACGTGGCTTTCGCGTCGCCGCCCCTCÄAGCACCGGCGAGTTGCATTAAAATGGGATGAGGCTGGAGAGAC GCAAAATCTCTGAGGACCGCGCTGAACGCGCGATCCGTCGCCTCGAGGGTCTCCGTTACATCGTCAACTGTATGGGCCGC AGAGAGAAACATATTGTGATAGGGATGAACATAGACGCCGCCCTTCAGGCACGCCGCGGCCCACGCATAGCCGATCCGAA AATCGGGATCGTCCGCAAAGAATATTTGCGGCATCTGCGCCGGGCCCGTCTGCTTCAACTCAAGACCATGGCGCTGAGAC TGTGCCTCCAGGCCTGCCCGCAGGGCGGCGCCGCTGGCGATCAGCGTTTCGAGATAAGGCGTCTCTCGAATGATCCTGAG GGTTTCGATCGCGGCCGCCATCGGTACCGCAGAGAACCAGAAGGAGCCGGTCACÄAATATATCCCGCGCCGCATCGCGCG CCTTGTTCGAGCCCAGCAGGGCGGAGATCGGATAGCCATTCGCAAAGCATTTTCCCCAGCAACTGAGATCGGGTTCGATA 

  CCCAAATGCGTCCAGCTGCAATCGCGCGCCACCCGGAAACCTGCGCGCACATCGTCAACGACCAGAAGCGCACCGGTC[tau]C GTCACAACATTTTCGAGCGGTGCGCGCGAACTCAAGCTGGGCGAGGGCCTGGTCCTCAAATACTTCGTGTCGGAAAGGTG TGGCAAAGACAGCCGCAATATCGCCATCGTGCGCCTTGAACGCGTCCGATAAGCTTTGGGCGTCGTTATAGGTATAATAT GCGACATGCACGCGATCGGAAGCGAGAATCCCGGCAGTATGCGGAGTGTTCCACGGGGAAGCGCCATGATAGGCGCCTTT GGCGCATAATATGGTTTTGCGCCCCGTATGGGCACGCGCGAGAACCATCGCCGTTGAGGTGGCATCGCTGCCATTTTTGC AGAACÄTCGCCCAATCCGCATGACGGACCATGCCCACÄAAGGCTTCGGCGAGGTTGACCATGATCTCC[sigma]AAGGACCGG[tau]C ATGGTGTCGCCGAGAAGTCGCTGCGCATCAGCCGCGGCTTCGAT[tau]TCGGATTGCCGGTAACCGAGCAAATTTGGCCCATA CGCGCACATATAGTCGATATAGGGCTGCTCGTCGGCGTCCCAAATTCGTGCCCCCAGCGCGCGCC[tau]GAAGAACTGGGGGA ATTCTGGCGGCAGCAACCGTGTCGACTCGTGGCCGTACATCCCGCCCGGAATGACCCGTTCGGCGCGTTCTCTGAGATCT TTCTGCCTTGTTCCGT[tau]CGCCATAATGCACCTCTCGCGATAAATAATGGGTAAAAATCCACGAAATTCAACGATTCGTGA 

  TCTGAAAGAGATATATCTTGTAATATACTGTATAATTATACACAATGCGCAATCGGACGACGGGATAGCGGGGCAGGGAG GACGGGGAAATCTATGCGGAACGTCAGCGACAAGGCGCCGCCCCACGAGACGC[tau]CACCGTAGTCGTCGCGGCAATGATCG TTGGCACGGCCGCCTTGATGGTGCTTGGAATACAGCCCATCCTTC[tau]CGGCGCCCTTGTAGAGGAGGGGCG[tau]ATTCCCGCC GAGGGGTTGGGATCGGCGGCAACGGTGGAAATACTGGCGATCGCGGCGGGAACATGCATCGGACCCGTTCTTATGAAGAC GGGATATCTGCGGGCGAAATGCGCGGCACTCTGCTTAATGCTCGCCGCAATCAACTTCGGATTGACGTTGCCGGGT[tau]TCG ATTTGCCCATCGTGGCTTGCCGAGCGGCAGCGGGAGCCCTGGAAGGTCTTTCGCTCAGCGCGGCGATCCTGATCATGACT CATAATCGGCGGCCGGACCGGCTGAGCGGAATATTTCTGGGCGCGCAGACGATACCGCAGGTAATATCTGC[tau][tau]ATTTGCT CCCGACGGAGATTATTCCGCGCTGGGGGAGCGCAGGCGGCTTCACGATCCTGGGCATTCTCGCGGCGATCGCCGCGATCG CGGCTCTGTGCCTCGTCGATCGCGTTGAGCTCGATCCGACGACCGTTAACGACGACTTGCAGTGGTCACCCGCGGCGATC GTCATTTCGATGGCGGCATTCGTTCAATTCTCGGGGGTCGGTGCCGCATGGAGCTATCTGGAGCGACTGGCTGCGCAGCA 

  CGGATTTTCGGGAGAAACGATCGGTATCGCCATTTCCGGGAGTTTGCTTTGCCÄGGTAGGCGGGGCTTGGCTGGCCGCTT GGATCGGTGGGCGGGTCGGATATCGCTTCGCCTTAATCGCTGGGAGCCTGCTTCAGGCGGGCÄACGTGATCGCATTGGCG GTGGCCGATCAGCCAAGCTGGTTTATTTCCGCTTCCTGTGCTTTCGGCCTGTTC[tau]GGTTGGCGATGCAGCCCTTCCAAAT CCGCTTCGCGATCGCGATAGATAACAGCCG[sigma]CAGCTTGCTGTACTGCTGACGCCGATCGCCCTCGTCGGGTTGAGCGCGG GGCCCTTGTTGCTCTCTCGCTT[tau]GCCGGGGCGACCGACTTGCGCTGGATCTTTGTGGGGAGTTCGACCTTGTTGCTGGCC AGCGCGCTTCTGTATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCAACCGCGCGGAAAGGTGATCGCTGAAACGGTGGACGTATGAAAAAG ACGGATCGGGGTTCGCGATGACATCGCAGGTCAAGCTTCGTAGCGCGGCAAAGCGGCCGCGCAGTCCTAAAAGCGAGCGA GGTCTTGCTCGTTACGAGTCCTTGCTTGATGCGACCGACAGGCTGTTGGTCGATCTAGACCCCGATCAGGTCGGTCTCTA TCAGATTGCAGAGGAAGCGGGTGCCTCACCGTCGTCCGTCTATCATTTCTTTCCGACCAAGGAAGTGGCTCATCTCGCTC TGATGCGCCGCTATCT[sigma]GA[sigma][sigma]GGCTCCGGAATCTCGACGCGATGGAAGTCGACATCG[sigma]CCAGCTCGAAAGCTGGCAGGAC 

  CTGATGAAGTTGGATCAGATCAGGGCGCGAGACTATTATAATAGCCACCCGCCCGCCCTCAA[sigma]CTTCTGTTCGGCGGATA TGGCGGGGTCGAGGCCAGAAAGCTTGACGAGCGATACTCCGAGGAAATCGTGAGCTCCATGTATGGCAGATACAACGGCA TTTTCCATATGCCGCAAATGGAGAATGAGGCTCTCATGTTCACGATCTGCTTCGCAATTCTCGACGCGGTATGGGCCGTC TCCTTTCGCCGGTTCGGTGAAATTACGTCGGATTTTCTTCGGGAGGGGCAAGCGGCTTGCATTGCCTATTGCCGACACTA TCTGCCCGAGCGAACGCCATCAGCGTGAATCCGTTCAACGATATGCAGGAATGTCCGTTGCGTTGAGTTCGGTTCTGAGT TCGGTCGGTTAGGAGGCCCCGCGATAAACCAACGCTCTTCTGTCGAAGGGATGTCGCCTGGTTCGACCAGGCCCTGCGAA GTCAGCCGCAATCAACGAGGCAGATGTCAACGTGGCCAGCAAGTTCAACTGTGAGTTACTCGATCTGCGATCATTTGTTG CGGTGTATGAAACGCGAAGTTTTAGCCACGCCGCGCGGCTTCTGAATCAATCGCAGCCCGCGCTCAGCCGGAGAATCCAG CGCCTCGAGAGTCTCGTGGGCGGTCCGT[tau]GTTCGAGCGGACCAGTCGGTCGCTTGCCGAAACGGCGCTCGGCAAAGAGTT GCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTTGTCGATACGTCGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGA 

  CAGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGCCGCCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACATGGATCAAAAT CCGAGGGTCCGACTCCGCATCCTTGACGTGCCGGCGGTCGAGGCTGCGGACCTGGTTGCGAGCGGCGAGGCGGAGTTCGG CATCAGCATTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGCCTGCGGTTCGATGCGCTCCACGAGGACCCGTTCGGCCTGGCATGCCACC GAAGCCATCCGCTGGCGTCGCTCGAGATCCTTGAATGGACGCAATTGAAAGGTGAAAGCCTGATCGCCGTTCACCGTGCG AGCCGGAACCGCACGTTGCTCGATGCCGAACTCGCGCGCAACAATATCGCGCTGGAATGGCGGTATGAGGTCGCGCATC[tau] GACGACGGCGCTGGGATTGATCGATGCGCAATTGGGTGTCGCTGTTATGCCCCGCATGGTTATGCCCCGC[tau]CGGGTCGGT CGGAGGTCGTCTG[sigma]CGCCCCGTCGTCGCGCCGGTCG[tau]CCAACGCACGATCGGCATCG[tau]TCAGCGCCGCACCGGCTCGATG CACCCTGCCGCACAGCAATTGCTTGCGCGGCTCCGCGCGGCCTGGTCG[tau]CCGCCAATCTGGGCGACATCGCGTCTCGCGA AGATGGGGCATCGTGACACGCGT CTATGCGCCTGCAGCATCGATGCTCACGATCATTGCATTTGCTGAGAGACGAACGC GAAGATACCGCTGGGTCACAGGATATCAGTCCATCGAGGCGGGAGAGAAATGTGTGAAAGAGCACCAATGCCGTGGCGGC 

  CGGGCGTCCCCCGCTGCGCCCGCCACGTGGCTTGCGCGGATCAGCGTTTCCCGGGGGGCCTCCGCCATCGCCTGGACCTT CATGCTTGGCGCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCAAACTGACGATCCGAAGCTCGTTCGTCATACCCÄGTCGGGCGCCG 

  
TCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGGAATACCCTTCGCGGCTCCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGG CCGCCGGCTCCGCCGAGGGCGTGGGCGGGCACCAGGGACGGCCGCCGCTTTGCGCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCT TAGAGAGGGGAGCCGGGCTGCCGGGACGAGCGAAGACTGCCTCTATCTGAATATCTGGTCTCCCAAACAGGTCGGTAAGG GGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCTGGCGCGGTGCCATATTATGACGGCTCT GCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCAACTATCGCGCCGGGATTCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCT TTCAAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATGGTCTTCTCGACATGCTCGCGGCGTTCAAATGGGTTCAGAACA ACATAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTCACGGTCTTTGGCGAGTCCGCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTC 

  
CTGACCTCGCCGCTCAGTGAGAGCGCCTTCAATCAGGCGATACTGCAAAGTCCGGGTCTGGCCÄGGCCGCTCGCCACGCT 

  
TTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCCGATATTTCTGCTCTACGGCGTGCCGATGCGGGCGAATTGACGA 

  
AGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTCACCAAGCCGCGGCCGATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTT 

  
TTGCGCACCCTTGACGTCGATGCCTTCGCCAAGGGGGCCTTCCGCAAGATACCCGTTCTGGTCGGCGGAAACGCCGACGA 

  
AGGGCGCGCTTTTACGGATCGCCTGCCGGTCAAAACGGTCCTTGAATATCGAGCCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACG 

  
AGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCCGCCGCCGTTGCCCGTC[Tau][Tau]TTTGGGGAT 

  
AGTCAGTTCAACAACGGGATCGAGCTGCTCTCGGCAGCCTTCGCGAAATGGCGAACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTAC 

  
GGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCATGGAGACGAAATTCCCTATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGT 

  
CCGTATCTATGTTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCGCCGGGGCGTCGGACATCAAACTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGG 

  
GTGAGCTTCGCGGTGCACGGGGTCCCCGATCAGGGCACGAAATCGCACTGGCCGCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCAT 

  
GACTT[Tau]TGGTTCGCAGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCÄAAATAGCGCC 

  
CGGCCTGTGCGTGCTTCAGCACGCCGTCCCGCTTTGCGGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGTAAGTTGCG 

  
CTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTGCÄTTGACGGCÄGCCGTGACGGCGCGTGAAGCGGGGGCCTCGGTTC 

  
TTGTGATCGAGCATGCGCCGCGCGCCATGCGCGGCGGCAACAGTCGTCACACACGCAATATGCGTACGATGCACGAACGT 

  
CCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATATTCGGCGGACGAATATTGGAATGATCTTGTCCGC[Sigma]TCACGGGGGG[Sigma]CGCACCGA 

  
CGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCAACACCACCGACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCGTTTCCAGC 

  
CCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACCTIACGCATTCTTCCTTGGCGGCGGGAAGGCGCTTGTAAACGCATAT 

  
TACGCCACGGCCGAACGGCTAGGCGTCGATATTCTCTATGATTCTGAGGTGACCGAGATCAACCTTCAGCAAGGCGTCGT 

  
GCAGCGTCTGCAATTGCGCAGCCGGGGATTCCCTGTCGAAGTGGAAGCCAAGGCTGCCATCGCCTCGTCCGGAGGATTCC 

  
AGGCAAATCTTGACTGGCTCTCAAGCGCATGGGGGCCTGCTGCGGCGAACTTCATCGTACGGGGCACGCCATATGCGACT 

  
GGCACGGTGCTCAAGAACC[Tau]GTTGGAGCAAGGCGTCGCCTCGGTGGGAGATCCAACCCAATGCCATGCTGTCGCGATCGA 

  
TGGGCGAGCGCCCAAATACGACGGCGGCATCGTCÄCACGACTGGACTGCGTTCCCTTCTCGATCGTCGTCAACÄAGGACG 

  
CCTTGCGCTTCTACGATGAAGGCGAAGATGTGTGGCCGAAGCGTTACGCCATATGGGGTCGCTTGGTGGCACAGCAGCCT 

  
GATCAGATCGCTTTCAGCATAATCGATCGGCAGGCCGAAGACCTCTTCATGCCGTCAGTGTTCCCCCCCGTGCAAGCGGA 

  
CACGA[Tau]CGCGGGTCTGGCCGAGAAACTCGGTCTGAATCCCGTAACCCTGGAACGCACGGTGGCCGAATTCÄACGCCGCAT 

  
GCGTGCCCGGCGAATTCGGCGGCCAAGATCTCGACGACCTCCACACCGAGGGAATCGAACCAAAGAAATCCAACTGGGCC 

  
CGACCGATTATTGTGCCCCCGTTCAGCGCCTATCCTCTCCGGCCCGGGATCACCTTCACCTATCTCGGCGTCAAGGTAGA 

  
CAGCCGTGCGCGGGTCATCATGGAGACAGGTGAGCCGACAAAAAACCTGTTTGCTTCGGGGGAAATAATGGCGGGCAGCA 

  
TTCTCGGCCAAGGTTATCTCGCTGGATTTGGAATGGCGATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGGAGGCCGCA 

  
CGTCA[Tau]GCAGGATTTTGATCTCGTAAAAATGCTGTCTGACTTGCCGTCGGCGCCGGAGCTGGAAGCCAGGCGCGTTATGG 

  
AGGTGTGCAACGCGTGCCGCTATTGCGAAGGGTTCTGCGCGGTATTTCCTGCAATGACCTTGCAGCGTCATTTCGCCAGC 

  
GGCGATCTCAGCCACCTCGCCAATCTCTGCCACTCGTGCCAAGGTTGCTATTACGCCTGCCAATACGCCCCTCCGCATGA 

  
GT[Tau]CGGAATAAACGTTCCAAAGGCGCTGTCGGAGTTGCGGCTCGAGAGCTACGAGCAGCA[Tau]GCTTGGCCCCGGCCGGTCG 

  
CCGCTCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCATTTCCATCTTGTCGGCGGCATGCATAACCGGCGTCCTTCTGCTTGCCGCC 

  
ATCTTCAACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATCGGTGCCCGGCGGCGGGTTTTACAACGTTATTCCTTATCAGGC 

  
GATGATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCGCGCTGGCGCTGGCGATCAGTCTCGTTCGCTTTTCGCGGACGA 

  
TCGGTCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCGGTTCTTCGGGCGCTACGCGATGCGGCGACTCTGCGATATCTC 

  
GGCGGCAGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGACGAGACATTTTCGACGACCCGGCGAAAATTTCATCACGCCCTTGC 

  
CTATGGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCACGGGCACGATCTACGATCATATGTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATG 

  
CGCTTTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACCGTTGGGGGGATCGGAATGGTCGTGGGCGCGATCGGCCTACTCTGGCTC 

  
AAGCTGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGATCACCGGCACTGCTTGGGCCGGATGTTGCCCTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCAT 

  
AGCGGCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGCACCGAAGTCATGGGCGTCGCGCTCGCCGTCCATCTCGGCGTCG 

  
TCTTGGCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCÄCGGTATCTTCAGGCTCACGGCTCTCGTGCGCCATCAT 

  
GCTGACCGCGAGGCAAGTAATGGCTTCGCCTCCAGCCCTCCCACGAAAAAGGGTTAAACAATGGAACATATGAAGTCCGT 

  
TCGCGATCGCAGTAGCGTCATGCAGATCGTGAGAGTGGCGAGTGGCAACTGTCTC[Sigma]AGCAATATGATTTCTTCGTTTACG 

  
GCTTCTATGCGGCATATATTGCGAGAAGCTTTTTTCCGACCGGCGATAACGCGACATCGCTCATGCTTTCAT[Tau]GGCCACT 

  
TTTGGCGCTGGTTTCCTCATGAGGCCCTTGGGGGCGATTTTTCTCGGGTCCTACATCGATCGCGTCGGGCGTCGGAAAGG 

  
CCTGATCGTGACACTCGCGATCATGGCCGTCGGAACCCTCACCATTGCGATGACTCCAAGCTATGAGGCAATTGGAT[Tau]AC 

  
TCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCAGGGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGTCGGGTGGCGTCTCAGTGTAC 

  
TTGGCGGAAATTGCGTCGCCCAAATCGAGAGGCTTCTTCACCTCGTGGCAGTCTGCCAGCCAGCAGGTGGCCGTCATGAT 

  
CGCCGCCGCGATCGGTCTTGCGCTGCAATCÄACGCTTTCACCGGAGCAAATGAACGACTGGGGATGGCGGGTGCCCTTGT 

  
TGATCGGATGC[Tau]TGATTATCCCCGTGATACTCTGGCTGCGCCGGTCTCTCCCGGAAACGAAAGCCTATCTCCACATGGAG 

  
CACAAGGCGCATTCGATCGGCGAATCCCTCCGCGAATTGCAACAGAGCTGGGGGCTGATCTTGACGGGCÄTGGCGATGTC 

  
GATCCTCACGACGACCACCTTTTACÄTGATTACCGCCTATACGCCGACATTTGGCGAGAAAGCACTCGGACTGAGCCCGC 

  
AAGATGTCCTGCTGGTTACCATCATGGTCGGCGTGTCGAACTTCCTGTGGCTTCCGATCGGGGGTGCTC[Tau]CTCGGATCGT 

  
ATCGGTAGAACCCCGATCCTACTGGTCGTGCCGGTCÄCCGTTCTCGCCATCGCCTTTCCCCTGATGAGCTGGCTCGTCGC 

  
GGCACCGACATTCGGAGCGCTTGCAGCTGTTCTGCTGACTTTCTCCGCATGCTTTGGACTCTATAATGGGGCGCTCATCG 

  
CGAGACTCACCGAGATTATGCCTCCCGCCATTAGAACCCTTGGCTTCTCGCTGGCGTTCAGTCTCGCGACCTCGCTGTTC 

  
GGCGGCTTCACCCCATTGGTAAGTACGGCGCTAATCCÄCGCGACGGGCAGCÄATTCCGCGCCTGCAATCTGGCTCTGTTT 

  
TGCGGCTTTCATCAGCTTCGTCGGTGTGGCCGCA[Tau]CGACCCGGCTGAGCCGGCCAATCGCCGAAGGCGCCAGATAGGACA 

  
ATCAGAGAATGCCCGTGCGGCAATGAAGCGAGATTCGGGCGGTAGGTGCGCTGGCGGCACTTCGCGAAGAGCCGTTGCGG 

  
ACGGCTGAAACGATGATGGTATGAATGGGCTAAGACATGAGAGCAGTAGTT[Tau]ACCGAAAT[Sigma]GCGAACT[Tau]GTCCTGGGGGC 

  
CTATGCTGATCCGATACCCGCCGCCGGGCAGGTGCTCGTCAAGACCAGAGCATGCGGCATCTGCGGATCTGACCTTCATT 

  
TT[Tau]GCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTTGCATCGCGGGCGGGTATCGCCTCTATGGAAGTTGATTTGTGTCGAGAC 

  
ATCGTTCTGGGGCATGAATTCTGTGGCGAGATTATGGAGTTCGGGCCCTC[Tau]GCGGATCGTCGCTTCAAACCCGGACAGCT 

  
TGTGTGCTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGGAGCGCGGACGATTGGCTACTCGGATGAGTATCCCGGCGGGCTCG 

  
GCGAATATATGGTCCTCACGGAAGCGCTCTTGCTGCCTGTTCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTTGACGGAG CCGATGGCGGTGGGATGGCATGCCGTCGAGATCGCGCAGGTTCAACCACATCACATCCCTGTGGTGATCGGGTGCGGACC GGTCGGGTTGGCAGTCGTCGCTGCCCTGAAACATAAGCAAGTTGCTCCGATTATTGCGTCGGATCCÄTCGCCCGATCGGC GTGCTCTTGCTCTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTGTCGATCCGCGCGAAGAATCACCCTTTCGCCAGGCCGAGAAGATC GCACGCCCGGTCGGACAAGGTGGGGCCCTGTCCAGCTCATTGCTGTCAAAGTCTCAAATGATATTCGAATGCGTAGGGGT GCCGGGCATGCTTCGGCATGCGATGGACGGCGCGTCCGACGGGTCCGAGATCÄTGGTCGTTGGCGCATGCATGCAGCCGG ACGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGCTCACGATCAAATTCTCGCGAACTTACACGGGTGAGGAATTCGCC GCGGTGCTTCACATGATAGGTGAGGGCGCACTCGACGTATCTCCGCTCGTTACCGATGTGATTGGCCTGTCCGATGTCCC GTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCAAGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGAGCCTGAGGATGCC AAGGGTGCGACGTTGGGCATCGTCAAAGAAGGCGACGTTGACCCGGTATGTGAACATCCCCATATTCTTCCGCAGCTGAA GCAGTTGGTAAACATGCCAAAATATGAACTGTAGTATTGCGTCGGGGTTCTCATTGTGGGGTTTGCCATTGTCATCGCTC 

  GCACCCGGCGACAAAGATTAGATGTACTTCCGATAATCCGTGC[tau]CTCGACCTGGCCTTCCTTCATATATTTCAGGACCTC TCCGACCATGC[sigma]TGCGGCGCGGA[tau]CGGGATCGGCAGGCGTTGGTTCATCTGGGTCGAGTTCCAGTTGATCTTCGTAAGAG 

  
AGA[Alpha]CACCTCCTCGGCTAACTGCGCCGCGGTACTATCGCAGGATCGTCTCGAGCGTYCGC 

  
>Seq ID 2 (fumA) 

  
ATGCGGAACGTCAGCGACAAGGCGCCGCCCCACGAGACGCTCACCGTAGTCGTCGCGGCAATGATCGTTGGCACGGCCGC 

  
CTTGATGGTGCTTGGAATACAGCCCATCCTTCTCGGCGCCCTTGTAGAGGAGGGGCGTATTCCCGCCGAGGGGTTGGGAT 

  
CGGCGGCAACGGTGGAAATAC[Tau]GGCGATCGCGGCGGGAACATGCATCGGACCCGTTCTTATGAAGACGGGATATCTGCGG 

  
GCGAAATGCGCGGCACTCTGCTTAATGCTCGCCGCAATCAACTTCGGATTGACGTTGCCGGGTTTCGATTTGCCCATCGT 

  
GGCTTGCCGAGCGGCAGCGGGAGCCCTGGAAGGTCTTTCGCTCAGCGCGGCGATCCTGATCATGACTCATAATCGGCGGC 

  
CGGACCGGCTGAGCGGAATATTTCTGGGCGCGCAGACGA[Tau]ACCGCAGGTAATATCTGCTTATTTGCTCCCGACGGAGATT 

  
ATTCCGCGCTGGGGGAGCGCAGGCGGCTTCACGATCCTGGGCATTCTCGCGGCGATCGCCGCGATCGCGGCTCTGTGCCT 

  
CGTCGATCGCGTTGAGCTCGATCCGACGACCGTTAACGACGACTTGCAGTGGTCACCCGCGGCGATCGTCATTTCGATGG 

  
CGGCATTCGTTCAATTCTCGGGGGTCGGTGCCGCATGGAGCTATCTGGAGCGACTGGCTGCGCAGCACGGATTTTCGGGA 

  
GAAACGATCGGTATCGCCATTTCCGGGAGTTTGCTTTGCCAGGTAGGCGGGGCTTGGCTGGCCGCTTGGATCGGTGGGCG 

  
GGTCGGATATCGCTTCGCCTTAATCGCTGGGAGCCTGCTTCAGGCGGGCAACGTGATCGCÄTTGGCGGTGGCCGATCAGC 

  
CAAGCTGGTTTATTTCCGCTTCCTGTGCTTTCGGCCTGT[Tau]CTGGTTGGCGATGCAGCCCTTCCAAATCCGCTTCGCGATC 

  
GCGATAGATAACAGCCGGCAGCTTGCTGTACTGCTGACGCCGATCGCCCTCGTCGGGTTGAGCGCGGGGCCCTTGTTGCT 

  
CTCTCGCTTTGCCGGGGCGACCGACTTGCGCTGGATCTTTGTGGGGAGTTCGACCTTGTTGCTGGCCAGCGCGCTTCTGT 

  
ATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCAACCGCGCGGAAAGGTGATCGCTGAAACGGTGGACGTA 

  
>Seq ID 4 (fumB) 

  
ATGACATCGCAGGTCAAGCTTCGTAGCGCGGCAAAGCGGCCGCGCAGTCCTAAAAGCGAGCGAGGTCTTGCTCGTTACGA GTCCTTGCTTGATGCGACCGACAGGCTGTTGGTCGATCTAGACCCCGATCAGGTCGGTCTCTATCAGATTGCAGAGGAAG CG[sigma]GTGCCTCACCGTCGTCCGTCTATCATTTCTTTCCGACCAAGGAAGTGGCTCATCTCGCTCTGATGCGCCGCTATCTG GAGGGGCTCCGGAATCTCGACGCGATGGAAGTCGACATCGGCCAGCTCGAAAGCTGGCAGGACCTGATGAAGTTGGATCA GATCAGGGCGCGAGACTATTATAATAGCCACCCGCCCGCCCTCAAGCTTCTGTTCGGCGGATATGGCGGGGTCGAGGCCA GAAAGCTTGACGAGCGATACTCCGAGGAAATCGTGAGCTCCATGTATGGCAGATACAACGGCATTTTCCATATGCCGCAA ATGGAGAATGAGGCTCTCATGTTCACGATCTGCTTCGCAATTCTCGACGCGGTATGGGCCGTCTCCTTTCGCCGGTTCGG TGAAATTACGTCGGATTTTCTTCGGGAGGGGCAAGCGGCTTGCATTGCCTATTGCCGACACTATCTGCCCGAGCGAACGC CATCAGCGTGA 

  
>Seq ID 6 { fumC) 

  
GTGGCCAGCAAGTTCAACTGTGAGTTACTCGATCTGCGATCATTTGTTGCGGTGTATGAAACGCGAAGTTTTAGCCACGC CGCGCGGCTTCTGAATCAATCGCAGCCCGCGCTCAGCCGGAGAATCCAGCGCCTCGAGAGTCTCGTGGGCGGTCCGTTGT TCGAGCGGACCAGTCGGTCGCTTGCCGAAACGGCGCTCGGCAAAGAGTTGCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTT GTCGATACGTCGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGACAGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGC CGCCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACATGGATCAAAATCCGAGGGTCCGACTCCGCATCCTTGACGTGC CGGCGGTCGAGGCTGCGGACCTGGTTGCGAGCGGCGAGGCGGAGTTCGGCATCAGCATTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGC CTGCGGTTC[sigma]ATGCGCTCCACGAGGACCCGTTCGGCCTGGCATGCCACCGAAGCCATCC[sigma]CTGGCGTCGCTCGAGATCCT TGAATGGACGCAATTGAAAGGTGAAAGCCTGATCGCCGTTCACCGTGCGAGCCGGAACCGCACGTTGCTCGATGCCGAAC TCGCGCGCAACAATATCGCGCTGGAATGGCGGTATGAGGTCGCGCATCTGACGACGGCGCTGGGATTGATCGATGCGCAA TTGGGTGTCGCTGTTATGCCCCGCÄTGGTTATGCCCCGCTCGGGTCGGTCGGAGGTCGTCTGGCGCCCCGTCGTCGCGCC 

  GGTCGTCCAACGCACGATCGGCATCGTTCAGCGCCGCACCGGCTCGATGCACCCTGCCGCACAGCAATTGCTTGCGCGGC TCCGCGCGGCCTGGTCGTCCGCCAATCTGGGCGACATCGCGTCTCGCGAAGATGGGGCATCGTGA 

  
>Seq ID 8 (fumD) 

  
GTGAAAGAGCACCAATGCCGTGGCGGCCGGGCGTCCCCCGCTGCGCCCGCCACGTGGCTTGCGCGGATCAGCGTTTCCCG GGGGGCCTCCGCCATCGCCTGGACCTTCATGCTTGGCGCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCAAACTGACGATCCGAAGC TCGTTCGTCATACCCAGTCGGGCGCCGTCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGGAATACCCTTCGCGGCT CCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGGCCGCCGGCTCCGCCGAGGGCGTGGGCGGGCACCAGGGACGGCCGCCGCTT[tau]GC GCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCTTAGAGAGGGGAGCCGGGCTGCCGGGACGAGCGAAGACTGCCTCTATCTGAATA TCTGGTCTCCCAAACAGGTCGGTAAGGGGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCT GGCGCGGTGCCATATTATGACGGCTCTGCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCÄACTATCGCGCCGGGAT TCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCTTTCAAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATGGTCTTCTCGACATGC    o _  

  
TCGCGGCGTTCAAATGGGTTCAGAACAACATAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTCACGGTCTTTGGCGAGTCC GCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTCCTGACCTCGCCGCTCAGTGAGAGCGCCTTCAATCAGGCGATACTGCÄAAGTCC GGGTCTGGCCAGGCCGCTCGCCACGCTTTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCCGATATTTCTGCTCTAC GGCGTGCCGATGCGGGCGAATTGACGAAGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTCACCAAGCCGCGGCCG ATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTTTTGCGCACCCTTGACGTCGATGCCTTCGCCAAG[sigma]GGGCCTTCCGCAAGA[tau]ACC CGTTCTGGTCGGCGGAAACGCCGACGAAGGGCGCGCTTTTACGGATCGCCTGCCGGTCAAAACGGTCCTTGAATATCGAG CCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACGAGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCC GCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGATAGTCAGTTCAACAACGGGATCGAGCTGCTCTCGGCAGCCTTCGCGAAATGGCG AACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTACGGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCÄCGCATGGAGACGAAATTCCCT ATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGTCCGTATCTATGTTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCGCCGGGGCGTCGGACATCAAA 

  CTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGGGTGAGCTTC[sigma]CGGTGCACGGGGTCCCCGATCAGGGCACGAAATCGCACTGGCC GCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCATGACTTTTGGTTCGCAGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCA AAGCCTGCCAACCCTCAAAATAG 

  
>Seq ID 10 { fumE) 

  
TTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCAAAATAGCGCCCGGCCTGTGCGTGCTTCAGCACGCCGTCCCGCTTT GCGGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGTAAGTTGCGCTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTG CATTGACGGCAGCCGTGACGGCGCGTGAAGCGGGGGCCTCGGTTCTTGTGATCGAGCATGCGCCGCGCGCCATGCGCGGC GGCAACAGTCGTCACACACGCÄATATGCGTACGATGCACGAACGTCCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATATTCGGCGGA CGAATATTGGAATGATCTTGTCCGCGTCACGGGGGGGCGCACCGACGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCAACACCA CCGACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCGTTTCCAGCCCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACC AACGCATTCTTCCTTGGCGGCGGGAAGGCGCTTGTAAACGCATATTACGCCACGGCCGAACGGCTAGGCGTCGATATTCT CTATGATTCTGAGGTGACCGAGATCAACCTTCAGCAAGGC[sigma]TCGTGCAGCGTCTGCAATTGCGCAGCCGGGGATTCCCTG TCGAA[sigma][tau]GGAAGCCAAGGCTGCCATCGCCTCGTCCGGAGGATTCCAGGCAAATCTTGACTGGCTCTCAAGCGCATGGGGG CCTGCTGCGGCGAACTTCATCGTACGGGGCACGCCATATGCGACTGGCACGGTGCTCAAGAACCTGTTGGAGCAAGGCGT

  CGCCTCGGTGGGAGATCCAACCCÄATGCCATGCTGTCGCGATCGATGGGCGAGCGCCCAAATACGACGGCGGCATCGTCA CACGACTGGACTGCGTTCCCTTCTCGATCGTCGTCAACAAGGACGCCTTGCGCTTCTACGATGAAGGCGAAGATGTGTGG CCGAAGCGTTACGCCATATGGGGTCGCTTGGTGGCACAGCAGCCTGATCAGATCGCTTTCAGCATAATCGATCGGCAGGC CGAAGACCTCTTCATGCCGTCAGTGTTCCCCCCCGTGCAAGCGGACACGATCGCGGGTCTGGCCGAGAAACTCGGTCTGA ATCCCGTAACCCTGGAACGCACGGTGGCCGAATTCAACGCCGCATGCGTGCCCGGCGAATTCGGCGGCCAAGATCTCGAC GACCTCCACACCGAGGGAATCGAACCAAAGAAATCCAACTGGGCCCGACCGATTATTGTGCCCCCGTTCAGCGCCTATCC TCTCCGGCCCGGGATCACCTTCACCTATCTCGGCGTCAAGGTAGACAGCCGTGCGCGGGTCATCATGGAGACAGGTGAGC CGACAAAAAACCTGTTTGCTTCGGGGGAAATAATGGCGGGCAGCATTCTCGGCCAAGGTTATCTCGCTGGATTTGGAATG GCGATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGGAGGCCGCACGTCATGCAGGATTTTGA 

  
>Seq ID 12 ( fumF) 

  
ATGCAGGATTTTGATCTCGTAAAAATGCTGTCTGACTTGCCGTCGGCGCCGGAGCTGGAAGCCAGGCGCGTTATGGAGGT GTGCAACGCGTGCCGCTATTGCGAAGGGTTCTGCGCGGTATTTCCTGCAATGACCTTGCAGCGTCATTTCGCCAGCGGCG ATCTCAGCCACCTCGCCAATCTCTGCCACTCGTGCCAAGGTTGCTATTACGCCTGCCAATACGCCCCTCCGCATGAGTTC GGAATAAACGTTCCAAAGGCGCTGTCGGAGTTGCGGCTCGAGAGCTACGAGCAGCATGCTTGGCCCCGGCCGGTCGCCGC TCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCATTTCCATCTTGTCGGCGGCATGCATAACCGGCGTCCTTCTGCTTGCCGCCATCT TCAACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATCGGTGCCCGGCGGCGGGTTTTACAACGTTATTCCTTATCAGGCGA[tau]G ATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCGCGCTGGCGCTGGCGATCAGTCTCGTTCGCTTTTCGCGGACGATCGG TCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCGGTTCTTCGGGCGCTACGCGATGCGGCGACTCTGCGATATCTCGGCG GCAGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGACGAGACATTTTCGACGACCCGGCGAAAATTTCATCACGCCCTTGCCTAT GGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCÄCGGGCACGATCTACGATCATATGTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATGCGCT 

  TTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACC[sigma]TTGGGGGGATCGGAATGGTCGTGGGCGCGATCGGCCTACTCTGGCTCAAGC TGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGA[tau]CACCGGCACTGCTTGGGCCGGATGTTGCCCTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCATAGCG GCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGCÄCCGAAGTCATGGGCGTCGCGCTCGCCGTCCATCTCGGCGTCGTCTT GGCCTTCTT TTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCACGGTATCTTCAGGCTCACGGCTCTCGTGCGCCATCATGCTG ACCGCGAGGCAAGTAATGGCTTCGCCTCCAGCCCTCCCACGAAAAAGGGTTAA 

  
>Seq ID 14 ( fumG) 

  
ATGGAACATATGAAGTCCGTTCGCGATCGCAGTAGCGTCATGCAGATCGTGAGAGTGGCGAGTGGCAACTGTCTCGAGCA ATATGATTTCTTCGTTTACGGCTTCTATGCGGCATATATTGCGAGAAGCTTTTTTCCGACCGGCGATAACGCGACATCGC TCAT[sigma]CTTTCAT[tau]GGCCACTTTTGGCGCTGGT[tau]TCCTCATGAGGCCCTTGGGGGCGATTTTTCTCGGGTCCTACATCGAT CGCGTCGGGCGTCGGAAAGGCCTGATCGTGACACTCGCGA[tau]CATGGCCGTCGGAACCCTCÄCCATTGCGATGACTCCAAG CTATGAGGCAATTGGATTACTCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCAGGGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGT CGGGTG[sigma]CGTCTCAGTGTACTTGGCGGAAATTGCGTCGCCCAAATCGAGAGGCTTCTTCACCTCGTGGCAGTCTGCCAGC CAGCAGGTGGCCGTCATGATCGCCGCCGCGATCGGTCTTGCGCTGCAATCAACGCTTTCACCGGAGCAAATGAACGACTG GG[sigma]ATGGCGGGTGCCCTTGTTGATCGGATGCTTGATTATCCCCGTGATACTC[tau]GGCTGCGCCGGTCTCTCCCGGAAACGA AAGCCTATCTCCACATGGAGCACAAGGCGCATTCGATCGGCGAATCCC[tau]CCGCGAATTGCAACAGAGCTGGGGGCTGATC T[tau]GACGGGCATGGCGATGTCGATCCTCACGACGACCACCTTTTACATGATTACCGCCTATACGCCGACATTTGGCGAGAA 

  AGCACTCGGACTGAGCCCGCAAGATGTCCTGCTGGTTACCATCATGGTCGGCGTGTCGAACTTCCTGTGGCTTCCGATCG GGGGTGCTCTCTCGGATCGTATCGGTAGAACCCCGATCCTACTGGTCGTGCCGGTCACCGTTCTCGCCATCGCCTTTCCC CTGATGAGCTGGCTCGTCGCGGCACCGACATTCGGAGCGCTTGCAGCTGTTCTGCTGACTTTCTCCGCATGCTTTGGACT CTATAATGGGGCGCTCATCGCGAGACTCACCGAGATTATGCCTCCCGCCATTAGAACCCTTGGCTTCTCGCTGGCGTTCA GTCTCGCGACCTCGCTGTTCGGCGGCTTCACCCCATTGGTAAGTACGGCGCTAATCCACGCGACGGGCAGCAATTCCGCG CCTGCAATCTGGCTCTGTTTTGCGGCTTTCATCAGCTTCGTCGGTGTGGCCGCATCGACCCGGCTGAGCCGGCCAATCGC CGAAGGCGCCAGATAG 

  
>Seq ID 16 ( fumH) 

  
ATGAGAGCAGTAGTTTACCGAAATGGCGAACTTGTCCTGGGGGCCTATGCTGATCCGATACCCGCCGCCGGGCAGGTGCT CGTCAAGACCAGAGCATGCGGCATCTGCGGATCTGACCTTCATTTTTGCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTTGCAT CGCGGGCGGGTATCGCCTCTATGGAAGTTGATTTGTGTCGAGACATCGTTCTGGGGCATGAATTCTGTGGCGAGATTATG GAGTTCGGGCCCTCTGCGGATCGTCGCTTCAAACCCGGACAGCTTGTGTGCTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGG AGCGCGGACGATTGGCTACTCGGATGAGTATCCCGGCGGGCTCGGCGAATATATGGTCCTCACGGAAGCGCTCTTGCTGC CTGTTCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTTGACGGAGCCGATGGCGGTGGGATGGCATGCCGTCGAGATCGCG CAGGTTCAACCACATCACATCCCTGTGGTGATCGGGTGCGGACCGGTCGGGTTGGCAGTCGTCGCTGCCCTGAAACATAA GCAAGTTGCTCCGATTATTGCGTCGGATCCATCGCCCGATCGGCGTGCTCTTGCTCTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTG TCGATCCGCGCGAAGAATCACCCTTTCGCCAGGCCGAGAAGATCGCACGCCCGGTCGGACÄAGGTGGGGCCCTGTCCAGC TCATTGCTGTCAAAGTCTCAAATGATATTCGAATGCGTAGGGGTGCCGGGCATGCTTCGGCATGCGATGGACGGCGCGTC CGACGGGTCCGAGATCATGGTCGTTGGCGCATGCATGCAGCCGGACGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGC 

  TCACGATCAAATTCTCGCGAACTTACACGGGTGAGGAATTCGCCGCGGTGCTTCACATGATAGGTGAGGGCGCACTCGAC GTATCTCCGCTCGTTACCGATGTGATTGGCCTGTCCGATGTCCCGTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCA AGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGA 

  
>Seq ID 18 (fuml) 

  
ATGGCGAACGGAACAAGGCAGAAAGATCTCAGAGAACGCGCCGAACGGGTCATTCCGGGCGGGATGTACGGCCACGAGTCGACACGG 

  
TTGCTGCCGCCAGAATTCCCCCAGTTCTTCAGGCGCGCGCTGGGGGCACGAATTTGGGACGCCGACGAGCAGCCCTATATCGACTAT 

  
ATGTGC[Sigma]CGTATGGGCCAAATTTGCTCGGTTACCGGCAATCCGAAATCGAAGCCGCGGCTGATGCGCÄGCGACTTCTCGGCGACACC 

  
ATGACCGGTCCTTCGGAGATCATGGTCAACCTCGCCGAAGCCTTTGTGGGCATGGTCCGTCATGCGGATTGGGCGATGTTCTGCAAA 

  
AATGGCAGCGATGCCACCTCAACGGCGATGGTTCTCGCGCGTGCCCATACGGGGCGCAAAACCATATTATGCGCCAAAGGCGCCTAT 

  
CATGGCGCTTCCCCGTGGAACACTCCGCATACTGCCGGGATTCTCGCTTCCGATCGCGTGCATGTCGCATATTATACCTATAACGAC 

  
GCCCAAAGCTTATCGGACGCGTTCAAGGCGCACGATGGCGATATTGCGGCTGTCTTTGCC[Alpha]CACCTTTCCGACACGAAGTATTTGAG 

  
GACCAGGCCCTCGCCCAGCTTGAGTTCGCGCGCACCGCTCGAAAATGTTGTGACGAGACCGGTGCGCTTCTGGTCGTTGACGATGTG 

  
CGCGCAGGTTTCCGGGTGGCGCGCGATTGCAGCTGGACGCATTTGGGTATCGAACCCGATCTCAGTTGCTGGGGAAAATGCTTTGCG 

  
AATGGCTATCCGATCTCCGCCCTGCTGGGCTCGAACÄAGGCGCGCGATGCGGCGCGGGATATATTTGTGACCGGCTCCTTCTGGTTC 

  
TCTGCGGTACCGATGGCGGCCGCGATCGAAACCCTCAGGATCATTCGAGAGACGCCTTATCTCGAAACGCTGATCGCCAGCGGCGCC 

  
GCCCTGCGGGCAGGCCTGGAGGCACAGTCTCAGCGCCATGGTCTTGAGTTGAAGCAGACGGGCCCGGCGCAGATGCCGCAAATATTC 

  
TTTGCGGACGATCCCGATTTTCGGATCGGCTATGCGTGGGCCGCGGCGTGCCTGAAGGGCGGCGTCTATGTTCATCCCTATCACAAT 

  
ATGTTTCTCTCTGCGGCCCATACAGTTGACGATGTAACGGAGACCCTCGAGGCGACGGATCGCGCGTTCAGCGCGGTCCTCAGAGAT 

  
TTTGCGTCTCTCCAGCCTCATCCCATTTTAATGCAACTCGCCGGTGCTTGA 

  
>Seq ID 20 (fumJ<">) 

  
ATGTATCGGAAGTTCAGAATCGAAAAGCCCGGCAAGGCAAATAGTTTGCTCGGCGCAGTAGCGCTCGGCACCCTCGCATTTCCTGTC 

  
TCTGCCAGTGCTCAGGATAGCGATCCCGCATCGATAGGTCAGCCGGACGAAGCGGACACGGACCGGGGAACGAGCGAAATCGTCGTG 

  
ACCGGCAGCCGCCTCCAGAACGGCTTCAATTCGCCGACGCCGGTTACAGCCGTATCCAGCGAGC[Alpha]GTTGAAGGAGGCATCTCCGACC 

  
AACCTTGCCGACGCACTCAACCAGCTGCCCGTGTTCAACGACAGCTTGAAGACCTCCAACCCTGGCACGACACCCGGAACGGGGAAC 

  
AGCGGTCAGAACCTGCTCAACATGCGCGGCCTCGGGTCAAACCGGAACCTCGTCCTGCTGAACGGCAACCGTTTCGTCGCGACCAAT 

  
TTCACAGGCTCGGTCGATATCAACGTGCTGCCGCAGGCGTTGGTCAAGCGCGTCGATGTCGTGACGGGCGGCGCCTCGGCCGCCTAC 

  
GGTTCCGATGCCGTTTCGGGCGTCATCAACTTCGTGCTCGACGAAGATCTGGAAGGCATCAGGGCCGAGCTCCAGTCGGGTGTTTCA 

  
ACCCGCGGCGACCTCCCGTCCTACGGCG[Sigma]TTCGATCGCCTTCGGCACTTC[Sigma]TTTGCCGACGACCGGTTGCAC[Tau]TGCTCGGCAGCTTC 

  
GAATATTTTCGACAGGACGGAATCCGGGCCGATGAAGCAACGGGTCGCCGCTGGTTCGACATCGCCGCCGGCCAATATCCCGTGCCC 

  
GGCGCTACGACAGGCGTCACGGTCGTGCCCGATATTCGCAGTTCTCGCGGATCCTACGGCGGACTTGTCACGTCCGGCCCTCTGAAA 

  
GGCATCGCGTTTTTGCCCGGAGGAGTCCTAGGGACCTTCGACTACGGGAATTTTACGAGCTCGTCGTTCCAGAGCGGCGGCGATGGA 

  
CCGCGCGTGAATATCGGCTTCGCCCCGGATCAGCTTCGCTACAACGCGTTCCTACGCGCCGCATATGATGTGTCCGACACTGTGCAG 

  
GTGTATGCGGAGGGCACCTATGCTTATTCCCACACCAACCTGGGTGCATTCGTAATATCGCATGTCGGTGGCTCGAATAATTTCCGG 

  
ATCTTCCGTGATAACGCCTTCCTTCCGGCTCCACTCGCGACGCTCATGGACAGAAATGCCCAGGCTTCGATCGTTGTCGGTCGCTTC 

  
TCAAGCGACTTTCCCTTGGTCGAAATCGAGAATTTCGCAAAGGTCTACCGCGGCGCTGCCGGCTTCCGGGCAGACATTGGCAATGGC 

  
TGGAAAC[Tau]CGATGGCTCGGCCTCCTTTGGCCTTACGGACCTCGAGCTTCGT[Sigma]AAAACAATCTCACCATCAACCGCAATCTCTACGCC 

  
GCCGTCGATGCGGTCCGCGATCCCGCGGGCAATATCGTCTGCCGTTCÄACÄCTGGCCGGCCTCGACCAAGA[Tau]TGCGTGCCGCTCAAT 

  
CTCTTCGGCACAGGCTCGCCGAGCGCGTCGGCCATCGACTATGTCACCGCTGATGGCGTCGCTCÄGCTGAGGCTTGAGCAATATGTG 

  
GCGGGACTCACGATTTCCGGCGACCTCGGCGATAGCCTGTCGTTCGGCGCGGGCCCGGTCTCGGTCGCCGCTGGTATCGAATATCGC 

  
AAGGAGAAGGCCCGGCAGGAAACCGACGCGATATCGCAGGCGACGACCTCGATCACGGGAATCAGGGGGGCTCCGGCGGCGCAGGCA 

  
GGTCGGCCTGGAGGCTTCAA[Tau]CTCTACAACCCACTTCCCTTCTCGGGAAGCTATGACATCAAGGAAGGTTTTGTCGAAATCGGCGTC 

  
CCGATTCTGAAGGACAGCGCGCTGGGACGTTCGCTGAACTTAAACGGCGCCGTCCGATATGCCGATTACAGCCAGTCCGGTGGAGTA 

  
ACAACCTGGAAGCTGGGCGGAGAATATGAGCCGATCGACGGCCTCAGGTTCCGCGCGACCCGTTCGCGAGATATCCGCGGGCCAAGC 

  
CTTGTCGAGCTATTCGACCCCGGCCGTCAGGCGACGCTCAATTCAATTTATGGCGGACAGGCTGTGCAGACGCGGTTCTTTACCGCC 

  
GGCAACGCGGATTTGCGCCCTGAAAAGGCGGACGTCCTTACATTCGGCGCGGTGCTACGCCCCGCCTTCGTGCCGGGGTTTCAGTTT 

  
TCGGTCGATCGCTATGTGGTGAAGGTGAAGGGCGCGATCGATTTCCTCCTTCCCCÄGCAGGAAATCGACGCGTGCGATGCAGGAAAC 

  
ACCTTCTTCTGCGACCTCATAACGGAGAATCCGGACGGCACCATCACAGTGACGGGTCCCAATCTCAACCTGGCTGTCCAGAAAGCG  

  
GCGGGAATTGACTTCGAGGCCTATTACTCACGCCCCGTCGGCGGCGGCACGTTCAGTCTTCGTGCGCTGGCAACGCACCATACCTCT GCCTATCGCATCGCGACCGGCTCGGCGCCCATCCGTTCGCTCGGACAACCGGACAC[sigma]CCAAAATGGTCGGCCAACTTCCAGGCGCGA TATTCGACCGACGATTGGGCGCTTCTCGTGCAGCAGCGCTTCATCGCAGCATCGGTGTTCAATGCCGACÄATGTGGAGGGCGTCGAT ACGAATTTGAACCACGCTCCGGCGGTTTGGTACACCGACGCGACATTGACCTTCGACATCGCGGCTTTTGGCCAGAAGCAGCAGCTG TTTCTATCGGTCAATAATTTGTTCGACCGAGATCCGCCAATAGCGACGAACGACCCCAGCAGTTTTTCCAGCCCGACCAGCTCTGCC TATGATCCGGTCGGCCGCTATTTTAATGTCGGGGTCCGTTTCCGGATCTGA 

  
>Seq ID 22 (fumK) nicht vollständig 

  
ATGCGCCTCACGGGCGGAGAATTATTGGCACGATGTTTGGCCGTCGAAGGCGTCCGGTATGTCTTCGGCCTCATGTCGCCGGAGG[tau]G GATCCGCTCCTGGCTGCGCTCGAAGACAATGGGATATTGTTCGTCCCGGTGCGGCACGAGGCCGCCGCAGCCTATATGGCCGAGGGC ATTTACAAGACCACCGGACAGGTCGCCGCGATTGTCACGAATCCGGGTCCCGGTACGGCAAACCTTCTGCCTGGAGTCGTGACGGCA CGCCACGAAGGGGTTCCCTTCGTCGCAATAACGTCCCAGCATCAACTTGGTGTCGTTTATCCCTGCACGCCAAAAACCTTTCAGGGA CAAGACCAGATCGACCTCTTTCGACCCGCGGTTAAATGGGGCGCACCCATCTTCGCCTGGAACCGGATTGTCGAAATCACCCATATG GCGTTCCGGGAAATGTGGGCCGGCAGGCCGGGACCCGTTCAGTTGGAAATCCCGARGTCTGTGATGTATGKTGTGGGCGAACGAGGA CCACGGTAGAAGTTTACRGATCGCCGACA... 

  
>Seq ID 24 

  
ATGGAATTGAGCCGCCAACGAGACCAGGCCTTGAGGGAGCGCGCCCAAGCGGTGATCCCGGGCGGGATGTACGGTCACGAGTCGACC TATCTGATGCCCGAGGGCACGCCACAGTTCTTCAGTCGCGGCAAAGGCGCCCGACTTTGGGACGCCGACGGCAACGAGTATGTCGAT TACATGTGCGCCTATGGCCCCAACCTGCTGGGTTACGGCTTCGAACCCGTCGAAGCGGCCGCCGCAGCCCAGCAAGCCCGGGGCGAT ACCCTGACCGGGCCGTCGGAGGTGATGGTGCAGTTGGCGGAAGACTTCGTCGCGCAAATCAGCCACGCGGACTGGGCCATGTTCTGC AAGAACGGCACÄGACGCCACCTCAATGGCGATGGTCATCGCGCGCGCACACACCGGCCGGAAGACGATCCTCTGCGCGAAAGGCGCC TATCATGGGGCCGCGCCTTGGTGCACGCCGATCCTGGCCGGAACGCTACCGGAGGATCGCGCCTTTGTAGTCTACTACGACTACAAT GACGCCCAAAGCCTCGTCGACGCCTTCGAGGCCCATCAGGACGACGTCGCGGCGATCTTCGCCACCCCTCACCGTCACGAGGTGTTC AGCGACCAGATCGATCCTGATCCGGAATATGCGGCCAGCGTGCGGGCGCTCTGCGACAAGAGCGGCGCCCTGCTCGTCGTCGACGAA GTTCGAGCCGGGTTCAGGATCGCGCGCGACTGCAGCTGGGCCAAGATCGGCGTCGCTCCGGATCTGAGCACCTGGGGCAAGTGCTTC GCCAACGGCTATCCGATCTCGGCGGTCCTAGGGGGCGAAAAGGTGCGCAGCGCGGCAAAGGCCGTCTACGTCACCGGCTCGTTCTGG 

  TTCTCGGCCACGCCCATGGCCGCAGCCGTCGAAACCCTGAAGCAAATCCGCGAGACCGACTATCTCGAGCGGATCAACGCGGCCGGG ACCCGCCTGCGCGAGGGCCTGCAGCAGCAGGCTGCTCACAACGGCTTTACGTTGCGCCAAACGGGGCCCGTCTCCATGCCCCAAGTC CTCTTCGAGGAAGATCCCGATTTTCGGGTCGGCTACGGCTGGGTTCGCGAATGCCTGAAGCGAGGGGTGTACTTCAGCCCCTACCAT AACATGTTCCTGTCGGCGGCCCATAGCGAGGCGGACCTGGCCAAGACCCTTGCGGCTACCGGCGACGCCTTCGTCGAGCTACGCGCC AAGCTTCCGAGCCTAGAAATCCACCAACCCCTCCTCGCCCTGAGAGCGGCCTAA 

  
Enzyme 

  
Sequenzen: 

  
>Seq ID 3 (FumA) 

  
MRNVSDKAPPHETLTVWAAMIVGTAALMVLGIQPILLGALVEEGRIPAEGLGSAATVEI LAIAAGTCIGPVLMKTGYLRAKCAALCLMLAAINFGLTLPGFDLPIVACRAAAGALEGLS LSAAILIMTHNRRPDRLSGIFLGAQTIPQVISAYLLPTEIIPRWGSAGGFTILGILAAIA AIAALCLVDRVELDPTTVNDDLQWSPAAIVISMAAFVQFSGVGAAWSYLERLAAQHGFSG ETIGIAISGSLLCQVGGAWLAAWIGGRVGYRFALIAGSLLQAGNVIALAVADQPSWFISA SCAFGLFWLAMQPFQIRFAIAIDNSRQLAVLLTPIALVGLSAGPLLLSRFAGATDLRWIF VGSSTLLLASALLYLCASLFQPRGKVIAETVDV 

  
>Seq ID 5 (FumB) 

  
MTSQVKLRSAAKRPRSPKSERGLARYESLLDATDRLLVDLDPDQVGLYQIAEEAGASPSS 

  
VYHFFPTKEVAHLALMRRYLEGLRNLDAMEVDIGQLESWQDLMKLDQIRARDYYNSHPPA 

  
LKLLFGGYGGVEARKLDERYSEEIVSSMYGRYNGIFHMPQMENEALMFTICFAILDAVWA 

  
VSFRRFGEITSDFLREGQAACIAYCRHYLPERTPSA 

  
>Seq ID 7 (FumC) 

  
VASKFNCELLDLRSFVAVYETRSFSHAARLLNQSQPALSRRIQRLESLVGGPLFERTSRS 

  
LAETALGKELLPVAHRALELVDTSLFASPNVREFRWTDITIACVQTAAFHVLPRAARLYM 

  
DQNPRVRLRILDVPAVEAADLVASGEAEFGISIESLLPSSLRFDALHEDPFGLACHRSHP 

  
LASLEILEWTQLKGESLIAVHRASRNRTLLDAELARNNIALEWRYEVAHLTTALGLIDAQ 

  
LGVAVMPRMVMPRSGRSEWWRPWAPWQRTIGIVQRRTGSMHPAAQQLLARLRAAWSS <>!! 

  
ANLGDIASREDGAS 

  
>Seq ID 9 (FumD) 

  
VKEHQCRGGRASPAAPATWLARISVSRGASAIAWTFMLGATAIPVAAQTDDPKLVRHTQS 

  
GAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGS 

  
RAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKG WT 

  
FNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGES 

  
AGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGE 

  
LTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAF 

  
TDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLS 

  
AAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIK 

  
LATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTFGSQVGSGEGLGVSPSKACQPSK 

  
>Seq ID 11 (FumE) 

  
LEFRRAKPANPQNSARPVRASARRPALRATGCALCLEGSKLRYDVAIIGGGNAALTAAVT 

  
AREAGASVLVIEHAPRAMRGGNSRHTRNMRTMHERPLSPLTGEYSADEYWNDLVRVTGGR 

  
TDEELARLVIRNTTDAIPFMTRCGVRFQPSLSGTLSLSRTNAFFLGGGKALVNAYYATAE 

  
RLGVDILYDSEVTEINLQQGWQRLQLRSRGFPVEVEAKAAIASSGGFQANLDWLSSAWG 

  
PAAANFIVRGTPYATGTVLKNLLEQGVASVGDPTQCHAVAIDGRAPKYDGGIVTRLDCVP 

  
FSIWNKDALRFYDEGEDVWPKRYAIWGRLVAQQPDQIAFSIIDRQAEDLFMPSVFPPVQ 

  
ADTIAGLAEKLGLNPVTLERTVAEFNAACVPGEFGGQDLDDLHTEGIEPKKSNWARPIIV 

  
PPFSAYPLRPGITFTYLGVKVDSRARVIMETGEPTKNLFASGEIMAGSILGQGYLAGFGM 

  
AIGTVFGRIAGWEAARHAGF 

  
>Seq ID 13 (FumF) 

  
MQDFDLVKMLSDLPSAPELEARRVMEVCNACRYCEGFCAVFPAMTLQRHFASGDLSHLAN LCHSCQGCYYACQYAPPHEFGINVPKALSELRLESYEQHAWPRPVAALYRKNALIISILS AACITGVLLLAAIFNGDALFAKHASVPGGGFYNVIPYQAMIAVAATTFLYSALALAISLV RFSRTIGLGIKVLYQHVPVLRALRDAATLRYLGGSDGEGCNDADETFSTTRRKFHHALAY GFGLCFAATATGTIYDHMFGWPAPYALFSLPWLGTVGGIGMWGAIGLLWLKLAGEDAP RSPALLGPDVALLVLLLAIAATGLLLLAVRSTEVMGVALAVHLGWLAFFLVMPYSKFVH GIFRLTALVRHHADREASNGFASSPPTKKG 

  
>Seq ID 15 (FumG) 

  
MEHMKSVRDRSSVMQIVRVASGNCLEQYDFFVYGFYAAYIARSFFPTGDNATSLMLSLAT 

  
FGAGFLMRPLGAIFLGSYIDRVGRRKGLIVTLAIMAVGTLTIAMTPSYEAIGLLAPVIVL 

  
VGRLLQGFSAGAESGGVSVYLAEIASPKSRGFFTSWQSASQQVAVMIAAAIGLALQSTLS 

  
PEQMNDWGWRVPLLIGCLIIPVILWLRRSLPETKAYLHMEHKAHSIGESLRELQQSWGLI 

  
LTGMAMSILTTTTFYMITAYTPTFGEKALGLSPQDVLLVTIMVGVSNFLWLPIGGALSDR 

  
IGRTPILLWPVTVLAIAFPLMSWLVAAPTFGALAAVLLTFSACFGLYNGALIARLTEIM 

  
PPAIRTLGFSLAFSLATSLFGGFTPLVSTALIHATGSNSAPAIWLCFAAFISFVGVAAST 

  
RLSRPIAEGAR 

  
>Seq ID 17 (FumH) 

  
MRAWYRNGELVLGAYADPIPAAGQVLVKTRACGICGSDLHFCDHAQAFTNLASRAGIAS 

  
MEVDLCRDIVLGHEFCGEIMEFGPSADRRFKPGQLVCSLPLAIGPTGARTIGYSDEYPGG 

  
LGEYMVLTEALLLPVPNGLPATCAALTEPMAVGWHAVEIAQVQPHHIPWIGCGPVGLAV 

  
VAALKHKQVAPIIASDPSPDRRALALRMGADAWDPREESPFRQAEKIARPVGQGGALSS 

  
SLLSKSQMIFECVGVPGMLRHAMDGASDGSEIMWGACMQPDAIEPMIGMFKALTIKFSR 

  
TYTGEEFAAVLHMIGEGALDVSPLVTDVIGLSDVPSAFEALRSPGAQAKVIVDPWR <>   Vi * -  

  
>Seq ID 19 (FumI) 

  
MANGTRQKDLRERAERVIPGGMYGHESTRLLPPEFPQFFRRALGARIWDADEQPYIDYMC 

  
AYGPNLLGYRQSEIEAAADAQRLLGDTMTGPSEIMVNLAEAFVGMVRHADWAMFCKNGSD 

  
ATSTAMVLARAHTGRKTILCAKGAYHGASPWNTPHTAGILASDRVHVAYYTYNDAQSLSD 

  
AFKAHDGDIAAVFATPFRHEVFEDQALAQLEFARTARKCCDETGALLWDDVRAGFRVAR 

  
DCSWTHLGIEPDLSCWGKCFANGYPISALLGSNKARDAARDIFVTGSFWFSAVPMAAAIE 

  
TLRIIRETPYLETLIASGAALRAGLEAQSQRHGLELKQTGPAQMPQIFFADDPDFRIGYA 

  
WAAACLKGGVYVHPYHNMFLSAAHTVDDVTETLEATDRAFSAVLRDFASLQPHPILMQLA 

  
GA 

  
>Seq ID 21 (FumJ) 

  
MYRKFRIEKPGKANSLLGAVALGTLAFPVSASAQDSDPASIGQPDEADTDRGTSEIWTG 

  
SRLQNGFNSPTPVTAVSSEQLKEASPTNLADALNQLPVFNDSLKTSNPGTTPGTGNSGQN 

  
LLNMRGLGSNRNLVLLNGNRFVATNFTGSVDINVLPQALVKRVDWTGGASAAYGSDAVS 

  
GVINFVLDEDLEGIRAELQSGVSTRGDLPSYGGSIAFGTSFADDRLHLLGSFEYFRQDGI 

  
RADEATGRRWFDIAAGQYPVPGATTGVTWPDIRSSRGSYGGLVTSGPLKGIAFLPGGVL 

  
GTFDYGNFTSSSFQSGGDGPRVNIGFAPDQLRYNAFLRAAYDVSDTVQVYAEGTYAYSHT 

  
NLGAFVISHVGGSNNFRIFRDNAFLPAPLATLMDRNAQASIWGRFSSDFPLVEIENFAK 

  
VYRGAAGFRADIGNGWKLDGSASFGLTDLELRENNLTINRNLYAAVDAVRDPAGNIVCRS 

  
TLAGLDQDCVPLNLFGTGSPSASAIDYVTADGVAQLRLEQYVAGLTISGDLGDSLSFGAG 

  
PVSVAAGIEYRKEKARQETDAISQATTSITGIRGAPAAQAGRPGGFNLYNPLPFSGSYDI 

  
KEGFVEIGVPILKDSALGRSLNLNGAVRYADYSQSGGVTTWKLGGEYEPIDGLRFRATRS 

  
RDIRGPSLVELFDPGRQATLNSIYGGQAVQTRFFTAGNADLRPEKADVLTFGAVLRPAFV 

  
PGFQFSVDRYWKVKGAIDFLLPQQEIDACDAGNTFFCDLITENPDGTITVTGPNLNLAV 

  
QKAAGIDFEAYYSRPVGGGTFSLRALATHHTSAYRIATGSAPIRSLGQPDTPKWSANFQA 

  
RYSTDDWALLVQQRFIAASVFNADNVEGVDTNLNHAPAVWYTDATLTFDIAAFGQKQQLF 

  
LSVNNLFDRDPPIATNDPSSFSSPTSSAYDPVGRYFNVGVRFRI 

  
>Seq ID 23 (FumK) nicht vollständig 

  
MRLTGGELLARCLAVEGVRYVFGLMSPEVDPLLAALEDNGILFVPVRHEAAAAYMAEGIY KTTGQVAAIVTNPGPGTANLLPG TARHEGVPFVAITSQHQLGWYPCTPKTFQGQDQI DLFRPAVKWGAPIFAWNRIVEITHMAFREMWAGRPGPVQLEIPXSVMY GERGPR-KFX DRR.... 

  
>Seq ID 25 

  
MELSRQRDQALRERAQAVIPGGMYGHESTYLMPEGTPQFFSRGKGARLWDADGNEYVDYM 

  
CAYGPNLLGYGFEPVEAAAAAQQARGDTLTGPSEVMVQLAEDFVAQISHADWAMFCKNGT 

  
DATSMAMVIARAHTGRKTILCAKGAYHGAAPWCTPILAGTLPEDRAFWYYDYNDAQSLV 

  
DAFEAHQDDVAAIFATPHRHEVFSDQIDPDPEYAASVRALCDKSGALLWDEVRAGFRIA 

  
RDCSWAKIGVAPDLSTWGKCFANGYPISAVLGGEKVRSAAKAVYVTGSFWFSATPMAAAV 

  
ETLKQIRETDYLERINAAGTRLREGLQQQAAHNGFTLRQTGPVSMPQVLFEEDPDFRVGY 

  
GWVRECLKRGVYFSPYHNMFLSAAHSEADLAKTLAATGDAFVELRAKLPSLEIHQPLLAL 

  
RAA- 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Verfahren so geführt, dass vor Einsatz der Enzyme im Futtermittel diese mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden. Indem das  

  
Verfahren so geführt wird, dass die Enzyme vor ihrem Einsatz im Futtermittel mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden, gelingt es, die Enzyme in noch stabilerer und an den späteren Einsatzzweck angepasster Form herzustellen, wodurch der sauerstoffunabhängige Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, im Futter noch weiter verbessert bzw. vervollständigt werden kann. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens wird das Verfahren so geführt, dass die Enzyme vor ihrem Einsatz in dem Futtermittelzusatz isoliert werden. Durch Isolation der Enzyme kann ein gezielter Einsatz einzelner Enzyme in dem Futtermittel und somit dem Verdauungstrakt von Tieren durchgeführt werden, wodurch ein noch gezielterer Abbau von Mykotoxinen möglich wird. 

  
Gemäss einer weiteren bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens wird das Verfahren so geführt, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden. Durch Verkapseln der Enzyme in einer Schutzhülle gelingt es, die Enzyme ohne Veränderung, insbesondere ohne Abbau und Schädigung an ihren Einsatzort, insbesondere in den Verdauungstrakt von Tieren, zu transportieren, so dass erst nach Auflösung der Schutzhülle, beispielsweise im MagenDarm-Trakt von Tieren, die Enzyme zu wirken beginnen, wodurch ein noch gezielterer, rascherer und vollständiger Abbau der Mykotoxine im sauerstoffunabhängigen bzw. anaeroben Milieu des MagenDarm-Trakts von Tieren erzielt werden kann. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung wird das erfindungsgemässe Verfahren so geführt, dass die Enzyme aus Permease ID-Nr. 3, Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase IDNr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt werden. Durch eine derartige Verfahrensführung können insbesondere Fumonisine vollständig und sauerstoffunabhängig abgebaut werden. In diesem Fall werden aus dem Geneluster der Nukleinsäuresequenz mit der ID-Nr. 1 ausgewählte offene Leserahmen in prokaryotisehen oder  

  
<>14* - " eukaryotisehen Wirtszellen zur Expression gebracht. Im bakteriellen Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM16254 erfolgt die Transkription der im Geneluster mit der ID-Nr 1 enthaltenen offenen Leserahmen gesteuert bzw. geregelt durch einen bidirektionalen Promotor, der zwischen fumA und fuml , wie dies Abb. 1 entnehmbar ist, angeordnet ist. Die Gene codieren für Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, bei der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumA, FumJ, FumG und im Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, FumI und FumK involviert sind.

   Aus den entsprechenden Nukleinsäuresequenzen, welche für spezielle Proteine codieren, wurden gemäss einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens gemäss der Erfindung die Gene ausgewählt, welche für den Substratkatabolismus verantwortlich sind, wodurch die entsprechenden gebildeten Enzyme das Substrat, nämlich Fumonisine vollständig katabolisieren können. 

  
In der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Bezeichnung der Gene des fumonisinkatabolischen Genclusters aufgeführt, wobei 0 die Orientierung, nämlich f forward und r reverse bedeuten. 

  
Tabelle 1 

  
Gen Sequenz 0 Start Ende Länge Bezeichnung ID fumA 2 f 5214 6395 1182 Permease fumB 4 f 6418 7068 651 tetR-artiger Transkriptionsregulator fumC 6 f 7232 8176 945 lysR-artiger Transkriptionsregulator fumD 8 f 8294 9916 1623 Carboxylesterase fumE 10 f 9876 11378 1503 Tricarballylatdehydrogenase fumF 12 f 11494 12537 1044 Citratverwertungsprotein B fumG 14 f 12541 13836 1296 Tricarballylatprotonensymport fumH 16 f 13957 15027 1071 Alkoholdehydrogenase fuml 18 r 5063 3795 1269 Aminotransferase fumJ 20 r 3513 679 2835 TonB-abhängiger Rezeptor fumK 22 r 551 ? <>? Acetolactatsynthase
 <EMI ID=14.1> 
(teilweise) Indem das erfindungsgemässe Verfahren bevorzugt so geführt wird, dass ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme ID-Nr.

   3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 aufweist, kann ein noch vollständigerer Abbau der Fumonisine im Magen-Darm-Trakt von Tieren sichergestellt werden, wobei gleichzeitig nicht nur Fumonisine, sondern auch verwandte bzw. strukturell ähnliche Mykotoxine im anaeroben Milieu entgiftet werden können, wie zum Beispiel das AAL Toxin. 

  
Indem das Verfahren bevorzugt so geführt wird, dass bei Einsatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 als Cosubstrat ein Keton, insbesondere eine [alpha]-Ketosäure, eingesetzt wird, kann insbesondere beim Abbau der Aminogruppe von Fumonisin und gleichzeitigem Einsatz von einer [alpha]-Ketosäure, wie beispielsweise Brenztraubensäure, die Aminogruppe an dem Fumonisinmolekül durch eine Ketogruppe ersetzt werden, wobei als Nebenprodukt dieser Reaktion Alanin entsteht, welches vollständig unschädlich ist, so dass ein vollständiger Abbau von Fumosinen zu unschädlichen Substanzen sichergestellt ist. 

  
Die Erfindung zielt weiterhin auf einen Futtermittelzusatz ab, mit welchem es sicher und zuverlässig gelingt, Mykotoxine, insbesondere Fumonisine im Futtermittel und/oder dem Verdauungstrakt von Tieren sauerstoffunabhängig abzubauen bzw. zu detoxifizieren. 

  
Zur Lösung dieser Aufgaben ist ein derartiger Futtermittelzusatz im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Produktion dieser Enzyme sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind. Ein derartiger Futtermittelzusatz, in dem wenigstens ein Enzym oder ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Produktion dieses Enzyms sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Co substrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind, zeichnet sich dadurch aus, dass er zielgerichtet Mykotoxine, insbesondere Fumonisine im Verdauungstrakt von Tieren abbaut und somit detoxifiziert .

   Durch den Einsatz eines erfindungsgemässen Futtermittelzusatzes, welcher im wesentlichen aus isolierten Enzymen sowie gegebenenfalls deren Cosubstraten und Trägern bestehen, ergibt sich der Vorteil, dass diese ihre katalytische Aktivität in einer Umgebung und unter Bedingungen beibehalten, in welchem beispielsweise komplette Mikroorganismen nicht oder nur wenig aktiv wären, wobei gleichzeitig eine bedeutend höhere, spezifische Aktivität erzielt werden kann, sowie definierte Reaktionen unter Vermeidung von unerwünschten Nebenreaktionen katalysiert werden können.

   Darüber hinaus können Probleme, welche gemäss dem Stand der Technik durch den Einsatz vermehrungsfähiger Keime in den Futtermitteln entstanden sind, mit Sicherheit hintangehalten werden und überdies weisen Futtermittelzusätze, welche nur isolierte Enzyme enthalten, sowohl eine bessere Eignung zur Formulierung für gezielte und kontrollierte Aktivierung, d.h. beispielsweise an einer bestimmten Stelle des Verdauungstrakts, als auch die Vermeidung von unerwünschtem, erhöhtem Substratverbrauch auf. Um die Spezifität noch weiter zu erhöhen, ist der Futtermittelzusatz gemäss der vorliegenden Erfindung dahingehend bevorzugt weitergebildet, dass durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese oder molekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung ist der Futtermittelzusatz so ausgebildet, dass ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 aufweist. Wenn ein Enzym eingesetzt ist bzw. wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym mit der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 aufweist, gelingt es, neben den bevorzugt abzubauenden Fumonisinen auch weitere Mykotoxine sicher und zuverlässig im Magen-Darm-Trakt von Tieren sauerstoffunabhängig abzu - J*   bauen, wodurch eine weitgehende Entgiftung der aufgenommenen Futtermittel erzielt werden kann. 

  
Indem der Futtermittelzusatz so ausgebildet ist, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung entspricht, dass die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind, kann sichergestellt werden, dass die Enzyme, die zu wenigstens 90 % identen Enzyme oder veränderten Enzyme vor einem vorzeitigen Aktivitätsverlust gesichert sind und sicher und zuverlässig an der vorgesehenen Stelle des Magen-Darm-Trakts ihre Wirkung entfalten. 

  
Indem der Futtermittelzusatz bevorzugt so weitergebildet ist, dass die Enzyme aus einer Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, einem Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase IDNr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat-Synthase ID-Nr. 23 gewählt sind, werden im wesentlichen die zum Substratkatabolismus befähigten Enzyme zum Einsatz gebracht, so dass neben einer geringeren Menge an einzusetzenden Enzymen auch sichergestellt werden kann, dass keine unerwünschten Nebenreaktionen im Magen-Darm-Trakt von Tieren auftreten. 

  
Gemäss einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung ist der Futtermittelzusatz so ausgebildet, dass eine Carboxylesterase IDNr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind. Indem der Futtermittelzusatz eine Carboxylesterase, eine Aminotransferase und eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat neben einem inerten Träger aufweist, gelingt es insbesondere, Fumonisine, welche in den Futtermitteln enthalten sind, zuerst zu hydrolysieren, indem von den Fumonisinen Tricarballylsäurereste mit Hilfe einer Carboxylesterase abgespalten werden, und das so gebildete hydrolysierte Fumonisin in weiterer Folge unter Einwirkung der Aminotransferase und der [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat, im vorliegenden Fall bevorzugt Brenztraubensäure, weiter umzusetzen,

   indem eine Aminogruppe von dem hydrolysierten Fumonisinmolekul durch eine Ketogruppe ersetzt wird, so dass ein für Tiere völlig ungefährliches 2-Keto-hydrolysiertes Fumonisin entsteht, welches unverändert ausgeschieden werden kann, und als Nebenprodukt Alanin gebildet wird, welches ebenfalls keinerlei negative Eigenschaften auf den Organismus ausübt. 

  
Schliesslich zielt die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Genen, wie sie in den Sequenzen ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 dargestellt sind, oder kompletten, rekombinanten Wirtsorganismen zur Expression dieser Gensequenzen sowie gegebenenfalls von Cosubstraten zur Herstellung eines Futtermittelzusatzes für Tiere ab. Mit derartig hergestellten Futtermittelzusätzen gelingt ein vollständiger und zuverlässiger Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen im Verdauungstrakt von Tieren, wobei für einen derartigen Abbau im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten Genen keinerlei molekularer Sauerstoff erforderlich ist. 

  
In bevorzugter Weise werden gemäss der vorliegenden Erfindung eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat sowie ein inerter Träger eingesetzt, mit welcher Verwendung insbesondere Fumonisine sicher und zuverlässig im Verdauungstrakt von Tieren zur Gänze zu unschädlichen Bestandteilen abgebaut werden können. 

  
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen sowie Figuren näher dargestellt. In diesen zeigt: 

  
Fig. 1 den Fumonisin-katabolischen Geneluster, 

  
Fig. 2 die Michaelis-Menten-Kurve für Fumonisin-Carboxylesterase FumD, und 

  
Fig. 3 eine Abbaukurve von hydrolysiertem Fumonisin Bi. 

  
In Fig. 1 ist ein Fumonisin katabolischer Geneluster als Teilsequenz von 15420 Basenpaaren eines mikrobiellen Stammes mit der Hinterlegungsnummer DSM 16254 dargestellt. In dem fum-Gencluster des bakteriellen Stammes DSM 16254 wird die Transkription der offenen Leserahmen durch einen bidirektionalen Promotor gesteuert bzw. geregelt, welcher zwischen fumA und fumJ angeordnet ist. Der Cluster codiert Proteine, welche in der Regulierung der Genexpression, wie beispielsweise FumB und FumC, in der Substraterkennung und dem Transport, wie beispielsweise FumJ, FumA und FumG und in einem Substratkatabolismus, wie beispielsweise FumD, FumE, FumF, FumH, FumI und FumK involviert sind.

  
Beispiele 

  
Beispiel 1: Die Enzymkinetik von Fumonisin-Carboxylesterase 

  
Das fumD Gen (Sequenz ID-Nr. 8) , welches eine Fumonisin-Carboxylesterase codiert, wurde kloniert und in Pichia pastoris unter Verwendung von Standardverfahren exprimiert. Das his-getaggte Enzym wurde rückgewonnen und aus der überstehenden Lösung der Kultur durch Affinitätschromatographie gereinigt. Die Enzymkonzentration wurde bestimmt und die enzymkinetischen Parameter wurden mit sieben unterschiedlichen Substratkonzentrationen im Bereich zwischen 50 [mu]g bis 25 mg FBi pro Liter und einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml bestimmt. Die Reaktionen wurden in 20 M Tris-Cl (pH 8,0) Puffer mit 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin gepuffert und bei 30 [deg.]C inkubiert. Proben wurden nach 0, 30, 60 120 und 240 Minuten Inkubation genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert.

   Fumonisin Bx (FBi) und hydrolysiertes Fumonisin Bi wurden quantifiziert basierend auf einer Kalibrierung mit den gereinigten Referenzsubstanzen und einem vollständig <13>C markierten, internen FBI Standard. 

  
Fig. 2 zeigt die Michaelis-Menten-Kurve für die Transformation von Fumonisin Bl (FBI) durch Fumonisin-Carboxylesterase FumD, welche bei einer Enzymkonzentration von 0,33 ng/ml in TrisCl-Puffer (pH 8,0) bestimmt wurde, wobei anfängliche Enzymgeschwindigkeiten gegen die Substratkonzentration aufgetragen wurden. Die Michaelis-Menten-Kurve zeigt einen Abfall bei höheren Substratkonzentrationen, da die Enzymgeschwindigkeit basierend auf dem Produkt, d.h. hydrolysierter FBi-Bildung berechnet wurde. Da hydrolysiertes FBi aus FBi in einer zweistufigen Reaktion über partiell hydrolysiertes FBx mit lediglich einer Tricarballylsäure-Seitenkette, die zurückbehalten wurde, und einer Seitenkette ausgebildet wird, die abgespalten wurde, war die Endproduktbildung bei hohen Substratkonzentrationen verzögert.

   Die MichaelisMenten-Konstante KM wurde als 0,90 [mu]mol/1 berechnet, was 650 ppb äquivalent ist, und die Umwandlungszahl war 900 pro Sekunde. 

  
Aus Fig. 2 ergibt sich, dass Fumonisine mit der Carboxylesterase in den relevanten Konzentrationsbereichen rasch und vollständig hydrolysiert werden können. 

  
Beispiel 2: Die katalytische Aktivität von hydrolysierter Fumonisinaminotransferase 

  
Sequenz ID-Nr. 18 wurde unter Verwendung von Standardverfahren kloniert und in E. coli exprimiert unter Steuerung bzw. Regelung eines Bakteriophagen T7 Promotors. Die Bakterienzellen wurden gesammelt in 50 mM Natriumphosphatpuffer, neuerlich suspendiert und durch Ultraschall lysiert. Hydrolysiertes Fumonisin wurde hinzugefügt und die Proben wurden bei 25 [deg.]C inkubiert. Proben wurden in Zeitintervallen genommen und durch HPLC-MS/MS analysiert. Es wurde keine Reduktion der hydrolysierten FBi Konzentration beobachtet. Wenn ein Cosubstrat, wie beispielsweise eine [alpha]-Ketosäure, wie Brenztraubensäure oder Oxalacetat zu der Reaktion hinzugefügt wurde, konnte ein vollständiger Abbau des hydrolysierten Fumonisins zu 2-Keto-HFB[iota] beobachtet werden, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist. Diese Substanz ist für Tiere vollständig unschädlich. 

  
Beispiel 3: Enzymaktivität in Darmmilieu 

  
Zur Überprüfung der enzymatischen Aktivität von FUM-Carboxylesterase im Verdauungstrakt wurden schlachtfrische Schweinedärme verwendet und unter Ausschluss von Sauerstoff ins Labor transportiert und in einer anaeroben Sterilwerkbank untersucht. Etwa 10cm lange Stücke von Duodenum und Jejunum wurden abgebunden und herausgeschnitten. Mit Kanülen wurde Fumonisin Bl in konzentrierter wässriger Lösung auf eine Endkonzentration von etwa 10 ppm eingespritzt und mit Darminhalt vermischt. Anschliessend wurden 5 [mu]g Fumonisin-Carboxylesterase in wässriger Lösung, bzw. dasselbe Volumen Wasser in den Negativkontrollen, eingespritzt und eingemischt. Die Darmabschnitte wurden bei 39 [deg.]C inkubiert. Mit Hilfe von Kanülen wurden Proben gezogen und durch HPLC-MS/MS analysiert.

   Dabei zeigte sich, dass Fumonisin Bl im Duodenum und Jejunum zum Zeitpunkt der ersten Probenahme nach zwei Stunden bereits vollständig hydrolysiert war. 

  
Beispiel 4 : Ermittlung des Temperaturbereichs der Aktivität von Fumonisin-Carboxylesterase 

  
Zur Ermittlung des Temperaturbereichs, in dem Fumonisin-Carboxylesterase aktiv ist, wurden 1,6 ng/ml FUM-Carboxylesterase in 20 mM Tris-Cl Puffer, pH 7,0, mit 0,1 mg/ml BSA und 10 ppm Fumonisin Bl bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Dabei zeigte sich, dass das Temperaturoptimum für das Enzym bei 30 [deg.]C lag. Auch bei 40 [deg.]C und sogar 50 [deg.]C wurde enzymatische Aktivität noch eindeutig festgestellt. Somit ist diese FUM-Carboxylesterase zur Anwendung unter den Temperaturbedingungen wie im Verdauungstrakt, oder im Zuge von Prozessschritten der Lebens- oder Futtermittelherstellung, die bei erhöhter Temperatur stattfinden, geeignet . 

  
Beispiel 5: Bestimmung des pH-Bereichs der Aktivität von Fumonisin-Carboxylesterase 

  
Zur Bestimmung des pH-Bereichs, in dem Fumonisin-Carboxylesterase aktiv ist, wurde Teorell-Stenhagen-Puffer verwendet. Dieser Puffer lässt sich durch die Kombination von Citrat, Phosphat und Borat über einen Bereich von 10 pH Einheiten mit gleicher Pufferkapazität einstellen. FUM-Carboxylesterase wurde in einer Konzentration von 3,3 ng/ml mit 10 ppm Fumonisin Bl bei verschiedenen pH-Werten in diesem Puffer bei 25 [deg.]C inkubiert. Die höchste Aktivität zeigte sich bei pH 8,0, aber es konnte im gesamten Bereich von pH 5 bis pH 10 Aktivität festgestellt werden. Durch die Aktivität in diesem breiten pH-Bereich wird die technologische Anwendung des Enzyms als Futtermittelzusatz bzw. in Zuge der Verarbeitung von Lebens- und Futtermitteln ermöglicht. 

  
Beispiel 6 : Fütterungsversuch mit Ferkeln 

  
Der Versuch wurde in einem Versuchsstall mit 12 Buchten für jeweils 10 Tiere durchgeführt. Der Stall war ausgestattet mit Spaltenboden, Schalentränkern und einem computergesteuerten Fütterungssystem. Die Automaten waren entlang der Buchtenwände angeordnet. Das Stallklima wurde täglich automatisch aufgezeichnet und die Temperatur nach den Standardempfehlungen zur Ferkelaufzucht eingestellt. 

  
120 gemischt-geschlechtliche Absetzferkel (Alter: ca. 4 Wochen, durchschnittliches Einstellgewicht 8,21 kg) wurden für diesen Versuch eingesetzt. Jedes Ferkel wurde mit einer Ohrmarke versehen und einzeln gewogen. Die 120 Ferkel wurden auf 12 Buchten zufällig verteilt. Alle Ferkel entstammten dem österreichischen Zuchtprogramm ÖHYB (= (Edelschwein x Landrasse) x Pietrain) . 

  
Direkt nach dem Absetzen wurden die Ferkel für 2 Tage mit einem Starterfutter gefüttert, nach dieser Eingewöhnungsphase erfolgte die Umstellung auf das Versuchsfutter. Die Fütterung erfolgte 2-phasig: Absetzphase Tag 1 - 14, Aufzuchtphase Tag 15 42. Das Versuchsfutter wurde buchtenindividuell über die SpotmixFütterungsanlage gemischt und je nach Anzahl der Ferkel, Gewichtsentwicklung und Futterverzehr zweimal täglich trocken zugeteilt. Wasser stand zur Aufnahme ad libitum zur Verfügung. Die 12 Buchten wurden in vier verschiedene Applikationsgruppen zu je <p *      

  
drei Wiederholungen geteilt und erhielten die folgenden Einmischungen ins oben beschriebene Futter: 

  
Gruppe 

  
Negativ-Kontrolle Keine Toxine, kein Enzymzusatz 

  
Positiv-Kontrolle 4 - 5,5 ppm Fumonisin Bl 

  
Versuchsgruppe 1 4 - 5,5 ppm Fumonisin Bl + Enzymmix 1 (Carboxylesterase, Aminotransferase, Pyruvat) 0,5 kg/t Futter 

  
Versuchsgruppe 2 4 - 5,5 ppm Fumonisin Bl + Enzymmix 1 (Carboxylesterase, Aminotransferase, Pyruvat, inerter Carrier) 1 kg/t Futter
 <EMI ID=23.1> 
 

  
In der Positiv-Kontrolle wurden bei fast der Hälfte der Tiere respiratorische Probleme beobachtet, wobei es auch zu einem Ausfall kam. Alle anderen Gruppen erschienen gesund. 

  
Leistungsdaten 

  
Gruppe Anzahl Anfangsgewicht Endgewicht Ausfälle der (Durchschnitt , (Durchschnitt , 

  
Tiere kg) kg) 

  
Negativ- 30 8,34 26,82 Kontrolle 

  
Positiv- 30 8,17 24,77 1 Kontrolle 

  
Versuchsgruppe 1 30 8,08 26,69 

  
Versuchsgruppe 2 30 8,25 27,03
 <EMI ID=23.2>

Claims (1)

  1. A n s p r ü c h e
    1. Verfahren zur Herstellung eines Futtermittelzusatzes zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotisehen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder auch ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus gewonnen werden kann, wobei das wenigstens eine Enzym gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem Futtermittel eingesetzt wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor Einsatz der Enzyme im Futtermittel diese mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme isoliert werden.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden.
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus Permease ID-Nr. 3, Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder AcetolactatSynthase ID-Nr. 23 gewählt werden.
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 aufweist.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei Einsatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 als Cosubstrat ein Keton, insbesondere eine [alpha]-Ketosäure, eingesetzt wird.
    8. Futtermittelzusatz zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in Futtermitteln bzw. im Verdauungstrakt von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus zur Produktion dieser Enzyme sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenigstens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind.
    9. Futtermittelzusatz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese oder molekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind.
    10. Futtermittelzusatz nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit einem Enzym der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 aufweist.
    11. Futtermittelzusatz nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind.
    12. Futtermittelzusatz nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus einer Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, einem Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder AcetolactatSynthase ID-Nr. 23 gewählt sind.
    13. Futtermittelzusatz nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat und ein inerter Träger enthalten sind.
    14. Verwendung von Genen, wie sie in den Sequenzen ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 dargestellt sind, 26 -
    oder kompletten, rekombinanten Wirtsorganismen zur Expression dieser Gensequenzen sowie gegebenenfalls von Cosubstraten zur Herstellung eines Futtermittelzusatzes für Tiere.
    15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, eine Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als Cosubstrat sowie ein inerter Träger eingesetzt werden.
    Wien, i g C[pound]p 2008 Erber Aktiengesellschaft durch :
    Patentanwälte Miksovsky & <EMI ID=26.1>
    - 24 -
    P a t e n t a n s p r ü c h e
    1. Verfahren zur Herstellung eines Futtermittelzusatzes zum sauerstoffunabhängigen, enzymatischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Genen entsprechend Sequenz ID-Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 und 24 vorgelegt wird, die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in prokaryotisehen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert wird und wenigstens ein dadurch hergestelltes Enzym entsprechend Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 oder auch ein kompletter, rekombinanter Wirtsorganismus gewonnen werden kann, wobei das wenigstens eine Enzym gegebenenfalls gemeinsam mit einem Cosubstrat in einem Futtermittel eingesetzt wird.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor Einsatz der Enzyme im Futtermittel diese mittels molekulargenetischer Methoden, Mutagenese oder molekularer Evolution verändert werden.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme isoliert werden.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme in einer Schutzhülle verkapselt werden.
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus Permease ID-Nr. 3, Carboxylesterase ID-Nr. 9, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr. 17, Aminotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder AcetolactatSynthase ID-Nr. 23 gewählt werden.
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt wird, welches wenigstens 90 % Sequenzidentität mit wenigstens einem der Enzyme ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 25 aufweist.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei Einsatz von Aminotransferase ID-Nr. 19 oder
    NACHGEREICHT 25
    ID-<N>r. 25 als <C>osubstrat ein Keton, insbesondere eine [alpha]-Keto säure, eingesetzt wird.
    <8>. Futtermittelzusatz zum sauerstoffunabhängigen, enzyma tischen Abbau von Mykotoxinen, insbesondere Fumonisinen, in Fut termitteln bzw. im Verdauungstrakt von Tieren, dadurch gekenn zeichnet, dass wenigstens ein Enzym der Sequenz ID-Nr. 3, 5, 7, 9/ 11, <13>, 15, <17>, 1<9>, 21, 23 und 25 oder wenigstens ein kompletter' rekombinanter <W>irtsorganismus zur Produktion dieser Enzyme sowie gegebenenfalls zusätzlich wenigstens ein Cosubstrat für wenig stens eines bzw. einige der eingesetzten Enzyme und ein inerter Träger enthalten sind.
    9. Futtermittelzusatz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich net, dass durch molekulargenetische Methoden, Mutagenese oder mo lekulare Evolution veränderte Enzyme eingesetzt sind.
    1<0>. Futtermittelzusatz nach Anspruch 8 oder 9, dadurch ge kennzeichnet, dass ein Enzym eingesetzt ist, welches wenigstens 90 <%> SequenzIdentität mit einem Enzym der ID-Nr. 3, 5, 7, 9, 1X 13 <1>5, 17, 19, 21, 23 und 25 aufweist.
    11. Futtermittelzusatz nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme, veränderten Enzyme und/oder zu wenigstens 90 % identen Enzyme mit einer Schutzhülle ummantelt eingesetzt sind.
    <1>2. Futtermittelzusatz nach einem der Ansprüche 8 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme aus einer Carboxylesterase ID-<N>r. <9>, Tricarballylat-Dehydrogenase ID-Nr. 11, einem Citratverwertungsprotein ID Nr. 13, Alkohol-Dehydrogenase ID-Nr 17 <A>minotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 und/oder Acetolactat<S>ynthase ID-Nr. 23 gewählt sind.
    <1>3. Futtermittelzusatz nach einem der Ansprüche 8 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylesterase ID-Nr. 9, eine <A>minotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25, eine [alpha]-Ketosäure als <C>osubstrat und ein inerter Träger enthalten sind.
    1<4>. <V>erwendung von Genen, wie sie in den Sequenzen ID-Nr. 1, <2>, 4, 6, <8>, <1>0, 12, 1<4>, 16, 18, 20, 22 und 24 dargestellt sind!
    NACHGEf»EICHT - 26 -
    oder kompletten, rekombinanten Wirtsorganismen zur Expression von Enzymsequenzen ID Nr. 3, 5, 7, 9, li, 13, 15, 17, 19, 21, 23 und 2<5> sowie gegebenenfalls von Cosubstraten zur Herstellung eines Futtermittelzusatzes für Tiere.
    <1>5. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein <C>osubstrat gewählt aus der Gruppe einer Carboxylesterase IDNr. <9>, einer <A>minotransferase ID-Nr. 19 oder ID-Nr. 25 oder einer [alpha]-Ketosäure und ein inerter Träger eingesetzt werden.
    Wien, 3. September 2009
    Erber Aktiengesellschaft durch: S^¯)
    Patentanwälte f Miksovsky & Pollhmjg[pound]^_QG
    NACHGEREICHT
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