AT506663B1 - Extraktionsvorrichtung zur zerstörungsfreien manipulation und analyse flüssig-heterogener partikelsuspensionen - Google Patents

Abstract

Mischungen aus Partikeln bzw. biologische Zellen werden während oder nach selektiver Färbung bzw. Markierung mittels Fluoreszenzfarbstoffen oder ionisierender Markersubstanzen durch einen Suspensionsinjektor ( 0.0 ) in eine Extraktionsvorrichtung gepresst, welche aus Wechselkartusche und Analysator besteht. Magnete ( 2.4, 2.5) und elektrische Felder beeinflussen gemeinsam mit einer hinter einer Glasplatte (1.8) angeordneten Porenfilterplatte (1.3) die selektive, grössenabhängige Retention bestimmter Partikel und immobilisieren diese zugleich innerhalb einer arretierbaren Wechselkartusche (6.3, 6.5). Elektrisch angeregte Lichtpulse ( 2.0) treffen durch eine transparente Sichtplatte (1.8) auf die im Zwischenraum befindlichen Partikelextrakte und regen diese zu Fluoreszenz an. Die korrelativ emittierten Photonen werden mittels hochempflindlicher temperaturkompensierter Photosensoren (3.1) spektral selektiv (3.0) registriert und über eine Auswerteelektronik samt Schwellwertschalter optisch, akustisch (3.7) oder mittels alphanumerischem Matrixdisplay zur Signalanzeige gebracht, die dem Nutzer direkt oder über Funkmodul ( 5.8 ) zugänglich ist.

Description

österreichisches Patentamt AT506 663 B1 2011-03-15

Beschreibung [0001] Verschiedene Diagnoseverfahren erfordern die Markierung und Manipulation von nicht sterilen Körperflüssigkeiten. Zur zytologischen Charakterisierung von Zellen in Harn, Blut oder Abstrichen, etc. ist die Färbung und Zählung und mikroskopische Morphologie von Bedeutung. Durch Inkubation von Zellen und Partikeln mittels fluoreszenzaktiver Chromophore wird eine Verdeutlichung von speziellen Zelltypen gegenüber Standardfärbemethoden ermöglicht. Zur Erlangung hoher Signal-Hintergrund Verhältnisse ist es wichtig die markierten Zellen einfach oder stufenweise abzutrennen oder zu konzentrieren. Die Beschreibungen gehen auf bestehende Systeme und deren Funktionsweise im Vergleich zu der gegenständlichen Erfindung detailiert ein. Weitere Anwendungen finden sich in den Umweltwissenschaften zur Untersuchung von Hydrosolen, in Flüssigkeiten suspensierten Aerosolen und allgemein infektiöstoxikologisch relevanter Teilchen bzw. zur grössenselektiven Sammlung radioaktiver Partikel. Zur Anwendung im Rahmen der Lebensmittelsicherheit und der Risikoforschung werden verschiedene isotopen-chemische Abscheidungs- und Konzentrationsmechanismen für radioaktive Elemente und Partikeln zum Gegenstand der Erfindung gemacht.

STAND DER TECHNIK

A) PARTIKELFILTER UND SEPARATIONSTECHNIK

[0002] Für Aerosole, Hydrosole und allgemeine Flüssigkeiten unter normalen atmosphärischen Bedingungen bestehen Filtervorrichtungen, Impaktoren oder Kartuschenfilter unterschiedlicher Bauart. Im medizinischen Bereiche finden in Kunststoff verkapselte Filter zur Aufreinigung von biologischen Flüssigkeiten wie z.B. auch Blut Anwendung. In flüssigen Medien wie z.B. Blut werden auch verschiedene Sedimentationstechniken zur Separation und Konzentration der verschiedenen Blutbestandteile angewendet. Hierzu gehören auch Dichtegradienten-Zentri-fugations und Sedimentationseinrichtungen. Einzelne suspensierte Zellen könne mittels mikro-fluidischer Techniken oder FACS-Flowcytometrie gezählt und statistisch ausgewertet werden. (Fluoreszenz-activiertes Zellsorting) Die gezählten Zellen können selektiv durch elektrostatische Aufladung aus einer Tröpfchenkette abgelenkt und getrennt gesammelt werden.

B) MESSTECHNIK

[0003] Üblicherweise werden durch Hydrosol-Filter oder Aerosolimpaktoren separierte Partikel näher untersucht in dem das Filterblatt aus der verschraubten Filterkartusche herausgenommen und z.B. mikroskopisch analysiert wird. Ebenso gibt es mikroskopische Vorrichtungen in welchen Filterpapier fluoreszenzoptisch untersucht werden kann, jedoch gilt bei allen Techniken, dass der zu untersuchende Filter aus seiner sterilen Kartusche entnommen wird und damit das Personal einerseits einem Infektionsrisiko ausgesetzt wird oder das Messergebnis durch Verunreinigungen verfälscht werden kann.

[0004] Prinzipiell berührungsfreie Messtechniken zur Untersuchung von Partikeln in Medien sind Techniken wie [0005] Absorbtionsspektroskopie [0006] Fluoreszenzspektroskopie [0007] Raman.-Spektros-kopie [0008] FTIR-Spektroskopie [0009] Konfokale Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie [0010] Pulsvoltammetrische Verfahren [0011] Mie-Streuung, Raman-Streuung, Raleigh-Streuung von Lichtstrahlung [0012] Thermografische Verfahren 1/20 österreichisches Patentamt AT506 663B1 2011-03-15 [0013] Fluoreszenz-aktiviertes Cell-Sorting ( FACS) [0014] LASER-induzierte Plasma-Spektroskopie [0015] Es existieren Verfahren zur Modulation von Partikelordnungen Aggregations- Separations- bzw. Phasentrennungsdynamiken, wie beispielsweise [0016] Ultraschall-Absorbtions und Reflexionsmethoden [0017] Ultraschallemulationsmethoden [0018] Bestimmung von Stosswellen-Attenuationskoeffizienten [0019] Weitere existente Verfahren zur berührungsfreien Untersuchung analysieren radioaktive Partikeln, mittels [0020] Energiebestimmung ionisierender Strahlung aus Isotopen mittels Szintillationskristallen [0021] Dosisbestimmungen durch Halbleiterdosimeter und Zählkammern [0022] Thermoliunineszenzdosimetrie [0023] Röntgenfluoreszenzspektrometrie und -dosimetrie [0024] etc.

[0025] Einzelne Methodiken können das laufende Messen von in Kanälen strömenden Partikeln ermöglichen wie Durchflussküvetten oder auch FACS Geräte zur Untersuchung von Blutzellen. Instrumentarien, welche zur spektrometrischen Messung erforderlich sind, stellen einen grossen technischen Aufwand dar und das Infektionsrisiko bzw. radioaktive Kontaminationsrisiko ist bei diesen Methoden trotzdem sehr hoch, weil neben den an sich dichten Küvetten noch komplexe Zuleitungsschläuche und Nebenbehälter zum Betrieb einer solchen Anlage benötigt werden.

[0026] Deshalb wurden „Wegwerf-Behältnisse" entwickelt, deren Gerätetechnik zumindest optische Analysen erlauben. Der Aufwand im zugehörigen Analysegerät ist trotzdem beträchtlich und schließt mobile Anwendungen aus.

[0027] On-Chip-Technologien ermöglichen zudem zwar eine Miniaturisierung eines Flüssigkeitsstromes in Kombination mit Nukeotid-Sequenz-spezifischen Farbstoff-feldern die mittels fluoreszenzoptischer Techniken in grossen Geräten ausgewertet werden. Derartige als DNA-Arrays zur Genotypisierung herangezogenen Laborinstrumente können ebenso NICHT zur MOBILEN DIAGNOSTIK von Partikelsuspensionen herangezogen werden.

[0028] Auf der anderen Seite gibt es für eine grosse Benutzerzahl ausgelegte nicht berührungsfreie unsterile Schnelltestverfahren zur Bestimmung verschiedener diagnostischer Parameter von Erkrankungen, wie Blutzuckerstreifentest für Harn oder Antikörpertests (z.B. NMP22) für die Tumordiagnostik. Die Auswertung dieser einfachen Schnelltests wird meist dem Benutzer überlassen. Für Steifentests mit Verfärbungsindikator gibt es deshalb auch einige Fehlermöglichkeiten zur Missdeutung von optischen Färbungen durch einfache visuelle Betrachtung. Sogenannte Point-of-care-tests (POC) genannte Vortestverfahren sollen einerseits in zunehmenden Ausmaß einer steigenden Zahl von Personen Zugang zu frühdiagnostischen Massnahmen ermöglichen. Umsomehr entsteht der Bedarf Beobachter-bedingte Messfehlermöglichkeiten zurückzudrängen, da diese die POC-Verfahren schwächen.

[0029] Die Analyse bestehender Systeme als Stand der Technik ergibt die Erkenntnis, dass es eine Lücke in verfügbaren Gerätetechnologien gibt. Es gibt keine mobilen Partikel-separations-systeme. die ZUGLEICH eine zuverlässige berührungsfreie fluoreszenz-optische Diagnostik von Partikeleigenschaften ermöglichen. Es gibt zudem keinen Streifenfarbtest, welcher zugleich eine mobile Objektivierung von Partikeleigenschaften durch optische Methoden anbietet, so-dass der Nutzer diese Beleuchtungs- und Visus-abhängigen Interpretationsunsicherheiten ausschließen könnte.

[0030] Die als Stand der Technik für präzise Partikelanalysatoren anzusehenden grossen Aerosolpartikelanalysatoren sind nicht zerstörungsfrei arbeitende hochkomplexe Geräte, deren 2/20 österreichisches Patentamt AT506 663B1 2011-03-15

Anwendung in mobilen Diagnosebereichen nicht möglich sind. In einem Gasanalysator werden beispielsweise mittels LASER-strahlen Partikel delektiert indem diese verdampft werden [1], [2], [3] um die chemische Zusammensetzung und Grösse zu bestimmen. Auch werden Filtervorrichtungen angewendet, die zwar wegen der zylindrischen Geometrie hohe Oberfläche aufweisen [3] , jedoch optisch für die vorliegende Messaufgabe nicht zugänglich sind. Eine andere Art der Detektion stellt die dynamische Lichtsteuung (DLS) dar, welche allerdings ebenfalls komplexe optische Bänke als Messaufbauten erforderlich machen.

ZIELE DER ERFINDUNG

[0031] Ziel der neuen Erfindung ist einerseits die skizzierten Mess-Unsicherheiten bei diagnostisch orientierten Massenartikeln besser ausschließen zu können und andererseits neuartige biochemische Markierungsmethoden für Medizin, Umwelttechnologie und Interventioneile Methoden einer breiten Nutzerzahl auf ökonomischer Basis zugänglich machen zu können. Weiters steigt auch der Bedarf für Sicherheits-orientierte Messvorrichtungen wie z.B. zur Bestimmung von hoch infektiösen Kontaminationen von bestimmten Sporen, Bakterien oder Kontaminationen durch unfallbedingte radioaktive Fall-out-teilchen. Auch für den Anwendungsbereich Telediagnostik in medizinischen oder umwelttechnolgischen Bereichen gewinnt dieser Bedarf steigende Bedeutung, da die hierzu notwendige Funkttechnologie heute als ökonomisch finanzierbar anzusehen ist.

[0032] Ein wichtiges Anwendungsbeispiel ist die Krebs-Frühdiagnostik an Körperflüssigkeit von Patienten zur Vorsorge-, Nachsorge- und Arbeitsmedizin. Eine weitere Anwendung dieser Erfindung liegt im empfindlichen Nachweis von Mikro- und Nanopartikeln in Flüssigkeiten, welche radioaktive oder toxikologische Risiken beispielsweise auch darstellen können. Die in Folge dargestellten erfindungsbezogenen kompakten Filtrations-, Separations- und Analysevorrich-tungen besitzen darüber hinaus Applikationen in ziviler und militärischer Weltraum-Medizin bzw. -Sicherheitstechnik einerseits und eröffnen mobile Qualitätskontrollen für die industrielle Pro-zess-technik andererseits.

[0033] Aufgrund von bisherigen vorliegenden Messungen an Tumorzellen in Flarnflüssigkeiten [4] und den damit verbundenen Markersubstanzentwicklungen [5], [6] wurde ein unerwarteter Anreicherungseffekt an vitalen Blasencarzinomzellen des Menschen festgestellt, der es im Kontext zur Anwendung verschiedener polymerbasierter Fluoreszenzmarker für sinnvoll erscheinen lassen ein einfaches, mobiles System zu für den schmerzlosen hochsensitiven Nachweis von vitalen Krebszellen in Körperflüssigkeiten entwickeln. Dies wurde durchgeführt.

[0034] Es ist daher eine exemplarisch besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung Tumorzellen in Harnflüssigkeiten zu identifizeren und deren Eigenschaften einfach anzuzeigen.

GEGENSTAND DER ERFINDUNG

[0035] In der vorliegenden Erfindung wird eine durch verschiedene Materialien bzw. Kunststoffen realisierbare kompakte Konzentrationsvorrichtung zur Extraktion und optoelektronischer Analyse vorgestellt, die durch Injektion mittels beliebiger Kolbenspritzen bedient werden kann. (Suspensionsinjektoren 0.0) Die Konstruktionen eignet sich gut zur Produktion als Massenartikel und weisen Vorzüge als low-cost Verbrauchsmaterial in arbeitsmedizinischer Vorsorge- und ontologischer Nachsorgediagnostik auf.

[0036] Die innerhalb von Flüssigkeit aufgetrennte Zellen oder Partikeln werden mit Licht selektiver Wellenlängen bestrahlt und fluoreszenzoptische Signale gemessen. Diese Signalwerte werden mittels elektronischer Verstärker temperaturkompensiert intensiviert. Ein kalibrierbarer elektronischer Komparator erzeugt ein dem Nutzer klar sichtbares Blinklichtsignal oder akustisches Begleitsignal, welches das Vorhandensein beispielsweise bestimmter Zelltypen als Diagnosehinweis anzeigt. Dieses Signal kann bei Bedarf auch in Verbindung mit einer telemedizini-schen Sendevorrichtung verwendet werden und damit eine regelmäßige diagnostische Verbindung zwischen Patient und Arzt ermöglichen.

[0037] Die für die Umweltdiagnostik relevanten Zusatzanwendungen (Partikelmessungen an 3/20 österreichisches Patentamt AT506 663B1 2011-03-15 radioaktiven Kontaminationen, etc.) nutzen die besonders kompakte Struktur der Extraktionskartuschen samt der miniaturisierten Elektronik dazu aus um die Geräte auch verstärkt in mobilen Einsatz zu bringen. Die gegenständlichen Extraktoren in Verbindung mit den speziellen Kompaktsensoren gibt es in dieser Form nicht am Markt. Ziel der vorliegenden Anmeldung ist es daher diese neuen Messgeräte für den Markt und die Risiko- und Vorsorgemedizin wirtschaftlich zu sichern.

FIGURENÜBERSICHT

[0038] Fig.

[0039] Fig. [0040] Fig.

[0041] Fig.

[0042] Fig.

[0043] Fig.

[0044] Fig. [0045] Fig. [0046] Fig. [0047] Fig. [0048] Fig. 1a zeigt einen Suspensionsinjektor samt Partikelextraktor, bestehend aus einer Wechselkartusche und einem Analysator in arretierter Position zur selektiven Detektion Analyse und Signalisierung von fluoreszenzmarkierter Tumorzellen oder Partikeln eines bestimmten Größenbereiches unter Verwendung eines einzigen optischen Spektralbereiches 1b zeigt den Partikelextraktor in der die Wechselkartusche in Entnahmeposition abgetrennt vom Analysator dargestellt ist. 2 zeigt einen Partikelextraktor, wie Fig. 1a jedoch mit einer Vorrichtung zur Detektion und Analyse fluoreszierender Tumorzellen oder Partikeln eines bestimmten Grössenbereiches unter Verwendung mehrerer optischer Spektralbereiche. (Multispektraler Monofraktionsextraktor)und unter Einsatz von verschiedenen Magnetfeldern. 3 zeigt den Aufbau einer Wechselkartusche eines Multifraktions-Partikel-Extraktors, der in der Lage ist, hinter verschiedenen Sichtfenstern unter Verwendung unterschiedlicher Porenfilter Partikel unterschiedlicher Grössen selektiv aufzutrennen und einer Messung zuzuführen. Exemplarisch werden die Positionen von Magneten an den Kanälen dargestellt. 4 zeigt den Querschnitt und Aufbau eines optoelektronischen Messbereiches von Extraktoren überhalb der die Wechselkartusche abschliessenden Sichtplatte samt Detailplan der Porenfilterplatte. Es werden die Positionen von Trennmagneten nah den Lichtquellen dargestellt. 5 zeigt eine Wechselkartusche, die mobil in einem optoelektronischen Multifunkti-ons-auslesegerät eingesteckt und fixiert gehalten wird. Das Gerät besitzt neben einer einfachen Signalvorrichtung (Lampe oder akkustischer Geber) auch eine digitale alphanumerische Anzeige, die eine Kalibration der einfachen Signalanzeige möglich macht. 6 zeigt einen Detailaufbau zweier Porenfilterplatten im Falle selektiv markierter, fluoreszierender Suspensionsteilchen und im Falle der Anreicherung radioktiver Marker beispielsweise an Tumorzellen. 7 zeigt den Querschnitt eines Monofraktionsextraktors, welcher neben optischen Sensoren zur Röntgen-Fluoreszenz oder Luminszenzdetektion auch mit Halbleiterdetektoren zur Detektion ionisierender Strahlung von extrahierten radioaktiven Partikeln ausgestattet ist. 8 zeigt einen Querschnitt eines Monofraktionspartikelexrakors, in welchem sowohl Szintillationskristalle und Thermolumineszenzkristalle sowie Halbleiterdetektoren zur energieselektiven Detektion ionisierender Strahlung extrahierter radioaktiver Partikeln dargestellt sind. 9 zeigt die elektronische Schaltung unter Verwendung von temperaturkompensierten Photodarlingtonverstärkern zur Detektion ultraschwacher Lumineszenzen aus extrahierten Partikelsuspensionen samt Schwellwert-signalgeber 10 zeigt die elektronische Schaltung unter Verwendung von temperaturkompensierten optischen ΟΝ-CHIP Verstärkern zur Detektion ultraschwacher Lumineszen- 4/20 österreichisches Patentamt AT506 663 B1 2011-03-15 zen aus extrahierten Partikelsuspensionen samt Schwellwert-signalgeber. Die Steuerung der LED findet durch freilaufenden Rechteckgenerator mit einstellbarem Tastverhältnis statt.

[0049] Fig. 11 zeigt die elektronische Schaltung unter Verwendung von temperaturkompensier ten optischen ΟΝ-CHIP Verstärkern, Differenzstufe und einem Rechteck -Puls-Signalgeber samt Lock-In Verstärker zur Störungsunempflindlichen Messungen bei wechselnden Lichtverhältnissen.

[0050] Fig. 12 zeigt die elektronische Schaltung unter Verwendung von temperaturkompensier ten optischen ΟΝ-CHIP Verstärkern, Differenzstufe und einem Quarz-Oszillator samt Lock-In Verstärker.

[0051] Fig. 13 zeigt die elektronische Schaltung unter Verwendung von temperaturkompensier ten optischen ΟΝ-CHIP Verstärkern, Differenzstufe, Integrator, Mixer und Phasendetektor samt Schwellenwert-Signalgeber und einem Quarz-Oszillator als Sinusgenerator. Ziel ist die Detektion von Phasenverschiebungen zwischen moduliertem Lichtanregungssignal und entstandenem Fluoreszenzsignal aus extrahierten Partikelsuspensionen.

[0052] Fig. 14 zeigt eine Schaltung bestehend aus durch einen Multiplexer gesteuerte Arrays von Lichtemittierenden Dioden (LED) und Arrays von Photosensoren samt optischer Filterketten zur simultanen Messung von optischen Fluoreszenz-Emissionsspektren und Fluoreszenz-Anregungsspektren an selektierten, extrahierten Partikelsuspensionen.

KOMPONENTENLISTE 0.0 Suspensionsinjektor 3.1 optoelektronisches Sensor-array 1.1 Injektionskanüle 3.2 Szintillationskristall 1.2 Separations-, Reaktions-, Analysekammern 3.3 Halbleiterstrahlungsdetektor für ionisierende Strahlung 13 Doppelporenfilter 3.4 Metallische Absorberplatte 1.4 Pressring für Porenfilter 3.5 TLD-thermolumineszenzkristall 1.5 Lamellengitter zur Halterung v Filter 3.6 Infrarot-Puls-LASER-diode 1.6 Einströmungsmündung 3.7 optischer, akustischer Signalgeber 1.7 Aus,- Überströmungsmündung 3.8 Multiplexer 1.8 transparente Sichtplatte 3.9 Rechteck-Puls-T aktgenerator 1.9 Silikondichtung 4.0 Lock-1 N-Verstärkerkette 2.0 LED-Halbleiteremmissonsdioden 4.1 Vielkanal-Analog-Digital-Wandler 2.1 Optische Emissionsfilter 4.2 Quarz-Oszillator 2.2 PCP-Elektronikplatine 4.3 Elektronisches Signal-Mixer-modul 2.3 hochempfindlicher optischer Sensor 4.4 Tiefpass, Phasendetektor 2.4 Magnete in Extraktorkartusche 4.6 Integrator 2.5 Magnete in Analysator 4.7 Differenzverstärkerstufe mit niedrigem Eingangsfehlstrom 2.8 Alphanumerisches Matrixdisplay 4.8 ON-Chip Photosensor-verstärker 2.9 optisches Anregungsfilter 4.9 Lichtabschirmung 3.0 optisches Emissionsfilter-Array 5.0 Schwellwertschalter 5.1 Integrator-Verstärker 5.9 Markersubstanz 5.2 Taster 6.0 Target-Partikel, Zellen 5.3 Photodarlington-T ransistor 6.3 Extraktionskartusche 5.5 Pulshöhendiskriminator 6.4 optoelektronisches Analysatorgehäuse 5.7 Röntgenfluoreszenzkristall 6.5 Arretierung 5.8 Funkeinrichtung zur Datenübertragung 5/20 österreichisches Patentamt AT506 663B1 2011-03-15

ANWENDUNGSORIENTIERTE DETAILBESCHREIBUNG DER FUNKTIONELLEN KOMPONENTEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

A) EINFACHE AUSFÜHRUNGSBESCHREIBUNG

[0053] Die einfachste Ausführung dieser Erfindung stellt eine Extraktionsvorrichtung dar mit integrierten miniaturisierten Lichtquellen zur einfachen Fluoreszenzanregung mit einfach definierten Lichtspektrum und optischen Filtern sowie Sensoren zur Signalerfassung. Eine Umsetzung und Darstellung dieser Signale gegenüber der bedienenden Person wird durch einfache Leuchtdioden (Fig.2, 3.7) oder Diodenarrays bzw. LCD-Anzeigen direkt auf dem Gerät realisiert. (Fig. 5, 3.7, 2.8) Durch hochkapazitive Ladungsspeicher wird die elektrische Funktion der Messgeräte für gewisse Zeiten und Bedienhäufigkeiten gewährleistet.

[0054] Die Extraktion der Partikelsuspension wird durch manuelles oder automatischen Injizieren unter Verwendung verschiedener Spritzen bzw. Injektoren durchgeführt. Ist die Extraktion erfolgt, so verbleiben die extrahierten Partikel in der Kartusche (6.3). Diese kann in der folge auf einen Analysator (6.4) durch eine Steck oder Schraubverbindung fixiert werden (Fig. 1a, Fig. 1 b) oder auch wieder getrennt werden um die Partikel an einem anderen Sensorgerät untersuchen zu können.

[0055] Der Analysator besteht aus optoelektronischen Komponenten, deren detailierte Aufgaben in den Figurenübersicht spezifiziert sind. Im einfachsten Beispiel werden elektrisch erzeugte Lichtpulse (2.0, Fig. 9) oder LASER-pulse (3.6, Fig. 8) durch eine Sichtplatte (1.8) auf die in der Kartusche (6.3) immobilisierten extrahierten Partikel gestrahlt und regen diese zur Fluoreszenz an. Die spektral gefilterten Photonen (3.0) werden durch hochempfindliche temperaturkompensierte Detektoren (3.1, Fig. 2) registriert und über eine Auswerteelektronik (4.7) und einem Schwellwertschalter (5.0) zur Anzeige gebracht (3.7)

B) KOMPLEXERE AUSFÜHRUNGSBESCHREIBUNGEN

[0056] Für komplexere Fragestellungen wird beispielsweise ein Multispektraler-Partikelextraktor (Fig. 2, Fig. 14), in der dargestellten Form angewendet, welcher eine Licht-Anregung von Partikeln bzw. Zellen mittels verschiedener Lichtwellenlängen bzw. Frequenzbändern erzeugt und Fluoreszenzen durch verschiedene spektrale Emissionsfilter f1, f2, f3 registriert. Besondere Auswahl der optoelektronischen Einstellungsparameter des Extraktionsgerätes wie die optische Filtersteilheit des Exzitationsfilters und der Wahl der Halbleiter-Leuchtdioden ermöglicht es die Signifikanz und Empfindlichkeit der Vorrichtungsanzeige für die jeweilige Diagnoseaufgabe zu optimieren.

[0057] Durch verschieden optisch gefilterte Dioden-Anregungslichtfrequenzbänder ν·\ - v4 werden Fluoreszenzen erzeugt mit unterschiedlichen Emissionsspektren oder Exzitationsspektren. Diese werden durch Messungen von Signalen aus verschiedenen Emissionsfrequenzbändern vT' - v4" alternierend durch einen Multiplexer zur Registration in einem Analog -Digital -Konverter gebracht. Die gewonnenen spektralen Informationen der Partikel-Lumineszenzen in Form der Emissionsmatrix ME [Φ[ί, j]] auf einem alphanumerischen Matrix-Display angezeigt. (Fig. 5, Fig. 14) ME φ[/. yj

^ί,ιΟνΟ (v2,v’) FyAvi>vl)ΛΛνΐ’ν4) θ'*. O ^>3^2*) Kl (Wl)FlAV3^l) ^1,1 OpW) KAwa) Fu(y*y*) 6/20 österreichisches Patentamt AT506 663 B1 2011-03-15 C) [0058] Fragestellungen, welche sehr von der Zusammensetzung einer Partikelmischung ab-hängen, werden sinnvollerweise durch hintereinander geschaltete Extraktionselemente ausgeführt. In einem solchen Mutti-Fraktionsextraktor (Fig. 3, Fig. 4) werden beispielsweise durch Magnete oder elektrische Felder die Teilchen vorselektiert um in der Folge durch die angedockten Analysatoren größenselektive Aussagen über die aufgetrennten Partikel zu erhalten. Die einfachen Analysatoren stellen einen einfachen Schwellwertschater zur Verfügung welcher ein Licht oder akustisches Signal erzeugt, wenn eine eingestellte Signalschwelle überschritten wird. Dieses Signal bedeutet für den Nutzer einen zu definierenden Handlungsbedarf abhängig von der gestellten Diagnoseaufgabe. (3.7 in allen Figuren) Die Größenselektivität wird durch Einsatz von Porenfilterplatten mit unterschiedlichen Porendurchmessern erreicht, welche mit Lamellengitterplatten sowie Pressingen in den Kartuschen fixiert sind. (Fig. 4) D) [0059] Mittels eines Multifunktionellen Auslesegerätes mit alphanumerischer Matrixanzeige kann ein Nutzer auch Zugang zu den genauen Messwerten aus einem Partikelextrakt erhalten und auf diese Weise seinen Schnelltester kalibrieren, prüfen und einstellen. (Fig. 5) E) [0060] Radioaktive Partikel werden durch spezielle Porenfilter mit aktivierten Oberflächen gebunden und extrahiert (Fig. 6) Deren Strahlung wird durch Halbleitersensoren mit einem Pulshöhendiskriminator für ionisierende Strahlung gemessen. (Fig. 7) Insbesondere wird hierbei die Röntgenfluoreszenz bestimmter dotierter Gläser und Kristalle als Sensorik in der Analysekartusche zusätzlich eingesetzt. F) [0061] Besondere Dosis- und Energieauflösung erreicht man mit einem speziellen Aufbau, welcher sowohl Thermolumineszenzkristalle (TLD) als auch Szintillationskristalle und energieselektiv gefilterte Halbleiterdetektoren im Analyseraum des Extraktors vorsieht. (Fig. 8) Diese sind als mobile Risikotester für rauhe Umgebungsbedingungen sehr geeignet.

[0062] Aktivierte transparente gläserne Sichtfenster ermöglichen Bindungsreaktionen zwischen Zellmembranen oder molekularen Flüssigkeitsbestandteilen deren sich verändernde Fluoreszenzeigenschaften als diagnostisches Messignal elektronisch dargestellt wird. Die Porenfilterplatte hat bei fluoreszenzoptischen Anwendungen geschwärzt zu sein, um bessere elektronische Signal-Rausch-Verhältnisse zu erhalten.

[0063] Eine einfache gepulste Ansteuerung von Licht emittierenden Dioden, vorzugsweise im UV bis blauem Spektralbereich ermöglicht eine stromsparende Anregung der Partikel in der Extraktionskammer. Das gewonnene Fluoreszenz-Signal wird geglättet und einem Schwellenwertschalter zugeleitet. Durch thermische Kompensation der elektronischen Signalerzeugung wird eine gute Reproduzierbarkeit der Messungen gewährleistet.

[0064] Mehrere Elektronikschaltungen kommen in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung zum Einsatz: G) [0065] Speziell für den Einsatz bei stark sich ändernden Lichtverhältnissen wird das Prinzip der synchronen Demodulation realisiert. (Fig. 11, 12) Ein Mixer-Modul führt eine Multiplikation von zwei zeitlich veränderlichen Signalen durch, deren Produkt nach einer Fourieranalyse wie folgt allgemein dargestellt werden kann: 7/20 österreichisches Patentamt AT506 663B1 2011-03-15 n*o [0066] Die generierten Rechteckimpulse liefern einerseits eine gepulste Ansteuerung der LED-Dioden zur Anregung der Partikel in der Extraktionskammer und andererseits ein Referenzsignal, das zur Demodulation in den Multiplikator eingeleitet wird sodass nur solche Signale am Ausgang dieses Lock-ln-verstärkers gemessen werden, die in konstanter Phase zu den Referenzsignalen liegen. Kurze Pulszeiten machen daher das Messergebnis faktisch unabhängig von umgebungsbedingten Störlichteinflüssen in der Messvorrichtung. H)

[0067] Speziell für den Einsatz von Markersubstanzen, deren Fluoreszenzlebensdauer sich mit den Bindungseigenschaften ändern wird hingegen das Prinzip der synchronen Demodulation unter Anwendung von stabilisierten Signalen eines Quartz-Oszillators realisiert. Es werden LED Dioden durch ein gewähltes Sinus-Signal angesteuert. Die durch die hervorgerufene optische Anregung der spezifisch markierten Partikel entstandene Fluoreszenz besitzt in Abhängigkeit von photochemischen oder photophysikalischen Bindungs-Eigenschaften abhängige unterschiedliche Lebensdauer τ. Entsprechend gilt die Stern-Vollmer-Gleichung für Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzlebensdauer eines geeigneten Fluorophors P unter Anwesenheit eines spezifischen Quenchers Q I _ τ 1 Ι0“τ,~(1+Κί¥·[Ο]) [0068] im Vergleich zur Situation ohne Quencher in Abhängigkeit von dessen Konzentration. KSv stellt eine substanzspezifische Quenching-konstante dar, die von Fluorophor und Quencher abhängig ist. Die unterschiedlichen Lebensdauern τ haben zur Folge, dass auch bei sinusförmiger Lichtanregung mit einer bestimmten Modulationsfrequenz fm0d eine Phasendifferenz ΔΦ zu dem ebenfalls sinusförmigen gemessenen Fluoreszenzlichtsignales entsteht. tan(AO) = 2it fmod τ [0069] In der vorliegenden Erfindung wird eine spezifische fluoreszenzfähige chemische Substanz in die Extraktionskammer gebracht, welche bestimmte Partikel selektiv markieren. Der Stern-Vollmer-Quenching Mechanismus ermöglicht hierbei einerseits die Intensität der Fluoreszenz in Kombination mit einem LOCK-IN Verstärker zu erfassen. Andererseits kann durch Messung der Phasenverschiebung auf eine Verschiebung der Fluoreszenzlebensdauer zurückgeschlossen werden. (Fig. 12, Fig. 13) I) [0070] Soll die Feststellung von Änderungen der Fluoreszenzlebensdauer eines spezifischen Fluorophors durch Messung einer Phasendifferenz zwischen Anregungslichtsignal und gemessenen Fluoreszenzlichtsignal zur Hauptaufgabe in der vorliegenden Messvorrichtung gemacht werden (Fig. 13), so wird ein der optischen Anregung entsprechendes Referenzsignal ref(t) mit dem zugehörigen phasenverschobenen, bzw. integrierten Messsignal s(t) multipliziert in einem elektronischen Mixersignalmodul, m = ref(t)js(0 [0071] Das derart gewonnene Phasendifferenz-Signal m wird mit einem Tiefpass geglättet und einem Schwellwertschalter-Modul zugeführt. (3.7 in Fig. 13) 8/20

Claims (16)

1. österreichisches Patentamt AT506 663 B1 2011-03-15 REFERENZEN [0072] [1] Patentschrift US 2003/0200796, Pawliszyn [0073] [2] Patentschrift WO 2001/057515 A2, Pawliszyn [0074] [3] WO 1999/ 045362 (Aerodyne research) [0075] [4] US Patent 7390510, (2008), H.G.Loew, et.al. [0076] [5] Ph-D-Thesis Dr. Hans G.Loew-Goretzki, Biophysik in Diagostik und Therapie, Oktober 2005, University Vienna p. 71,76,77,79 [0077] [6] How to make hypericin watersoluble A.Kubin(*), HG.Loew(*), U.Bumer, et.al., (*) equally conributing and sharing first-authorship Pharmazie 63:263-269 (2008) Patentansprüche 1. Extraktionsvorrichtung zur zerstörungsfreien Manipulation und Analyse flüssig-heterogener Partikelsuspensionen, dadurch gekennzeichnet, dass miniaturisierte Injektionskanäle (1.1) mit einer einfachen Anordnung von kompakten, transparenten Separations-, Reakti-ons- und Analysekammern (1.2) über Einströmungsmündungen (1.6) und Ausströmungsmündungen (1.7) verbunden sind und miniaturisierte optoelektronische Sensoren (2.3), auf einer Platine (2.2) sowie Strahlungsquellen (2.0) vorgesehen sind, welche an der Außenseite der transparenten, die Kammern verschließenden Glasplatte, überhalb eines Separationsbereiches (1.3) angeordnet sind.
2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Separationsbereich (1.3) aus einer Anordnung aus Poren (6.2) besteht, deren Durchmesser einheitlich zwischen 0,1 bis 200 pm gewählt sind und dessen Trägermaterial aus geschwärztem Kunststoffmaterial, Glas oder Metall besteht, welches an der Unterseite mit einem Lamellengitter (1.5) und an der Oberseite mit einem Pressring (1.4) verklebt, verbunden, bzw. verschmolzen ist.
3. 3. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einströ-mungs- und Überströmungskanäle der transparenten Kammern (1.2) mit Magneten (2.4) umgeben sind und Magnete (2.5) neben den Lichtquellen (2.0) oberhalb einer transparenten Sichtplatte (1.8) angeordnet sind.
4. 4. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Einströmungskanäle und Überströmungskanäle und Sichtplatten der Kammern (1.2) auf der Innenseite mit elektrisch leitfähigem Material und Markersubstanzen (5.9) oberflächenchemisch beschichtet und mit galvanischen Kontakten versehen sind.
5. 5. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2 und 3 dadurch gekennzeichnet, dass der gesamte mit der Sichtplatte abgeschlossene Kammerbereich (1.1 bis 1.9, 2.4, 6.3) vom Bereich der Elektronik und Optik (2.0-2.4, 2.5, 6.4) abnehmbar ist und durch eine Arretierung (6.5) mittels Steck bzw. Schraubbewegung fixierbar ist.
6. 6. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2 und 3 dadurch gekennzeichnet, dass die als Licht emittierenden Dioden ausgebildeten Strahlungsquellen (2.0) hinter einem Anregungsfilter (2.9) mit definiertem Transmissionsspektrum angeordnet sind und Photodiodensensoren (2.3) , hinter einem Emissionsfilter (3.0) mit definiertem Transmissionsspektrum angeordnet sind. 9/20 österreichisches Patentamt AT506 663 B1 2011-03-15
7. 7. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2 und 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Licht emittierenden Dioden (2.0) hinter mehreren Anregungsfiltern (2.9) unterschiedlich definierter Transmissionsspektren angeordnet sind und Photodiodensensoren (3.1), hinter mehreren Emissionsfiltern (3.0) unterschiedlich definierter Transmissionsspektren angeordnet sind.
8. 8. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass unterhalb der Sichtplatte (1.8) einerseits ein zur Szintillation fähiges Material (3.2) schichtartig angeordnet ist und Licht-Detektoren (2.3, 3.1) mit optischen Filtern (3.0) als auch mehrere Halbleiter-Strahlungsdetektoren (3.3) samt metallischen Absorberplatten (3.4) mit einem Pulshöhendiskriminator (5.5), elektrisch leitend verbunden sind, sowie andererseits Thermolumi-neszenzkristalle (3.5) mit einem kleinen Infrarot-Halbleiterlaser (3.6) angeordnet sind, welche insgesamt mit einer Signaleinrichtung (3.7) verknüpft sind.
9. 9. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass unterhalb der Sichtplatte (1.8) ein Röntgenfluoreszenzkristall (5.7) angeordnet ist und sowohl Licht-Detektoren (2.3) mit optischen Filter (2.1, 3.0) als auch ein Halbleiter-Strahlungsdetektor (3.3) samt metallischer Absorberplatte (3.4) mit einem Pulshöhendiskriminator (5.5) elektrisch leitend verbunden ist, welche insgesamt mit einer Signaleinrichtung (3.7) verknüpft ist.
10. 10. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-9, dadurch gekennzeichnet, dass statt einer einfachen optischen oder akustischen Signaleinrichtung (3.7) ein alphanumerisches Matrixdisplay (3.8) eingesetzt ist, welches mit sämtlichen Signalquellen im Gerät verbunden ist.
11. 11. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-7 dadurch gekennzeichnet, dass die Licht emittierenden LED- Dioden (2.0) mit einem Rechteckoszillator (3.9) angesteuerten elektronischen Multiplexer (3.8) und einem Auslösetaster (5.2) elektrisch verbunden sind und ein Sensor-Array für Lichtsignale (3.1) welches sowohl über eine Lock-In-Verstärkerkette (4.0) mit dem Multiplexer (3.8) elektrisch verbunden ist, als auch mit einem Analog/Digitalwandler-vielkanalspeicher (4.1) sowie einem alphanumerischen Matrix- Display (3.8) elektrisch verknüpft ist.
12. 12. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-7 dadurch gekennzeichnet, dass die Licht emittierenden LED-Dioden (2.0) mit einem Rechteckoszillator (3.9) und einem Auslösetaster (5.2) elektrisch verbunden sind und hochempfindlichen Photodarlingtontransistoren (5.3), von denen ein Exemplar durch eine Umhüllung (4.9) abgedunkelt ist, über eine temperaturkompensierte Differenzverstärkerstufe mit außerordentlich niedrigem Eingangsfehlstrom (4.7) mit einem Schwellenwertschalter (5.0) samt Signaleinrichtung (3.7) verknüpft sind.
13. 13. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-7 dadurch gekennzeichnet, dass die Licht emittierenden LED-Dioden (2.0) mit einem Rechteck-Pulsgenerator (3.9) und einem Auslösetaster (5.2) elektrisch verbunden sind und hochempfindliche optische ON-CHIP-Verstärker (4,8), von denen ein Exemplar durch eine Umhüllung (4.9) abgedunkelt ist, über eine temperaturkompensierte Differenzverstärkerstufe mit ausserordentlich niedrigem Eingangsfehlstrom (4.7) mit einem Lock-In Verstärker (4.3) und Schwellenwertschalter (5.0) samt Signaleinrichtung (3.7) verknüpft sind.
14. 14. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-7 dadurch gekennzeichnet, dass die Licht emittierenden LED-Dioden (2.0) mit einem Quarzoszillator als Sinusgenerator (4.2) und einem Auslösetaster (5.2) elektrisch verbunden sind und hochempfindliche optische ON-CHIP-Verstärker (4.8), von denen ein Exemplar durch eine Umhüllung (4.9) abgedunkelt ist, über eine temperaturkompensierte Differenzverstärkerstufe mit ausserordentlich niedrigem Eingangsfehlstrom (4.7) zuerst mit einem Lock-IN-Vestärker (4.3) und danach mit einem Integrator (5.1) sowie einem Schwellenwertschalter (5.0) samt Signaleinrichtung (3.7) verknüpftsind. 10/20 österreichisches Patentamt AT506 663 B1 2011-03-15
15. 15. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 2-7 dadurch gekennzeichnet, dass die Licht emittierenden LED-Dioden (2.0) mit einem Quarzoszillator als Sinusgenerator (4.2) und einem Auslösetaster (5,2) elektrisch verbunden sind und hochempfindliche optische ON-CHIP-Verstärker (4.8), von denen ein Exemplar durch eine Umhüllung (4.9) abgedunkelt ist, über eine temperaturkompensierte Differenzverstärkerstufe mit ausserordentlich niedrigem Eingangsfehlstrom (4.7) zuerst mit einem Integrator (4.6) und danach mit einem Mixer, bzw.-Lock.lN Verstärkerstufe (4.3) und Phasendetektor (4.4) sowie einem Schwellenwertschalter (5.0) für Phasensignale samt Signaleinrichtung (3.7) verknüpft sind.
16. 16. Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die optoelektronischen Signalquellen neben den Signaleinrichtungen 3.7 bzw. 3.8 zusätzlich mit einer Funkeinrichtung (5.8) für drahtlose, mobile Signalübermittlung verbunden ist. Hierzu 9 Blatt Zeichnungen 11 /20