AT500646A1 - Behandlung und diagnose von insulinbeständigen zuständen - Google Patents

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung sorgt für die Diagnose und Behandlung von Störungen, die Insulinresistenz umfassen, wie z.B. nichtinsulinabhängiger oder Typ-Il-Diabetes-mellitus und andere Insulinresistenz-Zustände, wie z.B. jene, die mit Fettleibigkeit und Alterung in Verbindung stehen. Im Spezielleren betrifft die Erfindung die Verwendung von Dkk-5 bei der Behandlung einer Insulinresistenz-Störung. Die Erfindung betrifft weiters insbesondere Verfahren unter Verwendung der Dkk-3-Mengen, um das Vorliegen einer Insulinresistenz-Störung in einem Individuum zu diagnostizieren, von dem vermutet wird, dass es Insulinresistenz oder verwandte Störungen, insbesondere nichtinsulinabhängigen Diabetes mellitus, aufweist.

Beschreibung des Stands der Technik

Insulinresistenz, definiert als eine geringer als erwartete biologische Reaktion auf eine gegebene Insulindosis, ist ein allgegenwärtiges Korrelat der Fettleibigkeit. In der Tat wird angenommen, dass viele der pathologischen Folgen von Fettleibigkeit mit Insulinresistenz einhergeht. Diese umfassen Hypertonie, Hyperlipämie und vor allem nichtinsulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM). Die meisten NIDDM-Patienten sind fettleibig, und eine sehr zentrale und frühe Komponente in der Entwicklung von NIDDM ist Insulinresistenz (Mölleret al., New. Eng. J. Med. 325, 938 (1991)). Es ist nachgewiesen worden, dass sich eine Post-Rezeptor-Anomalie während des Verlaufs der Insulinresistenz zusätzlich zur Down-Regulation des Insulinrezeptors während der Anfangsphasen dieser Krankheit entwickelt (Olefsky et al., in: Diabetes Mellitus, Rifkin und Porte, Jr. (Hrsg.), Elsevier Publishing Co. Inc., New York, 4. Aufl., S. 121-153(1990)). -1 -

Mehrere Studien über Glucosetransportsysteme als mögliche Orte für einen solchen Post-Rezeptor-Defekt haben gezeigt, dass die Menge sowie Funktion des insulinsensitiven Glucosetransporters (Glut4) bei Insulinresistenz-Zuständen in Nagern und Menschen defizient ist (Garvey et al., Science 245, 60 (1989); Sivitz et al., Nature 340, 72 (1989); Berger et al., Nature 340, 70 (1989); Kahn et al., J. Clin. Invest. 84, 404 (1989); Charron et al., J. Biol. Chem. 265, 7994 (1990); Dohm et al., Am. J. Physiol. 260, E459 (1991); Sinha et al., Diabetes 40, 472 (1991); Friedman et al., J. Clin. Invest. 89, 701 (1992)). Das Fehlen eines normalen Pools von insulinsensitiven Glucosetransportern kann theoretisch ein Individuum insulinresistent machen (Olefsky et al., in: Diabetes Mellitus, s.o.) Einige Studien konnten jedoch die Down-Regulation von Glut4 in Human-NIDDM, insbesondere im Muskel, dem Hauptort der Glucoseentsorgung, nicht zeigen (Bell, Diabetes 40, 413 (1990); Pederson et al., Diabetes 39, 865 (1990); Handberg et al., Diabetologia 33, 625 (1990); Garvey et al., Diabetes 41,465 (1992)).

Belege aus In-vivo-Untersuchungen in Tiermodellen und klinischen Studien weisen darauf hin, dass Insulinresistenz in Typ-Il-Diabetes aus Veränderungen der Expression und Aktivität von Zwischenprodukten des Insulin-Signaltransduktionsweges, Veränderungen der Rate des insulinstimulierten Glucosetransports oder Veränderungen der Verlagerung von GLUT4 zur Plasmamembran resultieren kann (Zierath et al., Diabetologia 43, 821-835 (2000)). Belege aus Tierstudien weisen darauf hin, dass Insulin-Signalisierungsdefekte im Muskel die Ganzkörper-Glucose-Homöostase verändern (Saad et al., J. Clin. Invest. 90, 1839-1849 (1992); Folli et al., J. Clin. Invest. 92, 1787-1794 (1993); Heydrick et al., J. Clin. Invest. 91, 1358-1366 (1993); Saad et al., J. Clin. Invest. 92, 2065-2072 (1993); Heydrick et al., Am. J. Physiol. 268, E604-612 (1995)) und Defekte bei Zwischenverbindungen in der Insulin-Signalkette, einschließlich von IR, IRS-1 und PI-3-Kinase, zu vermindertem Glucosetransport und verminderter insulinstimulierter GLUT4-Translokation im Skelettmuskel von Insulinresistenz- und Typ-Il-Diabetes-Patienten führen können. In einigen Beispielen sind veränderte Expression von IRS-1 (Saad et al. (1992), s.o.; -2-

Saad etal. (1993), s.o.; Goodyear et al., J. Clin. Invest. 95, 2195-2204 (1995)), PI-3-Kinase (Anai et al., Diabetes 47, 13-23 (1998)) oder GSK-3 (Nikoulina et al., Diabetes 49, 263-271 (2000)) oder verminderte Mengen PKC9 (Chalfant et al., Endocrinology 141,2773-2778 (2000)) oder PTP1B (Dadke et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 583-589 (2000)) beobachtet worden. Verminderte

Phosphorylierung von IR (Arner et al., Diabetologia 30, 437-440 (1987); Maegawa et al., Diabetes 44, 815-819 (1991); Saad et al. (1992), s.o.; Saad et al. (1993), s.o.; Goodyear et al., s.o.), IRS-1 (Saad et al. (1992), s.o.; Saad et al. (1993), s.o.; Goodyear et al., s.o.) und Akt (Krook et al., Diabetes 47, 1281-1286 (1998)) sind ebenfalls im Skelettmuskel einiger Typ-Il-Diabetes-Patienten beobachtet worden. Außerdem ist gezeigt worden, dass verminderte Aktivität von PI-3-Kinase (Saad et al. (1992), s.o., Heydrick et al. (1995), s.o.; Saad et al. (1993), s.o.; Goodyear et al., s.o.; Heydrick et al. (1993), s.o.; Folli et al., Acta Diabetol. 33, 185-192 (1996); Bjornholm et al., Diabetes 46, 524-527 (1997); Andreelli et al., Diabetologia 43, 356-363 (2000); Krook et al., Diabetes 49, 284-292 (2000)) und erhöhte Aktivität von GSK-3 (Eldar-Finkelman et al., Diabetes 48,1662-1666 (1999)), PKC (Avignon et al., Diabetes 45, 1396-1404 (1996)) und PTP1B (Dadke et al., s.o.) mit Typ-Il-Diabetes verbunden ist. Außerdem ist die Verteilung von PKC-Isoformen im Skelettmuskel von diabetischen Tieren verändert (Schmitz-Peiffer et al., Diabetes 46, 169-178 (1997)) und der Gehalt an PKCa, PKCß, PKCe und PKCö in Membranfraktionen erhöht und in Zytosolfraktionen des Musculus soleus in der nichtfettleibigen diabetischen Goto-Kakizaki- (GK-) Ratte vermindert (Avignon et al., s.o.).

Abnormale subzelluläre Lokalisierung von GLUT4 ist im Skelettmuskel von Insulinresistenz-Patienten mit oder ohne Typ-Il-Diabetes beobachtet worden (Vogt et al., Diabetologia 35, 456-463 (1992); Garvey et al., J. Clin. Invest. 101, 2377-2386 (1988)), was nahe legt, dass Defekte von GLUT4-Verkehr und -Translokation Insulinresistenz im Skelettmuskel verursachen können. In-vivo- und ln-vitro-Untersuchungen haben eine verminderte Rate des insulinstimulierten Glucosetransports im Skelettmuskel in einigen Typ-Il-Diabetes-Patienten nachgewiesen -3-

* · Mt MM IM «· aM (Andreasson et al., Acta Physiol. Scand. 142, 255-260 (1991); Zierath et al., Diabetologia 37, 270-277 (1994); Bonadonna et al., Diabetes 45, 915-925 (1996)).

Obgleich die Diagnose von symptomatischer Diabetes mellitus nicht schwierig ist, kann die Detektion der symptomlosen Erkrankung eine Reihe von Problemen verursachen. Die Diagnose kann üblicherweise durch den Nachweis von Fasten-Hyperglykämie bestätigt werden. In Grenzfällen wird üblicherweise der wohlbekannte Glucosetoleranztest angewendet. Einige Indizien weisen jedoch darauf hin, dass der orale Glucosetoleranztest Diabetes in beträchtlichem Maße überdiagnostiziert und dass wahrscheinlich Stress verschiedener Herkunft (über die Freisetzung des Hormons Epinephrin vermittelt) eine anomale Reaktion verursachen kann. Um diese Schwierigkeiten abzuklären, hat die National Diabetes Data Group der National Institutes of Health Kriterien für die Diagnose von Diabetes nach Exposition mit oraler Glucose empfohlen (National Diabetes Data Group: Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other categories of glucose intolerance, Diabetes 28, 1039(1979)).

Die Häufigkeit von Diabetes mellitus in der allgemeinen Bevölkerung ist schwer mit Sicherheit festzustellen, jedoch wird angenommen, dass die Störung mehr als zehn Millionen Amerikaner beeinträchtigt. Diabetes mellitus kann im Allgemeinen nicht geheilt, jedoch kontrolliert werden. In den letzten Jahren ist offensichtlich geworden, dass es eine Reihe von verschiedenen Syndromen gibt, die im Oberbegriff „Diabetes mellitus“ umfasst sind. Diese Syndrome unterscheiden sich hinsichtlich ihrer klinischen Manifestationen sowie Vererbungsmuster. Es wird erachtet, dass der Begriff Diabetes mellitus auf eine Reihe von Hyperglykämie-Zuständen anwendbar ist, welche die oben und unten erwähnten Charakteristika aufweisen.

Diabetes mellitus ist in zwei grundlegende Kategorien, primäre und sekundäre, eingeteilt worden und umfasst beeinträchtigte Glucosetoleranz, die als ein Zustand definiert werden kann, der mit abnormal erhöhten Glucosespiegeln im Blut nach -4-

einer oralen Glucoseaufnahme verbunden ist, bei dem das Ausmaß der Erhöhung nicht ausreicht, um die Diagnose von Diabetes zu ermöglichen. Personen in dieser Kategorie haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Fasten-Hyperglykämie oder symptomatischer Diabetes im Vergleich zu Personen mit normaler Glucosetoleranz, obgleich ein solcher Verlauf in einzelnen Patienten nicht vorhergesagt werden kann. In der Tat legen mehrere umfangreiche Studien nahe, dass die meisten Patienten mit beeinträchtigter Glucosetoleranz (ungefähr 75 Prozent) niemals Diabetes entwickeln (Jarrettet al., Diabetologia 16, 25-30 (1979)).

Die unabhängigen Risikofaktoren Fettleibigkeit und Hypertonie für atherosklerotische Krankheiten stehen ebenfalls mit Insulinresistenz in Verbindung. Unter Verwendung einer Kombination von Insulin/Glucose-Klammern, Tracer-Glucoseinfusion und indirekter Kalorimetrie ist nachgewiesen worden, dass die Insulinresistenz von essentieller Hypertonie in Periphergeweben lokalisiert ist (vornehmlich Muskel) und direkt mit der Schwere der Hypertonie korreliert (DeFronzo und Ferrannini, Diabetes 14, 173 (1991)). Bei der Hypertonie des Fettleibigen erzeugt Insulinresistenz Hyperinsulinämie, was als Mechanismus herangezogen wird, um weitere Gewichtzunahme über Thermogenese einzuschränken, jedoch erhöht Insulin auch die renale Natrium-Reabsorption und stimuliert das sympathische Nervensystem in Nieren, Herz und Gefäßen, wodurch Hypertonie hervorgerufen wird.

Es ist nunmehr anerkannt, dass Insulinresistenz üblicherweise das Ergebnis eines Defekts im Insulinrezeptor-Signalsystem an einer Stelle nach der Bindung von Insulin an den Rezeptor ist. Angesammelte wissenschaftliche Beweise, die Insulinresistenz in den Hauptgeweben nachweisen, die auf Insulin reagieren (Muskel, Leber, Fettgewebe), weisen stark darauf hin, dass ein Defekt der Insulin-Signaltransduktion in einem frühen Schritt in dieser Kaskade vorliegt, im Speziellen in der Insulinrezeptor-Kinaseaktivität, die anscheinend vermindert ist (Häring, Diabetologia 34, 848 (1991)). -5- • · · · · ... . • · · · t . . ·* ... .... ... «· ...

Es ist erwähnenswert, dass ungeachtet anderer Behandlungswege die Insulintherapie die Behandlung der Wahl für viele Patienten mit Typ-Il-Diabetes bleibt, insbesondere für jene, die primäre Ernährungsstörungen durchlebt haben und nicht fettleibig sind, oder für jene, die sowohl primäre Ernährungsstörungen als auch sekundäre orale hypoglykämische Störungen durchlebt haben. Es ist jedoch gleichermaßen klar, dass die Insulintherapie mit einem andauernden Bemühen um Diätkontrolle und Änderung der Lebensführung kombiniert werden muss und keinesfalls als Ersatz dafür dienen kann. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte die Insulintherapie von Eigenmessung der Blutglucose und adäquaten Abschätzungen glykosylierter Blutproteine begleitet sein: Insulin kann in verschiedenen Regimen alleine, in zwei oder mehreren Injektionen von kurz, mittelmäßig oder lang wirkenden Insulinen oder Gemischen von mehr als einer Art verabreicht werden. Das beste Regime für jeden Patienten muss durch einen Prozess der Anpassung der Insulintherapie an die beobachtete Reaktion des individuellen Patienten ermittelt werden.

Die Tendenz zur Anwendung der Insulintherapie bei Typ-Il-Diabetes hat sich mit der modernen Vergegenwärtigung der Bedeutung der strikten Glykämiekontrolle bei der Vermeidung von langfristigen diabetischen Komplikationen gesteigert. Bei nichtfettleibiger Typ-Il-Diabetes mit sekundärer oraler hypoglykämischer Störung jedoch ist eine gute Reaktion, obgleich die Insulintherapie zur Herstellung einer adäquaten Kontrolle erfolgreich eingesetzt werden kann, keinesfalls sichergestellt (Rendell et al., Ann. Int. Med. 90, 195-197 (1979)). In einer Studie erzielten nur 31% von 58 nicht fettleibigen Patienten, die bei maximalen Dosen von oralen Hypoglykämie-Mitteln nur schlecht kontrolliert waren, eine objektiv verifizierbare Verbesserung der Kontrolle bei einem einfachen Insulin-Regimen (Peacock et al., Br. Med. J. 288, 1958-1959 (1984)). Bei fettleibiger Diabetes mit Sekundärversagen war das Bild noch unklarer, da unter diesen Umständen Insulin häufig das Körpergewicht steigert, häufig mit einer gleichzeitigen Verschlechterung der Kontrolle. -6- • · · · t β , • ♦ ·«*···· ··· · # ···

Es ist daher offensichtlich, dass der gegenwärtige Stand von Wissen und Praxis bezüglich der Therapie von Typ-Il-Diabetes keinesfalls zufrieden stellend ist. Der Großteil der Patienten erleidet mit der Zeit primäre Ernährungsstörungen, und der Großteil von fettleibigen Typ-Il-Diabetikern erreicht nicht das ideale Körpergewicht. Obgleich orale Hypoglykämie-Mittel bei der Verminderung des Ausmaßes an Glykämie im Falle von primären Ernährungsstörungen häufig erfolgreich sind, bezweifeln viele Fachleute, dass das Ausmaß an erlangter Glykämie-Kontrolle ausreichend ist, um das Auftreten der langfristigen Komplikationen von atheromatöser Krankheit, Neuropathie, Retinopathie und peripherer Gefäßkrankheit, die mit langdauernder Typ-Il-Diabetes verbunden sind, zu verhindern. Der Grund dafür kann im Lichte der gegenwärtigen Erkenntnis verstanden werden, dass sogar eine minimale Glucoseintoleranz, die ungefähr einer Fasten-Plasmaglucose von 5,5 bis 6,0 mmol/l entspricht, mit einem erhöhten Risiko kardiovaskulärer Mortalität verbunden ist (Füller et al., Lancet 1, 1373-1378 (1980)). Es ist weiters nicht eindeutig, das die Insulintherapie irgendeine Verbesserung des langfristigen Ergebnisses gegenüber der Behandlung mit oralen Hypoglykämie-Mitteln hervorruft. Daher ist es verständlich, dass ein überlegenes Behandlungsverfahren von großem Nutzen wäre.

Die Dickkopf- (Dkk-) Familie von Proteinen ist eine Familie sekretierter Wnt-Inhibitoren (Krupnik et al., Gene 238, 301-313 (1999); Monaghan et al., Mech. Dev. 87, 45-56 (1999)). Dkk-1 (WO 00/12708, veröffentlicht am 9. März 2000, worin Dkk-1 als PR01316 und die kodierende DNA als DNA60608 bezeichnet ist) wurde als ein Induktor der Kopfbildung in Xenopus durch Hemmung der Wnt-Signalisierung identifiziert (Glinka et al., Nature 391, 357-362 (1998)), und es konnte anschließend gezeigt werden, dass es an der Gliedmaßenentwicklung beteiligt ist (Grotewold et al., Mech. Dev. 89, 151-153 (1999)) und die Wnt-induzierte morphologische Transformation hemmt (Fedi et al., J. Biol. Chem. 274, 19465-19472 (1999)). Es ist gefunden worden, dass Dkk-1 und Dkk-2 insofern wechselseitigen Antagonismus aufweisen, als dass Dkk-2 den Wnt/ß-Catenin-Signalweg in Xenopus-Embryos eher -7- aktiviert als hemmt (Wu et al., Current Biology 10, 1611-1614 (2000)). Es ist weiters berichtet worden, dass Dkk-1 die Wnt-Signalisierung hemmt, während ein Spaltprodukt von Dkk-1 diese aktiviert (Brott und Sokol, Mol. Cell. Biol. 22, 6100-6110(2000)).

Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass Dkks agieren, indem sie das Low-density-Lipoprotein-verwandte Protein LPR6 binden, das als ein Co-Rezeptor für die Wnt-Signalisierung agiert (Pinson et al., Nature 407, 527-530 (2000)). Dkk-1 antagonisiert die Wnt-Signalisierung durch Bindung an LPR6 an Domänen, die sich von denjenigen unterscheiden, die an seiner Wechselwirkung mit Wnt und Frizzled beteiligt sind, wodurch die LPR6-vermittlete Wnt/ß-Catenin-Signalisierung gehemmt wird (Bafico et al., Nat. Cell. Biol. 3, 683-686 (2001); Mao et al., Nature 411, 321-325 (2001); Semenov et al., Current Biology 11, 951-961 (2001)).

Der Wnt-Signalweg spielt eine Schlüsselrolle bei der embryonalen Entwicklung, Differenzierung verschiedener Zelltypen und bei der Onkogenese (Peifer und Polakis, Science 287, 1606-1609 (2000)). Der Wnt-Signalweg wird durch die Wechselwirkung zwischen Wnts und ihren Rezeptoren, den Frizzled-Proteinen, aktiviert (Hlsken und Behrens, J. Cell Sei. 113, 3545-3546 (2000)). Sie führt zur Aktivierung des Disheveled- (Dvl1-) Proteins, das Akt aktiviert, das anschließend zum Axin-ß-Catenin-GSK3ß-APC rekrutiert wird (Fukumoto et al., J. Biol. Chem. 276, 17479-17483 (2001)). Dem folgt die Phosphorylierung und Inaktivierung von GSK3b, was in der Hemmung der Phosphorylierung und des Abbaus von ß-Catenin resultiert. Das akkumulierte ß-Catenin wird in den Kern verlagert, wo es mit Transkriptionsfaktoren der lymphoiden Enhancer-Faktor-T-Zellen-Faktor- (LEF/TCF-) Familie wechselwirkt und die Transkription von Zielgenen induziert.

Zwei der Stromab-Effektoren der Wnt-Signalisierung, Akt und GSK3b, sind Schüssel-Intermediate im Insulinsignalweg und des Glucosestoffwechsels. Wnt-Signalisierung ist an der Regulation der Muskeldifferenzierung (Borello et al., Development 126, -8- 4247-4255 (1999); Cook et al., EMBO J. 15, 4526-4536 (1996); Cossu und Borello, EMBO J. 18, 6867-6872 (1999); Ridgeway et al., J. Biol. Chem. 275, 32398-32405 (2000); Tian et al., Development 126, 3371-3380 (1999); Toyofuko et al., J. Cell. Biol. 150, 225-241 (2000)) und Adipogenese (Ross et al., Science 289, 950-953 (2000)) beteiligt. Die Hemmung der Wnt-Signalisierung kann die Trans-Differenzierung von Myozyten zu Adipozyten stimulieren (Ross et al., s.o.). Außerdem ist LPR5 genetisch mit Typ-I-Diabetes assoziiert. Das Gen befindet sich innerhalb des insulinabhängigen Diabetes-mellitus- (IDDM-) Locus IDDM4 am Chromosom 1lq13 (Hey et al., Gene 216, 103-111 (1988)) und wird in den Langerhans-Inseln, in Makrophagen und Vitamin-A-System-Zellen exprimiert, welche Zelltypen sind, die am Fortschreiten der Typ-I-Diabetes beteiligt sind (Figueroa et al., J. Histochem. Cytochem. 48, 1357-1368 (2000)). LPR5-mRNA war in der Leber erhöht und akkumulierte in Cholesterin-beladenen Schaumzellen atherosklerotischer Läsionen in LDLR-defizienten Watanabe-Kaninchen mit erblicher Hyperlipoidämie (Kim et al., J. Biochem. (Tokyo) 124,1072-1076 (1998)).

Ein Dkk-5-Molekül ist in WO 01/40465 (PCT/US00/30873) beschrieben, worin das Dkk-5 als PRO10268 und die kodierende DNA als DNA145583-2810 bezeichnet ist, mit der ATCC-Hinterlegungsnummer PTA-1179, hinterlegt am 1/11/00. Ein weiteres Molekül mit einer Aminosäureänderung in der reifen Region im Vergleich zum Molekül in WO 01/40565 wird in EP 1067182-A2, veröffentlicht am 10. Jänner 2001, identifiziert (als PSEC0258 bezeichnet). Die letztere Anmeldung betrifft mehrere Nucleinsäuresequenzen, die für Human-Sekretions- oder Membranproteine kodieren, und dagegen gerichtete Antikörper. Der Fokus ihres Nutzens ist in zwei Beispielen enthalten. Das erste ist die Behandlung von NT-Zellen mit Rheumatoidarthritis (RA) und RA-Inhibitoren und das Betrachten der Up-/Down-Regulation einer Untergruppe der entdeckten Gene, so wie sie die neuronale Entwicklung durchlaufen. Das zweite Beispiel umfasst die Behandlung primärer Zellen aus Synovialgewebe mit TNF-Alpha auf RA und das Betrachten der -9-

Up-/Down-Regulation einer Untergruppe ihrer Gene. In keinem der Fälle ist das Dkk-5-Molekül von EP 1067182-A2 ein positiver Treffer.

Es besteht ein Bedarf für wirksame therapeutische Mittel, die bei der Diagnose und Therapie von Individuen verwendet werden können, die an einer Insulinresistenz-Störung, einschließlich an NIDDM, leiden.

Zusammenfassung der Erfindung

Das Protein Dkk-5 wurde als ein Modulator des Glucosestoffwechsels in kultivierten Skelettmuskelzellen und Adipozyten erkannt. Die Behandlung von Muskelzellen mit Dkk-5 resultiert in einem Anstieg der basalen und insulinstimulierten Glucoseaufnahme. Diese Wirkung wurde nach Langzeitbehandlung beobachtet, was nahe legt, dass Dkk-5 die Muskeldifferenzierung sowie die Expressionsstärken von Proteinen im Insulin-Signalweg beeinflussen. Die Daten zeigen, dass Dkk-5 den insulinstimulierten Glucosestoffwechsel sowie Glucosegrundstoffwechsel in vitro stimuliert. Daher ist Dkk-5 bei der Behandlung einer Insulinresistenz-Störung zweckdienlich, einschließlich einer solchen, die beispielsweise mit Fettleibigkeit, Glucoseintoleranz, Diabetes mellitus, Flypertonie und ischämischen Krankheiten der großen und kleinen Blutgefäße assoziiert ist.

Die Erfindung hierin besteht aus den beanspruchten Verfahren, Sets und Zusammensetzungen. Im Speziellen stellt die Erfindung in einer ihrer Ausführungsformen ein Verfahren zur Behandlung einer Insulinresistenz-Störung in Säugetieren bereit, das die Verabreichung einer wirksamen Menge an Dkk-5 an ein Säugetier umfasst, das dieses benötigt. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch und weist eine NIDDM auf oder ist fettleibig. Ebenso bevorzugt ist die systemische Verabreichung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein anderes Insulinresistenz-Behandlungsmittel zusätzlich zum Dkk-5 verabreicht, um die Störung der Insulinresistenz zu behandeln.

In noch einer weiteren Ausführungsform weist das zur Behandlung verwendete Dkk-5-Polypeptid zumindest ungefähr 85%, bevorzugter zumindest ungefähr 90%, bevorzugter zumindest ungefähr 95%, bevorzugter zumindest ungefähr 99% und insbesondere bevorzugt 100% Aminosäuresequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 5 in Fig. 2 auf, und zwar mit oder ohne seinem assoziierten Signalpeptid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Dkk-5 ein internes Spaltproteinfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa oder ist ein Gemisch aus einem Dkk-5 mit Seq.-ID Nr. 5 und einem internen Spaltproteinfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem

Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa oder ist ein Gemisch aus einem Dkk-5 mit der Seq.-ID Nr. 5, dem sein assoziiertes Signalpeptid fehlt, und einem internen Spaltproteinfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa. Bevorzugter ist das Dkk-5 ein Dkk-5, das die Seq.-ID Nr. 5 umfasst, oder ein Dkk-5, das die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 (das Ende) von Seq.-ID Nr. 5 umfasst, vorzugsweise ein Dkk-5, das die Sequenz zwischen den Resten 25 und 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfasst, oder ein internes Spaltproteinfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa oder eine Kombination des Spaltproteins mit einem oder beiden der Dkk-5, welche die Seq.-ID Nr. 5 oder die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfassen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder Beginns einer Insulinresistenz-Störung in einem Säugetier bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Messen der Menge an Dkk-5 in einer Probe aus dem Säugetier; und -11 - • · ♦ · · · · ·* ·♦♦ ···· ··· ·· ·»· (b) Vergleichen der in Schritt (a) bestimmten Menge mit einer in einer Standardprobe vorhandenen Menge an Dkk-5, wobei ein vermindertes Ausmaß der Menge an Dkk-5 in Schritt (a) ein Anzeichen für die Insulinresistenz-Störung ist.

Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch. Ebenso bevorzugt wird das Messen unter Verwendung eines Anti-Dkk-5-Antikörpers, wie z.B. eines monoklonalen Antikörpers, in einem Immuntest durchgeführt. Ebenso bevorzugt umfasst ein solcher Anti-Dkk-5-Antiklörper einen Marker, bevorzugter einen Fluoreszenzmarker, einen radioaktiven Marker oder einen Enzymmarker, wie z.B. einen Biolumineszenzmarker oder einen Chemilumineszenzmarker. Ebenso bevorzugt ist der Immuntest ein Radioimmuntest, ein Enzymimmuntest, ein Enzyme-Linked-Immunosorbent-Test, ein Sandwich-Immuntest, ein Präzipitationstest, ein immunradioaktiver Test, ein Fluoreszenzimmuntest, ein Protein-A-Immuntest oder ein Immunelektrophoresetest. Ebenso bevorzugt ist die Situation, wo die Insulinresistenz-Störung NIDDM ist.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Diagnoseset zum Nachweisen des Vorliegens oder Beginns einer Insulinresistenz-Störung in einem Säugetier bereit, wobei das Set Folgendes umfasst: (a) einen Behälter, der einen Antikörper umfasst, der Dickkopf-5 (Dkk-5) bindet; (b) einen Behälter, der eine Dkk-5 enthaltende Standardprobe umfasst; und (b) Anleitungen zur Verwendung des Antikörpers und einer Standardprobe, um die Störung zu detektieren, worin entweder der Antikörper, der Dkk-5 bindet, nachweisbar markiert ist oder das Set einen weiteren Behälter umfasst, der einen zweiten Antikörper umfasst, der nachweisbar markiert ist und an Dkk-5 oder an den Dkk-5 bindenden Antikörper bindet. Vorzugsweise ist der das Dkk-5 bindende Antikörper ein monoklonaler Antikörper und das Säugetier ein Mensch. -12- • · · ····· • · · · * ·«· · • ♦ · · · « φ ♦♦ ·♦· ·♦·· ··· ·· · Μ

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Set zum Behandeln einer Insulinresistenz-Störung in einem Säugetier bereit, wobei das Set Folgendes umfasst: (a) einen Dkk-5 umfassenden Behälter; und (b) Anleitungen zur Verwendung des Dkk-5, um die Störung zu behandeln.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Störung NIDDM, der Behälter ist ein Fläschchen und die Anleitungen legen fest, dass der Inhalt des Fläschchens zur sofortigen Injektion in eine Spritze aufzunehmen ist. Ebenso bevorzugt ist, dass das Set weiters einen Behälter umfasst, der ein Insulinresistenz-Behandlungsmittel umfasst, und dass das Säugetier ein Mensch ist.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes internes Spaltproteinfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa bereit.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die dieses Proteinfragment und einen Träger umfasst, und bevorzugter umfasst diese Zusammensetzung weiters ein die Seq.-ID Nr. 5 umfassendes Dkk-5 mit oder ohne seinem assoziierten Signalpeptid. Falls dem die Seq.-ID Nr. 5 umfassenden Dkk-5 sein assoziiertes Signalpeptid fehlt, umfasst es im Allgemeinen die Sequenz ungefähr zwischen Rest 20 bis ungefähr Rest 30 bis zum Ende von Seq.-ID Nr. 5, bevorzugter Reste 25 bis 347 von Seq.-ID Nr. 5.

Die Erfindung stellt weiters ein Hybridom bereit, das aus PTA-3090, PTA-3091, PTA-3092, PTA-3093, PTA-3094, PTA-3095 und PTA-3096 ausgewählt ist. Ebenso bereitgestellt wird ein Antikörper, der von irgendeinem dieser Hybridome produziert wird. -13- *·

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Die Erfindung stellt weiters ein Verfahren der Beurteilung der Wirkung eines pharmazeutischen Kandidat-Medikaments auf eine Insulinresistenz-Störung in einem Säugetier bereit, das die Verabreichung des Medikaments an ein transgenes nichthumanes Tiermodell umfasst, das die Dkk-5-cDNA überexprimiert, und ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung des Medikaments auf die Glucose-Clearance aus dem Blut des Modells. Vorzugsweise ist das Tiermodell ein Nager, bevorzugter ein Maus- oder Ratten- und insbesondere bevorzugt ein Mausmodell. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform steht die vom Modell überexprimierte Dkk-5-cDNA unter der Kontrolle eines muskelspezifischen Promotors, und die cDNA wird im Muskelgewebe überexprimiert.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 offenbart die schematische Struktur der Human-Dkk-Familie von Proteinen (hDkk-1, hDkk-2, hDkk-4, hDkk-3 und hDkk-5).

Fig. 2 bezeichnet die Sequenzangleichung für die humane Dkk-Familie von Proteinen, Dkk-1 (Seq.-ID Nr. 1), Dkk-2 (Seq.-ID Nr. 2), Dkk-3 (Seq.-ID Nr. 3), Dkk-4 (Seq.-ID Nr. 4), Dkk-5 (Seq.-ID Nr. 5). Die eingerahmten Regionen bezeichnen die Cystein-reichen Domänen, und die verkehrten Dreiecke bezeichnen den Ort der internen Spaltstelle für Proteine dieser Familie.

Fig. 3 zeigt die relativen Expressionsausmaße von Dkk-5 in verschiedenen adulten Humangeweben.

Fig. 4 zeigt die relativen Ausmaße an Dkk-5-Expression im Maus-Embryo.

Fig. 5A-5E zeigen die In-situ-Hybridisierungsanalyse ganzer Maus-Embryos an verschiedenen Tagen der Entwicklung, wobei Fig. 5A Tag 8,5-9 p.c., Fig. 5B Tag 10 -14- ·· · ** t Μ · t · *· ♦ · Μ · « «« • · · ····* • · · · · ♦·· ♦

• · · · · « I ·· ·♦· ·»·« ««« μ « Μ p.c., Fig. 5C Tag 10 (Nahaufnahme) p.c., Fig. 5D Tag 11 p.c. und Fig. 5E Tag 12,5 (Kopf) darstellen.

Fig. 6 zeigt das relative Expressionsausmaß an Dkk-5 während der L6-Zelldifferenzierung vom Tag 1 bis zum Tag 8.

Fig. 7 zeigt ein Coomassieblau-gefärbtes SDS-PAGE-Gel des in Baculovirus exprimierten hDkk-5 und seine Ausschnitte, wobei Lane 1 nichtreduzierende Bedingungen und Lane 2 reduzierende Bedingungen darstellen.

Fig. 8A-8B zeigen die Wirkung von Dkk-5 auf die basale und insulinstimulierte Glucoseaufnahme in L6-Muskelzellen bei 48 Stunden Behandlung (Fig. 8A) und 96 Stunden Behandlung (Fig. 8B). Die niedrigeren Balken stellen keine Insulinverwendung und die höheren Balken stellen die Verwendung von 30 nM Insulin dar.

Fig. 9A-9B zeigen die Wirkung von Dkk-5 auf den basalen und insulinstimulierten Einbau von Glucose in Glykogen in L6-Muskelzellen bei 48 Stunden Behandlung (Fig. 9A) und 96 Stunden Behandlung (Fig. 9B) dar. Die niedrigeren Balken stellen keine Insulinverwendung und die höheren Balken stellen die Verwendung von 30 nM Insulin dar.

Fig. 10A-10G stellen die Wirkung von Dkk-5 auf die Expressionsausmaße verschiedener an der Myogenese beteiligter Gene in L6-Muskelzellen dar. Fig. 10A zeigt die Wirkung auf die Expression der Myosin-Leichtkette (MLC-2); Fig. 10B zeigt die Wirkung auf die Myf5-Expression, Fig. 10C zeigt die Wirkung auf die Myogenin-Expression, Fig. 10D zeigt die Wirkung auf die Pax3-Expression; Fig. 10E zeigt die Wirkung auf die MLC-1/3-Expression; Fig. 10F zeigt die Wirkung auf die MyoD-Expression; und Fig. 10G zeigt die Wirkung auf die Expression der Myosin- -15- ··· ···#· • · · · · ... · • · * · . . . ·· ·♦« ··-»» ... .· ...

Schwerkette (HC). Die Rauten stellen unbehandelte Zellen und die Dreiecke stellen mit Dkk-5 behandelte Zellen dar.

Fig. 11 zeigt die Wirkung von Dkk-5 auf die Expression von Genen, die am Insulin-Signalweg (am Glucosestoffwechsel beteiligt) beteiligt sind. Der linke Balken bei jedem Paar ist Dkk-5 am Tag 5, und der rechte Balken bei jedem Paar ist Dkk-5 am Tag 7.

Fig. 12 zeigt eine FACS-Analyse der Bindung von Dkk-5 an L6-Zellen und was die Bindung aufheben kann.

Fig. 13A-13B zeigen die Wirkung von Dkk-5 auf die basale und insulinstimulierte Glucoseaufnahme in Adipozyten bei 48 Stunden Behandlung (Fig. 13A) und 96 Stunden Behandlung (Fig. 13B). Die niedrigeren Balken stellen keine Insulinverwendung und die höheren Balken stellen die Verwendung von 30 nM Insulin dar.

Fig. 14A-14B zeigen die Wirkung von Dkk-5 auf den basalen und insulinstimulierten Einbau von Glucose in Lipide in Adipozyten bei 48 Stunden Behandlung (Fig. 14A) und 96 Stunden Behandlung (Fig. 14B) dar. Die niedrigeren Balken stellen keine Insulinverwendung und die höheren Balken stellen die Verwendung von 30 nM Insulin dar.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Definitionen

Wie hierin verwendet bezieht sich „Dkk-5“ oder „Dickkopf-5“ oder „Dkk-5-Polypeptid“ auf ein Polypeptid, das zumindest ungefähr 85% Aminosäuresequenzidentität mit der Volllängen-Aminosäuresequenz des in Fig. 2 (Seq.-ID Nr. 5) gezeigten Dkk-5- -16-

Polypeptids aufweist, oder auf ein Polypeptid, das zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des in Fig. 2 (Seq.-ID Nr. 5) gezeigten Dkk-5-Polypeptids aufweist, dem sein assoziiertes Signalpeptid fehlt, oder auf ein Polypeptid, das zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die von der kodierenden Volllängen-Sequenz der unter der ATCC-Hinterlegungsnummer PTA-1179 hinterlegten DNA kodiert wird, oder auf jegliches andere Fragment des Volllängen-Polypeptids Seq.-ID Nr. 5, wie hierin offenbart, unter der Voraussetzung, dass das hierin definierte Dkk-5-Polypeptid die Aktivität zur Behandlung einer Insulinresistenz-Störung aufweist.

Das hierin definierte Dkk-5 kann aus einer Vielzahl von Quellen, wie z.B. aus Human-Gewebetypen oder aus einer anderen nativen Quelle, isoliert oder durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellt werden. Der Ausdruck „Dkk-5“ umfasst im Speziellen natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen des spezifischen Polypeptids (z.B. eine extrazelluläre Domänensequenz), natürlich auftretende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende allelische Varianten des Polypeptids. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist das Dkk-5-Polypeptid ein reifes oder Volllängen-Nativsequenz-Polypeptid, dass die Volllängen-Aminosäuresequenz der in Fig. 2 gezeigten Seq.-ID Nr. 5 umfasst. Obwohl das in der begleitenden Fig. 2 als Seq.-ID Nr. 5 offenbarte Dkk-5-Polypeptid als mit einem Methioninrest beginnend gezeigt ist, ist es denkbar und möglich, dass andere Methioninreste, die entweder stromauf oder stromab der Anfangsaminosäureposition von Seq.-ID Nr. 5 in Fig. 2 lokalisiert sind, als Anfangsaminosäurerest für das Dkk-5-Polypeptid eingesetzt werden können.

Dkk-5-Polypeptide umfassen zum Beispiel Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste an den N- oder C-Terminus der nativen Volllängen-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 5 addiert oder davon deletiert sind. Ein Dkk-5-Polypeptid weist üblicherweise zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 81% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 82% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 87% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 98% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 99% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest ungefähr 100% Aminosäuresequenzidentität mit der hierin offenbarten Seq.-ID Nr. 5 oder mit der hierin offenbarten Seq.-ID Nr. 5 ohne Signalpeptid auf, unter der Voraussetzung, dass es die Aktivität zur Behandlung einer Insulinresistenz-Störung aufweist. Für gewöhnlich weisen Dkk-5-Polypeptide eine Länge von zumindest ungefähr 10 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 20 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 30 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 40 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 50 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 60 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 70 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 80 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 90 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 100 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 150 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 200 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest ungefähr 300 oder mehr Aminosäuren auf unter der Voraussetzung, dass sie die Aktivität zur Behandlung einer Insulinresistenz-Störung aufweisen.

Das isolierte interne Spaltprodukt (beginnend mit MA), das bei Spaltung an der durch einen verkehrten Pfeil in Seq.-ID Nr. 5 von Fig. 2 markierten internen Stelle gebildet wird und ein Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa aufweist, ist für die Steigerung der basalen und insulinstimulierten Glucoseaufnahme in Muskelzellen aktiv, so wie es auch das rekombinante Präparat ist, das hauptsächlich das reife Protein und/oder das die Signalsequenz enthaltende Protein enthält.

Bevorzugt sind jene mit zumindest ungefähr 85%, bevorzugter zumindest ungefähr 90%, bevorzugter zumindest ungefähr 95%, bevorzugter zumindest ungefähr 99% Aminosäuresequenzidentität zu Seq.-ID Nr. 5. Noch bevorzugter sind das Polypeptid der Seq.-ID Nr. 5 von Fig. 2 hierin, das in WO 01/40465 (PCT/US00/30873) als PR010268 bezeichnete Polypeptid und das in EP 1067182-A2 (veröffentlicht am 10.Jänner 2001) als PSEC0258 bezeichnete Polypeptid. Noch bevorzugter sind das Polypeptid mit der Seq.-ID Nr. 5 von Fig. 2 hierin und PRO10268 aus WO 01/40465 und die reifen Polypeptide davon sowie das interne Spaltproteinfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa und Gemische davon mit einem Dkk-5 mit der Seq.-ID Nr. 5, mit oder ohne seinem assoziierten Signalpeptid. Insbesondere bevorzugt ist das die Seq.-ID Nr. 5 von Fig. 2 hierin umfassende Polypeptid mit oder ohne seinem assoziierten Signalpeptid und/oder das interne Spaltproteinfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa.

Das „Signalpeptid“ des hierin offenbarten Polypeptids befindet sich ungefähr von Methionin an Position 1 bis Alanin an Position 24 der Seq.-ID Nr. 5 von Fig. 2, wobei -19- die Spaltstelle sich zwischen dem Alanin an Position 24 und dem Glycin an Position 25 der Seq.-ID Nr. 5 von Fig. 2 befindet. Es wird jedoch angemerkt, dass die C-terminale Begrenzung eines Signalpeptids variieren kann, jedoch höchstwahrscheinlich um nicht mehr als ungefähr fünf Aminosäuren an beiden Seiten der C-terminalen Begrenzung des wie anfangs hierin definierten Signalpeptids, wobei die C-terminale Begrenzung des Signalpeptids nach auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig eingesetzten Kriterien zum Identifizieren dieser Art von Aminosäuresequenzelement identifiziert werden kann (z.B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1-6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14, 4683-4690 (1986)). Darüber hinaus ist ebenfalls anerkannt, dass in manchen Fällen die Abspaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Protein nicht völlig einheitlich ist, was in mehr als einer sekretierten Spezies resultiert. Diese reifen Polypeptide, wo das Signalpeptid innerhalb von nicht mehr als ungefähr fünf Aminosäuren an beiden Seiten der C-terminalen Begrenzung des hierin definierten Signalpeptids gespalten ist, und die für sie kodierenden Polynucleotide sind in der vorliegende Erfindung vorgesehen. „Prozentuelle (%) Aminosäuresequenzidentität“ bezüglich der hierin identifizierten Dkk-5-Polypeptidsequenzen ist als der prozentuelle Anteil von Aminosäureresten in einer Kandidat-Sequenz definiert, der mit den Aminosäureresten in der speziellen Polypeptidsequenz identisch ist, und zwar nach dem Angleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, falls dies zur Erzielung der maximalen prozentuellen Sequenzidentität erforderlich ist, und ohne Berücksichtigung jeglicher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität. Die Angleichung zum Zwecke der Ermittlung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf zahlreiche Art und Weisen erzielt werden, die von Fachleuten durchgeführt werden können, beispielsweise unter Anwendung von öffentlich zugänglicher Software, wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign- (DNASTAR-) Software. Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung können geeignete Parameter zum Messen der Angleichung ermitteln, einschließlich jeglicher Algorithmen, die zum Erzielen -20- ·· · ·· » ·· · • · *· · · ·· · · ·· * · · ····· • · * · » ··· · • · · · · t · ·· ··· ···· »·· ·· ··· maximaler Angleichung über die volle Länge der verglichenen Sequenzen benötigt werden. Für die Zwecke hierin werden jedoch % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramms ALIGN-2 erzeugt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm in Tabelle 1 der WO 01/16319, veröffentlicht am 8. März 2001, und WO 00/73452, veröffentlicht am 7. Dezember 2000, bereitgestellt wird. Der Verfasser des ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramms war Genetech Inc., und der Quellcode ist mit der Benutzerdokumentation im US Copyright Office, Washington DC, 20559, hintergelegt worden, wo er unter der US Copyright Registration No. TXU510097 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem kompiliert werden, vorzugsweise digital UNIX V4.0D. Alle Sequenzvergleichsparameter sind vom ALIGN-2-Programm festgelegt und variieren nicht.

Unter Umständen, wo ALIGN-2 für Aminosäuresequenzvergleiche eingesetzt wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer gegebenen Aminosäuresequenz A mit einer oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B (die alternativ dazu als eine gegebene Aminosäuresequenz A formuliert werden kann, die eine gewisse % Aminosäuresequenzidentität mit einer oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet:

100 mal der Bruch X/Y wobei X die Anzahl von Aminosäureresten ist, die durch das Angleichungsprogramm ALIGN-2 bei der Angleichung von A und B in diesem Programm als identische Übereinstimmungen gewertet werden, und wobei X die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B ist. Es wird anerkannt, dass wo die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der Aminosäuresequenzidentität -21 - ·· • ·· • ·· • • · • · • · • • • • • • • • • • · ··· • • • • von B zu A sein wird. Beispiele von Berechnungen von Aminosäuresequenzidentitäten unter Anwendung von ALIGN-2 werden in den Tabellen 2 und 3 der WO 01/16319, veröffentlicht am 8. März 2001, und WO 00/73452, veröffentlicht am 7. Dezember 2000, bereitgestellt.

Wenn nicht anders angegeben, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie im unmittelbar vorhergehenden Absatz beschrieben unter Anwendung des ALIGN-2-Computerprogramms erlangt. Jedoch können die % Aminosäuresequenzidentitätswerte auch wie unten beschrieben unter Anwendung des WU-BLAT-2-Computerprogramms (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)) erhalten werden. Die meisten der WU-BLAST-2-Suchparameter sind auf Vorgabewerte eingestellt. Jene, die nicht auf Vorgabewerte eingestellt sind, d.h. die einstellbaren Parameter, werden auf die folgenden Werte eingestellt: Overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 und scoring matrix = BLOSUM62. Wenn WU-BLAST-2 eingesetzt wird, wird ein % Aminosäuresequenzidentitätswert durch Dividieren (a) der durch WU-BLAST-2 ermittelten Anzahl übereinstimmender Aminosäurereste zwischen der

Aminosäuresequenz des DKK-5-Polypeptids von Interesse, die eine sich vom nativen Dkk-5-Polypeptid herleitende Sequenz aufweist, und der

Vergleichsaminosäuresequenz von Interesse (d.h. diejenige Sequenz, gegen die das Dkk-5-Polypeptid von Interesse verglichen wird) durch (b) die Gesamtzahl der Aminosäurereste des Dkk-5-Polypeptids von Interesse bestimmt. Beispielsweise ist in der Aussage „ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz A aufweist, die zumindest ungefähr 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz B aufweist“ die Aminosäuresequenz A die Vergleichsaminosäuresequenz von Interesse und die Aminosäuresequenz B die Aminosäuresequenz des Dkk-5-Polypeptids von Interesse.

Die prozentuelle Aminosäuresequenzidentität kann auch unter Anwendung des Sequenzvergleichsprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, -22- • · ♦ · · ··· · • · · · · · · ·· ··♦ ···· ··· ·· ··· 3389-3402 (1997)) ermittelt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichs-programm kann von http:Wwww.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen werden oder anderenfalls vom National Institute of Health, Bethesda, MD, erhalten werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Vorgebewerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, Strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final grapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.

Unter Umständen, wo NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche eingesetzt wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer gegebenen Aminosäuresequenz A mit einer oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B (die alternativ dazu als eine gegebene Aminosäuresequenz A formuliert werden kann, die eine gewisse % Aminosäuresequenzidentität mit einer oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B aufweist oder umfasst) wie folgt berechnet:

100 mal der Bruch X/Y wobei X die Anzahl von Aminosäureresten ist, die durch das Angleichungsprogramm NCBI-BLAST2 bei der Angleichung von A und B in diesem Programm als identische Übereinstimmungen gewertet werden, und wobei X die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B ist. Es wird anerkannt, dass, wo die Länge der Aminosäuresequenz A nicht gleich der Länge der Aminosäuresequenz B ist, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der Aminosäuresequenzidentität von B zu A sein wird.

Wie hierin verwendet, beschreibt „behandeln“ das Management und die Betreuung eines Patienten zum Zwecke der Bekämpfung einer Insulinresistenz-Störung und umfasst die Verabreichung, um den Beginn von Symptomen oder Komplikationen zu vermeiden, die Symptome oder Komplikationen zu lindern, oder die Insulinresistenz- -23- • · ·· · · *· · · *· • * · ····· • * · · · ··· < • · · · · · · ·· ··· ···· ··· Μ ···

Krankheit, Leiden oder Störung zu beseitigen. Zum Zwecke dieser Erfindung umfassen günstige oder erwünschte klinische Ergebnisse die Linderung von Symptomen, die mit Insulinresistenz verbunden sind, die Verminderung des Ausmaßes der Symptome der Insulinresistenz, Stabilisierung (d.h. keine Verschlechterung) der Symptome der Insulinresistenz (z.B. Verminderung des Insulinbedarfs), Steigerung der Insulinempfindlichkeit und/oder Insulinausscheidung, um das Versagen der Inselzellen zu verhindern, und Verzögerung oder Verlangsamung der Insulinresistenz-Progression, z.B. Diabetes-Progression, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Wie von einem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohl verstanden wird, hängen die speziellen Symptome, die zur Behandlung gemäß der Erfindung führen, von der Art der zu behandelnden Insulinresistenz-Störung ab. Jene, „die eine Behandlung benötigen“, umfassen Säugetiere, welche die Störung bereits aufweisen, sowie jene, die für die Störung anfällig sind, einschließlich jener, bei denen die Störung zu verhindern ist.

Der Begriff „Säugetier“ bezieht sich zum Zwecke der Behandlung und Diagnose auf jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Menschen, Sport-, Zoo-, Haus- oder Nutztiere, wie z.B. Hunde, Katzen, Rinder, Schafe, Schweine, Pferde und Primaten, wie z.B. Affen. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.

Eine „Insulinresistenz-Störung“ ist eine Krankheit, ein Leiden oder eine Störung, die aus dem Versagen der normalen metabolischen Reaktion von Periphergeweben (Unempfindlichkeit) auf die Wirkung von exogenem Insulin resultiert, d.h. sie ist ein Leiden, wo die Gegenwart von Insulin eine subnormale biologische Reaktion hervorruft. In klinischer Hinsicht liegt Insulinresistenz vor, wenn normale oder erhöhte Blutglucosespiegel angesichts normaler oder erhöhter Insulinspiegel anhalten. Sie stellt im Wesentlichen eine Glykogensynthesehemmung dar, bei der entweder die basale oder die insulinstimulierte Glykogensynthese oder beide vermindert sind oder unter den normalen Ausmaßen liegen. Insulinresistenz-Störung spielt eine Hauptrolle -24- bei Typ-Il-Diabetes, wie durch die Tatsache nachgewiesen wird, dass die in Typ-Il-Diabetes vorhandene Hyperglykämie manchmal durch Diät oder Gewichtsverlust scheinbar in ausreichendem Maße rückgängig gemacht werden kann, um die Empfindlichkeit von Periphergeweben auf Insulin wiederherzustellen. Der Ausdruck umfasst abnormale Glucosetoleranz sowie die zahlreichen Störungen, bei denen Insulinresistenz-Störung eine Schlüsselrolle spielt, wie z.B. Fettleibigkeit, Diabetes mellitus, Eierstock-Hyperandrogenismus und Hypertonie. „Diabetes mellitus“ bezieht sich auf einen Zustand chronischer Hyperglykämie, d.h. überschüssigen Zuckers im Blut, eine Konsequenz bei relativem oder absolutem Fehlen von Insulinwirkung. Es gibt drei grundlegende Arten von Diabetes mellitus, Typ I oder insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM), Typ II oder nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) und Typ-A-Insulinresistenz, obgleich Typ A relativ selten ist. Patienten mit Typ-I- oder Typ-Il-Diabetes können über eine Reihe von Mechanismen unempfindlich für die Wirkungen von exogenem Insulin werden. Typ-A-Insulinresistenz resultiert aus entweder aus Mutationen im Insulinrezeptorgen oder aus Defekten der für Glucosestoffwechsel entscheidenden Post-Rezeptor-Wirkstellen. Diabetische Patienten können vom Arzt leicht erkannt werden und sind durch Hyperglykämie, beeinträchtigte Glucosetoleranz, glykosyliertes Hämoglobin und in manchen Fällen durch mit Trauma oder Krankheit verbundener Ketoazidose gekennzeichnet. „Nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus“ oder „NIDDM“ bezieht sich auf Typ-Il-Diabetes. NIDDM-Patienten weisen eine abnormal hohe Blutglucosekonzentration beim Fasten und verzögerte Zellaufnahme von Glucose nach Mahlzeiten oder nach einem als Glucosetoleranztest bekannten diagnostischen Test auf. NIDDM wird auf Basis anerkannter Kriterien diagnostiziert (American Diabetes Association, Physician’s Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes (1988); American Diabetes Association, Physician’s Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes (1988)). -25- ·· * ·· · Μ · • ···» ···· · Μ • · · · · · ♦ · • · · · · φ φ φ » • · · · · · · • · ··«««·· φ φ φ Μ ···

Symptome und Komplikationen einer als wie hierin definierten Störung zu behandelnden Diabetes umfassen Hyperglykämie, unbefriedigende Glykämie-kontrolle, Ketoazidose, Insulinresistenz, erhöhte Wachstumshormonspiegel, erhöhte Spiegel an glykosyliertem Hämoglobin und fortgeschrittene Glykosylierungsendprodukte (AGE), Dämmerungsphänomen, unbefriedigendes Lipidprofil, Gefäßkrankheit (z.B. Atherosklerose), Mikrogefäßkrankheit, Netzhautstörungen (z.B. proliferative diabetische Retinopathie), Nierenstörungen, Neuropathie, Komplikationen der Schwangerschaft (z.B. verfrühter Abbruch und Geburtsfehler) und dergleichen. In der Definition von Behandlung umfasst sind solche Endresultate wie z.B. Erhöhung der Insulinempfindlichkeit, Verminderung der Insulindosierung bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Glykämiekontrolle, Verminderung von HbA1c, verbesserte Glykämiekontrolle, Verminderung von Gefäß-, Nieren-, Neuronen-, Netzhaut- oder anderen Komplikationen, Verhinderung oder Verminderung des „Dämmerungsphänomens“, verbessertes Lipidprofil, verminderte Komplikationen bei Schwangerschaft und verminderte Ketoazidose.

Eine „therapeutische Zusammensetzung“ oder „Zusammensetzung“ ist wie hierin verwendet so definiert, als dass sie Dkk-5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie z.B. Wasser, Mineralien, Proteine und andere Exzipienten, umfasst, die einem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.

Der Begriff .Antikörper“ wird hierin in weitesten Sinne verwendet und umfasst speziell intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper), die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte, hierin dargelegte biologische Aktivität aufweisen, zum Beispiel Bindung an Dkk-5 in einem diagnostischen Test.

Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper“ bezieht sich wie hierin verwendet auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern -26- • · · · · ···· ··· • · · ····· • · · · · ««« · • · · · « t · ·· ····«·· |M · · Ml erhalten wird, d.h. die einzelnen die Population umfassenden Antikörper sind identisch mit der Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige antigene Stelle. Darüber hinaus ist jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu polyklonalen Antikörperpräparaten, die unterschiedliche, gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper enthalten, gegen eine einzige Determinante am Antigen gerichtet.

Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper insofern vorteilhaft, als dass sie ohne Verunreinigung mit anderen Antikörpern synthetisiert werden können. Der Modifikator „monoklonal“ kennzeichnet den Charakter des Antikörpers dahingehend, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt wird und ist nicht dahingehend auszulegen, dass die Produktion des Antikörpers irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Antikörper mit dem erstmals von Köhler et el., Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder können mit rekombinanten Verfahren (z.B. US-Patent Nr. 4.816.567) hergestellt werden. Die „monoklonalen Antikörper“ können beispielsweise auch aus Phagen-Antikörperbibliotheken unter Anwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), beschriebenen Techniken hergestellt werden.

Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen im Speziellen „Chimäre“ Antikörper, in denen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die sich von einer bestimmten Spezies herleiten oder einer bestimmten Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die sich von einer anderen Spezies herleiten oder einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die hierin erwähnte gewünschte -27- biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855 (1984)). Chimäre Antikörper von Interesse hierin umfassen „primatisierte“ Antikörper, die von einem nichthumanen Primaten (z.B. Altweltaffen (Old World Monkey), Menschenaffen usw.) hergeleitete

Antigenbindungssequenzen der variablen Domäne und humane Konstantregion-Sequenzen umfassen. „Antikörperfragmente“ umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, der vorzugsweise die antigenbindende oder variable Domäne davon umfasst. Beispiele von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab’-, F(ab’)2- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper; Einzelketten-Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, die aus (einem) Antikörperfragment(en) gebildet werden.

Ein „intakter“ Antikörper ist einer, der eine variable Antigenbindungsregion sowie eine Leichtkettenkonstantdomäne (CL) und Schwerkettenkonstantdomänen (CH1, Ch2 und Ch3) umfasst. Die Konstantdomänen können Nativsequenz-

Konstantdomänen (z.B. humane Nativsequenz-Konstantdomänen) oder eine Aminosäuresequenzvariante davon sein.

Der Begriff „Probe“ bezieht sich wie hierin verwendet auf eine biologische Probe, die Dkk-5 enthält oder von der vermutet wird, dass sie Dkk-5 enthält. Diese Probe kann von irgendeiner Quelle herrühren, vorzugsweise von einem Säugetier und bevorzugter von einem Menschen. Solche Proben umfassen wässrige Flüssigkeiten, wie z.B. Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Follikelflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Milch, Gesamtblut, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Sputum, Tränen, Schweiß, Schleim, Gewebekulturmedium, Gewebeextrakte und Zellextrakte.

Ein „Insulinresistenz-Behandlungsmittel“ oder „Hypoglykämiemittel“ (hierin wechselseitig verwendet) ist ein Mittel, das nicht Dkk-5 ist und verwendet wird, um -28- eine Insulinresistenz-Störung zu behandeln, wie z.B. Insulin (ein oder mehrere verschiedene Insuline), Insulin-Mimetika, wie z.B. Kleinmolekül-Insulin, z.B. L-783,281, Insulinanaloga (z.B. LYSPRO™ (Eli Lilly Co.), LysB28lnsulin, ProB29lnsulin oder AspB2slnsulin oder jene, die beispielsweise in US-Patenten Nr. 5.149.777 und 5.514.646 beschrieben sind) oder physiologisch aktive Fragmente davon, insulinverwandte Peptide (C-Peptid, GLP-1, IGF-1 oder IGF-1/IGFBP-3-Komplex) oder Analoga oder Fragmente davon, Ergoset, Pramlintid, Leptin, BAY-27-9955, T-1095, Antagonisten gegen Insulinrezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor, Antagonisten gegen die TNF-Alpha-Funktion, ein Wachstumshormon-freisetzendes Mittel, Amylin oder Antikörper gegen Amylin, ein Insulin-Sensibilisator, wie z.B. Verbindungen der Glitazon-Familie, einschließlich jene, die im US-Patent Nr. 5.753.681 beschrieben sind, wie z.B. Troglitazon, Pioglitazon, Englitazon und verwandte Verbindungen, wie z.B. LINALOL™ alleine oder mit Vitamin E (US-Patent Nr. 6.187.333) und Insulinsekretionsverstärker, wie z.B. Nateglinid (AY-4166), Calcium-(2S)-2-benzyl-3-(cis-hexahydro-2-isoindolinylcarbonyl)propionat-Dihydrat (Mitiglindin, KAD-1229), Repaglindin und Sulfonylharnstoff-Medikamente, zum Beispiel Acetohexamid, Chlorpropamid, Tolazamid, Tolbutamid, Glyclopyramid, Glipizid, Gliquidon, Glisoxepid, Glybuthiazol, Glibuzol, Glyhexmaid, Glymidin, Glypinamid, Phenbutamid, Tolcyclamid, Glimepirid usw., sowie Biguanide (wie z.B. Phenformin, Metfomin, Biformin usw.) und α-Glucosidase-lnhibitoren (wie z.B. Acarbose, Voglibose, Miglitol, Emiglitat usw.) und solche untypische Behandlungen, wie z.B. Pankreastransplantation oder Autoimmunreagenzien.

Wie hierin verwendet, bezieht sich „Insulin“ auf irgendeine Substanz oder auf alle Substanzen mit einer Insulinwirkung und als Beispiele dienen beispielsweise aus Rinder- oder Schweinepankreas extrahiertes Tierinsulin, halbsynthetisches Humaninsulin, das enzymatisch aus von Schweinepankreas extrahiertem Insulin synthetisiert wird, und Humaninsulin, das durch Techniken der Gentechnik synthetisiert wird, wobei typischerweise E. coli oder Hefe usw. verwendet werden. Weiters kann Insulin Insulin-Zink-Komplex, der ungefähr 0,45 bis 0,9 Gew.-% Zink -29- * ·····«·· • · · ♦ * ··« · * * · · · ♦ · ·· ··· ···· ♦·· ·« ··· enthält, aus Zinkchlorid produziertes Protamin-Insulin-Zink, Protaminsulfat und Insulin usw. umfassen. Insulin kann in Form seiner Fragmente oder Derivate, z.B. INS-1, vorliegen. Insulin kann weiters insulinähnliche Substanzen, wie z.B. L83281, und Insulin-Agonisten umfassen. Obwohl eine Vielzahl von Insulintypen verfügbar ist, wie z.B. sehr schnell wirkend, schnell wirkend, bimodal wirkend, mäßig schnell wirkend, lange andauernd wirkend usw., können diese Typen je nach Leiden des Patienten in geeigneter Weise gewählt werden.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Transgen“ auf eine Nucleinsäuresequenz, die teilweise oder vollständig heterolog zum transgenen Tier ist, d.h. für das Tier, in das sie eingeführt wird, fremd ist,, oder die zu einem endogenen Gen des transgenen Tiers, in dass sie eingeführt wird, homolog ist, die jedoch so konstruiert ist, dass sie in einer solchen Weise in das Genom des Tiers insertiert wird, dass das Genom der Zelle, in die sie eingeführt wird, verändert wird (d.h. sie wird an einem Ort eingeführt, der sich von dem des natürlichen Gens unterscheidet). Ein Transgen kann operativ an eine oder mehrere Transkriptionsregulationssequenzen und an jede andere Nucleinsäure, wie z.B. an Introns, gebunden sein, die zur optimalen Expression einer gewählten Nucleinsäure notwendig sind. Das Transgen hierin kodiert für Dkk-5.

Die „transgenen nichthumanen Tiere“ hierin enthalten alle das für Dkk-5 kodierende Transgen in den meisten ihrer Zellen, was den Phänotyp der Wirtszelle bezüglich der Glucose-Clearance im Blut verändert.

Unter „isoliert“ wird bei Verwendung zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide und Proteinfragmente ein Polypeptid oder Protein verstanden, das identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischenweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid oder Protein stören würden, -30- und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem Grad gereinigt, der ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Zentrifugenbecher-Sequenzierers zu erlangen, oder (2) zur Homogenität gereinigt, mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau-oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes Polypeptid umfasst Polypeptid in situ mit rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung von Dkk-5 nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird das isolierte Polypeptid jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.

Durchführungsweisen der Erfindung

Auf Basis der hierin gemachten Entdeckung der Wirkungen von Dkk-5 auf L6-Muskelzellen und anderer Daten werden neue Verfahren zum Diagnostizieren und Behandeln einer Insulinresistenz-Störung unter Verwendung von Dkk-5 offenbart. Daher stellt die Erfindung Verfahren bereit, die bei einer Reihe von diagnostischen und therapeutischen ln-vitro- und In-vivo-Situationen zweckdienlich sind.

Therapeutische Verwendung

Das Dkk-5 wird an Säugetiere über jeglichen geeigneten Weg verabreicht, einschließlich einem parenteralen Verabreichungsweg, wie z.B., jedoch nicht eingeschränkt auf, intravenöse (IV), intramuskuläre (IM), subkutane (SC) und Intraperitoneale (IP) sowie transdermale, bukkale, sublinguale, intrarektale, intranasale und inhalierende Wege. IM-, SC- und IP-Verabreichung kann durch Bolus oder Infusion erfolgen und kann im Falle von SC auch durch eine langsam freisetzende implantierbare Vorrichtung erfolgen, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Pumpen, langsam freisetzende Formulierungen und mechanische Vorrichtungen. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung systemisch, und eine -31 - ♦ · · ♦· · ·· · • · · · * ···· ··· • « · · · · · · • · · · · ··· · • · · · · · · ·· ··· ···· ··# «φ ···

Verminderung der Insulinresistenz manifestiert sich in einem Abfall der zirkulierenden Glucose- und/oder Insulinspiegel im Patienten.

Ein speziell bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung von Dkk-5 ist die subkutane Infusion, insbesondere unter Verwendung einer dosierbaren Infusionsvorrichtung, wie z.B. einer Pumpe. Eine solche Pumpe kann wiederverwendbar oder wegwerfbar und implantierbar oder extern montierbar sein. Medikationsinfusionspumpen, die zu diesem Zweck zweckdienlich eingesetzt werden, umfassen beispielsweise die in den US-Patenten Nr. 5.637.095; 5.569.186; und 5.527.307 offenbarten Pumpen. Die Zusammensetzungen können kontinuierlich oder periodisch aus solchen Pumpen verabreicht werden.

Therapeutische Formulierungen von Dkk-5 zur Lagerung umfassen Gemische des Proteins mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger in eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid; Phenol; Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Catechol; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Kresol); niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatierende Mittel, wie z.B. EDTA; Zucker, wie z.B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Proteinkomplexe); und/oder -32- • II · · β · · • · · · · ··· · • · · · · # · ·· ······# #·* ·· ««« nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN™, PLURONICS™ oder Polyethylenglykol (PEG). Bevorzugte lyophilisierte Dkk-5-Formulierungen sind in WO 97/04801 beschrieben. Diese Zusammensetzungen umfassen Dkk-5 und enthalten ungefähr 0,1 bis 90 Gew.-% und allgemeiner 10 bis 30 Gew.-% des aktiven Dkk-5, vorzugsweise in löslicher Form.

Die aktiven Inhaltsstoffe können auch in Mikrokapseln eingeschlossen werden, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln in kolloidalen Medikamentabgabesystemen (zum Beispiel Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln) oder in Makroemuisionen. Solche Techniken sind in Remington’s Pharmaceutical Sciences, s.o., offenbart.

Das hierin offenbarte Dkk-5 kann auch als Immunliposomen formuliert werden. Das Dkk-5 enthaltende Liposomen werden durch Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. durch jene, die in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 4030 (1980); US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und WO 97/38731, veröffentlicht am 23. Oktober 1997, beschrieben sind. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.

Besonders zweckdienliche Liposomen können durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung erzeugt werden, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) enthält. Liposomen werden durch Filter definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu liefern.

Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele von Retardpräparaten umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, -33- • · · · · ♦ • · · · · · · ·· ··· ·♦♦♦ «ι· ·· ··· die Dkk-5 enthalten, wobei die Matrices in Form von Formteilen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln vorliegen. Beispiele von Retardmatrices umfassen Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere aus L-Glutaminsäure und y-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylen-Vinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. LUPRON DEPOT™ (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolid-Acetat zusammengesetzt sind), und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure.

Das Dkk-5 kann an ein Trägerprotein gebunden werden, um seine Serumhalbwertszeit zu erhöhen. Die für In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen erzielt werden.

Die Formulierung hierin kann wie für die speziell zu behandelnde Indikation notwendig auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht nachteilig beeinflussen. Weiters kann eine solche aktive Verbindung dem behandelten Säugetier gesondert verabreicht werden. Solche anderen Medikamente können über einen Weg und in einer Menge, der/die üblicherweise dafür verwendet wird, gleichzeitig oder nacheinander mit Dkk-5 verabreicht werden. Bei gleichzeitiger Verwendung von Dkk-5 mit einem oder mehreren anderen Medikamenten wird eine pharmazeutische Dosierungseinheitsform bevorzugt, die derartige andere Medikamente zusätzlich zum Dkk-5 enthält. Demgemäß umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung jene, die auch einen oder mehrere andere aktive Inhaltsstoffe zusätzlich zum Dkk-5 enthalten. Beispiele von Insulinresistenz-Behandlungsmitteln oder Hypoglykämie-Mitteln, die mit dem Dkk-5 kombiniert und entweder gesondert oder in denselben pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden können, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: -34- ·· · ·· · ·· • · · · · · · • · · · · ·«· • · · · · « a) Insulinsensibilisatoren, einschließlich (i) PPAR-Gamma-Agonisten, wie z.B. die Glitazone (z.B. einschließlich jener, die im US-Patent Nr. 5.753.681 beschrieben sind, wie z.B. Troglitazon (Noscal oder Resilin), Pioglitazon HCl, Englitazon, MCC-555, BRL-49653, ALRT 268, LGD 1069, Chrom-Picolinat, DIAB II™ (V-411) oder GLUCANIN™ und dergleichen) und Verbindungen, die in WO 97/27857, WO 97/28115, WO 97/28137 und WO 97/27847 offenbart sind, und (ii) Biguanide, wie z.B. Metformin und Phenformin. (b) Insulin (ein Insulin oder mehrere Insuline), Insulin-Mimetika, wie z.B. Kleinmolekül-Insulin, z.B. L-783,281, Insulinanaloga (z.B. LYSPRO™ (Eli Lilly Co.), LysB28lnsulin, ProB29lnsulin oder AspB28lnsulin oder jene, die beispielsweise in US-Patenten Nr. 5.149.777 und 5.514.646 beschrieben sind) oder physiologisch aktive Fragmente davon, Insulin-verwandte Peptide (C-Peptid, GLP-1, IGF-1 oder IGF-1/IGFBP-3-Komplex) oder Analoga oder Fragmente davon; (c) Sulfonylharnstoffe, wie z.B. Acetohexamid, Chlorpropamid, Tolazamid, Tolbutamid, Glibenclamid, Glibornurid, Gliclazid, Glipizid, Gliquidon und Glymidin; (d) Alpha-Glucosidase-Inhibitoren (wie z.B. Acarbose); (e) Cholesterin-vermindernde Mittel, wie z.B. (i) HMG-CoA-Reduktase-lnhibitoren (Lovastatin, Simvastatin und Pravastatin, Fluvastatin, Atorvastatin und andere Statine), (ii) Sequestrationsmittel (Cholestyramin, Colestipol und ein Dialkylaminoalkyl-Derivat eines vernetzten Dextrans), (iii) Nicotinylalkohol Nicotinsäure oder ein Salz davon, (iv) Proliferator-Aktivator Rezeptor-Alpha-Agonisten, wie z.B. Fenofibrinsäure-Derivate (Gemfibrozil, Clofibrat, Fenofibrat und Benzafibrat), (v) Inhibitoren der Cholesterinabsorption, beispielsweise Beta-Sitosterol und (Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase)-lnhibitoren, beispielsweise Melinamid, (vi) Probucol, (vii) Vitamin E und (viii) Thyromimetika; -35- ·♦ · ·· · ·· • · · · · · · • · · · · ··« • · · · I f (f) PPAR-Delta-Agonisten, wie z.B. jene, die in WO 97/28149 beschrieben sind; (g) Anti-Fettleibigkeit-Verbindungen, wie z.B. Fenfluramin, Dexfenfluramin, Phentermin, Sibutramin, Orlistat und andere Beta3-adrenergische Rezeptoragonisten; (h) Fressverhalten modifizierende Mittel, wie z.B. Neuropeptid-Y-Antagonisten (z.B. Neuropeptid Y5), beispielsweise jene, die in WO 97/19682, WO 97/20820, WO 97/20821, WO 97/20822 und WO 97/120823 offenbart sind; (i) PPAR-Alpha-Agonisten, wie z.B. jene, die in WO 97/36579 beschrieben sind; (j) PPAR-Gamma-Agonisten, wie z.B. jene, die in WO 97/10813 beschrieben sind; (k) Serotonin-Wiederaufnahmehemmer, wie z.B. Fluoxetin und Sertralin; (l) ein oder mehrere Insulinsensibilisatoren gemeinsam mit einem oder mehreren oral aufgenommenen Insulinen, einem injiziertes Insulin, einem Sulfonylharnstoff, einem Biguanid oder einem Alpha-Glucose-Inhibitor, wie beschrieben im US-Patent Nr. 6.291.495; (m) Autoimmunreagenzien; (n) Antagonisten gegen Insulinrezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitor (US-Patente Nr. 5.939.269 und 5.939.269); (o) IGF-1 (IGFBP-3-Komplex (US-Patent Nr. 6.040.292); (p) Antagonisten gegen die TNF-Alpha-Funktion (US-Patent Nr. 6.015.558); -36- (q) Wachstumshormon freisetzendes Mittel (US-Patent Nr. 5.939.387); und (r) Antikörper gegen Amylin (US-Patent Nr. 5.942.227).

Andere Mittel sind in der obigen Definition spezifiziert oder dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.

Solche zusätzlichen Moleküle sind in geeigneter Weise vorhanden oder werden in Kombination in Mengen verabreicht, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind, typischerweise weniger als diejenige Menge, die verwendet wird, wenn sie alleine ohne Dkk-5 verabreicht werden. Bei gemeinsamer Formulierung können sie in denjenigen Mengen formuliert werden, die beispielsweise entsprechend der Person, dem Alter und Körpergewicht der Person, dem gegenwärtigen klinischen Zustand, der Verabreichungszeit, Dosisform, dem Verabreichungsverfahren usw. ermittelt werden. Zum Beispiel wird ein begleitendes Medikament vorzugsweise in einem Anteil von ungefähr 0,0001 bis 10.000 Gewichtsteilen pro einem Gewichtsteil des Dkk-5 hierin verwendet.

Das Hypoglykämie-Mittel wird durch eine beliebige geeignete Technik an ein Säugetier verabreicht, einschließlich parenteral, intranasal, oral oder über irgendeinen anderen wirksamen Weg. Insbesondere bevorzugt erfolgt die Verabreichung durch Injektion (wie von Insulin) oder über den oralen Weg. Beispielsweise sind MICRONASE™-Tabletten (Glyburid), die von Upjohn in Konzentrationen von 1,25, 2,5 und 5 mg pro Tablette vermarktet werden, für orale Verabreichung geeignet. Die übliche Erhaltungsdosis für auf diese Therapie gesetzte Typ-Il-Diabetiker liegt im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 1,25 bis 20 mgTTag, die wie als notwendig erachtet als Einzeldosis oder über den Tag verteilt verabreicht werden kann (Physician’s Desk Reference, 2563-2565 (1995)). Andere Beispiele von Glyburid-basierten Tabletten, die zur Verschreibung erhältlich sind, umfassen -37- ·· · ·· · ·· · • · ·· · · ·· · · ·· ··· ··##· • · · · I 4«· « • · · · · · · ·· ··«·*·* ·«· »f Μ· GLYNASE™-Markenmedikament (Upjohn) und DIABETA™-Markenmedikament (Hoechst-Roussel). GLUCOTROL™ (Pratt) ist der Markename für eine Glipizid- (1-Cyclohexyl-3-[p-{2-(5-methylpyrazincarboxamid)ethyl}phenyl]sulfonylharnstoff-) Tablette, die in den Stärken 5 sowie 10 mg erhältlich ist und auch an Typ-Il-Diabetiker verschrieben wird, die Hypoglykämie-Therapie nach Diätkontrolle benötigen, oder an Patienten, die aufgehört haben, auf andere Sulfonylharnstoffe anzusprechen (Physician’s Desk Reference, 1902-1903 (1995)).

Die Verwendung von Dkk-5 in Kombination mit Insulin ermöglicht die Herabsetzung der Insulindosis im Vergleich zur Dosis zum Zeitpunkt der alleinigen Verabreichung von Insulin. Daher ist das Risiko einer Blutgefäßkomplikation und Hypoglykämie-Induktion, die beide Probleme bei hohen Mengen an Insulinverabreichung darstellen können, gering. Für die Verabreichung von Insulin an einen erwachsenen diabetischen Patienten (Körpergewicht ungefähr 50 kg) beträgt beispielsweise die Tagesdosis für gewöhnlich ungefähr 10 bis 100 U (Einheiten), vorzugsweise ungefähr 10 bis 80 U, jedoch kann die vom Arzt ermittelte Dosis geringer sein. Für die Verabreichung von Insulin-Sekretionsverstärkern an denselben Patiententyp beträgt beispielsweise die Tagesdosis vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 1000 mg, bevorzugter ungefähr 1 bis 100 mg. Für die Verabreichung von Biguaniden an denselben Patiententyp beträgt beispielsweise die Tagesdosis vorzugsweise ungefähr 10 bis 2.500 mg, bevorzugter ungefähr 100 bis 1000 mg. Für die Verabreichung von α-Glucosidase-lnhibitoren an denselben Patiententyp beträgt beispielsweise die Tagesdosis vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 400 mg, bevorzugter ungefähr 0,6 bis 300 mg. Die Verabreichung von Ergoset, Pramlintid, Leptin, BAY-27-9955 oder T-1095 an solche Patienten kann mit einer Dosis von vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 2.500 mg, bevorzugter ungefähr 0,5 bis 1.000 mg erfolgen. Alle diese obigen Dosen können einmal oder mehrmals am Tag verabreicht werden. -38-

Das Dkk-5 kann auch gemeinsam mit einer Nicht-Medikament-Behandlung gegen eine Insulinresistenz-Störung, wie z.B. einer Pankreastransplantation, verabreicht werden.

Die Dosierungen des an ein insulinresistentes Säugetier verabreichten Dkk-5 wird üblicherweise vom Arzt angesichts der maßgeblichen Umstände, einschließlich der Kondition des Säugetiers und des gewählten Verabreichungswegs ermittelt. Die hierin dargelegten Dosisbereiche beabsichtigen nicht, den Schutzumfang der Erfindung auf irgendeine Weise einzuschränken. Eine „therapeutisch wirksame“ Menge ist zum Zwecke hierin durch die obigen Faktoren bestimmt, beträgt jedoch im Allgemeinen ungefähr 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag. Die bevorzugte Dosis beträgt ungefähr 0,1 bis 50 mg/kg/Tag, bevorzugter ungefähr 0,1 bis 25 mg/kg/Tag. Noch bevorzugter beträgt die intravenöse oder intramuskuläre Dosis für einen Menschen bei täglicher Verabreichung des Dkk-5 ungefähr 0,3 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag, bevorzugter ungefähr 0,5 bis 5 mg/kg. Für die subkutane Verabreichung ist die Dosis vorzugsweise höher als die therapeutisch äquivalente intravenös oder intramuskulär verabreichte Dosis. Vorzugsweise beträgt die tägliche subkutane Dosis für einen Menschen ungefähr 0,3 bis 20 mg/kg, bevorzugter ungefähr 0,5 bis 5 mg/Tag.

Die Erfindung sieht eine Vielzahl von Dosisschemata vor. Die Erfindung sieht kontinuierliche Dosisschemata vor, bei denen Dkk-5 regelmäßig (täglich oder monatlich in Abhängigkeit von der Dosis und Dosisform) ohne wesentliche Unterbrechungen verabreicht wird. Bevorzugte kontinuierliche Dosierungsschemata umfassen tägliche kontinuierliche Infusion, wo Dkk-5 jeden Tag infundiert wird, und kontinuierliche Bolusverabreichungsschemata, wo Dkk-5 zumindest einmal am Tag durch Bolusinjektion oder über inhalierende oder intranasale Wege verabreicht wird. Die Erfindung sieht weiters diskontinuierliche (z.B. intermittierende und erhaltende) Dosierungsschemata vor. Die genauen Parameter derartiger diskontinuierlicher Schemata variieren je nach Formulierung, Abgabeverfahren und klinischen -39- ·· • ·· • • • · • · • · • • ♦ • • ♦ • « • • · ··· • • • •

Erfordernissen des behandelten Säugetiers. Wenn beispielsweise das Dkk-5 durch Infusion verabreicht wird, können Verabreichungsschemata eine erste Zeitspanne der Verabreichung, gefolgt von einer zweiten Zeitspanne umfassen, während der Dkk-5 nicht verabreicht wird, wobei die zweite Zeitspanne länger, gleich lang oder kürzer als die erste Zeitspanne ist.

Wo die Verabreichung durch Bolusinjektion, insbesondere durch Bolusinjektion einer langsam freisetzenden Formulierung erfolgt, können Dosierungsschemata insofern kontinuierlich sein, als dass Dkk-5 jeden Tag verabreicht wird, oder können diskontinuierlich sein, und zwar wie oben beschrieben mit einer ersten Zeitspanne und einer zweiten Zeitspanne und so weiter.

Kontinuierliche und diskontinuierliche Verabreichungsschemata durch irgendein Verfahren umfassen weiters Dosierungsschemata, bei denen die Dosis über die erste Zeitspanne hinweg so moduliert wird, dass beispielsweise am Beginn der ersten Zeitspanne die Dosis niedrig ist und bis zum Ende der ersten Zeitspanne erhöht wird, die Dosis anfangs hoch ist und während der ersten Zeitspanne erniedrigt wird, die Dosis anfangs niedrig ist, auf einen Maximalausmaß erhöht und dann gegen Ende der ersten Zeitspanne vermindert wird, und jegliche Kombination davon.

Die Wirkungen der Verabreichung von Dkk-5 können mit einer Vielzahl von Tests gemessen werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Am häufigsten resultiert die Linderung der Wirkungen der Diabetes in verbesserter Glykämiekontrolle (gemessen durch Reihentestung von Blutglucose), Verminderung des Insulinbedarfs zur Erhaltung guter Glykämiekontrolle, Verminderung der Seruminsulinspiegel, Verminderung von glykosyliertem Hämoglobin, Verminderung der Blutspiegel an fortgeschrittenen Glykosylierungsendprodukten (AGE), vermindertem „Dämmerungssyndrom“, verminderter Ketoazidose und verbessertem Lipidprofil. Alternativ dazu kann die Verabreichung von Dkk-5 in einer Stabilisierung -40- • ·· « ·· « • 9 • · • « • • • • • • • t • # i ··· • • 9 9 der Diabetessymptome, wie sie durch Verminderung der Blutglucosespiegel angezeigt wird, vermindertem Insulinbedarf, verminderten Seruminsulinspiegeln, vermindertem glykosyliertem Hämoglobin und Blut-AGE, verminderten Gefäß-, Nieren-, Neuronen- und Netzhautkomplikationen, verminderten Schwangerschaftskomplikationen und verbessertem Lipidprofil resultieren.

Die Blutglucose-erniedrigende Wirkung des Dkk-5 kann durch Bestimmen der Konzentration von Glucose oder Hb (Hämoblobin)A1c im venösen Blutplasma des Patienten vor und nach Verabreichung und anschließendem Vergleich der erhaltenen Konzentration vor und nach Verabreichung beurteilt werden. HbA1c bedeutet glykosyliertes Hämoglobin und wird allmählich als Reaktion auf die Blutglucosekonzentration produziert. Daher wird von HbA1c angenommen, dass es als ein Index der Blutzuckerkontrolle von Bedeutung ist, der nicht leicht von raschen Blutzuckerveränderungen in diabetischen Patienten beeinflusst wird.

Die Erfindung stellt weiters Sets für die Behandlung einer Insulinresistenz-Störung bereit. Die Sets der Erfindung umfassen einen oder mehrere Behälter von Dkk-5 in einer vorherbestimmten Menge in Kombination mit einem Satz von Anleitungen, im Allgemeinen schriftlichen Anleitungen, die sich auf die Verwendung und Dosierung von Dkk-5 für die Behandlung einer Insulinresistenz-Störung, vorzugsweise Diabetes, beziehen. Die im Set enthaltenen Anleitungen umfassen im Allgemeinen Informationen über die Dosierung, das Dosisschema und den Verabreichungsweg zur Behandlung der Insulinresistenz-Störung. Die Dkk-5-Behälter können Einheitsdosierungen, Mengenpackungen (z.B. Mehrfachdosis-Packungen) oder Untereinheiten-Dosierungen sein.

Dkk-5 kann in jede zweckdienliche, geeignete Verpackung verpackt werden. Wenn Dkk-5 beispielsweise eine gefriergetrocknete Formulierung ist, wird normalerweise eine Ampulle oder ein Fläschchen mit einem elastischen Stopfen als Behälter verwendet, so dass das Medikament durch Injektion von Flüssigkeit durch den -41 - elastischen Stopfen leicht rekonstituiert werden kann. Ampullen mit nicht elastischen, entfernbaren Verschlüssen (z.B. versiegeltes Glas) oder elastischen Stopfen werden am zweckdienlichsten für injizierbare Formen von Dkk-5 verwendet. In diesem Fall legen die Anleitungen vorzugsweise fest, dass der Inhalt des Fläschchens zur sofortigen Verabreichung in eine Spritze aufzunehmen ist. Ebenso vorgesehen sind Packungen zur Verwendung in Kombination mit einer speziellen Vorrichtung, wie z.B. einem Inhalator, einer nasalen Verabreichungsvorrichtung (z.B. einem Zerstäuber) oder einer Infusionsvorrichtung, wie z.B. einer Minipumpe.

Das Set kann weiters einen Behälter umfassen, der ein Insulinresistenz-Behandlungsmittel in einer vorherbestimmten Menge umfasst.

Diagnostische Verwendung

Zahlreiche verschiedene Tests und Testformate können verwendet werden, um die Menge von Dkk-5 in einer Probe im Vergleich zu einer Kontrollprobe nachzuweisen. Diese Formate sind ihrerseits in den diagnostischen Tests der vorliegenden Erfindung zweckdienlich, die verwendet werden, um das Vorliegen oder den Beginn einer Insulinresistenz-Störung in einem Säugetier nachzuweisen.

Jegliches auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zur Messung löslicher Analyten kann bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kompetitive und nichtkompetitive Testsysteme unter Anwendung von Techniken wie z.B. Radioimmuntest, Enzymimmuntests (EIA), vorzugsweise ELISA, „Sandwich“-Immuntests, Präzipitationsreaktionen, Geldiffusionsreaktionen,

Immundiffusionsreaktionen, Agglutinationstests, Komplement-Fixierungstests, immunradiometrische Tests, Fluoreszenzimmuntests, Protein-A-Immuntests und Immunelektrophoresetests. Für Beispiele bevorzugter Immuntestverfahren siehe US-Patente Nr. 4.845.026 und 5.006.459. -42- • · ··· ·«··

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In einer der Ausführungsformen werden ein oder mehrere Anti-Dkk-5-Antikörper verwendet, um die Menge an Dkk-5 in der Probe zu messen. Für diagnostische Anwendungen wird der Antikörper, falls ein Anti-Dkk-5-Antikörper zum Nachweis verwendet wird, mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein. Vorzugsweise wird ein derartiger Antikörper in einem Immuntest verwendet. In einem Markierungsaspekt ist ein oder sind mehrere Anti-Dkk-5-Antikörper markiert; in einem weiteren Aspekt ist ein erster Antikörper unmarkiert und es wird ein markierter zweiter Antikörper verwendet, um das an den ersten Antikörper gebundene Dkk-5 nachzuweisen oder um den ersten Antikörper nachzuweisen.

Es sind zahlreiche Marker verfügbar, die allgemein in die folgenden Kategorien eingeteilt werden können; (a) Radioisotope, wie z.B. 35S, 14C, 125l, 3H und 131l sind verfügbar. Der Antikörper kann mit dem Radioisotop oder Radionuklid unter Anwendung der beispielsweise in Current Protocols in Immunology, Bd. 1 und 2, Coligen et al. (Hrsg.), Wiley-Intersciences, New York (1991) beschriebenen Techniken markiert und die Radioaktivität mittels Szintillationszählung gemessen werden. (b) Fluoreszenzmarker, wie z.B. Chelate seltener Erden (Europium-Chelate) oder Fluorescein und seine Derivate (wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat), Rhodamin und seine Derivate, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd, Fluorescamin, Dansyl, Lissamin und Texasrot sind verfügbar. Die Fluoreszenzmarker können beispielsweise unter Verwendung der in Current Protocols in Immunology, s.o., offenbarten Techniken markiert werden. Fluoreszenz kann unter Verwendung eines Fluorimeters quantifiziert werden. Der nachweisende Antikörper kann auch unter Verwendung von Fluoreszenz-emittierenden Metallen, wie z.B. 152Eu oder anderen der Lanthanidreihe markiert nachweisbar werden. Diese Metalle können unter Verwendung von metallchlatierenden Gruppen, wie z.B. -43- V ····»··· • · · · · ··· · • · · · · , · ·· ······· ♦·· · · ···

Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), an den Antikörper gebunden werden. (c) Verschiedene Enzym-Substrat-Marker sind für einen EIA verfügbar und US-Patent Nr. 4.275.149 stellt einen Überblick von einigen davon bereit. Das Enzym katalysiert im Allgemeinen eine chemische Veränderung des chromogenen Substrats, die unter Verwendung verschiedener Techniken gemessen werden kann. Beispielsweise kann das Enzym eine Farbveränderung in einem Substrat katalysieren, die spektrophotometrisch gemessen werden kann. Alternativ dazu kann das Enzym die Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz des Substrats verändern. Techniken zum Quantifizieren einer Fluoreszenzveränderung sind oben beschrieben. Das Chemilumineszenzsubstrat wird durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt und kann dann Licht emittieren, das gemessen werden kann (beispielsweise unter Verwendung eines Chemiluminometers), oder gibt Energie an einen Fluoreszenzakzeptor ab. Beispiele enzymatischer Marker umfassen Luciferase (z.B. Leuchtkäfer-Luciferase und bakterielle Luciferase; US-Patent Nr. 4.737.456), Luciferin, Aequorin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Malatdehydrogenase, Urease, eine Peroxidase, wie z.B. Meerrettichperoxidase (HRPO), Alkalische Phosphatase, ß-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen (z.B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, Alpha-Glycerophosphat-dehydrogenase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase), Staphylococcus-Nuclease, Delta-V-Steroidisomerase, Triosephosphatisomerase, Asparaginase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Acetylcholinesterase, heterocyclische Oxidasen (z.B. Uricase und Xanthinoxidase), Lactoperoxidase, Microperoxidase und dergleichen. Techniken zum Konjugieren von Enzymen an Antikörper werden in O’Sullivan et al., Methods in Enzym., Langone und Van Vunakis (Hrsg.), Academic Press, New York 73,147-166 (1981), beschrieben.

Beispiele von Enzym-Substrat-Kombinationen umfassen: -44-

(i) Meerrettichperoxidase (HRPO) mit Wasserstoffperoxidase als Substrat, worin die Wasserstoffperoxidase einen Farbstoffvorläufer (z.B. Orthophenylendiamin (OPD) oder 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin Hydrochlorid (TMB)) oxidiert; (ii) Alkalische Phosphatase (AP) mit p-Nitrophenylphosphat als chromogenes Substrat; und (iii) ß-D-Galactosidase (ß-D-Gal) mit einem chromogenen Substrat (z.B. p-Nitrophenyl-ß-D-Galactosidase) oder dem fluorogenen Substrat 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Galactosidase.

Zahlreiche andere Enzym-Substrat-Kombinationen sind dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung verfügbar. Für einen allgemeinen Überblick siehe US-Patente Nr. 4.275.149 und 4.318.980.

Manchmal wird der Marker direkt mit dem Antikörper konjugiert. Der geübte Fachmann wird die verschiedenen Techniken, um dies zu erzielen, kennen. Beispielsweise kann der Antikörper mit Biotin konjugiert werden und beliebige der drei umfassenden Kategorien der oben erwähnten Marker können mit Avidin markiert werden oder umgekehrt. Biotin bindet selektiv an Avidin und folglich kann der Marker auf diese indirekte Weise mit dem Antikörper konjugiert werden.

Alternativ dazu wird der Antikörper, um die indirekte Konjugation des Markers mit dem Antikörper zu erzielen, mit einem kleinen Hapten (z.B. Dioxin) konjugiert. Demgemäß kann die indirekte Konjugation des Markers mit dem Antikörper erzielt werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung muss der Anti-Dkk-5-Antikörer nicht markiert sein und seine Anwesenheit kann unter Verwendung eines markierten Antikörpers nachgewiesen werden, der an den Dkk-5-Antikörper bindet. -45- ♦ · • I ·< • · « • · · 4 • I • · · · « · • · «····«

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren, wie z.B. kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests eingesetzt werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147-158 (1987).

In den Tests der vorliegenden Erfindung werden das Antigen Dkk-5 oder Antikörper dagegen vorzugsweise an eine Festphasenunterlage oder an einen Festphasenträger gebunden. Mit „Festphasenunterlage oder Träger“ ist jegliche Unterlage beabsichtigt, die zur Bindung eines Antigens oder von Antikörpern fähig ist. Wohlbekannte Unterlagen oder Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Charakter des Trägers kann für die Zwecke der Erfindung entweder teilweise löslich oder unlöslich sein. Das Unterlagenmaterial kann praktisch jegliche mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül fähig ist, an ein Antigen oder an einen Antikörper zu binden. Folglich kann die Konfiguration der Unterlage sphärisch, wie bei einer Perle, oder zylindrisch, wie bei der inneren Oberfläche eines Teströhrchens oder bei der äußeren Oberfläche eines Stabs sein. Alternativ dazu kann die Oberfläche flach sein, wie z.B. ein Blatt, Teststreifen usw. Bevorzugte Unterlagen umfassen Polystyrolperlen. Die Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung werden zahlreiche andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörper oder Antigen kennen oder werden in der Lage sein, dasselbe durch routinemäßiges Experimentieren zu gewährleisten.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Sandwichimmuntest durchgeführt, d.h. das Antigen wird mit einem Verfahren nachgewiesen oder gemessen, das die Bindung eines ersten Antikörpers an das Antigen und die Bindung eines zweiten Antikörpers an das Antigen und das Nachweisen oder Messen des immunspezifisch vom ersten sowie zweiten Antikörper gebundenen Antigens umfasst. In einer speziellen Ausführungsform sind die ersten -46- und zweiten Antikörper monoklonale Antikörper. In dieser Ausführungsform muss der zweite monoklonale Antikörper, wenn das Antigen keine vom monoklonalen Antikörper erkannten, sich wiederholenden Epitope enthält, an eine Stelle binden, die sich von der des ersten Antikörpers unterscheidet (wie sich z.B. durch das Fehlen kompetitiver Hemmung zwischen den beiden Antikörpern um die Bindung an das Antigen widerspiegelt). In einer weiteren speziellen Ausführungsform ist der erste oder zweite Antikörper ein polyklonaler Antikörper. In noch einer weiteren Ausführungsform sind sowohl der erste, als auch der zweite Antikörper polyklonale Antikörper.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein „Vorwärts“-Sandwichimmuntest verwendet, wie er unten schematisch beschrieben wird. Ein gegen das Dkk-5 gerichteter Antikörper (Einfang-Antikörper, Ab1) wird an eine Festphasenmatrix, vorzugsweise an eine Mikroplatte gebunden. Die Probe wird mit der Ab1-beschichteten Matrix kontaktiert, so dass jegliches Dkk-5 in der Probe, gegen das Ab1 spezifisch ist, an den Festphasen-Ab1 bindet. Ungebundene Probenkomponenten werden durch Waschen entfernt. Ein enzymkonjugierter, gegen ein zweites Epitop des Antigens gerichteter zweiter Antikörper (Nachweisantikörper, Ab2) bindet an das von Ab1 eingefangene Antigen und vervollständigt den Sandwich. Nach Entfernen von ungebundenem Ab2 durch Waschen wird ein chromogenes Substrat für das Enzym zugegeben und es wird ein gefärbtes Produkt proportional zur Menge des im Sandwich vorhandenen Enzyms gebildet, was die Menge von Antigen in der Probe widerspiegelt. Die Reaktion wird durch Zugabe von Stopplösung terminiert. Die Farbe wird als Absorption bei einer geeigneten Wellenlänge unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Eine Standardkurve wird aus bekannten Konzentrationen des Antigens erstellt, aus der unbekannte Probenwerte ermittelt werden können.

Andere Arten von „Sandwich“-Tests sind die so genannten „simultanen“ und „reversen“ Tests. Ein simultaner Test umfasst einen einzigen Inkubationstest, da der -47- an die feste Unterlage gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzeitig zur gestesteten Probe zugegeben werden. Nachdem die Inkubation beendet ist, wird die feste Unterlage gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe und nicht komplexierten markierten Antikörper zu entfernen. Die Gegenwart des mit der festen Unterlage assoziierten markierten Antikörpers wird dann wie in einem herkömmlichen „Vorwärts“-Sandwichtest ermittelt.

Im „reversen“ Test wird schrittweise zuerst eine Lösung von markiertem Antikörper zur flüssigen Probe zugegeben, gefolgt von der Zugabe des an eine feste Unterlage gebundenen unmarkierten Antikörpers nach einer geeigneten Inkubationsdauer. Nach einer zweiten Inkubation wird die Festphase auf herkömmliche Weise gewaschen, um sie vom Rest der gestesteten Probe und der Lösung des nicht reagierten markierten Antikörpers zu befreien. Die Menge an mit einer festen Unterlage assoziiertem markiertem Antikörper wird wie im „simultanen“ und „Vorwärts“-Test bestimmt.

Sets, die einen oder mehrere Behälter oder Fläschchen umfassen, die Komponenten zur Durchführung der Tests der vorliegenden Erfindung enthalten, sind im Schutzumfang der Erfindung ebenfalls enthalten. Ein solches Set ist eine verpackte Kombination von Reagenzien in vorherbestimmten Mengen mit Anleitungen zum Durchführen des diagnostischen Tests. Zum Beispiel kann ein solches Set einen Antikörper oder Antikörper, vorzugsweise ein Paar von Antikörpern gegen des Dkk-5 Antigen umfassen, die vorzugsweise nicht um dieselbe Bindungsstelle am Antigen konkurrieren. In einer speziellen Ausführungsform kann Dkk-5 an die Festphasenmatrix voradsorbiert sein. Das Set enthält vorzugsweise die anderen notwendigen Waschreagenzien, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Für den EIA enthält das Set das chromogene Substrat, sowie ein Reagens zum Stoppen der enzymatischen Reaktion, wenn Farbentwicklung aufgetreten ist. Das im Set umfasste Substrat ist eines, das für das an eines der Antikörperpräparate konjugierte Enzym geeignet ist. Diese sind auf dem Gebiet der Erfindung -48- wohlbekannt und einige sind unten beispielhaft angeführt. Das Set kann gegebenenfalls auch einen Dkk-5-Standard umfassen; d.h. eine Menge an gereinigtem Dkk-5, die einer normalen Menge an Dkk-5 in einer Standardprobe entspricht.

Wo der Antikörper mit einem Enzym markiert ist, umfasst das Set Substrate und Cofaktoren, die von Enzym benötigt werden (z.B. einen Substratvorläufer, der ein nachweisbares Chromophor oder Fluorophor bereitstellt). Außerdem können andere Zusätze umfasst sein, wie z.B. Stabilisatoren, Puffer (z.B. ein Blockpuffer oder Lysepuffer) und dergleichen. Die relativen Mengen an verschiedenen Reagenzien können weitgehend variiert werden, um für Konzentrationen der Reagenzien in Lösung zu sorgen, die im Wesentlichen die Empfindlichkeit des Tests optimieren. Insbesondere können die Reagenzien als trockene Pulver, für gewöhnlich lyophilisiert bereitgestellt werden und umfassen Exzipienten, die bei Auflösung für eine Reagenslösung mit der geeigneten Konzentration sorgen.

In einer speziellen Ausführungsform umfasst ein Diagnoseset zum Nachweisen des Vorliegens oder Beginns einer Insulinresistenz-Störung folgendes: (1) einen Behälter, der einen Antikörper umfasst, der Dkk-5 bindet; (2) einen Behälter, der eine Dkk-5 enthaltende Standardprobe umfasst; und (3) Anleitungen zum Verwenden des Antikörpers und der Standardprobe, um die Störung nachzuweisen, worin entweder der Dkk-5 bindende Antikörper markiert ist oder das Set weiters einen weiteren Behälter umfasst, der einen zweiten Antikörper umfasst, der nachweisbar markiert ist und an das Dkk-5 oder an den Dkk-5 bindenden Antikörper bindet. Vorzugsweise ist der Dkk-5 bindende Antikörper ein monoklonaler Antikörper.

In einer weiteren speziellen Ausführungsform umfasst ein Set der Erfindung folgendes in einem oder mehreren Behältern: (1) einen Festphasenträger, wie z.B. eine mit einem ersten Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte; (2) einen nachweisbar -49- «*« ·· ··· ···· ··· Φφ Mt markierten zweiten Antikörper; und (3) eine Standardprobe des Dkk-5-Moleküls, das von ersten und zweiten Antikörper nachgewiesen wird, sowie geeignete Anleitungen.

Screening unter Verwendung transgener Tiere

Transgene, nichthumane Tiere, die Dkk-5-cDNA in Muskelzellen überexprimieren, können verwendet werden, um Kandidatmedikamente (Proteine, Peptide, Polypeptide, kleine Moleküle usw.) auf Effizienz zur Erhöhung der Glucose-Clearance aus dem Blut, die eine Behandlung für eine Insulinresistenz-Störung anzeigt, zu screenen.

In einer der Ausführungsformen werden die transgenen Tiere durch Einführen des Dkk-5-Transgens in die Keimbahn des nichthumanen Tiers produziert. Embryonale Zielzellen verschiedener Entwicklungsstadien können verwendet werden, um Transgene einzuführen. Es werden verschiedene Verfahren in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium der embryonalen Zielzelle verwendet. Die spezielle(n) Linie(n) jegliches zur praktischen Umsetzung dieser Erfindung verwendeten Tieres wird/werden nach allgemein guter Gesundheit, guten Embryoausbeuten, guter Prokern-Sichtbarkeit im Embryo und guter Reproduktionstauglichkeit ausgewählt. Außerdem ist der Haplotyp ein signifikanter Faktor. Wenn beispielsweise transgene Mäuse zu produzieren sind, werden Stämme wie z.B. C57BL/6- oder FVB-Linien häufig verwendet. Die zur praktischen Umsetzung dieser Erfindung verwendete(n) Linie(n) kann/können selbst transgen sein und/oder kann/können (eine) Knockout-Linie(n) sein (d.h. aus Tieren erlangt sein, bei denen ein oder mehrere Gene partiell oder vollständig supprimiert sind).

Das Transgenkonstrukt kann in einen Einzelstadium-Embryo eingeführt werden. Die Zygote ist das beste Ziel für die Mikroinjektion. Die Verwendung von Zygoten als Ziel für den Gentransfer hat insofern einen großen Vorteil, als dass die injizierte DNA in den meisten Fällen vor der ersten Spaltung in das Wirtsgenom eingebaut wird -50- • · « · • ·· • * t • · • · • • m • t · • · • • • (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 4438-4442 (1985)). Als Konsequenz tragen alle transgenen Tiere das eingebaute Transgen. Dies widerspiegelt sich im Allgemeinen in der effizienten Übertragung des Transgens auf die Nachkommenschaft des Gründers, da 50 % der Keimzellen das Transgen tragen.

Normalerweise werden befruchtete Embryos in geeigneten Medien inkubiert, bis die Prokerne sichtbar werden. Ungefähr zu dieser Zeit wird die das Transgen umfassende Nucleotidsequenz in den weiblichen oder männlichen Prokern eingeführt. In manchen Spezies, wie z.B. in Mäusen wird der männliche Prokern bevorzugt. Das exogene genetische Material kann dem männlichen DNA-Komplement der Zygote zugegeben werden, bevor es durch den Eizellenkern oder weiblichen Zygoten-Prokern prozessiert wird.

Folglich kann das exogene genetische Material dem männlichen DNA-Komplement oder jedem anderen DNA-Komplement zugegeben werden, bevor es vom weiblichen Prokern beeinflusst wird, was der Fall ist, wenn die männlichen und weiblichen Prokerne gut getrennt und beide nahe der Zellmembran lokalisiert sind. Alternativ dazu könnte das exogene genetische Material dem Kern des Spermiums zugegeben werden, nachdem seine Dekondensation induziert worden ist. Das exogene Material enthaltende Spermien können dann der Eizelle zugegeben werden oder es könnte das dekondensierte Spermium der Einzelle zugegeben werden, wobei die Transgenkonstrukte dann so bald als möglich zugegeben werden.

Es kann jegliche Technik eingesetzt werden, welche die Zugabe von exogenem Material in genetisches Kernmaterial ermöglicht, solange sie die Zelle, Kernmembran oder andere bestehende Zell- oder Genstrukturen nicht zerstört. Die Einführung der Transgennucleotidsequenz in den Embryo kann mit jedem auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Mittel erzielt werden, wie z.B. durch Mikroinjektion, Elektroporation oder Lipofektion. Das exogene genetische Material wird vorzugsweise durch Mikroinjektion in das genetische Kernmaterial eingeführt. Die -51 - • · • • ♦ 0 • · • · • · • · « • • • • • • • • ♦ · • · 4 0

Mikroinjektion von Zellen und Zellstrukturen ist bekannt und wird auf dem Gebiet der Erfindung verwendet. In der Maus erreicht der männliche Prokern die Größe von ungefähr 20 Mikrometern Durchmesser, was die reproduzierbare Injektion von 1-2 pl DNA-Lösung ermöglicht. Nach der Einführung der Transgennucleotidsequenz in den Embryo kann der Embryo in vitro für variierende Zeitspannen inkubiert oder wieder in den Surrogatwirt implantiert werden oder beides. Die ln-vitro-lnkubation zur Reife liegt im Schutzumfang dieser Erfindung. Ein gebräuchliches Verfahren ist es, den Embryo in vitro für ungefähr 1-7 Tage in Abhängigkeit von der Spezies zu inkubieren und dann wieder in den Surrogatwirt zu implantieren.

Die Anzahl an Kopien des Transgenkonstrukts, die der Zygote zugegeben werden, hängt von der Gesamtmenge an zugegebenem exogenem Genmaterial ab und ist üblicherweise diejenige Menge, die das Auftreten der genetischen Transformation ermöglicht. Theoretisch ist nur eine Kopie erforderlich; jedoch werden im Allgemeinen zahlreiche Kopien eingesetzt, beispielsweise 1.000-20.000 Kopien des Transgenkonstrukts, um zu gewährleisten, dass eine Kopie funktionstüchtig ist. In Bezug auf die vorliegende Erfindung kann es ein Vorteil sein, mehr als eine funktionstüchtige Kopie der insertierten exogenen DNA-Sequenz vorliegen zu haben, um ihre phänotypische Expression zu verstärken.

Transgene Nachkommen des Surrogatwirts können auf die Anwesenheit und/oder Expression des Transgens mit einem beliebigen geeigneten Verfahren gescreent werden. Das Screening wird häufig durch Southern-Blot- oder Northern-Blot-Analyse erzielt, wobei eine Sonde verwendet wird, die zumindest zu einem Abschnitt des Transgens komplementär ist. Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen das vom Transgen kodierte Dkk-5 kann als alternatives oder zusätzliches Verfahren zum Screenen auf das Vorliegen des Transgenprodukts eingesetzt werden. Typischerweise wird DNA aus Schwanzgewebe hergestellt und mittels Southern-Analyse oder PCR auf das Transgen hin analysiert. Alternativ dazu werden die Gewebe oder Zellen, von denen angenommen wird, dass sie das -52-

Transgen im höchsten Ausmaß exprimieren, auf das Vorliegen und die Expression des Transgens hin unter Verwendung von Southern-Analyse oder PCR getestet, obgleich beliebige Gewebe oder Zelltypen für diese Analyse verwendet werden können.

Alternative oder zusätzliche Verfahren zur Beurteilung des Vorliegens des Transgens umfassen ohne Einschränkung geeignete biochemische Tests, wie z.B. enzymatische und/oder immunologische Tests, histologische Färbungen auf bestimmte Marker- oder Enzymaktivitäten, Durchflusszytometrie-Analyse und dergleichen. Die Blutanalyse kann ebenfalls zweckdienlich sein, um das Vorliegen des Transgenprodukts im Blut nachzuweisen, sowie um die Wirkung des Transgens auf den Spiegel von Blutbestandteilen, wie z.B. Glucose zu beurteilen.

Nachkommen der transgenen Tiere können durch Paarung des transgenen Tiers mit einem geeigneten Partner oder durch In-vitro-Fertilisation von aus dem transgenen Tier erlangten Eiern und/oder Spermien erhalten werden. Wo die Paarung mit einem Partner durchzuführen ist, kann der Partner ein transgenes und/oder Knockout-Tier sein, muss es aber nicht; wo es transgen ist, kann es dasselbe Transgen oder ein anderes Transgen oder beides enthalten. Alternativ dazu kann der Partner eine Elternlinie sein. Wo die In-vitro-Fertilisation verwendet wird, kann der befruchtete Embryo in einen Surrogatwirt implantiert oder in vitro inkubiert werden oder beides. Bei Verwendung von einem der Verfahren kann die Nachkommenschaft auf das Vorliegen des Transgens unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren oder anderer Verfahren beurteilt werden.

Die gemäß dieser Erfindung produzierten transgenen Tiere umfassen exogenes genetisches Material, d.h. eine DNA-Sequenz, die in der Produktion von Dkk-5 resultiert. Die Sequenz wird operativ an ein Transkriptionskontrollelement, z.B. an einen Promotor gebunden sein, das vorzugsweise die Expression der Transgenproduktion in einem bestimmten Zelltyp ermöglicht. Das hierin -53- insbesondere bevorzugte derartige Kontrollelement ist ein muskelspezifischer Promotor, der die Überexpression der Dkk-5-cDNA im Muskelgewebe ermöglicht. Ein Beispiel eines solchen Promotors ist der Myosinleichtkettenpromotor (Shani, Nature 314, 283-6 (1985)) oder derjenige, der die Smoothelin-A- oder -B-Expression antreibt oder ähnliche Promotoren, wie sie beispielsweise in WO 01/18048, veröffentlicht am 15. März 2001, beschrieben sind.

Retrovirusinfektion kann ebenfalls verwendet werden, um das Transgen in ein nichthumanes Tier einzuführen. Der sich entwickelnde nichthumane Embryo kann in vitro im Blastozytenstadium kultiviert werden. Während dieser Zeit können die Blastomere Ziele für die Retrovirusinfektion sein (Jaenich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 1260-1264 (1976)). Die effiziente Infektion der Blastomere wird durch enzymatische Behandlung zur Entfernung der Zona pellucida erhalten (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1986)). Das zur Einführung des Transgens verwendete Virusvektorsystem ist typischerweise ein replikationsdefekter Retrovirus, der das Transgen trägt (Jahner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 6972-6931 (1985); Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 6148-6152 (1985)). Die Transfektion wird leicht und effizient durch Kultivieren der Blastomere auf einer Monoschicht virusproduzierender Zellen erlangt (Van der Putten et al., s.o.; Stewart et al., EMBO J. 6, 383-388 (1987)). Alternativ dazu kann die Infektion in einem späteren Stadium durchgeführt werden. Virus- oder virusproduzierende Zellen können in das Blastozöl injiziert werden (Jahner et al., Nature 298, 623-628 (1982)). Die meisten Gründer werden bezüglich des Transgens mosaikartig sein, da die Inkorporation nur in einer Untergruppe derjenigen Zellen auftritt, welche das transgene nichthumane Tier bildeten. Weiters kann der Gründer verschiedene retrovirale Insertionen des Transgens an verschiedenen Positionen im Genom enthalten, die im Allgemeinen in der Nachkommenschaft segregieren. Außerdem ist es auch möglich, die Transgene durch intrauterine Retrovirusinfektion des Embryos im mittleren Schwangerschaftsstadium in die Keimbahn einzuführen (Jahner et al. (1992), s.o.). -54-

Eine dritte Art von Zielzelle für die Transgeneinführung ist die embryonale Stammzelle (ES) ES-Zellen werden aus in vitro kultivierten Vorimplantations-Embryos und Fusion mit Embryos erhalten (Evans et al., Nature 292, 154-156 (1981); Bradley et alM Nature 309, 255-258 (1984); Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 9065-9069 (1986); Robertson et al., Nature 322, 445-448 (1986)). Transgene können durch DNA-Transfektion oder durch Retrovirus-vermittelte Transduktion effizient in ES-Zellen eingeführt werden. Derartige transformierte ES-Zellen können danach mit Blastozyten aus einem nichthumanen Tier kombiniert werden. Die ES-Zellen besiedeln danach den Embryo und tragen zur Keimlinie des resultierenden Chimären Tiers bei. Für einen Überblick siehe Jaenisch, Science 240, 1468-1474 (1988).

Kandidat-Medikamente werden auf ihre Fähigkeit hin gescreent, eine Insulinresistenz-Störung zu behandeln, indem sie einem solchen Tier (beispielsweise durch Inhalation, Ingestion, Injektion, Implantation usw.) in einer Menge zugeführt werden, die für das zu messende Glucose-Clearance- oder Aufnahme-Potenzial geeignet ist. Eine erhöhte Glucose-Clearance oder Aufnahme wäre ein Anzeichen für die Fähigkeit des Medikaments, Diabetes oder andere Insulinresistenz-Störungen zu behandeln.

Gentherapie mit Dkk-5

Dkk-5 kann in der Gentherapie zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden. Es können verschiedene Wege eingeschlagen werden, wie z.B. kutane Gentherapie oder Retrovirusvektor-Gentherapie oder Mangel an korrektem Leptin, der einen Phänotyp von vermindertem Adipose-Gewebe und Insulinresistenz sowie erblich bedingter Fettleibigkeit und Diabetes im Menschen hervorruft (Larcher et al., FASEB J. 15, 1529-1538 (2001)). Ein weiteres Verfahren zur Wiederherstellung der Insulinempfindlichkeit über Gentherapie ist das Verwenden der Adenovirus- -55- ·· · • « ·« • · · • · · · « * «« #4« vermittelten Gentherapie, wie sie in Ueki et al., J. Clin. Invest. 105, 1437-1445 (2000) beschrieben wird. Ein weiteres Verfahren ist das Verwenden der Gentherapie, um der diabetischen Hyperglykämie entgegenzuwirken, indem Skelettmuskel gentechnisch so verändert wird, dass er für Dkk-5 kodierende DNA exprimiert, wie es von Otaegui et al., Human Gene Therapy 11,1543-1552 (2000) beschrieben wird.

Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um das Verstehen der Erfindung zu unterstützen, und sollten selbstverständlich nicht dahingehend ausgelegt werden, als dass sie die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung speziell einschränken. Variationen der Erfindung, die im Bereich der Fachkundigen liegen würden, einschließlich der Substitution aller Äquivalenten, die jetzt bekannt sind oder später entwickelt werden, fallen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, wie sie im Folgenden beansprucht wird. Die Offenbarungen aller Zitate hierin sind durch Verweis aufgenommen.

Beispiel 1

Wirkungen von Dkk-5

Materialien und Verfahren L6-Zellkultur L6-Myoblasten wurden in Wachstumsmedium vermehrt, das MEM Alpha (Gibco-BRL) in 10% Fötalkälberserum enthielt. Vor Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit Trypsin dispergiert und in frisches Wachstumsmedium neu ausgesät. Die Myoblastenfusion wurde durch Ändern des Mediums auf Differenzierungsmedium bei Konfluenz (MEM Alpha mit 2% Fötalkälberserum) induziert. Die Zellen wurden in diesem Medium für 3-9 Tage gezüchtet, und für mehr als 28 Stunden lange Behandlungen wurde diesem Medium Dkk-5 zugegeben. Weniger als 28 Stunden -56- • · • · I · ι · « ··*· * • · • · « • «t .· lange Behandlungen wurde in MEM Alpha mit 0,5% Fötalrinderserum (FBS) durchgeführt.

Expression von rekombinantem Dkk-5

Das Human-Analogon von Dkk-5 (hDkk-5) (siehe Seq.-ID Nr. 5 der Fig. 2 hierin) wurde in Baculovirus-infizierten Insektenzellen als C-terminale 8X-His-tagFusion exprimiert und mittels Nickelaffinitätssäulenchromatographie (WO 01/40465 und WO 01/16319) gereinigt. Die Identität des gereinigten Proteins wurde mittels N-terminaler Sequenzanalyse verifiziert. Das gereinigte Protein wies weniger als 0,3 EU/ml Endotoxin auf. DOG-Aufnahme

Kontrollzellen und mit Dkk-5 behandelte Zellen wurden in Krebs-Ringer-Phosphat-HEPES-Puffer (KRHB) (130 mM NaCI, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCI2, 1,3 mM MgS04,10 mM Na2HP04 und 25 mM HEPES, pH 7,4), der 0,5 pCi 2-Desoxy[14C]glucose enthielt, in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,5 μΜ Insulin für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit KRHB gewaschen und in 100 mM NaOH lysiert und die Menge an intrazellulärer 2-Desoxy[14C]glucose in den Zelllysaten wurde mittels Flüssigszintillation (LSC) gemessen.

Die Glykogensynthese wurde als [14C]Glucoseinkorporation in Glykogen bestimmt. Kontroll-L6-Zellen und mit Dkk-5 behandelte Zellen wurden für 2 Stunden in serumfreiem MEM Alpha inkubiert, das [U-14C]Glucose (5 mM Glucose; 1,25 pCi/ml) mit oder ohne 0,5 μΜ Insulin enthielt. Das Experiment wurde durch Entfernung des Mediums und rasches dreimaliges Waschen der Zellen mit einkaltem PBS und Lyse der Zellen mit 20% (Gew./Vol.) KOH terminiert, wobei die KOH nach 1 Stunde durch Zugabe von 1 M HCl neutralisiert wurde. Die Lysate wurden für 5 Minuten aufgekocht und mittels Zentrifugation geklärt und das Zellglykogen im Überstand mit -57- ·· · ·· · #· · • · ♦· · · ·· · · ·· ··· ····· • · · · · ♦♦· · • * · · · * *

Isopropanol bei 0°C mit 1 mg/ml kaltem '0lyc0gen*,ars*,Tflger**präzipitiert. Das präzipitierte Glycogen wurde mittels Zentrifugation abgetrennt, mit 70% Ethanol gewaschen und wieder in Wasser aufgelöst und die Inkorporation von [14C]Glucose mittels LSC bestimmt.

Glucoseinkorporation in Lipide

Kontroll- und behandelte 3T3 L1-Adipozyten wurden mit D-[U-14C]Glucose (0,2 pCi/ml) in serumfreiem MEM Alpha für 2 Stunden bei 37°C in Gegenwart und Abwesenheit von 0,5 μΜ Insulin inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 100 mM NaOH lysiert. Die Lysate wurden mit 100 mM Salzsäure neutralisiert. Die Zelllipide in den Lysaten wurden in n-Heptan extrahiert und die Inkorporation von [14C]Glucose in das extrahierte Lipid mittels Flüssigszintillationszähler (LSC) gemessen.

Quantitative Real-time-PCR RTQ-PCR wurde unter Verwendung eines ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System-Geräts und Software (PE Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) wie von Gibson et al., Genome Res. 6, 995-1001 (1996) und Heid et al., Genome Res. 6, 986-994 (1996) beschrieben durchgeführt.

Analyse

Wenn nicht anders angegeben, sind alle angegebenen Daten Mittelwerte plus und minus der Standardabweichungen. Vergleiche zwischen Kontrollzellen und behandelten Zellen und zwischen transgenen Mäusen und Mäusen der Wildform wurden unter Verwendung eines ungepaarten Student-t-Tests durchgeführt.

Kultur von 3T3/L1-Adipozyten -58- ι· · ·· ♦ · ·· · ·

• · · · • · · · · • · · •t♦· ··· Μ 3T3/L1 -Fibroblasten wurden zur Konfluenz gezüchtet und zu Adipozyten differenziert (Rubin et al., J. Biol. Chem. 253, 7570-7578 (1978)). Differenzierte Zellen wurden zum Zeitpunkt 72 Stunden nach Induktion und Differenzierung mit Dkk-5 behandelt.

Tiere

Alle Arbeitsvorschriften würden von einem „Institutional Use and Care Committee“ genehmigt werden. Wenn nicht anders angegeben, werden Mäuse mit standardmäßigem Laborfutter in einer temperatur- und feuchtigkeitsregulierten Umgebung gehalten. Es wird ein 12-stündiger (18.00 Uhr/6.00 Uhr) Lichtzyklus verwendet.

Transgene Mäuse

Die Human-Dkk-5-DNA wurde 3’ an die pRK-Donor/Akzeptor-Spleißstelle ligiert, welcher der Myosinleichtkettenpromotor (Shani, Nature 314, 283-6 (1985)) vorangeht. Der Dkk-5-cDNA folgten die zwischen dem vierten und fünften Exon des humanen Wachstumshormongens vorhandenen Donor/Akzeptor-Spleißstellen (Stewart et al., Endocrinology 130, 405-414 (1992)). Das gesamte

Expressionsfragment wurde durch Reinigung von verunreinigenden Vektorsequenzen befreit und in einzellige Maus-Eier injiziert, die sich von FVB X FVB-Paarungen herleiteten. Transgene Mäuse wurden mittels PCR-Analyse von aus Schwanzbiopsien extrahierter DNA identifiziert.

Ergebnisse

Dkk-5 ist ein sekretiertes Protein, das sehr eng mit der Dickkopf-Familie von Proteinen verwandt ist. Siehe Fig. 1 und Fig. 2. Unter Verwendung von Radiation-Hybrid-Mapping wurde das Gen für Dkk-5 von den Erfindern am Chromosom 1 -59- •·!»· · zwischen DIS434 (32,2 cM) und DIS2843 (48,8 cM) lokalisiert. Diese Lokalisierung wird durch Daten aus anderen Sequenzierungsversuchen bestätigt, wie sie durch BLAST-Analyse der öffentlichen Sequenzdatenbanken (siehe unten) ermittelt wurden.

Sequenzierung im Gange, in geordneten Stücken. 119969 bp. DNA, HTG 28. Juni 2001 Zugang: AL031731 Version: AL031731.36 Gl:14575526 Quelle: menschlich Organismus: Homo sapiens Referenz: 1 (Basen 1 bis 119969)

Autor: S. Martin Titel: direkte Einreichung

Journal: eingereicht (26. Juni 2001) Sänger Centre, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, Großbritannien

Kommentar: Am 28. Juni 2001 ersetzte diese Sequenzversion gi:14422201.

Es wurde gefunden, dass Dkk-5 in adulten Humangeweben weithin exprimiert wird, wie in Fig. 3 gezeigt ist. Dies wurde mittels quantitativer Real-time-PCR wie oben beschrieben ermittelt.

Dkk-5 wurde während der embryonalen Mausentwicklung differenziell exprimiert. Die quantitative Real-time-RT-PCR-Analyse von Mausembryos offenbarte, dass die Dkk-5-Expression am Tag 10 p.c. beginnt und mit dem Maximum am Tag 12 p.c. bis zum Tag 16 p.c. andauert. Siehe Fig. 4. Die In-situ-Hybridisierungsanalyse von ganzen Embryos zeigte, dass diese Expression an der Mittelhirn-Hinterhirn-Verbindung und entlang der Deckplatte auftritt, einer Region, die bei der Spezialisierung der Mesoderm-Entwicklung von Bedeutung ist. Siehe Fig. 5. -60- ·· • ♦ · • ·· • • · • · • · • • • • • • • · · • t·· • · • ♦ *

Die Ergebnisse zeigen, dass die Dkk-5-Expression während der Differenzierung von L6-Muskelzellen reguliert war. Die mittels quantitativer Real-time-RT-PCR gemessenen Mengen des Transkripts begannen am Tag 3 der Differenzierung anzusteigen und begannen bis zum Tag 7 der Differenzierung abzufallen. Siehe Fig. 6, die das relative Expressionsausmaß an Dkk-5 während der L6-Zelldiffernezierung von Tag 1 bis Tag 8 zeigt. Dieses Expressionsmuster entspricht der Zeitspanne, während der L6-Zellen auf Dkk-5 reagieren, und entspricht auch der Zeitspanne, während der die Dkk-5-Bindung an L6-Zellen nachweisbar ist.

Bei Expression in Baculovirus-infizierten Insektenzellen wurde das Volllängen-Dkk-5-Protein intern geschnitten, um drei Spaltprodukte zu liefern, die hinsichtlich der Größe im Bereich von 16 kDa und 20 kDa lagen. In dem in Fig. 7 gezeigten Gel entspricht Bande „b“ dem Volllängenprotein. Die N-terminale Sequenz des Volllängenproteins einschließlich der Signalsequenz ist MAGPAIHTAPML (Seq.-ID Nr. 6). Das reife Protein beginnt bei GALAPGTP (Seq.-ID Nr. 7), so dass sich die Signalpeptid-Spaltstelle zwischen dem Alanin an Position 24 und dem Glycin an Position 25 in Seq.-ID Nr. 5 befindet. Die als „a“ gruppierten Banden entsprechen den intern geschnittenen Proteinen, die alle die N-terminale Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) aufweisen. Die Proteine bilden Dimere (Bande c, Lane 1 in Fig. 7), die unter reduzierenden Bedingungen in die monomere Form umgewandelt werden. Das geschnittene 16-kDa-Protein verstärkte nach weitgehender Reinigung (auf ungefähr 90%) aus dem Präparat des rekombinant produzierten Volllängen-Dkk-5 mittels Anionenaustauschchromatographie mittels einer MONO-Q™-Säule die basale und insulinstimulierte Glucoseaufnahme in Muskelzellen. Das Dkk-5, auf das in den untenstehenden Experimenten Bezug genommen wird, war ein Präparat, das als Gemisch von Volllängen- und intern geschnittenem Protein charakterisiert wurde, das ungefähr 5% geschnittenes Protein enthielt. -61 -

--- — v V

Das geschnittene Proteinfragment kann vom*rek0m6manieh tybllläffgen-Protein und jeglichen anderen unerwünschten Proteinen mithilfe jeglicher klassischen Proteinchemietechnik gereinigt werden, die nicht auf lonenaustauschchromatographie beschränkt ist. Außerdem können große Mengen des Volllängen-Dkk-5-Proteins mit begrenzter Proteolyse exprimiert werden, um hauptsächlich geschnittenes Material zu erhalten; die Arg-Arg-Stelle im Molekül kann ebenfalls geschnitten und das resultierende gewünschte Spaltprodukt mittels Größenausschluss oder anderen herkömmlichen Proteinreinigungstechniken gereinigt werden, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.

Die Behandlung von L6-Muskelzellen mit Dkk-5 resultierte in einer erhöhten Glucose- (2-DOG-) Aufnahme. Siehe Fig. 8. Die Wirkung von Dkk-5 kann innerhalb von 48 Stunden beobachtet werden (Fig. 8A) und hängt vom Differenzierungszustand der Zellen ab. Die Wirkungen der Dkk-5-Behandlung auf die Steigerung der insulinabhängigen Glucoseaufnahme sind zum Zeitpunkt 96 Stunden signifikanter (p=0.001) (Fig. 8B), obgleich die Wirkung sogar zum Zeitpunkt 48 Stunden (p=0,05) zu beobachten ist.

Die Behandlung von L6-Muskelzellen mit Dkk-5 resultierte in einer erhöhten Inkorporation von Glucose in Glycogen. Siehe Fig. 9. Wie in Fig. 9A gezeigt ist, können die Wirkungen von Dkk-5 in 48 Stunden (p=0,003) beobachtet werden und diese Wirkung könnte ohne Einschränkung auf irgendeine Theorie durch die Regulation der Aktivität von Akt und/oder GSK-3b vermittelt sein, die beide Zwischenprodukte der Wnt- und Insulinsignalwege sind.

Dkk-5 beeinflusste die Myogenese in L6-Zellen. Da die Wirkungen von Dkk-5 nach Langzeitbehandlung beobachtet wurden, ist es ohne Einschränkung auf irgendeine Theorie möglich, dass das Protein durch Beeinflussen der Differenzierung von L6-Zellen agiert. Es wurde RT-PCR-Analyse unter Verwendung der TAQMAN™-PCR -62- • · · • · · · durchgeführt, um die Expressionsstärken de’r* an 'der My*ogeriese*‘Beteiligten Gene, wie z.B. Myosinschwerkette (MHC), Myosinleichtkette (MLC), Myogenin, Pax3, Myf4 und MyoD in mit Dkk-5 behandelten L6-Zellen zu bestimmen. Fig. 10A-G zeigen, dass die Dkk-5-Behandlung in einer veränderten Expression von Myogenin und MyoD zwischen Tag 4 und 6 der Differenzierung, und von MLC2, Myf5 und Pax3 zwischen Tag 2 und 4 der Differenzierung resultierte.

Dkk-5 regulierte die Expression von Genen im Insulinsignalweg in Muskelzellen. RT-PCR-Analyse (TAQMAN™) wurde durchgeführt, um zu ermitteln, ob Dkk-5 die Expressionsstärken von am Glucosestoffwechsel beteiligten Genen beeinflusst. Wie in Fig. 11 gezeigt ist, erhöhte die Dkk-5-Behandlung die Expression von Akt (2fach), Glycogensynthase (4fach) und IRS-1 (2fach) nach 96 Stunden und verminderte die Expression von IRS-2 (0,2fach nach 48 Stunden Behandlung) und Glut-1 und PDK-1 (nach 96 Stunden).

Unter Anwendung der FACS-Analyse mit polyklonalen Antikörpern gegen Dkk-5 und monoklonalen Antikörpern gegen den His-8-Epitop-Marker wurde nachgewiesen, dass Dkk-5 L6-Zellen vom Tag 2 bis zum Tag 5 der Differenzierung bindet, dass sich jedoch diese Bindung bis zum Tag 6 vermindert oder verloren geht. Die Dkk-5-Bindung an L6 kann durch Denaturierung des Proteins beseitigt werden, kann durch Verwendung von überschüssigem Fc-markiertem Dkk-5 durch Konkurrenz verdrängt werden, und wird durch einen Überschuss an His-markiertem Protein nicht beeinträchtigt, was nahe legt, dass es sich um eine spezifische Wechselwirkung handelt. Siehe Fig. 12. Daher weist Dkk-5 einen spezifischen Rezeptor an der Oberfläche von Muskelzellen auf. Das verwandte Protein Dkk-1 bindet LRP6 und es ist ohne Einschränkung auf irgendeine Theorie wahrscheinlich, dass Dkk-5 ebenfalls über diesen Rezeptor wirken kann. Die Erfinder haben gefunden, dass diese Rezeptoren an der Oberfläche von L6-Zellen exprimiert werden und von anderen wurde gefunden, dass sie im normalen Muskel in Mäusen und Menschen exprimiert -63- 00 00 • 0 • § 0 • · • · • » 00 • 0 0 · 0

Mt werden (Hey et al., Gene 216, 103-111 (1998),* Brown’ef al*'Brachem. Biophys. Res. Commun. 248, 879-888 (1998)).

Die Dkk-4-Behandlung verminderte die basale und insulinstimulierte Glucoseaufnahme in Adipozyten. Im Speziellen zeigten Dkk-5-behandelte 3T3 L1-Zellen eine Erhöhung der Ausmaße an basaler und insulinstimulierter Glucoseaufnahme (Fig. 13A und 13B), sowie eine erhöhte Inkorporation von Glucose in Lipide nach Insulinstimulierung (Fig. 14A und 14B). Die nach 48 Stunden beobachtete Erhöhung der insulinabhängigen Glucoseaufnahme war 96 Stunden nach der Behandlung stärker ausgeprägt und eine ähnliche Beobachtung wurde bei der insulinabhängigen Inkorporation von Glucose in Lipid gemacht.

Die Wirkungen von Dkk-5 in vivo wurden durch Analysieren des Glucosestoffwechsels transgener Mäuse ermittelt, die Dkk-5-cDNA unter der Kontrolle eines muskelspezifischen Promotors (Shani, s.o.) exprimierten. Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass diese speziellen transgenen Tiere keinen veränderten Glucosestoffwechsel aufwiesen. Ohne auf irgendeine Theorie eingeschränkt zu sein, könnte dieses Ergebnis auf niedrige Expression, ungeeignete oder keine Spaltung des Proteins in diesen Tieren oder auf das Fehlen der Sekretion des Proteins aus Muskelzellen in die Nachbarzellen zurückzuführen sein, was die Abwesenheit jeglicher sichtbarer Wirkungen auf den Glucosestoffwechsel erklärt. Es wird erwartet, dass die Verwendung eines anderen Promotors oder anderen Expressionssystems, wie z.B. einer anderen Donor/Akzeptor-Spleißstelle an einem der beiden Enden der Dkk-5-DNA, eine stärkere Expression bewirkt. Außerdem würde die Expression von cDNA, die nur für ein aktives Spaltprodukt, wie z.B. das interne 16-kDa-Spaltprodukt von Dkk-5 kodiert, unter Verwendung von geeigneten Startcodons und anderen Elementen im Expressionskonstrukt, die dem geübten Fachmann offensichtlich wären, die Ermittlung ihrer Wirkungen auf den Glucosestoffwechsel in diesen transgenen Tieren ermöglichen. -64- • · • · • · • ·

Zusammenfassung und Diskussion

Dkk-5 hat deutliche Wirkungen auf die Glucoseaufnahme in Muskelzellen und in Adipozyten. Dkk-5-behandelte Muskelzellen waren empfindlicher auf Insulinbehandlung. Dkk-5-Behandlung stimulierte eine leichte Steigerung der Inkorporation in Glycogen und dies könnte ohne Einschränkung auf irgendeine Theorie auf die Wirkungen auf die Expressionsstärken von Glycogensynthase zurückzuführen sein. Dkk-5 könnte weiters seine Wirkungen auf den Glucosestoffwechsel in Muskelzellen ausüben, indem es die Expressionsstärken von Proteinen im Insulinsignalweg beeinflusst. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass Dkk-5 auch die Aktivität von Proteinen im Insulinsignalweg beeinflusst und/oder die Verlagerung des insulininduzierbaren Glucosetransporters (GLUM) in L6-Zellen reguliert.

In Adipozyten erhöht die Dkk-5-Behandlung sowohl die basale, als auch die insulinstimulierte Glucoseaufnahme und die Inkorporation von Glucose in Lipide nach 96-stündiger Behandlung. Glucoseaufnahme und Lipidakkumulierung in Adipozyten hängen vom Differenzierungszustand der Zellen ab und die Adipozytendifferenzierung wird durch Wnt-Signalisierung reguliert. Es wird erwartet, dass aktive Dkk-5-überexprimierende Mäuse eine erhöhte Glucosetoleranz aufweisen.

Schlussfolgerung

Dkk-5 beeinflusste den Glucosestoffwechsel in L6-Muskelzellen und es wird erwartet, dass es dasselbe in transgenen Mäusen tut, die das Protein im Muskel unter Verwendung eines Expressionssystems überexprimieren, welches dem obigen ähnlich ist. Von der Verwendung des injizierten rekombinanten Dkk-5-Proteinpräparats, welches im Gel von Fig. 7 dargelegt ist und das Volllängenprotein sowie den 16-kDa-Abschnitt davon enthält, oder des injizierten 16-kDa-Abschnitts -65- • · ·· ♦♦«···· ·« alleine wird erwartet, das es zur Behandlung von Insulinresistenz in Säugetieren wirkt. Die Behandlung von Muskelzellen mit Dkk-5 (sowohl Volllängen-, als auch intern gespaltenes 16-kDa-Produkt) resultierte in einer Steigerung der basalen und insulinstimulierten Glucoseaufnahme. Diese Wirkung wurde nach Langzeitbehandlung beobachtet, was ohne Einschränkung auf irgendeine Theorie nahe legt, dass Dkk-5 die Muskeldifferenzierung und sowohl die Aktivität, als auch die Expressionsstärken der Proteine im Insulinsignalweg beeinflusst. Die obigen Beobachtungen weisen nach, dass Dkk-5 die Insulinempfindlichkeit induziert. Insulinresistenz ist eine Schlüsseleigenschaft der meisten NIDDM-Formen. Daher wäre Dkk-5 bei der Behandlung von Insulinresistenz-Störungen zweckdienlich und Dkk-5 ist als ein diagnostischer Marker in Tests für solche Konditionen zweckdienlich. Weiters wird von Dkk-5 erwartet, dass es den Fortschritt des Diabetesphänotyps in transgenen Tiermodellen hemmt, wie beispielsweise im US-Patent Nr. 6.187.991 offenbart ist, und zur Identifizierung neuer Medikamente zur Behandlung von Insulinresistenz-Störungen sowie in der Gentherapie unter Verwendung der in Larcher et al., s.o., Ueki et al., s.o., und Otaegui et al., s.o., dargelegten Techniken zweckdienlich ist.

Beispiel 2

Entwicklung von monoklonalen Anti-Dkk-5-Antikörpern Fünf weibliche Balb/c-Mäuse (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, DE) wurden mit gereinigtem rekombinantem Polyhistidin-markiertem (HIS8), in Baculovirus-infizierten Insektenzellen exprimiertem und in RIBI™-Adjuvans (Ribi Immunochem Research Inc., Hamilton, MO) verdünntem Human-Dkk-5 hyperimmunisiert. Die Tiere wurden zweimal die Woche immunisiert, wobei 50 μΙ für jedes Tier verwendet und über die Fußsohle verabreicht wurden. Nach fünf Injektionen wurden B-Zellen aus den Lymphknoten von fünf Mäusen, die hohe Anti-Dkk-5-Titer aufwiesen, unter Verwendung der in Köhler und Milstein, s.o., und Hongo et al., Hybridoma 14, 253-260 (1995) beschriebenen Arbeitsvorschriften mit Maus-Myelomzellen (X63.Ag8.653; -66- • · ·· »M ···· ........

American Type Culture Collection, Manassas, VA) fusioniert. Nach 10-14 Tagen wurden die Überstände geerntet und mittels direktem ELISA auf Antikörperproduktion gescreent. Sieben positive Klone, die nach der zweiten Subklonierungsrunde durch Reihenverdünnung die höchste Immunbindung aufwiesen, wurden zur In-vivo-Produktion der monoklonalen Antikörper in PRISTANE™-geprimte Mäuse (Freund und Blair, J. Immunol. 129, 2826-2830 (1982)) injiziert. Die Aszitesflüssigkeiten wurden gepoolt und mittels Protein-A-Affinitätschromatographie (PHARMACIA™ Fast-protein-Flüssigchromatographie [FPLC]; Pharmacia, Uppsala, Schweden) wie von Hongo et al., s.o., beschrieben gereinigt. Die gereinigten Antikörperpräparate wurden sterilfiltriert (0,2 pm Porengröße; Nalgene, Rochester, NY) und bei 4°C in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelagert.

Diese Antikörper, die aus den unten dargelegten hinterlegten Hybridomen hergestellt wurden, können in den hierin dargelegten diagnostischen Verfahren unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken verwendet werden.

Materialhinterlegung

Die folgenden Materialien sind bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) hinterlegt worden:

Bezeichnung ATCC-Hinterlegungsnr. Hinterlegungsdatum DKK5.MAB3060.7A9.1A1.2G5 PTA-3090 21. Februar 2001 DKK5. MAB3058.13E10.1 G4.2B8 PTA-3091 21. Februar 2001 DKK5.MAB3059.3A4.1B10.1G8 PTA-3092 21. Februar 2001 DKK5.MAB3057.6C5.2C2.2E3 PTA-3093 21. Februar 2001 DKK5.MAB3063.11A8.2F1.2B8 PTA-3094 21. Februar 2001 DKK5.MAB3061.11 H3.2F6.1E3 PTA-3095 21. Februar 2001 DKK5.MAB3056.7H4.1H6.2B3 PTA-3096 21. Februar 2001 -67- 4 ·Μ·

Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder“ (Budapest-Übereinkommen) durchgeführt. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATTC unter den Bedingungen des Budapest-Übereinkommens zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des einschlägigen US-Patents oder bei Offenlegung irgendeiner US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden vom US-Bevollmächtigten für Patente und Warenzeichen bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC §122 und der dazugehörigen Regel des Bevollmächtigten (einschließlich 37 CFR, Sektion 1.14, mit besonderem Bezug auf 886 OG 638) berechtigt ist.

Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch andere derselben ersetzt wird. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.

Die vorangehende Patentschrift wird als ausreichend erachtet, einem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung die praktische Umsetzung der Erfindung zu ermöglichen. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird durch die hinterlegten Konstrukte nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform eine einzelne Illustration bestimmter Aspekte der Erfindung beabsichtigt und jegliche -68- ·· ···*·*· *·" ’

Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten sind. Die Hinterlegung des Materials hierin stellt weder ein Zugeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzureichend ist, die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der bestmöglichen Ausführungsweise davon, zu ermöglichen, noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der Ansprüche auf die speziellen Illustrationen einschränkt, die er darstellt. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben werden, dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorangehenden Beschreibung offensichtlich und liegen innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Ansprüche.

Die Prinzipien, bevorzugten Ausführungsformen und Ausführungsweisen der vorliegenden Erfindung sind in der vorangehenden Patentbeschreibung beschrieben worden. Die Erfindung, deren Schutz hierin beabsichtigt ist, ist jedoch nicht dahingehend auszulegen, dass sie auf die speziell offenbarten Ausgestaltungen eingeschränkt ist, da sie als illustrativ und nicht als einschränkend zu betrachten sind. Variationen und Änderungen können vom Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung vorgenommen werden, ohne vom beabsichtigten Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

-69-

Claims (28)

1. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Behandlung einer Insulinresistenz-Störung bei Säugetieren, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge Dickkopf-5 (Dkk-5) an ein Säugetier, das dieses benötigt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Störung nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) oder Fettleibigkeit ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin Dkk-5 zumindest ungefähr 85% Aminosäuresequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 5 aus Fig. 2 aufweist oder Dkk-5 zumindest ungefähr 85% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 aufweist.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin Dkk-5 die Seq.-ID Nr. 5 aus Fig. 2 umfasst oder die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Dkk-5 die Sequenz zwischen den Resten 25 und 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Dkk-5 ein internes Proteinspaltfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) ist und ein Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa aufweist, oder ein Gemisch aus einem Dkk-5, das die Seq.-ID Nr. 5 umfasst, und dem internen Proteinspaltfragment ist oder ein Gemisch aus einem Dkk-5, das die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfasst, und dem internen Proteinspaltfragment ist.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das weiters die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Insulinresistenz-Behandlungsmittels umfasst. • · · · · · ♦ ,, *. ···· ··· ·· *··
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Mittel Insulin, IGF-1 oder Sulfonylharnstoff ist.
9. 9. Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder Beginns einer Insulinresistenz-Störung bei einem Säugetier, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Messen der Menge an Dickkopf-5 (Dkk-5) in einer Probe aus dem Säugetier; und (b) Vergleichen der in Schritt (a) bestimmten Menge mit einer in einer Standardprobe vorhandenen Menge an Dkk-5, wobei ein vermindertes Ausmaß der Menge an Dkk-5 in Schritt (a) ein Anzeichen für die Insulinresistenz-Störung ist.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Messen unter Verwendung eines Anti-Dkk-5-Antikörpers in einem Immuntest durchgeführt wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Anti-Dkk-5-Antikörper einen Marker umfasst.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Marker aus der aus einem Fluoreszenzmarker, einem radioaktiven Marker oder einem Enzymmarker bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin die Insulinresistenz-Störung nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) oder Fettleibigkeit ist.
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, worin das Dkk-5 ein die Seq.-ID Nr. 5 umfassendes Dkk-5 oder ein Dkk-5 ist, das die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 oder ein internes Proteinspaltfragment der Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa oder eine Kombination aus dem Spaltprodukt und einem oder beiden der Dkk-5 umfasst, welche die Seq.-ID Nr. 5 oder die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfassen. -2-
15. 15. Diagnosseset zum Nachweisen des Vorliegens oder Beginns einer Insulinresistenz-Störung, wobei das Set Folgendes umfasst: (a) einen Behälter, der einen Antikörper umfasst, der Bickkopf-5 (Dkk-5) bindet; (b) Anleitungen zur Verwendung des Antikörpers und einer Standardprobe, um die Störung zu detektieren, worin entweder der Antikörper, der Dkk-5 bindet, nachweisbar markiert ist oder das Set einen weiteren Behälter umfasst, der einen zweiten Antikörper umfasst, der nachweisbar markiert ist und an Dkk-5 oder an den Dkk-5 bindenden Antikörper bindet.
16. 16. Set nach Anspruch 15, worin der Antikörper, der Dkk-5 bindet, ein monoklonaler Antikörper ist.
17. 17. Set nach Anspruch 15 oder 16, worin das Dkk-5 ein die Seq.-ID Nr. 5 umfassendes Dkk-5 oder ein Dkk-5 ist, das die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 oder ein internes Proteinspaltfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK (Seq.-ID Nr. 8) und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa oder eine Kombination aus dem Spaltprodukt und einem oder beiden der Dkk-5 umfasst, welche die Seq.-ID Nr. 5 oder die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfassen.
18. 18. Set zum Behandeln einer Insulinresistenz-Störung, wobei das Set Folgendes umfasst: (a) einen Dkk-5 umfassenden Behälter; und (b) Anleitungen zur Verwendung des Dkk-5, um die Störung zu behandeln.
19. 19. Set nach Anspruch 18, worin die Störung nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) oder Fettleibigkeit ist. ·· ··
20. 20. Set nach Anspruch 18 oder 19, worin der Behälter ein Fläschchen ist und die Anleitungen festlegen, dass der Inhalt des Fläschchens zur sofortigen Injektion in eine Spritze aufzunehmen ist.
21. 21. Set nach einem der Ansprüche 18 bis 20, das weiters einen Behälter umfasst, der ein Insulinresistenz-Behandlungsmittel umfasst.
22. 22. Set nach einem der Ansprüche 18 bis 21, worin das Dkk-5 ein die Seq.-ID Nr. 5 umfassendes Dkk-5 oder ein Dkk-5 ist, das die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 oder ein internes Proteinspaltfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYBDLK (Seq.-ID Nr. 8) mit einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa oder eine Kombination aus dem Spaltprodukt und einem oder beiden der Dkk-5 umfasst, welche die Seq.-ID Nr. 5 oder die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfassen.
23. 23. Isoliertes internes Proteinspaltfragment von Seq.-ID Nr. 5 mit der N-terminalen Sequenz MALFDWTDYEDLK und einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa.
24. 24. Zusammensetzung, die ein Proteinfragment nach Anspruch 23 und einen Träger umfasst.
25. 25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, die weiters ein Seq.-ID Nr. 5 umfassendes Dickkopf-5 (Dkk-5) oder ein Dkk-5 umfasst, das die Sequenz zwischen Rest 20 bis Rest 30 und Rest 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
26. 26. Zusammensetzung nach Anspruch 24 oder 25, worin das Dkk-5 eine Sequenz zwischen den Resten 25 und 347 von Seq.-ID Nr. 5 umfasst. -4- • ·
27. 27. Dkk-5-Antikörper produzierendes Hybridom, das aus der aus PTA-3090, PTA-3091, PTA-3092, PTA-3093, PTA-3094, PTA-3095 und PTA-3096 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
28. 28. Antikörper, der von einem Hybridom nach Anspruch 27 produziert wird. Wien, am 15. April 2004 GENENTECH, INC. durch: -5-

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