AT413335B - Monoclonaler antikörper gegen die na,k-atphase-beta-3-untereinheit und seine verwendung als therapeutikum - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper gegen die Na, K-ATPase-beta-3-Untereinheit (im Folgenden P-3E10 genannt) sowie seine Verwendung als Therapeutikum. 5 Zellen, Reagenzien und Antikörper - Alle humanen hämatopoietischen Zelllinien, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 5% C02 in RPMI-1640 Medium, das mit fetalem Kälberserum (FCS) (Gibco, Grand Island, NY), 40 pg/ml Gentamicin und 2,5 pm/ml Amphotericin B versetzt wurde, kultiviert. Periphere mononukleäre Zellen des Blut (PBMCs) wurden von gesunden Spendern mittels einer Ficoll-Hypaque-io Dichtegradientenzentrifugation (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) isoliert. Die monoklonalen Antikörper (mAb) P-3E10 gegen die beta-3 Untereinheit der Na, K-ATPase, CD99 mAb MT99/3, CD147 mAb M6-1E9 und der mAb KLH, spezifisch für das KLH-Molekül, wurden in Laboratorien der Anmelderin generiert. Der mAb MEM-188 (CD56; lgG2a Isotype) als auch der mAb AFP-01 gegen humanes alpha-Fetoprotein (lgG1 Isotype) wurden von Dr. V. Horejsi (Insti-15 tut für Molekulare Genetik, Akademie der Wissenschaften der Tschechischen Republik, Prag, Tschechische Republik) zur Verfügung gestellt. Maus-lgG2a, UPC 10, wurde von Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Chemical, St. Louise, MO) erworben. Der mAb 4G2 (lgG2a Isotype), der spezifisch gegen das E-Protein vom Denguevirus gerichtet ist, wurde von Dr. P. Malasit, Medizinisch Biotechnologische Abteilung, Mahido Universität, Bangkok, Thailand, zur Verfügung gestellt. 20 Für die Reinigung der mAbs wurde Affinitätschromatographie eingesetzt. Die IgG Isotype mAbs wurde über eine Protein-A-beschichtete Sepharosesäule (Zymed Laboratory Inc., San Franciso, CA) nach Methoden, die in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Storing and purifying antibodies. In Harlow, E. and Lane, D., eds., Antibodies: a Laboratory Manual, S. 285. Cold Spring Harbor Laboratory, New York., beschrieben wurden, gereinigt. 25

Proliferationsnachweis - Für die Analyse des Wachstums von Lymphozyten wurde jede Kultur in einem Flachboden-96-Nämpfchen Behälter (NUNC, Roskilde, Dänemark) bei einem Endvolumen von 200 μΙ/Näpfchen angesetzt. Dreifachansätze von 1 x 105 oder 5 x 105 PBMCs wurden unter Verwendung von immobilisiertem CD3 mAb OKT3 (20 ng/ml oder 1 pg/ml) bzw. löslichem 30 Ziegen-anti-human-IgM-Antikörper (10 pg/ml) (Hyland Diagnostics, Deerfield, MA) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen der getesteten mAbs aktiviert. Die Kulturen wurden 3 Tage lang in einem 5% C02 -Inkubator bei 37°C inkubiert. Dann wurde pro Näpfchen 1 pCi von [3H]Thymidin (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) hinzugefügt. Bis zur Ernte wurden die Kulturen weitere 18 Stunden inkubiert. Die aufgenomme-35 ne Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Micro Beta; Wallac, Tuiku, Finnland) gezählt. Für die Wachstumsbestimmung der Zelllinien wurden Dreifachansätze von 1.5 x 104 Zellen mit 0.5 pCi/Näpfchen [3H]Thymidin (Amersham Pharmacia) in der Anwesenheit von 2.5 pg/ml 40 P-3E10 mAb oder nur im Medium kultiviert. Die Kulturen wurden für 3 und 5 Stunden in einem 5% C02 Inkubator bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Kulturen entnommen und die aufgenommene Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Wallac) gezählt.

Bestimmung der Zytokinproduktion - 1 x 105 PBMCs wurden in der Anwesenheit oder Abwe-45 senheit von verschiedenen Konzentrationen der getesteten mAbs (in einem Gesamtvolumen von 200 pl) in einem Flachboden-96-Nämpfchen-Behälter (NUNC) kultiviert, der mit mAb OKT3 (1 pg/ml) beschichtet war. Nach der Inkubation bei 37°C in einem C02 Inkubator für 24 oder 72 Stunden wurde der Überstand gesammelt. Die Zytokine wurden mit einem ELISA mittels passenden Antikörperpaaren gemessen. Die immobilisierten sowie auch die detektierenden so Antikörper gegen humanes IL-10 wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN) erworben. Für die Bestimmung von IFN-gamma wurde ein mAb (Klon 25718.111) von R&D Systems (Minneapolis) als immobilisierter Antikörper und ein mAb (Klon GZ4) von Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) als detektierender Antikörper verwendet. Für die IL-2 und IL-4 Bestimmung wurde ein ELISA-Kit von Euroclone (Euroclone Ltd., West York, UK) verwendet. Standards aus 55 humanem, rekombinanten Material wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN) erworben. Die 3

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Proben wurden in Zweifachansätzen analog zu den Anleitungen der Hersteller gemessen.

Um Pathogene abzuwehren, ohne das eigene Gewebe zu schädigen, ist eine hochorganisierte Kooperation von Stimulation und Hemmung der Immunreaktionen erforderlich. Unter bestimm-5 ten Umständen wie z.B. Autoimmunität oder Hypersensibilität, kann das Immunsystem dieses Gleichgewicht nicht herstellen und wird eher zu einer Gefahr als zur Hilfe. In diesen Fällen zielt die therapeutische Intervention darauf hin, die autoreaktive bzw. hyperreaktive Immunantwort zu unterdrücken, und dadurch das natürliche Gleichgewicht des Immunsystems wiederherzustellen. Antikörper, die gegen immunologisch wichtige Moleküle gerichtet sind, stellen eine io zukünftige therapeutische Klasse von immunregulierenden Wirkstoffen dar.

Von der Anmelderin wurden verschiedene mAbs gegen Leukozyten-Oberflächenmoleküle generiert und bezüglich ihrer Fähigkeit überprüft, das T-Zellwachstum von mononukleären Zellpräparationen des peripheren Blutes zu modulieren. Dabei wurde herausgefunden, dass 15 einer dieser mAbs, den wir als P-3E10 bezeichneten, das OKT3-induzierte T-Zellwachstum in vitro hemmt.

Gemäß der Erfindung ist der monoklonale Antikörper P-3E10 dadurch gekennzeichnet, dass er spezifisch gegen die Na, K-ATPase-beta-3 Untereinheit gerichtet ist und eine regulatorische 20 Rolle in der Aktivierung von humanen T- und B-Lymphozyten spielt. Der anti- Na, K-ATPase-beta-3 Untereinheit Antikörper P-3E10 wurde zum 8. Internationalen Workshop über humane Leukozytendifferenzierungsantigene (HLDA8) am 7. Feber 2002 eingesandt und ist am Child Health Research Institute, 72 King William Road, North Adelaide 5006, Australien unter der Antibody Reference Number (ANR) 80199 hinterlegt. Der Antikörper ist dort für Fachleute auf 25 Antrag zur Durchführung von Versuchen zugänglich.

Das Überraschende an vorliegender Erfindung ist, dass dieser spezifische anti- Na, K-ATPase-beta-3 monoklonale Antikörper P-3E10 selektiv das Wachstum von Lymphozyten hemmt, obwohl sein Antigen, die beta-3 Kette der Na, K-ATPase, auch auf vielen anderen Zellen expri-30 miert wird. Der monoklonale Antikörper P-3E10 kann objektiv durch seine Spezifität für die beta-3 Untereinheit der Na, K-ATPase nachgewiesen werden.

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung hemmt der monoklonale Antikörper P-3E10 spezifisch die T- und B-Zell-Antigenrezeptor-mediierte Lymphozytenaktivierung. Ferner betrifft die 35 Erfindung die Verwendung des anti- Na, K-ATPase-beta-3 monoklonalen Antikörpers P-3E10 als Therapeutikum, um fehlerhafte oder unerwünschte Lymphozytenreaktionen bei immunologischen und entzündlichen Krankheiten, wie z.B. Allergien und Autoimmunerkrankungen, als auch bei klinischen Eingriffen, wie Transplantationen, zu unterbinden. 40 Die Methode der Expressionsklonierung, die vorliegendenfalls eingesetzt wurde, zeigte, dass der mAb P-3E10 spezifisch die beta-3 Untereinheit der Na, K-ATPase erkennt, ein membrangebundenes Enzym, welches für den aktiven Transport von Na+ und K+ Ionen in den meisten tierischen Zellen verantwortlich ist. So wie in Fig. 1a und b gezeigt, wurde das T-Zellwachstum durch den mAb P-3E10 signifikant gehemmt (n=16). Im Gegensatz dazu hatten die Isotyp-45 Kontroll-mAbs KLH und UPC 10 keinen Einfluss auf die Antwort von T-Zellen gegenüber immobilisiertem OKT3. Als nächstes wurde analysiert, ob mAb P-3E10 imstande ist die Zytokinproduktion von T-Zellen zu beeinflussen. PBMCs wurden mit immobilisiertem OKT3 mAb in der Anwesenheit oder Abwesenheit von löslichem P-3E10 aktiviert, und die Zytokine IFN-gamma, IL-2, IL-10 und IL-4 wurden im Überstand mittels ELISA gemessen. In Anwesenheit von P-3E10 so mAb wurde die Produktion von allen getesteten Zytokinen gehemmt (Fig. 2a-d). Der Isotype-Kontroll-mAb hatte keinen solchen Effekt. Da die Na, K-ATPase von verschiedenen Zelltypen exprimiert wird, wurde auch der Effekt von P-3E10 mAb auf das Wachstum von B-Zellen, Endothelzellen und verschiedenen Zelllinien überprüft. Das von anti-IgM-Antikörpern verursachte B-Zellwachstum wurde ebenfalls von P-3E10 mAb (Fig. 3) gehemmt. Der mAb hatte aber kei-55 nen Einfluss auf das Wachstum von Endothelzellen (Fig. 4a) und verschiedenen hämatopoieti-

Claims (2)

1. 4 AT 413 335 B sehen Zelllinien einschließlich SupT-1, Jurkat, Molt4 und U937 (Fig. 4b). Die beta-Untereinheit ist äußerst wichtig für die normale Aktivität der Na, K-ATPase und scheint für die Bindung von K+ und die Modulation der Affinität des Enzyms gegenüber K+ und Na+ 5 verantwortlich zu sein. Es wurde bereits berichtet, dass die Inaktivierung der Na, K-ATPase durch spezifische Hemmstoffe die Mitogen- und Antigeninduzierte Lymphozytenaktivierung blockiert. Eine Unterdrückung von Lymphozytenwachstum durch Na, K-ATPase-Hemmstoffe wurde sowohl in T (CD4+ und CD8+) und B (CD19+) Lymphozyten beobachtet. In der vorliegenden Studie demonstrierten wir, dass die Bindung des mAb P-3E10 an die Na, K-ATPase beta-3 io Untereinheit spezifisch das T-und B-Lymphozytenwachstum unterdrückt. Obwohl der genaue Mechanismus der Hemmung unbekannt ist, scheint der mAb P-3E10 die Na, K-ATPase Aktivität in Lymphozyten spezifisch zu blockieren und könnte deswegen als Therapeutikum verwendet werden, um fehlerhafte oder unerwünschte Lymphozytenreaktion bei immunologischen und entzündlichen Krankheiten sowie bei klinischen Eingriffen zu unterbinden. 15 Der Gegenstand der Erfindung wird an Hand der angeschlossenen Figuren näher erläutert. Fig. 1a und Fig. 1b: P-3E10 mAb hemmt das CD3-induzierte T-Zellwachstum. PBMCs wurden mit immobilisiertem OKT3 mAb 20 pg/ml (Fig. 1a) oder 1 pg/ml (Fig. 1b) in der Anwesenheit der 20 angegebenen Konzentrationen von P-3E10 mAb, Isotype-Kontroll-mAbs (KLH und UPC 10) oder Medium allein aktiviert. Die Balken stellen den Mittelwert ±SD der Ergebnisse von 10 (Fig. 1a) und 6 (Fig. 1b) gesunden Spendern dar. Fig. 2a-d: P-3E10 mAb hemmt die Zytokinproduktion in T-Zellen. PBMCs wurden mit immobili-25 siertem CD3 mAb 0KT3 (1 pg/ml) in der Anwesenheit der angegebenen Konzentrationen von löslichen P-3E10 mAb, Isotype-Kontroll-mAbs oder Medium allein aktiviert. Der Überstand wurde gesammelt und die Zytokine IFN-gamma, IL-2, IL-4 and IL-10 wurden mittels ELISA gemessen. 30 Fig. 3: P-3E10 mAb hemmt das anti-IgM-induzierte B-Zellwachstum. PBMCs wurden mit löslichem anti-lgM Antikörper (10 pg/ml) in der Anwesenheit von 10 pg/ml P-3E10 mAb, Isotype-Kontroll-mAb (4G2) oder Medium allein aktiviert. Die Balken repräsentieren den Mittelwert ±SD von 3 gesunden Spendern. 35 Fig. 4a, Fig. 4b: Effekt des P-3E10 mAb auf das Wachstum von HUVECs und hämatopoieti-schen Zelllinien. A, HUVECs wurden in M199 Medium + 1% SCS (Negativkontrolle) oder mit M199 + 10% SCS in der Anwesenheit der angegebenen Konzentrationen von löslichem P-3E10 mAb oder Isotype-Kontroll-mAb MEM-M6/3 kultiviert. Die Zeitzahl wurde mittels Kristallviolettfärbung bestimmt. B, Die angegebenen Zelllinien wurden in der Anwesenheit (geschlossene 40 Säulen) oder Abwesenheit (offene Säulen) von P-3E10 mAb kultiviert. Der [1H]Thymidineinbau wurde nach 3 Stunden und 5 Stunden Kultivierung bestimmt. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente. 45 Patentansprüche: 1. Monoklonaler Antikörper gegen die Na, K-ATPase-beta-3-Untereinheit, der eine regulatorische Rolle in der Aktivierung von humanen T- und B-Lymphozyten spielt. so 2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er spezifisch die T- und B-Zell-Antigenrezeptor-mediierte Lymphozytenaktivierung hemmt. 1 Verwendung des monoklonalen Antikörpers gegen die Na, K-ATPase-beta-3-Untereinheit nach Anspruch 2 als Therapeutikum, um fehlerhafte oder unerwünschte Lymphozytenreak-55 tionen bei immunologischen und entzündlichen Krankheiten, wie z.B. Allergien und Auto- 5 AT 413 335 B immunerkrankungen, zu unterbinden.
2. 4. Verwendung des monoklonalen Antikörpers gegen die Na, K-ATPase-beta-3-Untereinheit nach Anspruch 2 als Therapeutikum, um fehlerhafte oder unerwünschte Lymphozytenreak-5 tionen bei klinischen Eingriffen, wie Transplantationen, zu unterbinden. Hiezu 4 Blatt Zeichnungen 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55